Artykuł metodologiczny

Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis w Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/59301

⸱

23 marca 2019

 ,  , 
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicień Caenorhabditis elegans jest doskonałym modelem do analizy interakcji gospodarz-patogen. Opisano tutaj protokół zakażenia robaka paciorkowcami z grupy mitis i określenia aktywacji odpowiedzi na stres oksydacyjny przeciwkoH2O2wytwarzanej przez tę grupę organizmów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans), wolno żyjący nicień, stał się atrakcyjnym modelem do badania interakcji gospodarz-patogen. Prezentowany protokół wykorzystuje ten model do określenia patogenności wywoływanej przez paciorkowce z grupy mitis poprzez produkcjęH2O2. Paciorkowce z grupy mitis są nowym zagrożeniem, które powoduje wiele chorób u ludzi, takich jak bakteriemia, zapalenie wsierdzia i zapalenie tkanki łącznej oczodołu. Opisano tutaj protokół określający przeżywalność tych robaków w odpowiedzi na H2O2 wytwarzany przez tę grupę patogenów. Wykorzystując gen skn-1 kodujący czynnik transkrypcyjny odpowiedzi na stres oksydacyjny, wykazano, że model ten jest ważny dla identyfikacji genów gospodarza, które są niezbędne przeciwko infekcji paciorkowcowej. Ponadto wykazano, że aktywacja odpowiedzi na stres oksydacyjny może być monitorowana w obecności tych patogenów za pomocą transgenicznego szczepu robaka reporterowego, w którym SKN-1 jest połączony z białkiem zielonej fluorescencji (GFP). Testy te dają możliwość zbadania odpowiedzi na stres oksydacyjny naH2O2pochodzącą ze źródła biologicznego, w przeciwieństwie do źródeł egzogennie dodanych reaktywnych form tlenu (ROS).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

paciorkowce z grupy Mitis to ludzkie komensale jamy ustnej i gardła1. Jednak organizmy te mogą uciec z tej niszy i powodować różne choroby inwazyjne2. Infekcje wywoływane przez te mikroorganizmy obejmują bakteriemię, zapalenie wsierdzia i zapalenie tkanki łącznej oczodołu2,3,4,5,6. Co więcej, stają się one czynnikami wywołującymi infekcje krwi u pacjentów z obniżoną odpornością, neutropeną i rakiem, którzy przeszli chemioterapię5,7,8,9.

Mechanizmy leżące u podstaw patogenezy grupy mitis są niejasne, ponieważ zidentyfikowano niewiele czynników wirulencji. Wiadomo, że grupa mitis wytwarzaH2O2, który odgrywa ważną rolę w społecznościach drobnoustrojów jamy ustnej10. Ostatnio kilka badań podkreśliło rolęH2O2jako cytotoksyny, która indukuje śmierć komórek nabłonka11,12. Wykazano, że S. pneumonia, który należy do tej grupy, wytwarza wysoki poziomH2O2, który indukuje uszkodzenie DNA i apoptozę w komórkach pęcherzyków płucnych13. Korzystając z modelu zwierzęcego ostrego zapalenia płuc, ci sami naukowcy wykazali, że wytwarzanieH2O2przez bakterie daje przewagę w zakresie zjadliwości. Badania nad pneumokokowym zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych wykazały również, żeH2O2 pochodzący z patogenu działa synergistycznie z pneumolizyną, wywołując śmierć komórek neuronalnych14. Obserwacje te jednoznacznie wskazują, żeH2O2wytwarzany przez tę grupę bakterii jest ważny dla ich patogenności.

Co ciekawe, wykazano również, że członkowie grupy mitis S. mitis i S. oralis powodują śmierć nicieni C. elegans poprzez produkcję H2O215,16. Ten wolno żyjący nicień został wykorzystany jako prosty, genetycznie podatny model do badania wielu procesów biologicznych. Niedawno robak pojawił się jako model do badania interakcji gospodarz-patogen17,18. Ponadto kilka badań podkreśliło znaczenie badania stresu oksydacyjnego za pomocą tego organizmu19,20,21. Jego krótki cykl życiowy, zdolność do eliminowania interesujących genów przez RNAi oraz wykorzystanie reporterów połączonych z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) do monitorowania ekspresji genów to tylko niektóre z atrybutów, które czynią go atrakcyjnym systemem modelowym. Co ważniejsze, szlaki regulujące stres oksydacyjny i wrodzoną odporność robaka są wysoce konserwatywne u ssaków20,22.

