Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Streszczenie

Kompleksy maszynerii fosforylacji oksydacyjnej tworzą supramolekularne układy białkowe zwane superkompleksami (SC), które, jak się uważa, nadają mitochondriom strukturalne i funkcjonalne korzyści. SC zostały zidentyfikowane u wielu gatunków, od drożdży po ssaki, a coraz więcej badań donosi o zakłóceniu ich organizacji w chorobach genetycznych i nabytych u ludzi. W związku z tym coraz więcej laboratoriów jest zainteresowanych analizą SC, co może być wyzwaniem metodologicznym. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół, który łączy zalety metod PAGE Blue- i Clear-Native w celu rozwiązywania i analizowania SC w sposób efektywny czasowo. Dzięki tej hybrydowej metodzie CN/BN-PAGE mitochondrialne SC ekstrahowane optymalnymi ilościami łagodnego detergentu digitoniny są na krótko wystawiane na działanie anionowego barwnika Coomassie Blue (CB) na początku elektroforezy, bez narażenia na działanie innych detergentów. Ta krótka ekspozycja na CB pozwala na separację i rozwiązanie SC tak skutecznie, jak w przypadku tradycyjnych metod BN-PAGE, przy jednoczesnym uniknięciu negatywnego wpływu wysokich poziomów CB na testy aktywności w żelu i labilnych interakcji białko-białko w SC. Dzięki temu protokołowi możliwe jest połączenie precyzyjnych i szybkich pomiarów aktywności żelu z technikami analitycznymi obejmującymi elektroforezę 2D, detekcję immunologiczną i/lub proteomikę w celu zaawansowanej analizy SC.

Wprowadzenie

Mitochondria wytwarzają energię poprzez fosforylację oksydacyjną, gdzie kompleksy oddechowe I-II-III-IV utleniają substraty i przenoszą elektrony do tlenu, generując gradient, który umożliwia fosforylację ADP przez syntazę ATP (CV). W ostatnich latach szeroko zakrojone badania wykazały, że kompleksy łańcuchów oddechowych są nie tylko włączone w sposób liniowy do wewnętrznej błony mitochondrialnej, ale są również zorganizowane w układy superkompleksów (SCs)^1,2. W mitochondriach ssaków SC występują w różnych stechiometriach: CI/CIII₂/CIV_1-4 (który jest nazywany respirasomem i który jest zdolny do oksydoredukcji NADH:O₂ in vitro)², CI/CIII₂ i CIII₂/CIV_1-2 ^3,4. Ponadto kompleksy oddechowe są rozmieszczone w różnych proporcjach między ich formą wolną a układem SC. Dlatego szacuje się, że 85%–100% CI, 55%–65% CIII i 15%–25% CIV znajduje się w SCs⁴. Uważa się, że te supramolekularne struktury zmniejszają produkcję ROS, stabilizują lub pomagają w składaniu poszczególnych kompleksów, regulują aktywność łańcucha oddechowego i zapobiegają agregacji białek w bogatej w białko wewnętrznej błonie mitochondrialnej^5,6,7,8. Ich zdolność do przebudowy w zależności od zmian zapotrzebowania na energię oraz ich znaczenie w patogenezie chorób są badane w kilku laboratoriach^3,7,9^{,10,11,12,13,14}. Badania wykazały, że patologiczne zmiany w składaniu SCs są obecne w różnych zaburzeniach, w tym między innymi w genetycznym defektywstwie syntezy kardiolipiny¹⁵, niewydolność serca¹⁶, niedokrwienie-reperfuzja¹⁷, diabetes¹² i aging¹⁸.

Natywna elektroforeza i immunodetekcja są szeroko stosowane w badaniach SCs w celu rozwiązania czwartorzędowych układów kompleksów OXPHOS2^,19,20,21. Natywna elektroforeza może być dodatkowo połączona ze specyficznymi testami aktywności żelu lub 2D-SDS PAGE, aby umożliwić precyzyjne określenie molekularne różnych zespołów SCs^1,19. Możliwość badania SC jest krytycznie zależna od warunków ekstrakcji, w tym rodzaju i stężenia użytego detergentu, siły jonowej i pH, a także od warunków migracji elektroforetycznej, które obejmują skład buforu, obecność CB, wielkość żelu i procentową zawartość akryloamidu².

Protokoły i rozdzielczość pasm SC różnią się znacznie między artykułami, co utrudnia porównywanie badań i adaptację metod utrudnia²². W związku z tym w niniejszym artykule zaproponowano solidny i optymalny protokół ekstrakcji SC z izolowanych mitochondriów z różnych źródeł za pomocą niejonowego detergentu digitoniny oraz rozdzielczości pasm SC o dużej masie cząsteczkowej. Zoptymalizowane stężenie detergentu, skład buforu ekstrakcyjnego i brak Coomassie Blue w przygotowaniu próbki minimalizują zakłócenia kompleksów białkowych. Protokół ten (patrz Rysunek 1 dla przeglądu) łączy CN-PAGE i BN-PAGE w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości zespołów SCs na dużym żelu i jest kompatybilny z testami aktywności w żelu, co pozwala na lepszą wizualizację pasm reaktywnych, wraz z zastosowaniem immunodetekcji do szczegółowej analizy układów i składu SC.

