Artykuł metodologiczny

Protokół szybkiej izolacji kropelek lipidów przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji organelli

DOI:

10.3791/59290

⸱

19 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół ustanawia nowatorską metodę izolacji i oczyszczania kropelek lipidów z wątroby myszy, przy użyciu dobrze znanego zestawu do izolacji retikulum endoplazmatycznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kropelki lipidów (LD) to bioaktywne organelle znajdujące się w cytozolu najbardziej eukariotycznych i niektórych komórek prokariotycznych. LD składają się z obojętnych lipidów otoczonych monowarstwą fosfolipidów i białek. Lipidy LD w wątrobie, takie jak ceramidy i białka, są zaangażowane w kilka chorób, które powodują stłuszczenie wątroby. Chociaż poprzednie metody izolacji LD zostały ustalone, wymagają one czasochłonnego przygotowania odczynników i nie są przeznaczone do izolacji wielu kompartmentów subkomórkowych. Staraliśmy się ustalić nowy protokół, który umożliwiłby izolację LD, retikulum endoplazmatycznego (ER) i lizosomów z pojedynczej wątroby myszy.

Ponadto, wszystkie odczynniki używane w przedstawionym tutaj protokole są dostępne na rynku i wymagają minimalnego przygotowania odczynnika bez poświęcania czystości LD. Poniżej przedstawiamy dane porównujące ten nowy protokół ze standardowym protokołem gradientu sacharozy, wykazując porównywalną czystość, morfologię i wydajność. Dodatkowo możemy wyizolować ER i lizosomy przy użyciu tej samej próbki, zapewniając szczegółowy wgląd w tworzenie i przepływ wewnątrzkomórkowy lipidów i powiązanych z nimi białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LD to bioaktywne organelle występujące w cytozolu większości komórek eukariotycznych i niektórych komórkach prokariotycznych1,2,3. Rdzeń LD składa się z neutralnych lipidów, takich jak trójglicerydy (TG) i estry cholesterolu. Zawierają również ceramidy, bioaktywne lipidy biorące udział w komórkowych szlakach sygnałowych4,5. LD są otoczone monowarstwą fosfolipidową i pokryte białkami, w tym białkami perylipiny 2 (PLIN2) i 3 (PLIN3)1,5,6. Obecne są również enzymy lipogenne, lipazy i białka transportujące błonę, które zostały powiązane z kilkoma chorobami stłuszczeniowymi wątroby, w tym niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby, alkoholową chorobą wątroby i wirusowym zapaleniem wątroby C3,5,6,7,8,9,10.

LDs są uważane za formowane z zewnętrznej błony ER i zawierają nowo zsyntetyzowane TG pochodzące z wolnych kwasów tłuszczowych pochodzących z ER11. Nie wiadomo jednak, czy zgromadzone lipidy pączkują, pozostają połączone, czy też są wycinane z klasy ER6,11, co sprawia, że izolacja LD wolnych od ER jest technicznie trudna. Wolne kwasy tłuszczowe mogą być uwalniane z LD przez działanie lipaz powierzchniowych w celu zapewnienia produkcji energii lub syntezy błonowej. Dodatkowo, LD mogą być degradowane przez lipofagię jako mechanizm regulacyjny i do produkcji wolnych kwasów tłuszczowych12.

Oprócz ER i lizosomów, istnieją inne organelle - takie jak mitochondria, endosomy, peroksysomy i błona plazmatyczna - które znajdują się w ścisłym związku z LDs11. Ta ścisła poligamia utrudnia przeprowadzenie czystej ekstrakcji LD. Jednak wrodzoną niską gęstość neutralnych lipidów można wykorzystać poprzez wirowanie5.