W tym protokole pokazano, jak używać C. elegans do wyjaśnienia patogenności wywołanej przez H2O2 pochodzące z paciorkowców. Pokazano zmodyfikowany test przeżycia, a członkowie grupy mitis są w stanie szybko zabić robaki poprzez produkcjęH2O2. Wykorzystując członków grupy mitis, zapewnia się trwałe biologiczne źródło reaktywnych form tlenu (ROS), w przeciwieństwie do źródeł chemicznych, które indukują stres oksydacyjny u robaków. Co więcej, bakterie są w stanie szybko skolonizować robaki, co pozwala na bezpośrednie skierowanieH2O2do komórek jelitowych (w porównaniu z innymi źródłami, które muszą przekroczyć kilka barier). Test jest walidowany albo 1) poprzez określenie przeżycia zmutowanego szczepu skn-1, albo 2) poprzez strącenie skn-1 za pomocą RNAi u robaków w stosunku do robaków N2 typu dzikiego i kontrolnego wektorowego. SKN-1 jest ważnym czynnikiem transkrypcyjnym, który reguluje odpowiedź na stres oksydacyjny u C. elegans23,24,25. Oprócz testów przeżycia, szczep robaka wykazujący ekspresję transgenicznego reportera SKN-1B / C::GFP jest używany do monitorowania aktywacji odpowiedzi na stres oksydacyjny poprzez produkcjęH2O2 przez grupę mitis.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie płytek agarowych THY (Todd-Hewitt Yeast Extract)

  1. Na 1 l pożywki dodać 30 g proszku Todda-Hewitta, 2 g ekstraktu drożdżowego i 20 g agaru do kolby Erlenmeyera o pojemności 2 litrów. Dodać 970 ml wody dejonizowanej do zawartości kolby i dołączyć mieszadło. Autoklawować pożywkę w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 15 lb/cal2 przez 30 min. Następnie umieść podłoże na talerzu do mieszania i pozostaw do ostygnięcia, delikatnie mieszając.
  2. Wlać pożywkę na sterylne szalki Petriego o odpowiedniej wielkości (szalki 100 mm x 15 mm do wzrostu i utrzymania bakterii, szalki 35 mm x 10 mm do oznaczania zabijania) pod przepływem laminarnym. Pozostaw podłoże do wyschnięcia na 2 godziny pod pokrywą laminarną. Następnie płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.

2. Przygotowanie pożywki dla nicieni (NGM) i płytek do karmienia RNAi (NGM RNAi)

  1. Za pomocą mieszadła rozpuść 2,5 g peptonu i 3 g NaCl w 970 ml wody dejonizowanej w 2-litrowej kolbie Erlenmeyera. Dodaj 20 g agaru do podłoża. Autoklawować pożywkę w temperaturze 121 °C i ciśnieniu 15 lb/cal2 przez 30 min. Umieść podłoże na talerzu mieszającym i pozwól mu ostygnąć, delikatnie mieszając.
  2. Dodać następujące roztwory do pożywki w celu przygotowania płytek NGM: 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (pH = 6,0), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml (5 mg / ml w 95% etanolu) cholesterolu, 1 ml (10% v/w w etanolu) nystatyny i 1 ml 25 mg / ml streptomycyny.
  3. Do pożywki w celu przygotowania płytek do karmienia RNAi NGM dodać następujące roztwory: 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (pH = 6,0), 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml (5 mg/ml w 95% etanolu) cholesterolu, 1 ml (10% v/w w etanolu) nystatyny, 1 ml 50 mg/ml karbenicyliny i 1 ml IM IPTG.
  4. Wlać pożywkę do sterylnych szalek Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm pod przepływem laminarnym. Pozostaw podłoże do wyschnięcia na 2 godziny pod pokrywą laminarną. Następnie płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.