Protokół

1. Ekstrakcja SC

1. Przygotować 100 ml buforu ekstrakcyjnego (patrz Tabela 2) rozpuszczając EDTA w wodzie. Zwiększ pH za pomocą KOH aż do całkowitego rozpuszczenia, a następnie dostosuj pH do 7,5 za pomocą HCl. Dodaj pozostałe składniki do roztworu, uzupełnij do końcowej objętości wodą i trzymaj na lodzie. W probówce rozpuść digitoninę w buforze ekstrakcyjnym, aby uzyskać 10% roztwór podstawowy, dokładnie zmieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia i trzymaj na lodzie.
   UWAGA: Bufor ekstrakcyjny można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 2 miesiące. Jeśli na dnie żelu zaczną pojawiać się faliste pasma, oznacza to, że bufor ekstrakcyjny jest zbyt stary. Przygotowując 10% roztwór digitoniny, należy przygotować objętość wywaru liczącą 500 μl na próbkę, jeśli używasz mitochondriów wątroby myszy. Rozpuszczalność digitoniny różni się w zależności od pochodzenia i partii produktu (patrz tabela materiałów).
2. Mitochondria wyizolowane z tkanek zwierzęcych (mysie serce, mięśnie, wątroba; serce szczura) lub komórek (ludzkie fibroblasty) przy użyciu standardowych protokołów^23,24,25 mogą być używane do ekstrakcji SCs. Po uzyskaniu mitochondriów należy określić ilościowo zawartość białka za pomocą zestawu do oznaczania kwasu bicinchoninowego zgodnie z zaleceniami producenta. W razie potrzeby uzupełnij izolowane mitochondria w proteazy i inhibitory fosfataz na tym etapie.
   UWAGA: SC mogą być ekstrahowane zarówno na świeżych, jak i rozmrożonych mitochondriach. Zaleca się ekstrakcję SC ze wszystkich próbek w tym samym czasie, aby upewnić się, że są one traktowane tymi samymi partiami roztworów i w tych samych warunkach.
3. Na podstawie uzyskanego stężenia białka mitochondrialnego i pożądanego ostatecznego stosunku digitoniny do białka, należy obliczyć wymaganą objętość podstawowego roztworu digitoniny i buforu ekstrakcyjnego zgodnie z tabelą 1. W przypadku ekstrakcji SC dodać 1 μl buforu ekstrakcyjnego (Tabela 2) zawierającego digitoninę na każde 10 μg białka mitochondrialnego. Stosunek digitoniny do białka może wahać się od 2 do 8 g/g. Miareczkowanie digitoniny powinno być zawsze wykonywane dla każdego nowego rodzaju użytej próbki (patrz rysunek 2 dla przykładu).
4. Mitochondria osadu w probówce o pojemności 1,5 ml przez odwirowanie przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić mitochondrialny osad w obliczonej objętości lodowatego buforu ekstrakcyjnego zawierającego digitoninę. Umieścić probówki na mini rotatorze probówek i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C przy średniej prędkości obrotowej. Upewnij się, że próbki są odpowiednio wymieszane.
6. Odwirować próbki o masie 20 400 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnych fragmentów.
7. Przenieść supernatant do nowej probówki na lód i określić ilościowo białka. Frakcja ta reprezentuje ekstrakt z superkompleksów oddechowych. Jeżeli elektroforeza nie zostanie przeprowadzona tego samego dnia, próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: 1) Unikaj cykli zamrażania/rozmrażania ekstraktu, ponieważ zakłóca to wyższe układy molekularne SC. W razie potrzeby podwielokrotną próbkę należy wykonać przed pierwszym cyklem zamrażania/rozmrażania. 2) Aby przeprowadzić standardowy eksperyment BN-PAGE, na tym etapie należy dodać CB do ekstraktu SCs. CB należy dodawać w proporcji 1g/8g w stosunku do ilości użytego detergentu.

