Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59293

⸱

3 maja 2019

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Organoidy powstałe z mysich gruczołów sutkowych zostały napromieniowane i scharakteryzowane w celu oceny cech nabłonka i interakcji z komórkami odpornościowymi. Napromieniowane organoidy można wykorzystać do lepszej oceny interakcji komórka-komórka, które mogą prowadzić do rekrutacji komórek nowotworowych w napromieniowanej normalnej tkance.

Streszczenie

Organoidy pochodzące z trawionej tkanki to wielokomórkowe trójwymiarowe (3D) konstrukty, które lepiej odwzorowują warunki in vivo niż monowarstwy komórek. Chociaż nie są one w stanie w pełni odwzorować złożoności in vivo, zachowują pewną funkcjonalność oryginalnego narządu. W modelach nowotworowych organoidy są powszechnie stosowane do badania inwazji komórek nowotworowych. Protokół ten ma na celu opracowanie i scharakteryzowanie organoidów z prawidłowej i napromieniowanej tkanki gruczołu sutkowego myszy w celu oceny odpowiedzi na promieniowanie w normalnych tkankach. Organoidy te mogą być stosowane w przyszłych badaniach nad rakiem in vitro w celu oceny interakcji komórek nowotworowych z napromieniowanymi organoidami. Gruczoły sutkowe wycięto, napromieniowano do 20 Gy i strawiono w roztworze kolagenazy VIII. Organoidy nabłonkowe oddzielono poprzez różnicowanie odśrodkowe, a organoidy 3D opracowano w 96-dołkowych mikropłytkach o niskiej adhezji. Organoidy wyrażały charakterystyczny marker nabłonkowy cytokeratynę 14. Interakcję makrofagów z organoidami zaobserwowano w eksperymentach z udziałem współkultur. Model ten może być przydatny do badania interakcji guz-zręb, infiltracji komórek odpornościowych i polaryzacji makrofagów w napromieniowanym mikrośrodowisku.

Wprowadzenie

Około 60% pacjentek z potrójnie ujemnym rakiem piersi (TNBC) wybiera terapię oszczędzającą pierś (BCT) jako formę leczenia1. W tej metodzie leczenia guz zawierający część tkanki piersi jest usuwany, a otaczająca normalna tkanka jest wystawiana na działanie promieniowania jonizującego w celu zabicia wszelkich pozostałych komórek nowotworowych. Leczenie zmniejsza nawroty u większości populacji chorych na raka piersi; jednak około 13,5% leczonych pacjentów z TNBC doświadcza nawrotów lokoregionalnych2. Dlatego badanie, w jaki sposób promieniowanie może rekrutować krążące komórki nowotworowe (CTC), doprowadzi do ważnych informacji na temat nawrotu miejscowego3,4.

Poprzednie prace wykazały, że promieniowanie normalnej tkanki zwiększa rekrutację różnych typów komórek5. W przedklinicznych modelach TNBC napromienianie prawidłowych tkanek zwiększyło makrofagi, a następnie rekrutację komórek nowotworowych do normalnych tkanek5. Status immunologiczny wpłynął na rekrutację komórek nowotworowych do miejsc napromieniowanych, przy czym migrację komórek nowotworowych obserwowano u osób z obniżoną odpornością. Rekapitulacja tych interakcji przy użyciu organoidów pochodzących z gruczołów sutkowych pozwoli na obserwację migracji komórek i interakcji komórka-zręb w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii i obrazowania żywych komórek w celu określenia roli uszkodzeń popromiennych w zmianie zachowania komórek nowotworowych.

Organoidy sutkowe myszy pomogły wyjaśnić kluczowe etapy rozwoju gruczołu sutkowego. Organoid sutkowy to wielokomórkowy, trójwymiarowy konstrukt izolowanego nabłonka sutka o wielkości większej niż 50 μm6,7,8,9,10. Korzystając z pierwotnych organoidów nabłonkowych, Simian i wsp. ocenili czynniki niezbędne do rozgałęzienia gruczołu sutkowego7. Shamir i in. odkryli, że rozprzestrzenianie się może odbywać się bez przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego, co zapewnia wgląd w kaskadę przerzutów8. Metody generowania i charakteryzowania organoidów z tkanki gruczołu sutkowego są dobrze znane6,11,12,13. Jednakże, zgodnie z naszą wiedzą, metody hodowli napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych nie zostały zgłoszone. Protokół hodowli i charakterystyki napromieniowanych organoidów byłby kluczowym krokiem w rekapitulacji indukowanej promieniowaniem rekrutacji komórek immunologicznych i nowotworowych.