Tradycyjnie, LD były izolowane za pomocą gradientu gęstości sacharozy1,5,13. Jednak metody te nie zostały zaprojektowane do izolowania innych organelli. Dodatkowo wymagają czasochłonnego przygotowania odczynników. Protokół ten dostosowuje dostępny na rynku zestaw izolacyjny ER (patrz Tabela materiałów), aby umożliwić izolację LD. Używamy bufora ekstrakcyjnego dostarczonego przez zestaw, dodając krok izolacji LD. Co więcej, protokół może być również stosowany do izolacji ER i lizosomów przy użyciu tych samych próbek, co pozwala na uzyskanie bardziej kompleksowego obrazu cyklu życia LD. Aby zwalidować tę nową metodę, oznaczamy wydajność, morfologię, wielkość i czystość LD. Przedstawione tutaj wyniki porównujemy z wynikami uzyskanymi za pomocą powszechnie stosowanego protokołu wykorzystującego gradient sacharozy do izolacji LD.

Użyliśmy 10- do 12-tygodniowej, 20-gramowej samicy myszy C57BL/6 na czczo przez 16 godzin (usuwanie pokarmu o 17:00 do 9:00 czasu izolacji LD) z wolnym dostępem do wody. Typowa wydajność dla TG wynosi 0,6 mg/g wątroby, a dla białka LD 0,25 mg/g wątroby. Zapewnia to wystarczającą ilość materiału na ~10 immunoblot przez SDS PAGE. Poniższy protokół wyszczególnia użyte odczynniki oraz protokół odpowiedni dla pojedynczej 1 g wątroby. Protokół izolacji gradientu sacharozy jest zaadaptowany z Sato14 i Wu15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone na stanowisku laboratoryjnym z osobistym sprzętem ochronnym odpowiednim dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1, w tym fartuchem laboratoryjnym, rękawicami i okularami ochronnymi. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Pensylwanii. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować dyskomfort zwierząt, a zwierzęta były traktowane z humanitarną opieką.