2. Gradientowe odlewanie żelowe i elektroforeza

1. Przygotować 3 razy bufor gradientowy i zapasy akryloamidu do przygotowania żelu gradientowego, podwielokrotność, i przechowywać w temperaturze -20 °C (patrz Tabela 3).
2. Przygotować anodowe i katodowe i utrzymywać je w temperaturze 4 °C (patrz tabela 5).
3. Otwórz komorę odlewu i umieść w niej zewnętrzną szklaną płytkę (20 cm x 22 cm). Ustaw jeden zestaw przekładek (1.5 mm) za pomocą karty wyrównowania, aby upewnić się, że są mocno osadzone z boku i rogów komory. Umieść wewnętrzną szklaną płytkę (20 cm x 20 cm) na podkładkach dystansowych (tworzy to kanapkę z żelem) i połóż plastikowy arkusz rozdzielający na szklanej płycie.
4. Powtarzaj krok 2.3, aż do osiągnięcia żądanej liczby żeli do odlania. W tym protokole odlewane są 4 żele. Stosowany przez nas system komór odlewniczych (patrz Tabela Materiałów) pozwala na odlewanie jednorazowo maksymalnie 10 żeli. Zajmij pozostałą przestrzeń w komorze, dodając najpierw tyle bloków akrylowych, ile potrzeba, a następnie szklane płytki, jeśli to konieczne.
   UWAGA: Montaż musi być szczelnie zamknięty; Pomiędzy kanapkami z żelem w komorze nie powinno być żadnej przestrzeni.
5. Umieść pasek parafilmu w rowku przed mocnym osadzeniem uszczelki w wycięciu uszczelki. Umieść płytkę uszczelniającą na komorze i dokręć wszystkie 6. Postaw komorę odlewniczą.
6. Umieścić gradient formujący na płycie mieszającej z mieszadłem magnetycznym w "lekkiej" komorze mieszania. Podłącz rurkę komory odlewniczej do formownika gradientowego, zabezpiecz rurkę w kasecie pompy perystaltycznej i upewnij się, że zawór odcinający formy gradientowej jest zamknięty.
7. Aby odlać 4 żele, należy przygotować 60 ml 4% i 60 ml 12% roztworów żelu (patrz Tabela 4) w kolbie Erlenmeyera i dokładnie zamieszać do wymieszania. Wlać 60 ml 4% roztworu żelu do "lekkiej" komory mieszania i 60 ml 12% do "ciężkiej" komory zbiornika gradientu. Ustaw prędkość mieszania płytki mieszającej na 350 obr./min. Otwórz kran i włącz pompę przy 35 obr./min.
8. Gdy frakcja lekka jest niższa niż frakcja ciężka, zatrzymaj pompę i otwórz trzpień zaworu między zbiornikami "lekkimi" i "ciężkimi", pozwól, aby objętość frakcji się zrównoważyła i uruchom ponownie pompę.
   UWAGA: Ważne jest, aby żadne pęcherzyki nie dostały się do systemu i nie zostały uwięzione między szklanymi płytkami. Jeśli tak się stanie, cofnij montaż, umyj i ponów nawóz.
9. Gdy żel gradientowy zostanie całkowicie wylany, zatrzymaj pompę i nalej wodę (około 1 ml) na każdą kanapkę z żelem, aby zapobiec wysuszeniu żelu. Pozostaw do polimeryzacji na 2 godziny.
10. Przygotować 25 ml żelu do układania w stos w Erlenmeyer i zamieszać do dokładnego wymieszania. Usuń wodę i włóż 15 grzebieni do każdej kanapki z żelem. Wlać żel do układania w stos i pozostawić do polimeryzacji przez 2 godziny
    UWAGA: Żele można odlewać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
11. Włóż żel do zacisków kanapkowych i wyjmij grzebień. Trzymając krótką szklaną płytkę skierowaną w dół, włóż kanapkę z żelem do rdzenia chłodzącego. Powtórz po drugiej stronie i umieść rdzeń w zbiorniku do elektroforezy.
12. Wlej 300 ml buforu z niebieską katodą do wewnętrznej komory zbiornika do elektroforezy. Wlej 2 litry buforu anodowego do zewnętrznej komory zbiornika do elektroforezy.
    UWAGA: Elektroda musi być zanurzona w buforze katody, co wymaga około 300 ml.
13. Załaduj od 75 μg do 175 μg białka na studzienkę. Uruchomić żel pod napięciem 150 V przez 1,5 godziny (lub do momentu, gdy wszystkie próbki dostaną się do żelu gradientowego) w chłodni (4 °C).
    UWAGA 1: 1) Minimum 75 μg na studzienkę jest wymagane dla dobrej rozdzielczości pasm aktywności w żelu. Obciążenie ponad 175 μg białka doprowadzi do utraty czystych prążków z powodu nadmiernej aktywności enzymów. 2) Powtórzenia próbki należy załadować do oddzielnych studzienek, aby umożliwić równoległe oznaczanie aktywności w żelu i analizę immunoblot kompleksów OXPHOS. Równoległe oznaczanie IGA dla CI, CII, CIV i CV wymaga minimum 300 μg. Równoległa analiza immunoblot CI, CII, CII, CIV i CV wymaga minimum 375 μg.
14. Usuń bufor z niebieską katodą za pomocą pipety lub próżni, zastąp 300 ml buforem katodowym Coomassie Blue-free i uruchom żel pod napięciem 200 V przez noc (16–20 h) w chłodni (4 °C). Przejdź do kroku 3 lub 4, aby zmierzyć aktywność w żelu lub immunoblotting.

3. Aktywność w żelu dla kompleksów I, II, IV i CV

1. Przed zakończeniem elektroforezy należy przygotować aktywności w żelu zgodnie z tabelą 6 i przechowywać w ciemności w temperaturze RT. 20 ml buforu aktywności w żelu wystarcza na 3 pasy próbki.
   UWAGA: Ten test aktywności CV w żelu opiera się na odwrotnej aktywności syntazy ATP (tj. hydrolizie ATP) i wykorzystuje wapń jako kofaktor, który wytrąca się w żelu. Wapń jest mniej szkodliwy niż ołów stosowany w innych protokołach. Ponadto korzystanie z tego protokołu nie wymaga wstępnej aktywacji/kondycjonowania gel²³.
2. Przerwij elektroforezę i odzyskaj żel. W razie potrzeby przetnij pasy i przenieś pasy żelu w plastikowych torbach (przecięte z 3 stron i plastikowa torba otwarta jak książka). Uszczelnij 2 z 3 stron za pomocą zgrzewarki.
   UWAGA: Aby porównać skład prążków SC między grupami eksperymentalnymi, zaleca się przeprowadzenie tych samych próbek w powtórzeniach na tym samym żelu. Przeciąć pasy, aby inkubować każdą kontrpróbę w różnych aktywności w żelu (CI, II, IV, V). Aby potwierdzić specyficzność testów, można przygotować dodatkowe kontrpróby, które będą działać w żelu w obecności określonych inhibitorów łańcucha oddechowego.
3. W przypadku 3 próbek eksperymentalnych (tj. 3 studzienek) dodaj 20 ml buforu aktywności w żelu, usuń pęcherzyki i zamknij^4-tą stronę plastikowej torby.
   UWAGA: Dodać inhibitory w eksperymentach kontroli ujemnej, jeśli są wykonywane: CI: Rotenon 1 μM; CII: Malonian sodu 10 mM; CIII: Antymycyna-A 8 μM; CIV: KCN 0,6 mM; CV: Oligomycyna 0,5 μM.
4. Inkubować paski żelu w temperaturze 37 °C w ciemności i sprawdzać co 15 minut. Czas inkubacji różni się w zależności od ilości białka i kompleksów. CI zareaguje szybciej niż CIV lub CV. Optymalne barwienie następuje zwykle po 2 godzinach dla CI, 4 h dla CIV i 6 h dla CII i CV.
5. Spłucz pasy żelu w wodzie, aby zatrzymać reakcję, i obraz na białym tle dla CI, CII, CIV lub czarnym tle dla CV.
   UWAGA: Żele można przechowywać w plastikowych torebkach w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez kilka miesięcy.