W tym artykule opisujemy metodę hodowli i charakteryzowania napromieniowanych organoidów nabłonka sutka w mikropłytkach o niskiej adhezji pokrytych hydrofilowym polimerem, który wspomaga tworzenie sferoid. Organoidy te hodowano wspólnie z makrofagami w celu zbadania kinetyki infiltracji komórek odpornościowych. Prace te można rozszerzyć o współhodowlę organoidów z komórkami tłuszczowymi w celu podsumowania cech sutka, komórek raka piersi w celu wizualizacji rekrutacji komórek nowotworowych oraz limfocytów T CD8 + w celu zbadania interakcji komórek nowotworowych z układem odpornościowym. Do oceny napromieniowanych organoidów można wykorzystać wcześniej ustalone protokoły. Wcześniejsze modele kohodowli organoidów sutka i komórek odpornościowych rzuciły światło na mechanizmy przerzutów i rozprzestrzeniania się. DeNardo i wsp. odkryli, że regulacja limfocytów T CD4 + makrofagów związanych z nowotworem wzmacniała fenotyp przerzutowy gruczolakoraka sutka14. Modele kokultur wykorzystano również do wyjaśnienia mechanizmów rozwoju biologicznego. Plaks i wsp. wyjaśnili rolę limfocytów T CD4 + jako regulatorów w dół organogenezy sutka15. Jednak nasza grupa jest pierwszą, która opracowała procedurę wizualizacji, w jaki sposób normalne napromienianie tkanek wpływa na zachowanie komórek odpornościowych. Ponieważ wykazano, że normalne napromienianie tkanek zwiększa rekrutację komórek nowotworowych5, protokół ten może być dalej rozwijany w celu analizy, w jaki sposób zachowanie komórek nowotworowych jest zmieniane przez napromienianie normalnych tkanek i komórek, co prowadzi do lepszego zrozumienia nawrotu raka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi oraz protokołami zatwierdzonymi przez Vanderbilt University Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie myszy i pozyskanie komórek (na podstawie Nguyen-Ngoc i wsp.11)