1. Izolacja LD za pomocą zestawu izolacyjnego ER

  1. Przygotowanie
    UWAGA: Podane ilości są odpowiednie dla pojedynczej 1 g wątroby myszy.
    1. Przygotować 10 ml 1x izotonicznego buforu ekstrakcyjnego (bufor IE, z zestawu do izolacji ER), rozcieńczając 2 ml 5x buforu IE 8 ml ultraczystej wody. Ostudzić bufor, umieszczając go na lodzie.
    2. Przygotuj 100 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), rozcieńczając 10 ml 10x PBS w 90 ml ultraczystej wody. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    3. Przygotować 10 ml 5% eteru p-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)-fenylowego glikolu polietylenowego (PGPE), rozcieńczając 500 μl PGPE w 9,5 ml ultraczystej wody. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby odmierzyć PGPE, ponieważ jest lepki. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    4. Schłodzić wszystkie probówki, umieszczając je na lodzie: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml, probówki wirówkowe o pojemności 15 ml, probówki wirówkowe o dużej prędkości 50 ml i probówki ultrawirówkowe o pojemności 13 ml.
    5. Schłodzić wszystkie wymagane wirówki do temperatury 4 °C: mikrowirówkę, wirówkę o dużej pojemności do probówek 15 ml, wirówkę szybkoobrotową do probówek 50 ml i ultrawirówkę.
    6. Sterylizuj kleszcze i nożyczki preparacyjne przez autoklawowanie.
  2. Przygotowanie tkanek
    1. Poddaj mysz eutanazji, umieszczając ją w komorze wypełnionej 100% CO2 na 10 minut. Potwierdź eutanazję, wykonując zwichnięcie szyjki macicy.
    2. Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek preparacyjnych przeciąć warstwę skóry i mięśni brzucha na osi tylnej/przedniej, aby odsłonić wątrobę.
    3. Przetnij więzadła łączące wątrobę z przeponą i jelitem. Użyj kleszczy, aby odciągnąć jelito od wątroby w kierunku tylnej, aby odsłonić więzadła.
    4. Przeciąć między wątrobą a grzbietową klatką piersiową, przesuwając się od przodu do tyłu, aż wątroba zostanie uwolniona.
    5. Przenieś wątrobę na zimną 5 cm szalkę Petriego z 10 ml zimnego 1x PBS.
    6. Myć wątrobę 2x na bujanej platformie w 10 ml zimnego 1x PBS przez 5 minut w temperaturze 4 °C na 5 cm szalce Petriego. Odlej 1x PBS po ostatnim praniu.
    7. Użyj sterylnego ostrza chirurgicznego w rozmiarze 10 (patrz Tabela Materiałów), aby pokroić wątrobę na 3-5 mm kawałki na 5-centymetrowej szalce Petriego (Ryc. 1A).
    8. Pokrojoną w kostkę wątróbkę myć 2x 10 ml zimnej 1x PBS przez 5 minut w temperaturze 4 °C na 5 cm szalce Petriego.
      UWAGA: W celu izolacji lizosomów przenieś 0,5 g wątroby do czystego homogenizatora o pojemności 45 ml i postępuj zgodnie ze wskazówkami dostarczonymi przez zestaw do ekstrakcji lizosomów (patrz Tabela materiałów).
    9. Zdekantować 1x PBS i przenieść pokrojone w kostkę kawałki wątroby do zimnego homogenizatora Dounce o pojemności 45 ml. Upewnij się, że wszystkie kawałki trafiają na dno homogenizatora.
    10. Dodać 7 ml zimnego buforu 1x IE (z zestawu izolacyjnego ER) i homogenizować na lodzie, przesuwając tłuczek w górę iw dół 20x. Upewnij się, że tłuczek opada na dno homogenizatora podczas każdego pociągnięcia.
    11. Przenieś homogenat (Rysunek 1B) do zimnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    12. Przepłukać homogenizator 1 ml zimnego buforu 1x IE (z zestawu izolacyjnego ER) i dodać go do reszty homogenatu.
  3. Izolacja LD
    1. Usunąć jądra przez odwirowanie homogenatu w wirówce o dużej pojemności przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C (Rysunek 1C).