4. Immunoblotting

1. Przygotować bufor transferowy zgodnie z tabelą 7 i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować TBST i przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Umieść cały żel lub wybrane tory w pojemniku i dodaj bufor transferowy uzupełniony SDS (0,25% ostatecznie w buforze transferowym). Umieść pojemnik na bujaku i inkubuj przez 1 godzinę.
3. Przeciąć membranę PVDF (wielkość odpowiadającą wielkości żelu) i aktywować w 20 ml metanolu pod wpływem mieszania przez 2 minuty. Zastąp 20 ml buforu transferowego i poddaj mieszaniu na 2 minuty.
4. Przygotuj kanapkę transferową, od dołu do góry, upewniając się, że nie ma pęcherzyków między żelem a aktywowaną membraną PVDF: przezroczysta strona kasety / gąbka / bibuła / membrana / żel / bibuła / gąbka / strona kasety. Zamknij i zablokuj kasetę.
5. Umieść kanapkę transferową w zbiorniku transferowym, przezroczystą stroną kanapki skierowaną w stronę czerwonej strony elektrody i wlej bufor transferowy, aby zanurzyć żel. Podłączyć układ chłodzenia do zbiornika transferowego i ustawić na 4 °C. Podłączyć do zasilania, ustawić na 40 mA i pracować przez 24 godziny.
6. Pobrać błony, blokować przez 1 godzinę w 5% BSA w TBST i inkubować w roztworze przeciwciał pierwotnych przygotowanym w 5% BSA w TBST przez noc w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Patrz Tabela 8 dla zastosowanych przeciwciał.
7. Płukać membrany w TBST 3x przez 10 min każda.
8. Inkubować błony w drugorzędowych roztworach przeciwciał przygotowanych w 5% BSA w TBST przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
9. Płukać membrany w TBST 3x przez 10 min każda.
10. Dodaj roztwór chemiluminescencyjny do membran i obrazu.

5. Analiza

1. Do analizy SC można wykorzystać obrazy testowe aktywności w żelu lub immunobloty. Aby przeanalizować skład prążków, wyrównaj replikaty i sprawdź, który kompleks zareagował pozytywnie dla każdego danego pasma.
2. Aby przeanalizować rozkład kompleksów w różnych złożeniach supramolekularnych, otwórz obrazy w ImageJ i użyj narzędzia do analizy Gel (patrz Rysunek 5 dla przykładu).
   1. Wybierz pasy ruchu za pomocą narzędzia Prostokąt i wykreśl pasy.
   2. Narysuj linie, aby zamknąć obszar pod krzywą każdego interesującego pasma i kliknij każdy obszar za pomocą narzędzia różdżki, aby wygenerować tabelę zawierającą wartości obszaru pod krzywą.
   3. Aby obliczyć rozkład kompleksu, należy podać wartości dla każdego pasma w stosunku do monomeru.

Wyniki

Rysunek 2 przedstawia wyniki eksperymentu z miareczkowaniem digitoniny, którego celem było określenie właściwej ilości digitoniny potrzebnej do ekstrakcji SC. Ilość ta będzie się różnić w zależności od typu tkanki/komórki i tego, czy próbka została zamrożona, czy nie. W tym eksperymencie przeprowadzono aktywność CIV w żelu w celu wizualizacji SC wyizolowanych ze świeżych mitochondriów wątroby myszy. Badano proporcje od 2/1 do 10/1 g digitoniny/g białka. Optymalna ilość digitoniny dla tej próbki wynosi 4 g/g, ponieważ zapewnia dobrą rozdzielczość monomerycznej CIV i SC o wysokiej masie cząsteczkowej. Przy niższym stosunku prążki nie są przezroczyste i podczas elektroforezy zamieniają się w rozmaz, podczas gdy zastosowanie wyższego stosunku digitoniny prowadzi do zakłócenia SC o dużej masie cząsteczkowej.

Rysunek 3 i Rysunek 4 pokazują wyniki kompletnego eksperymentu przeprowadzonego na preparacie mitochondriów wątroby myszy ekstrahowanych 4 g digitoniny /g białka. Białka rozdzielono za pomocą hybrydy BN/CN-PAGE, standardowej BN-PAGE lub CN-PAGE. Wszystkie trzy żele zostały odlane w tym samym czasie, a pasy zostały załadowane replikami tej samej próbki. Po elektroforezie poszczególne tory zostały wycięte i przetworzone w celu pomiaru aktywności żelu (CI, CII, CIV i CV na Rysunek 3) i immunoblottingu (CI, CII, CIII, CIV, CV na Rysunek 4).