  1. Uśmierć myszy atymiczne Nu/Nu (w wieku 8-10 tygodni) poprzez uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie kręgów szyjnych. Oczyść skórę za pomocą 70% etanolu.
  2. Wycinaj gruczoły mlekowe brzuszne i pachwinowe z myszy, używając wysterylizowanych wcześniej nożyczek i pęsety. Usuń węzły chłonne przed resekcją. Przepłucz w sterylnym 1x roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (Rycina 1A).
  3. Umieść tkankę w probówkach 15 mL z 10 mL pożywki DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Media/Nutrient Mixture F12) do transportu. Próbki można przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C lub przetworzyć natychmiast. Przechowuj w lodzie.
  4. Naświetl próbki dawką 20 Gy przy użyciu źródła cezu (Rycina 1B).
  5. 45 min po naświetlaniu umieść gruczoły mlekowe w sterylnej płytce hodowlanej 35 mm i rozdrobnij skalpelami (Rycina 1C,D). Rozdrabniaj, wykonując około 40 cięć, aż tkanka zmięknie, a uzyskane fragmenty nie będą większe niż około 1 mm2 powierzchni.
  6. Przenieś materiał do roztworu kolagenazy w probówce wirówkowej 50 mL. Roztwór kolagenazy składa się z 2 mg/mL kolagenazy (patrz Tabela materiałów), 2 mg/mL trypsyny, 5% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 μg/mL insuliny oraz 50 μg/mL gentamycyny w pożywce DMEM/F12. Użyj 10 mL roztworu kolagenazy na jedną mysz.
  7. Umieść w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C, mieszając na wirówce typu vortex co 10 min przez 30-60 min. Trawienie jest zakończone, gdy roztwór kolagenazy stanie się mętny (Rycina 1E,F).
  8. Odwiruj strawiony roztwór z prędkością 450 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Zaobserwowane zostaną trzy warstwy. Nadosad jest złożony z tłuszczu, warstwa środkowa to roztwór wodny, a na spodzie znajduje się osad. Osad będzie miał czerwony kolor, ponieważ jest mieszaniną komórek nabłonkowych, pojedynczych komórek zrębu i erytrocytów (Rycina 1G).
  9. Przed kontaktem z próbkami pokryj wszystkie pipety, końcówki do pipet i probówki wirówkowe roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Roztwór BSA składa się z 2,5 w/v % BSA w buforowanym roztworze soli fosforanowej Dulbecco (DPBS). Aby pokryć powierzchnię, po prostu dodaj, a następnie usuń roztwór BSA z wnętrza końcówki pipety i probówek. Roztwór BSA można wykorzystać ponownie, choć przed każdym eksperymentem powinien zostać przefiltrowany sterylnie.
  10. W celu dodatkowego odzyskania komórek przenieś nadosad do nowej probówki 15 mL pokrytej BSA. Energicznie pipetuj w górę i w dół, aby rozproszyć warstwę tłuszczu. Wiruj z prędkością 450 x g przez 10 min w RT. Odessaj nadosad, pozostawiając w probówce niewielką ilość pożywki, aby uniknąć odessania osadu komórkowego.
  11. Odessaj warstwę wodną z probówki zawierającej oryginalny osad.
  12. Dodaj 10 mL DMEM/F12 do probówki z oryginalnym osadem i przenieś zawartość do drugiej probówki. Energicznie pipetuj, aby połączyć i resuspender oba osady.
  13. Wiruj z prędkością 450 x g przez 10 min w RT. Odessaj nadosad i dodaj do probówki 4 mL DMEM/F12.
  14. Dodaj 40 μL doksyrybonukleazy (DNase) do zawiesiny i delikatnie wstrząsaj ręcznie przez 2-5 min w RT. Roztwór DNase składa się z 4 U/mL DNase w DMEM/F12.
  15. Dodaj 6 mL DMEM/F12 i dokładnie wymieszaj pipetą. Wiruj probówkę z prędkością 450 x g przez 10 min w RT.
  16. Odessaj nadosad do poziomu 0,5 mL. Resuspender w 10 mL DMEM/F12 i dokładnie wymieszaj pipetą.
  17. Przyspiesz wirowanie do 450 x g i zatrzymaj 4 s po osiągnięciu tej prędkości.
  18. Powtórz kroki 1.16-1.17 jeszcze trzy razy, aby oczyścić organoidy poprzez różnicowanie odwirowywanie. Osad powinien mieć teraz kolor złamanej bieli i składać się wyłącznie z organoidów nabłonkowych (Rycina 1H).
    UWAGA: Organoidy można również filtrować za pomocą sterylnych filtrów siatkowych 40 μm. Po kroku 1.16 przepuść pipetą pożywkę zawierającą organoidy przez filtr do probówki wirówkowej, a następnie przepłucz 5 do 10 mL pożywki DMEM/F12. Odwróć filtr nad nową probówką wirówkową 50 mL. Przepuść 10 mL pożywki DMEM/F12 w przeciwnym kierunku, aby wypłukać retentat. Retentat powinien składać się z organoidów, a filtrat głównie z komórek zrębu, które można odrzucić lub zachować, jeśli jest to pożądane.