    2. Przenieść supernatant pojądrowy (PNS) do nowej, zimnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Aby zapobiec utracie LD, należy upewnić się, że wszelkie lipidy zebrane w górnej części probówki o pojemności 15 ml są ponownie zawieszone przed przeniesieniem PNS.
    3. Pobrać 100 μl podwielokrotności PNS do analizy czystości i umieścić ją w zimnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Odłóż na lód.
    4. W celu usunięcia mitochondriów należy odwirować próbkę PNS, a nie podwielokrotność, w wirówce szybkoobrotowej z chłodzeniem o sile 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
      1. Opcjonalnie: W przypadku surowych izolatów LD (CLD) (z zanieczyszczeniem cytozolem i błoną komórkową) należy pobrać górną warstwę lipidową za pomocą szklanej pipety i przenieść ją do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Przejdź do sekcji 1.4.
    5. Przenieś supernatant postmitochondrialny (PMS) do probówki ultrawirówkowej. Aby zapobiec utracie LD, upewnij się, że lipid zebrany na górze jest ponownie zawieszony przed przeniesieniem PMS.
    6. Pobrać 100 μl porcji PMS do analizy czystości i umieścić ją w zimnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml. Odłóż na lód.
    7. Napełnij probówkę ultrawirówki po brzegi zimnym buforem 1x IE, aby zapobiec zapadaniu się probówki podczas ultrawirowania.
    8. Zrównoważyć próbki i odwirować je w ultrawirówce o sile 100 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C (Rysunek 1D).
    9. Aby usunąć warstwę LD, przechyl probówkę pod kątem 45° i użyj szklanej pipety do natarcia. Przenieś osad do zimnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml.
      UWAGA: Osad zawiera izolowany ER. Użyj tej frakcji za ER do izolacji ER.
    10. Zebrać 100 μl supernatantu post-ER (PER) pod warstwą lipidową w celu analizy czystości.
  4. Mycie LD
    1. Dodać 1x PBS do frakcji LD zebranej w probówce mikrowirówki 1,7, do całkowitej objętości 1,3 ml.
    2. Odwirować próbkę.
    3. Wirować w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby osadzać wszelkie resztki komórek. Delikatnie ogrzej probówkę rękami, aby pomóc w ponownym zawieszeniu warstwy LD. Przenieść supernatant wraz z warstwą lipidową do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml.
    4. Powtarzaj kroki 1.4.1–1.4.3 2x–3x, aż granulka przestanie być widoczna.
    5. Dodać 1x PBS do bezgranulkowego supernatantu LD do końcowej objętości 1,5 ml. Przemyć frakcję lipidową przez odwirowanie w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Usuń 1 ml 1x PBS (spod warstwy lipidowej) szklaną pipetą, nie naruszając warstwy lipidowej.
    7. Powtórz kroki 1.4.5 i 1.4.6 4x–5x, aż 1x PBS stanie się wizualnie przezroczysty bez zmętnienia.
    8. Usuń wszystkie 1x PBS poniżej warstwy lipidowej za pomocą szklanej pipety (Rysunek 1E).
    9. Wynik, czyli czystą frakcję LD, należy wykorzystać do dalszej analizy.
  5. Oznaczanie ilościowe białka LD za pomocą testu kwasu bicinchoninowego
    UWAGA: Nie należy stosować testu kwasu bicinchoninowego (BCA), jeśli ma być oceniana morfologia LD.
    1. Zawiesić LD w 500 μl 5% PGPE.
    2. Gotować próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C, wirować je i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 5 minut do ostygnięcia.
    3. Powtórz krok 1.5.2 dodatkowo 2 razy.
    4. Sonikować próbki przez 5 minut w 30-sekundowym cyklu włączania/wyłączania, przy średniej intensywności.
    5. Znormalizować próbki, mierząc stężenie białka we wszystkich próbkach do analizy czystości oraz we frakcji LD za pomocą testu BCA.