Dodanie CB albo na chwilę w buforze katodowym (np. hybrydowym CN/BN-PAGE), albo w buforze próbki i katody podczas elektroforezy (np. BN-PAGE), znacznie poprawia ruchomość i rozdzielczość pasm SC oraz poszczególnych kompleksów oddechowych w porównaniu do CN-PAGE (Rysunek 3). Pasma są łatwe do odróżnienia za pomocą techniki hybrydowej lub BN-PAGE po aktywności w żelu dla CIV, podczas gdy w tej samej próbce rozdzielonej przez CN-PAGE nie można zidentyfikować SC i monomerycznych prążków reaktywnych CIV.

Rysunek 3 i Rysunek 4 pokazują, że rozdzielczość i wzór pasm monomerów OXPHOS i zespołów supramolekularnych jest jakościowo porównywalny między hybrydami CN/BN-PAGE i BN-PAGE. Istnieją jednak znaczące różnice. Po pierwsze, ruchliwość elektroforetyczna kompleksów OXPHOS jest nieznacznie zmniejszona, gdy białka są rozdzielane przy użyciu hybrydowych warunków CN/BN-PAGE w porównaniu ze standardowym BN-PAGE, ze względu na zmniejszoną ilość CB. Ta zmiana ruchliwości jest większa w przypadku monomerów CIV, a następnie monomerów CV i CI (Rysunek 3 i Rysunek 4). Po drugie, niebieskie tło znajduje się niżej w hybrydowym CN/BN-PAGE w porównaniu do BN-PAGE (Rysunek 3, lewe pasy). W rezultacie, wysokie poziomy tła po BN-PAGE całkowicie maskują barwienie aktywności w żelu dla CII i wzmacniają szum tła związany z aktywnością dimerów CIV (Rysunek 3). Po trzecie, aktywność CV jest wyższa, gdy próbki są badane w hybrydowych warunkach CN/BN-PAGE w porównaniu z BN-PAGE (Rysunek 3), ze względu na zmniejszoną ilość CB, o której wiadomo, że zakłóca aktywność katalityczną CV. ²⁶ CN/BN-PAGE pozwala również na lepsze zachowanie zespołów supramolekularnych CV, o czym świadczy większa proporcja całkowitej aktywności CV związana z dimerami CV (Rysunek 3). Co więcej, oligomery CV są widoczne w warunkach CN/BN-PAGE, podczas gdy są całkowicie zdysocjowane w warunkach BN-PAGE. Co ciekawe, wyraźne pasma wykazujące aktywność CV obserwuje się również między monomerami CV a dimerami, gdy próbki są prowadzone pod CN/BN-PAGE (Rysunek 2).

Rysunek 5 przedstawia reprezentatywną analizę rozkładu kompleksu OXPHOS w zespołach supramolekularnych. Obraz przedstawia CI w aktywności żelu w próbkach uzyskanych z 4 różnych zdrowych preparatów mitochondriów wątroby myszy. Analiza densytometryczna pozwala na pomiar pola pod krzywą pasm CI-reaktywnych oraz przedstawienie względnego rozkładu aktywności C1 w formie monomerycznej (I₁) i supramolekularnej (I₁III₂, I₁III₂IV₁, I₁III₂IV_n). Podobną analizę można przeprowadzić po immunoblot.

Rysunek 1: Przebieg pracy testu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Miareczkowanie digitoniny w celu ekstrakcji superkompleksów ze świeżych mitochondriów wątroby myszy. Ten przykład pokazuje podwielokrotności mitochondriów wątroby myszy, wyizolowanych od jednego zwierzęcia, któremu podawano coraz większe ilości digitoniny w celu ekstrakcji superkompleksów oddechowych. Próbki następnie rozdzielono za pomocą hybrydowego CN/BN PAGE i określono aktywność CIV w żelu. CIV₁: złożone monomery dożylne; CIV₂: Dimery złożone IV; SC: superkompleksy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Aktywność kompleksów OXPHOS w żelu po hybrydowych CN/BN-PAGE, BN-PAGE lub CN-PAGE. Mitochondria wątroby wyizolowane od jednej myszy potraktowano digitoniną (stosunek digotoniny do białka 4 g/g) w celu ekstrakcji superkompleksów oddechowych. Podwielokrotności tej próbki zostały następnie załadowane do wielu studzienek w trzech różnych żelach i przesłane do CN/BN-PAGE, BN-PAGE lub CN-PAGE. Każdy pas kontrpróby w każdym żelu został następnie przecięty i natychmiast wykorzystany do testów aktywności w żelu (oznaczonych jako CI, CII, CIV i CV). Jeden pas został użyty jako kontrola, aby pokazać tło (oznaczone jako BG) zabarwienie Coomassie Blue. Kompleksy OXPHOS i zespoły supramolekularne są identyfikowane przy użyciu standardowej nomenklatury, z liczbami we wskaźnikach wskazującymi stechiometrię molekularną każdego kompleksu OXPHOS. Należy zauważyć, że pozycja zespołów supramolekularnych zawierających CIII opiera się na immunodetekcji, ponieważ w tym konkretnym eksperymencie nie przeprowadzono aktywności w żelu dla CIII. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Analiza immunoblot kompleksów OXPHOS po hybrydowym CN/BN-PAGE lub BN-PAGE. Powtórzenia z eksperymentów opisanych w legendzie Rysunek 3 przeniesiono elektrolitycznie na pojedynczą membranę. Po przeniesieniu poszczególne pasy zostały przecięte i inkubowane ze specyficznymi przeciwciałami rozpoznającymi CI, CII, CIII, CIV i CV. Kompleksy OXPHOS i zespoły supramolekularne są identyfikowane przy użyciu standardowej nomenklatury, z liczbami we wskaźnikach wskazujących stechiometrię molekularną każdego kompleksu OXPHOS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Kwantyfikacja rozkładu CI w zespołach monomerycznych i supramolekularnych. (A) Aktywność CI w żelu określona po hybrydowym CN/BN-PAGE ekstraktów SC z mitochondriów wątroby uzyskanych od 4 myszy. (B) Densytogramy uzyskane za pomocą narzędzia do analizy żelu ImageJ pokazujące wyraźne piki odpowiadające monomerom CI (I₁) i różnym kompleksom supramolekularnym zawierającym CI (I₁III₂, I₁III₂IV₁ i I₁III₂IV_n). (C) ilościowe określenie względnego rozkładu aktywności C1. Dane reprezentują średnią i SEM 4 myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt.