2. Oznaczanie gęstości i wysiewanie organoidów

  1. Resuspend pellet w 10 mL DMEM/F12. Pipetuj dokładnie, aby uzyskać jednorodny roztwór.
  2. Przenieś 50 µL do szalki Petriego o średnicy 30 mm i obejrzyj pod mikroskopem fazokontrastowym przy powiększeniu 20x. Policz liczbę organoidów za pomocą licznika mechanicznego.
    UWAGA: W tym etapie konsekwentnie używano końcówek do pipet o minimalnej średnicy 457 μm, co stanowi 5-10 razy średnicę wysiewanych organoidów. Do przenoszenia objętości 2 mL lub większych (np. kroki 1.16 i 2.1) należy używać pipet serologicznych o średnicy końcówki powyżej 1 500 μm.
  3. Oblicz gęstość organoidów, korzystając z następującego równania:
    Równanie służące do obliczenia stężenia organoidów w probówce, przedstawione w formie diagramu stosunku formuł.
    Pożądana gęstość to 1 000 organoidów/mL, aby uprościć dalsze rozcieńczanie. Jeśli gęstość jest zbyt niska, wiruj przy 450 x g przez 5 min i odessaj medium. Dodaj ilość medium niezbędną do osiągnięcia 1 000 organoidów/mL i pipetuj dokładnie, aby uzyskać jednorodną mieszaninę.
    1. Aby hodować organoidy w macierzy białkowej, wysiej organoidy w stężeniu 1 organoid/μL w kolagenie typu 1 rozcieńczonym do 87% lub w błonie podstawnej wyekstrahowanej z mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm. Podczas pracy z próbkami utrzymuj je w lodzie.
    2. Aby zamrozić organoidy, przenieś pożądaną objętość do oddzielnej probówki wirówkowej. Wirować przy 450 x g przez 5 min. Odessać medium, a następnie dodać taką samą objętość 90% FBS/10% DMSO. Resuspenduj organoidy, a następnie rozdziel je do krioprobówek. Przenieś do -80 ˚C, a w ciągu tygodnia do ciekłego azotu.
    3. Aby rozmrozić, ogrzewaj w łaźni wodnej w temperaturze 37 ˚C przez jedną minutę. Wiruj przy 450 x g przez 5 min, a następnie odessać medium do mrożenia. Przepłucz sterylnym DPBS, a następnie ponownie wiruj. Odessać DPBS i dodać medium do organoidów.
  4. Pipetuj 50 µL (50 organoidów) do każdego dołka płytki niskoprzylepnej (Rysunek 1I).
  5. Dodaj 150 µL medium do organoidów, aby całkowita objętość robocza wyniosła 200 µL. Medium do organoidów składa się z 1% penicyliny-streptomycyny i 1% insuliny-transferyny-selenu (ITS) w medium DMEM/F12.
  6. Co 2 dni ostrożnie wymieniaj medium.
    UWAGA: Płytki niskoprzylepne nie są modyfikowane do hodowli tkanek; w związku z tym komórki mogą zostać łatwo oderwane. Odsysaj medium powoli, przechylając płytkę i wkładając końcówkę pipety przy krawędzi każdego dołka. Pozostaw niewielką ilość medium na dnie dołka. Dodawaj nowe medium powoli, aby uniknąć wywierania niepotrzebnych sił ścinających na organoidy.

3. Kokultywacja z makrofagami

  1. Hodować makrofagi RAW 264.7 znakowane GFP lub dTomato w pożywce DMEM uzupełnionej o 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny. Wysiać 1 x 104, 5 x 104 lub 1 x 105 komórek/mL do pożywki dla organoidów.
  2. Wykorzystać obrazowanie fluorescencyjne oraz mikroskopię fazowo-kontrastową żywych komórek do monitorowania infiltracji makrofagów w czasie.

4. Barwienie immunofluorescencyjne organoidów

UWAGA: Organoidy można barwić w dołkach o niskiej adhezji lub przenieść na szkiełka z komorą. Aby przenieść organoidy, należy delikatnie pipetować ciecz w górę i w dół, aż organoidy odłączą się od płytek. Następnie przenieść je na szkiełka z komorą i inkubować przez 4-8 h, aby umożliwić adhezję organoidów do powierzchni płytki.