3. Utrzymanie C. elegans

  1. Wysiewaj płytki NGM, zauważając 50 μl wyhodowanej przez noc E. coli OP50 na środku płytek. Kultura E. coli jest przygotowywana uprzednio w pożywce Luria-Bertani (LB) i przechowywana w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy. Przykryj talerze i pozostaw je do wyschnięcia na 24 godziny pod pokrywą laminarną, a następnie przechowuj je w pojemniku z polistyrenu.
  2. Pod mikroskopem preparacyjnym podnieś od 10 do 12 ciężarnych dorosłych osobników za pomocą sterylnego kilofa do robaków i przenieś robaki na płytkę NGM z nasionami E. coli OP50. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez noc.
  3. Następnego dnia usuń dorosłe osobniki za pomocą sterylnego kilofa do robaków i pozwól zarodkom rozwinąć się w larwy L4 w temperaturze 20 °C (~2,5 dnia).

4. Przygotowanie populacji robaków synchronicznej pod względem wieku

  1. Umyj gravidy dorosłe osoby z dwóch do czterech płytek NGM za pomocą M9W i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    1. Aby przygotować M9W: połączyć 3 g NaCl, 6 g Na2HPO4 i 3 g KH2PO4 i rozpuścić w końcowej objętości 1 l wody dejonizowanej. Roztwór należy sterylizować w autoklawie i dodać 1 ml 1 MMgSO4.
  2. Wirować probówkę o masie 450 x g przez 1 minutę, a następnie zdekantować supernatant, upewniając się, że osad ślimakowy pozostaje nienaruszony.
  3. Dodać 400 μl 8,25% podchlorynu sodu (wybielacz domowy) i 100 μl 5 N NaOH, aby przygotować roztwór do lizy robaków. Dodaj roztwór do lizy do osadu robaka i wymieszaj zawartość, przesuwając probówkę, aż 70% dorosłych robaków zostanie zlizowanych. Okresowo obserwuj zawartość probówki pod mikroskopem preparacyjnym, aby upewnić się, że jaja nie są nadmiernie bielone.
  4. Rozcieńczyć mieszaninę wybielacza, dodając 10 ml M9W do zawartości stożkowej probówki.
  5. Wirować probówkę o masie 450 x g przez 1 minutę. Zdekantować supernatant, a następnie dodać 10 ml M9W.
  6. Powtórz krok 4.5 jeszcze dwa razy.
  7. Zawiesić powstały osad jajeczny w 3-5 ml M9W. Umieść rurkę na rotatorze rurowym. Pozwól rurkom obracać się z prędkością 18 obr./min w temperaturze pokojowej (RT) przez noc.
  8. Następnego dnia obracaj probówkę o gramaturze 450 x g przez 1 minutę, aby wypluć larwy L1. Usuń większość M9W przez aspirację, pozostawiając ~250 μL płynu w probówce. Ponownie zawiesić larwy L1 i umieścić trzy krople zawiesiny robaków o pojemności 5 μl na pokrywie szalki Petriego, a następnie oszacować liczbę robaków na μl za pomocą mikroskopu preparacyjnego.

5. Indukcja RNAi u robaków

  1. Za pomocą sterylnej pętli lub kilofa wyrzuć pożądane szczepy E. coli zawierające RNAi z zamrożonych wywarów (biblioteki Ahringer i Vidal) na płytki agarowe LB o wymiarach 100 mm x 15 mm zawierające 50 μg/ml karbenicyliny i 15 μg/ml tetracykliny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  2. Pobrać i zaszczepić izolowaną kolonię z pożądanego szczepu RNAi do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 15 ml zawierających 2 ml LB uzupełnionych 50 μg/ml karbenicyliny. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obr./min.
  3. Następnego dnia rozprowadź 150 μl wyhodowanej przez noc kultury na płytkach do karmienia NGM RNAi o wymiarach 65 mm x 15 mm za pomocą sterylnego rozsiewacza. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
  4. Pozostawić płytki do ostygnięcia do temperatury pokojowej po inkubacji w temperaturze 37 °C. Dodać odpowiednią objętość M9W zawierającą ~200 larw L1 (uzyskaną z etapów synchronicznej populacji robaków) do płytek karmiących NGM RNAi wysiewanych przez E. coli. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C, aż larwy osiągną stadium L4 (~2,5 dnia).