Stosunek digitoniny do białka (g/g)	2 g/g	4 g/g	6 g/g	8 g/g
Objętość buforu ekstrakcyjnego (μL)	400	300	200	100
Objętość 10 % wyjściowej digitoniny (μl)	100	200	300	400
Całkowita objętość buforu ekstrakcyjnego (μl)	500	500	500	500

Tabela 1: Objętości wymagane do ekstrakcji SC z 5 mg białek mitochondrialnych przy użyciu różnych proporcji digitoniny do białka.

związek	Stężenie końcowe
EDTA, pH 7,5	1 mM
HEPESY	30 mM
Octan potasu	150 mM
glicerol	12%
Kwas 6-aminokapronowy	2 mM

Tabela 2: Bufor ekstrakcyjny SC (stężenia końcowe). Przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 3 miesiące.

.

związek	Stężenie końcowe
3X Bufor żelowy: Podwielokrotność i utrzymywać w temperaturze -20 °C, pH 7,5
Imidazol/HCl pH-7,0	75 mM
Kwas 6-aminokapronowy	1,5 mln
Bufor akrylamidowy: Podwielokrotność i utrzymywać w temperaturze -20 °C
Akrylamid	99,5%
Bis-akryloamid	3 proc

Tabela 3: zapasów żelowych.

Na 2 żele:	4% (60 ml)	12% (60 ml)	Układanie w stosy (4%) (25 ml)
3X Bufor żelowy	19,8 ml	19,8 ml	8,25 ml
Bufor akryloamidowy	4,8 ml	14,4 ml	2 ml
H2O	35 ml	13,1 ml	14,6 ml
glicerol	-	12 ml	-
APS 10%	360 μL	60 μL	150 μL
TEMED	24 μL	12 μL	10 μL

Tabela 4: 4%–12% gradientu żelu.

związek	Stężenie końcowe
Bufor anodowy: Przechowywać w temperaturze 4 °C, pH 7,5
Imidazol	25 mM
Bufor katodowy: Przechowywać w temperaturze 4 °C, pH 7,5
Trykot	50 mM
Imidazol	7,5 mM
Z lub bez Coomassie Blue (G250)	0,022%

Tabela 5: do elektroforezy.

związek	Stężenie końcowe
Bufor aktywności kompleksu I: przygotuj świeże w 5 mM TRIS-HCl pH 7,4
Nitrotetrazolium niebieskie	3 mM
Nadh	14 mM
Bufor aktywności kompleksu II: przygotuj świeże w 5 mM TRIS-HCl pH 7,4
Bursztynian	20 mM
PMSF (Kanał PMSF)	0,2 mM
Nitrotetrazolium niebieskie	3 mM
Complex IV activity Buffer: przygotuj świeże w 50 mM Na-fosforan pH 7,2
Cytochrom C	0,05 mM
Diaminobenzydyna	2,3 mln
Bufor aktywności syntezy ATP: przygotuj świeże w wodzie, dostosuj pH do 8 za pomocą KOH
glicyna	50 mM
MgCl2	5 mM
HEPESY	50 mM
CaCl2	30 mM
Atp	5 mM

Tabela 6: do oznaczania aktywności w żelu.

.

związek	Stężenie końcowe
Bufor transferu
Baza Tris	25 mM
glicyna	192 mln
Sds	4 proc
metanol	20%
TBST
Baza Tris	20 mM
Zawartość NaCl	137 mM
Animacja 20	0,1 %

Tabela 7: immunoblottingowe.

) TGL powiedział: )

kompleks	Podjednostce	klon
ja	Zobacz materiał NDUFA9	20C11B11B11
Ii	Sieć SDHA (SDHA	Zobacz materiał 2E3GC12FB2AE2
Iii	UQCRC2	Numer katalogowy: 13G12AF12BB11
Iv	COX4 (Jednostka COX4	1D6E1A8
V	ATPB (Biblioteka ATPB)	3K5

Tabela 8: Przeciwciała używane do immunoblottingu w celu wykrycia SC łańcucha oddechowego. Zobacz tabelę materiałów dla firm i numerów partii.

Dyskusja

Superkompleksy mitochondrialne są aktywnie badane w celu wyjaśnienia ich fizjologicznej roli i znaczenia w patogenezie wielu chorób człowieka, niezależnie od tego, czy są to nabyte, czy genetyczne choroby mitochondrialne 3,7,9,10,11,12,13,14 . Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Protokół ten został przetestowany z mitochondriami wątroby myszy, mitochondriami mięśni szkieletowych myszy (wyniki nie pokazane), mitochondriami serca szczura i mitochondriami ludzkich fibroblastów (wyniki nie pokazane), ale z pewnością można go dostosować do innych źródeł izolowanych mitochondriów. Metoda optymalnie łączy różne aspekty protokołów BN i CN-PAGE, co pozwala na ograniczenie narażenia na detergenty i związki anionowe do minimum w porównaniu z opublikowanymi protokołami 20,27,28.