  1. Usunąć pożywkę do organoidów z dołków poprzez ostrożne odessanie. Utrwalić próbki w 10% neutralnie buforowanej formalinie przez 15 min w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Przemyć 3x przez 5 min w 1x PBS. W razie potrzeby utrwalone próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień do dalszego barwienia.
  3. Przeprowadzić permeabilizację za pomocą 0,1% 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) phenyl-polyethylene glycol przez 5 min.
    UWAGA: Aby zabarwić F-aktynę, inkubować próbki z faloidyną w rozcieńczeniu 1:1 000 oraz barwnikiem jądrowym bisbenzimidem w stężeniu 1,67 nM w 1% PBS/BSA przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Następnie przejść do kroku 4.8.
  4. Przemyć 0,5PBS. Próbki można przechowywać w temperaturze 4°C obrazami kopii i obrazami immunofluorescencyjnymi. mechanizmy przyczyniające się do blokady CTC z 5% normalną surowicą kozią w 0,1% PBS/Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (PBST) przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Przemyć 3x przez 5 min w PBS.
  5. Inkubować z przeciwciałem Anti-Cytokeratin 14 w rozcieńczeniu 1:1 000, E-Cadherin w rozcieńczeniu 1:200 lub Tight Junction Protein One w rozcieńczeniu 1:100 w 1% NGS w PBST przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Przemyć 3x przez 5 min w PBST.
  6. Inkubować z przeciwciałem wtórnym Goat Anti-Rabbit w rozcieńczeniu 1:200 w 1% NGS/PBST przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Przykryć folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło.
  7. Przemyć 3x przez 5 min w PBS. Użyć barwnika jądrowego (patrz Tabela materiałów) do zabarwienia jąder.
  8. Przemyć 3x przez 5 min w PBS. W przypadku użycia szkiełka z komorą, zamontować z szkiełkiem nakrywnym. Przechowywać owinięte w folię w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Napromieniowane organoidy nabłonka gruczołów mlekowych zostały pomyślnie uzyskane z gruczołów mlekowych myszy, przetworzone i hodowane na płytkach o niskim stopniu adhezji (Rysunek 1). Wydajność organoidów przetestowano poprzez wysiew w różnych środowiskach wzrostu (Rysunek 2A-G). Bezpośredni wysiew komórek na 10 cm płytki hodowlane traktowane do hodowli tkanek doprowadził do przerostu komórek fibroblastów. Fibroblasty zidentyfikowano pod mikroskopem fazokontrastowym w tej s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole opracowaliśmy metodę powtarzalnego wzrostu i charakterystyki napromieniowanych organoidów sutka (ryc. 1). Dawkę napromieniowania 20 Gy zastosowano w celu odzwierciedlenia wcześniejszych modeli rekrutacji komórek nowotworowych in vivo5. Napromienianie gruczołów sutkowych ex vivo przed powstaniem organoidów pozwoliło na wyizolowanie skutków uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem bez odpowiedniej infiltracji komórek odpornościowych. Opracowanie napromien...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Laurze L. Bronsart za dostarczenie makrofagów RAW 264.7 znakowanych GFP i dTomato. Badania te były wspierane finansowo przez #R00CA201304 grantu NIH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% neutralna buforowana formalinaVWR16004-128
Anty-cytokeratyna 14abcamab181595Partia: GR3200524-3
Albumina surowicy bydlęcejSigmaA1933-25G
Kolagen typu ICorning354236
Kolagenaza z Clostridium Histolyticum, typ VIIISigmaC2139
Kolagenaza IGibco17018029
DMEM/F12Thermofisher11320-033
DNAzy10104159001
DPBS14190250
Sygnalizacja komórkowaE-kadheryny24E10Partia: 13
FBSSigmaF0926
GentamycynaGibco15750
Koza anty-królik wtórnyabcamab150077zielony
Partia: GR3203000-1
Kozia anty-królik wtórnyabcamab150080czerwony
Partia: GR3192711-1
Hoechst 33342Fisher62249Partia: TG2611041
Insulina (10 mg / mL)SigmaI9278
Insulina-Transferyna-Selen, 100xGibco51500-056
Membrana podstawna Matrigel (błona podstawna ekstrahowana z mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm)Corning356237
Normalna surowica koziaVector LaboratoriesS-1000
Nuclon Sphera 96-dołkowe płytkiThermo174927
PBSVWR10128-856
Długopis/paciorkowiecFisher
Phalloidinabcamab176757Partia: GR3214582-16
Białko ścisłego połączenia 1NovusNBP1-85047Partia: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)glikol fenylopolietylenowy)SigmaX100-100ML
TrypsynaGibco27250-018
Tween-20 (monolaurynian glikolu polietylenowego)SigmaP1379-100ML
Roche Fisher 15140122

Bibliografia

  1. Lautner, M., et al. Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer. Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).
  2. Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).
  3. Kim, M. Y., et al. Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  4. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  5. Rafat, M., et al. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).
  6. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  7. Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells. Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).
  8. Shamir, E. R., et al. Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin. Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).
  9. Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis. Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).
  10. Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).
  11. Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. 3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion. Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).
  12. Ewald, A. J. Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).
  13. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews. , (2018).
  14. DeNardo, D. G., et al. CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages. Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).
  15. Plaks, V., et al. Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis. Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).
  16. Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum. The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).
  17. Mandl, I., Zaffuto, S. F. Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase. The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).
  18. Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum. Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).
  19. Zhang, L., et al. Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells. Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).
  20. Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).
  21. Richert, M. M., et al. An atlas of mouse mammary gland development. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).
  22. Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).
  23. LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  24. Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution. Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).
  25. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).
  26. Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium. Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).
  27. Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from: http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract (1989).
  28. Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. Understanding Adipocyte Differentiation. Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).
  29. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  30. Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).
  31. Ewald, A. J. Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).
  32. Zhang, M., et al. A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients. Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).
  33. Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time. BioMed Central Cancer. 10, 112(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organoidy gruczo u piersiowegotkanka napromieniowanar nicowanie od rodkowep ytki o niskiej adhezjimikroskopia konfokalnacytokeratyna 14interakcja z makrofagamitrawienie kolagenazmarker nab onkowyzr b nowotworu
Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.