2. Izolacja LD za pomocą gradientu gęstości sacharozy

  1. preparat
    1. Przygotować 200 ml buforu TE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA [pH 8,0]). Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    2. Przygotować 100 ml 60% (m/v) roztworu sacharozy w buforze TE, rozpuszczając 60 g sacharozy w buforze TE, doprowadzając końcową objętość do 100 ml. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    3. Przygotować 6 ml 40% (w/v) roztworu sacharozy, dodając 4 ml 60% sacharozy do 2 ml buforu TE. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    4. Przygotować 6 ml 25% (w/v) roztworu sacharozy, dodając 2,5 ml 60% sacharozy do 3,5 ml buforu TE. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    5. Przygotować 4 ml 10% (w/v) roztworu sacharozy, dodając 0,7 ml 60% sacharozy do 3,3 ml buforu TE. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    6. Przygotować 10 ml roztworu inhibitora proteazy i fosfatazy, dodając jedną tabletkę zarówno proteazy, jak i inhibitorów fosfatazy do 10 ml buforu TE.
    7. Przygotować bufor homogenatu tkankowego, dodając 4 ml roztworu inhibitora proteazy i fosfatazy do 50 ml 60% roztworu podstawowego sacharozy. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    8. Przygotować bufor nakładkowy, dodając 2 ml roztworu inhibitora proteazy i fosfatazy do 50 ml buforu TE. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    9. Przygotuj 100 ml 1x PBS, rozcieńczając 10 ml 10x PBS w 90 ml ultraczystej wody. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    10. Przygotuj 10 ml 5% PGPE, rozcieńczając 500 μl PGPE w 9,5 ml ultraczystej wody. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml, aby odmierzyć PGPE, ponieważ jest lepki. Ostudzić go, umieszczając go na lodzie.
    11. Schłodzić następujące probówki wirówkowe, umieszczając je na lodzie: probówki do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml, probówki wirówkowe o pojemności 15 ml, probówki wirówkowe szybkoobrotowe o pojemności 50 ml i probówki ultrawirówkowe o pojemności 13 ml.
    12. Schłodzić wymagane wirówki do temperatury 4 °C: mikrowirówkę, wirówkę o dużej pojemności (do probówek 15 ml), wirówkę szybkoobrotową (do probówek 50 ml) i ultrawirówkę.
  2. Przygotowanie tkanek
    1. Wykonaj kroki 1.2.1–1.2.9, aby przygotować tkankę do homogenizacji.
    2. Dodaj 7 ml zimnego buforu do homogenatu tkankowego i homogenizuj go na lodzie, przesuwając tłuczek w górę iw dół 20 razy. Podczas pierwszych pięciu pociągnięć upewnij się, że tłuczek opada na dno homogenizatora.
    3. Przenieść homogenat do zimnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    4. Przepłukać homogenizator 1 ml zimnego buforu do homogenatu tkankowego i przenieść go do poprzednio używanej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    5. Doprowadzić objętość homogenatu do 10 ml za pomocą buforu do homogenatu tkankowego.
    6. Odwirować próbkę w wirówce o dużej pojemności przy 1 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Przenieść 8 ml supernatantu do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    8. Przenieść 100 μl pozostałego supernatantu jako próbkę PNS do analizy czystości.
  3. Gradient sacharozy
    1. Przechylić probówkę wirówkową o pojemności 50 ml zawierającą 8 ml PNS pod kątem 45°. Ostrożnie dodaj 6 ml 40% roztworu sacharozy, upewniając się, że obie fazy pozostają oddzielone.
    2. W podobny sposób powoli dodawać 6 ml 25% roztworu sacharozy, następnie dodać 4 ml 10% roztworu sacharozy, a na koniec dodać 8 ml buforu nakładkowego.
    3. Odwirować próbkę w wirówce szybkoobrotowej przy 30 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    4. Przenieść górną warstwę zawierającą LD do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.
    5. W przypadku mycia LD należy postępować zgodnie z instrukcjami podanymi w punkcie 1.4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy izolację LD za pomocą zestawu ER na około 30 myszach i porównaliśmy wyniki z tymi, które zastosowano zgodnie z protokołem izolacji sacharozy na około 40 myszach. Przedstawione wyniki są typowe dla obu protokołów. Myszy poszczono przez noc ze swobodnym dostępem do wody, aby zwiększyć wydajność LD. Izolację LD z wykorzystaniem gradientu sacharozy prowadzono równolegle z protokołem izolacji LD zestawu ER. Próbki PNS, PMS, PER, CLD i LD zostały pobrane w całym protokole izol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologia LD wątroby jest coraz częściej uznawana za krytyczny regulator fizjologii komórek wątrobowych zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Jako organelle działające w dobrej wierze, LD są dynamiczne, wchodzą w interakcje z innymi strukturami komórkowymi i zawierają w nich bioaktywne składniki biorące udział zarówno w homeostazie lipidów, jak i glukozy. Gradient sacharozy jest rutynowo stosowany do izolacji LD i umożliwia badaczom badanie struktury LD, ale wymaga od nich wykonania wielu. Wykazaliśmy, że zastosowanie dostęp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Carr otrzymuje wsparcie badawcze od Intercept Pharmaceuticals.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Instytutowi Badań nad Rakiem Rodziny Abramsonów. Prace te są wspierane przez następujące granty: NIH/NIAAA R01 AA026302-01, NIH/NIAAA K08-AA021424, Robert Wood Johnson Foundation, Harold Amos Medical Faculty Development Award, 7158, IDOM DRC Pilot Award P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/NIAAA F32-AA024347 (J.C.). Prace te były częściowo wspierane przez NIH P30-DK050306 i jego główne urządzenia (Molecular Pathology and Imaging Core, Molecular Biology/Gene Expression Core i Cell Culture Core) oraz pilotażowy program grantów. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mieszalnik wirowy BioExpressGeneMateS-3200-1Wirówka mieszająca Vortex