Przygotowanie próbki

Przygotowanie próbki stanowi kluczowy krok do pomyślnego oddzielenia SC. Skład buforu powinien być starannie dobrany, aby osiągnąć właściwą rozpuszczalność białek i zespołów białek, przy jednoczesnym zachowaniu w jak największym stopniu ich integralności funkcjonalnej i strukturalnej. Siła jonowa i pH buforu ekstrakcyjnego to dwa ważne czynniki, które należy wziąć pod uwagę. Zbyt niskie stężenia soli (< 50 mM K-octanu lub NaCl) spowodują słabą rozpuszczalność białek w obecności niejonowych detergentów, podczas gdy stężenia soli powyżej 500 mM będą sprzyjać układaniu / agregacji białek oraz wytrącaniu CB i białek²⁹. W związku z tym SC powinny być ekstrahowane przy użyciu o sile jonowej zbliżonej do fizjologicznej. Jeśli chodzi o pH, zaleca się stosowanie pH zbliżonego do fizjologicznego.

Rodzaj detergentu i stosunek detergentu do białka mają również kluczowe znaczenie dla optymalnej ekstrakcji SC. W celu maksymalnego zachowania rodzimych SC preferowana jest digitonina²⁶. Jak wykazano w niniejszym protokole i innych opublikowanych metodach 23,30,31,32, ten łagodny detergent zachowuje supramolekularny skład wielu zespołów SC oraz dimeryczną i oligomeryczną strukturę ATPsyntazy (Rysunek 3 i Rysunek 4). Miareczkowanie badanych próbek różnymi ilościami digitoniny ma kluczowe znaczenie dla określenia warunków, które umożliwiają optymalną rozpuszczalność, przy jednoczesnym zachowaniu aktywności enzymów i fizjologicznych interakcji białek. Miareczkowanie powinno być wykonywane w proporcjach od 2 do 8 g/g²⁶. Optymalne wyniki dla mitochondriów wątroby, mięśni szkieletowych i serca uzyskuje się odpowiednio przy 4, 5 i 6 g digitoniny/g białka. Należy zauważyć, że digitonina może być zastąpiona przez Triton X-100, który w optymalnych warunkach skutkuje podobną migracją i składem SC jak te obserwowane w przypadku digitoniny². Detergent ten należy jednak stosować ostrożnie, ponieważ stosunkowo niewielki wzrost stosunku detergentu do białka (np. z 1 do 1,5 g/g) może spowodować całkowitą dysocjację zespołów SC², co może skutkować niespójnościami eksperymentalnymi. Po ekstrakcji próbki są tradycyjnie uzupełniane Coomassie Blue w celu nadania białkom ładunku po nałożeniu na żel, z wyjątkiem tradycyjnego CN-PAGE^20,26. W celu zminimalizowania narażenia na białko Coomassie blue i potencjalnej dysocjacji labilnych białek, próbki nie są uzupełniane błękitem Coomassie w tym protokole.

Elektroforezy

Zarówno CN-PAGE, jak i BN-PAGE zostały wykorzystane do badania mitochondrialnych kompleksów OXPHOS, z których każdy ma odrębne zalety i ograniczenia. Łagodniejsze warunki stosowane w CN-PAGE (głównie brak CB, który ma działanie podobne do detergentu), pozwalają na lepsze zachowanie aktywności syntazy ATP w żelu i ograniczają dysocjację labilnych białek w zespołach SC i syntazy ATP o dużej masie cząsteczkowej²⁶. Jednak brak anionowego barwnika CB w ekstrakcie białkowym i do elektroforezy powoduje migrację białek w oparciu o ich ładunek wewnętrzny i punkt izoelektryczny, co zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną białek w żelu²⁶. Ponadto, przy braku CB, białka o niewystarczającym ładunku ujemnym mają tendencję do agregacji, zmniejszając w ten sposób rozdzielczość kompleksów białkowych w żelu^20,26. Aby obejść te ograniczenia, tak zwana CN-PAGE o wysokiej rozdzielczości została opracowana przez Wittiga i Schraggera²⁰. W tym protokole deoksycholan sodu (DOC) i różne łagodne detergenty niejonowe (DDM, Triton X100) są dodawane do bufora katodowego, aby utrzymać rozpuszczalność białek błonowych i nałożyć ujemne przesunięcie ładunku na białka, co skutkuje znaczną poprawą rozdzielczości²⁰.

Charakterystyczną cechą obecnego hybrydowego protokołu CN/BN jest to, że porównywalną rozdzielczość można osiągnąć bez tych detergentów. Chwilowe dodanie CB do bufora katodowego na początku elektroforezy jest wystarczające, aby ograniczyć agregację białek i zwiększyć ruchliwość w żelu (Rysunek 3 i Rysunek 4). W rezultacie, ta hybrydowa technika umożliwia doskonałą rozdzielczość różnych zespołów SC i bardzo niskie lub zerowe narażenie na detergenty. Obecność niewielkich ilości CB pozwala również na lepsze zachowanie aktywności CV, lepsze zachowanie dimerycznych i oligomerycznych zespołów CV (Rysunek 3 oraz Wittig i Schägger^{2005 26}) oraz redukcję niebieskiego szumu tła, który może utrudniać ilościowe określenie aktywności żelu, szczególnie w przypadku CII i CIV (Rysunek 2). Co więcej, brak CB w ekstrakcie białkowym ogranicza zakłócenie labilnych interakcji białkowych w obrębie SC. Na przykład fizyczne powiązanie syntazy ATP z ANT w celu utworzenia syntasomu ³³ lub z cyklofiliną-D w celu regulacji otwarcia PTP ³⁴ jest lepiej widoczne przy braku CB. Chwilowa ekspozycja na CB tylko podczas elektroforezy może być zatem przydatna do ujawnienia nowych interakcji białkowych w SC. Ogólnie rzecz biorąc, ten hybrydowy protokół CN/BN-PAGE pozwala zatem na połączenie precyzyjnych i szybkich pomiarów aktywności żelu z technikami analitycznymi obejmującymi elektroforezę 2D, immunodetekcję i/lub proteomikę w celu zaawansowanej analizy SC. Należy zauważyć, że wraz z rosnącym zainteresowaniem SC, coraz więcej badań wykorzystuje małe żele 10 x 10 cm do natywnej PAGE. Chociaż takie podejście może być wystarczające do zidentyfikowania poważnych zmian w obfitych zespołach SC, niższa zdolność separacji małych żeli jest prawdopodobnie ograniczona do rozwiązywania subtelnych przegrupowań lub wycinania wyraźnych prążków do analizy proteomicznej. Co więcej, kilka badań z użyciem mniejszych żeli wykazało, że respiresom migruje w tym samym rozmiarze co dimer ATPsynthazy, co utrudnia ich dysocjację²². Dlatego należy faworyzować stosowanie dużych żeli.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hydrat tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny	Sigma	D5637
Kwas 6-amino-kapronowy	Sigma	A2504
Akrylamid	Sigma	A3553
Adenozyno-5'-trifosforan soli disodowej hydrat	sigma	A3377
Przeciwciało anty-ATPB [3D5] - Marker mitochondrialny	Abcam	ab14730	Numer partii GR3174539-12, RRID AB_301438
Przeciwciało anty-SDHA [2E3GC12FB2AE2]	Abcam	ab14715	Numer partii GR3235943-1, RRID AB_301433
Przeciwciało anty-UQCRC2 [13G12AF12BB11]	Abcam	ab14745	Numer partii GR304308-3, RRID AB_2213640
Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide	Biorad	1610201
Brilliant Blue G	Sigma	27815
Przeciwciało monoklonalne COX4 (1D6E1A8)	Invitrogen	459600	Numer partii TI2637158, RRID AB_2532240
Cytochrom c z serca konia	sigma	C7752
Digitonina	Sigma	D141
Fisherbrand FH100M Wielokanałowe pompy perystaltyczne	Thermo Fisher	13-310-660
Imidazol	Sigma	I0250
Wewnętrzne szklane płytki. Opakowanie 2 sztuk 20 x 20 cm, płytki szklane do komórek elektroforetycznych PROTEAN II xi i PROTEAN II XL o długości 20 cm, stosować z płytą zewnętrzną	Biorad	1651823
Model 485 Gradient Former. 40-175 ml akrylowy preparat do formowania gradientowego, zawiera trzpień zaworu i zestaw rurek, do stosowania z systemami wielokomorowych odlewów Mini-PROTEAN
NDUFA9 (20C11B11B11)	Invitrogen	459100	Numer partii TD2536591, RRID AB_2532223
Nitrotetrazolium Blue chloride	Sigma	N6639
Zewnętrzne płytki szklane. Opakowanie 2, 22,3 x 20 cm, szklane płytki do 20 cm komórek do elektroforezy PROTEAN II xi i PROTEAN II XL, do stosowania z płytką wewnętrzną	Biorad	1651824
Floride fenylometanosulfonylu	Sigma	P7626
Powerpack 1000	Biorad	Numer seryjny 286BR 07171
Zaciski kanapkowe PROTEAN II. Opakowanie 2 szt., zaciski do żeli do biegania, do 20 cm ogniwa do elektroforezy PROTEAN II xi, 1 lewe i 1 prawe	Biorad	1651902
PROTEAN II xi Cell. Wielkoformatowa pionowa cela do elektroforezy, żel 16 x 20 cm, pojemność 4 żeli, przekładki i grzebienie	Biorad	1651811
PROTEAN II xi Comb. Opakowanie 1, 15-dołkowe, 1,5 mm, grzebień do komory elektroforetycznej PROTEAN II xi	Biorad	1651873
Komory Odlewniczej PROTEAN II xi Multi-Gel. Wielożelowa komora odlewnicza, żel o wymiarach 20 x 20 cm, do dziesięciu żeli o grubości 1,5 mm, zawiera płytkę uszczelniającą, uszczelkę, arkusze separacyjne, bloki akrylowe, karty wyrównujące PROTEAN II XL Biorad		1652025
PROTEAN II xi Dystanse. Opakowanie 4, 1,5 mm, przekładki do 20 cm Komórka do elektroforezy PROTEAN II xi	Biorad	1651849
SCIENCEWARE Worki użytkowe (10 x 12") 4 mil, Bel-Art, pudełko 100 grubych	VWR	11215-388
. Opakowanie 25 arkuszy, 15 x 20 cm, chłonna bibuła filtracyjna, do stosowania z kasetą Trans-Blot	Biorad	1703956
Ogniwo Trans-Blot z elektrodami płytkowymi i cewką Super Cooling. Komórka transferowa i cewka chłodząca (#170-3912), zawiera 2 kasety z uchwytami na żel, zbiornik buforowy, pokrywę z, podkładki z włókna, 1 opakowanie bibuły	Biorad	1703939