54242 REppendorf54242 RMikrowirówka z chłodzeniem przeciwprądowym
Wirnik: FA-45-24-11
Wirówka Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6+Wirówka szybkoobrotowa z chłodzeniem
Wirnik: Wirówka F21S-8x50Y
Sorvall Legend RT+Thermo ScientificLegend RT+Chłodzona wirówka o dużej pojemności
Wirnik: 75006445 Wiadro: 75006441
cOmplete Koktajl inhibitorów proteazySigma Aldrich04 693 116 001Tabletki inhibitora proteazy
Diagenode Bioruptur UCD-200SystemSonicationUCD-200
Młynek do tkanek (45 ml)Wheaton357546Użyj luźnego tłuczka
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (1x)Corning21-031-CM
Zestaw do izolacji retikulum endoplazmatycznegoSigma AldrichER0100do zestawu ER Ekstrakcja:
Zawiera:
Bufor do ekstrakcji izotonicznej 5X 100 mL
Bufor do ekstrakcji hipotonicznej 10 ml
Chlorek wapnia, roztwór 2,5 M 5 ml
OptiPrep Gradient Medium 100 mL
Igła z noskiem 1 szt.
Zewnętrzne źródło światła do wzbudzenia fluorescencyjnegoLeicaLeica EL6000
Kwas solnySigma AldrichH1758Kwas solny
ImageJOprogramowanie do analizy obrazu
Odwrócony modulowany mikroskop kontrastowyLeicaDM IRB
Zestaw do wzbogacania lizosomów do tkanek i hodowanych komórekThermo Fisher Scientific89839Do kamery mikroskopu do izolacji lizosomów
QimagingQICAM fast 1394
Optima XL-100K UltrawirówkaBeckman-CoulterXL-100KUltrawirówka
Wirnik: SW41Ti
Pipety PasteuraFisher Scientific22-042817
Szalka Petriego 5 cmFisher ScientificFB0875713A
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001Tabletki hamujące fosfatazę
Sterylne ostrze chirurgiczne #10PioneerS2646
SacharozaFisher ScientificS5-500Krystaliczny/certyfikowany
zestaw do triglicerydów ACS LiquicolorStanbio 2200-225Zestaw triglicerydów kolorymetrycznych
Tris BaseFisher ScientificBP152-1Do buforu TE
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-1005%, Eter p-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)-fenylowy glikolu polietylenowego, Odczynnik do lizy białek
UltraPure EDTA (0,5 M, pH 8,0)Thermo Fisher Scientific15575-038Do buforu TE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. Isolation of Lipid Droplets from Cells by Density Gradient Centrifugation. Current Protocols in Cell Biology. 72, (2016).
  2. Ding, Y., et al. Isolating lipid droplets from multiple species. Nature Protocols. 8 (1), 43-51 (2013).
  3. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 49(2015).
  4. Correnti, J. M., et al. Ethanol and C2 ceramide activate fatty acid oxidation in human hepatoma cells. Scientific Reports. 8 (1), 12923(2018).
  5. Williams, B., et al. A novel role for ceramide synthase 6 in mouse and human alcoholic steatosis. FASEB Journal. 32 (1), 130-142 (2018).
  6. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  7. Carr, R. M., et al. Perilipin Staining Distinguishes Between Steatosis and Nonalcoholic. Steatohepatitis in Adults and Children. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 15 (1), 145-147 (2017).
  8. Carr, R. M., et al. Reduction of TIP47 improves hepatic steatosis and glucose homeostasis in mice. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (8), R996-R1003 (2012).
  9. Carr, R. M., Peralta, G., Yin, X., Ahima, R. S. Absence of perilipin 2 prevents hepatic steatosis, glucose intolerance and ceramide accumulation in alcohol-fed mice. PLoS One. 9 (5), e97118(2014).
  10. Tsai, T. H., et al. The constitutive lipid droplet protein PLIN2 regulates autophagy in liver. Autophagy. 13 (7), 1130-1144 (2017).
  11. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (Pt 6), 749-752 (2009).
  12. Liu, K., Czaja, M. J. Regulation of lipid stores and metabolism by lipophagy. Cell Death and Differentiation. 20 (1), 3-11 (2013).
  13. Mannik, J., Meyers, A., Dalhaimer, P. Isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas. Journal of Visualized Experiments. (86), e509814(2014).
  14. Sato, S., et al. Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein. Journal of Biochemistry. 139 (5), 921-930 (2006).
  15. Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R. 3rd, McManaman, J. L. Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells. Electrophoresis. 21 (16), 3470-3482 (2000).
  16. Zhang, S., et al. Morphologically and Functionally Distinct Lipid Droplet Subpopulations. Scientific Reports. 6, 29539(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Lipid Droplet IsolationEndoplasmic Reticulum IsolationLysosome IsolationOrganelle Isolation KitLiver Tissue PreparationDifferential CentrifugationUltracentrifugation ProtocolLipid Droplet Purity AnalysisPLIN2 Marker DetectionSEC61A Protein Assay

Powiązane artykuły