6. Przygotowanie paciorkowców z grupy Mitis do zakażenia

  1. Na agarze THY o wymiarach 100 mm x 15 mm należy rozprowadzić pożądane szczepy paciorkowców (jeśli płytki były przechowywane w temperaturze 4 °C, należy je wstępnie ogrzać do 37 °C przed nałożeniem smug odpowiednich szczepów), a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc (~18 godzin) w słoiku ze świecą, zapewniając mikroaerofilne środowisko do wzrostu paciorkowców (płytki z prążkami można przechowywać przez tydzień w temperaturze 4 °C).
  2. Aby rozmnażać kliniczne izolaty paciorkowców, użyj tryptycznego agaru z krwią sojową. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w słoiku ze świecą przez noc (~18 h).
  3. Następnego dnia wyjmij płytki ze słoika ze świecą i zbierz izolowane kolonie za pomocą sterylnej pętli. Zaszczepić 15 ml sterylnych stożkowych probówek zawierających 2 ml bulionu THY. Aby rozmnażać kliniczne izolaty paciorkowców, należy uzupełnić bulion THY o 5% v/v krwi owczej. Zamknąć szczelnie nakrętki i inkubować probówki w temperaturze 37 °C w warunkach statycznych.

7. Testy przeżycia

UWAGA: Kroki związane z tym testem są przedstawione w Rysunek 1. W celu wykazania, żeH2O2uzyskany przez grupę mitis jest odpowiedzialny za zabijanie robaka, należy uzupełnić pożywkę katalazą lub zmutowanym szczepem ΔspxB i szczepem dopełniacza Δ spxB; można użyć spxB+ S. gordonii. SpxB koduje oksydazę pirogronianową, która jest odpowiedzialna za produkcjęH2O2w grupie mitis.

  1. Podgrzej płytki THY o wymiarach 35 mm x 10 mm do temperatury 37 °C. Dodać 80 μl wyhodowanych przez noc kultur pożądanych szczepów paciorkowców i całkowicie rozprowadzić bakterie po powierzchni agaru za pomocą sterylnego rozsiewacza. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w słoiku ze świecą przez noc (~18 h). Jako kontrolę, wysiewaj dwie płytki NGM o wymiarach 35 mm x 10 mm z 80 μl wyhodowanych przez noc kultur E. coli OP50. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Aby potwierdzić, że H2O2 wytwarzany przez grupę mitis jest odpowiedzialny za zabijanie robaków, dodaj 50 μl zawierających 1000 jednostek katalazy c na płytkę THY. Rozprowadzić roztwór katalazy za pomocą sterylnego rozsiewacza i pozostawić płytki do wyschnięcia w przepływie laminarnym przez 30 minut. Następnie wysiać płytki odpowiednimi szczepami paciorkowców, jak opisano w kroku 7.1.
  3. Następnego dnia wyjmij płytki ze słoika ze świecą i pozwól im ostygnąć do temperatury RT przez 10-15 minut. Za pomocą sterylnego kilofa do robaków przenieś 30 larw L4 z płytek karmiących NGM lub NGM RNAi na płytki THY wysiewane paciorkowcami. Użyj dwóch płytek THY z nasionami z łącznie 60 robakami na szczep paciorkowców. Inkubować płytki w temperaturze 25 °C.
  4. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego policz liczbę żywych i martwych larw L4 na każdej płytce w kilku punktach czasowych. Początkowo oceniaj robaki jako martwe lub żywe co 30 minut. Następnie, gdy robaki szybko zaczną umierać, nacinaj je w odstępach 15-minutowych. Użyj sterylnego kilofa, aby delikatnie szturchnąć robaki i określić, czy są żywe, czy martwe. Robak jest uważany za martwego, jeśli nie ma ruchu w odpowiedzi na szturchanie.
  5. Test zajmie 5-6 godzin. Powtórz eksperyment jeszcze dwa razy. Po zakończeniu testu połącz dane z dwóch płytek. Wprowadź dane każdej grupy, porównaj krzywe przeżycia i przeprowadź analizę przeżycia Kaplana-Meiera za pomocą oprogramowania statystycznego.

8. Przygotowanie płatków agarozowych do mikroskopii

  1. Rozpuść 2% w/v agarozy w wodzie dejonizowanej, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej. Objętość 5 ml roztworu wystarcza do przygotowania 20 szkiełek.
  2. Przyklej taśmę laboratoryjną wzdłuż dwóch szklanych szkiełek. To określi grubość płatków agarozowych. Umieść czyste szklane szkiełko między dwoma zaklejonymi taśmą szkiełkami.
  3. Umieść 100 μl stopionej agarozy na środku czystego szkiełka. Natychmiast umieść kolejną czystą szklankę na stopionej agarozie i delikatnie dociśnij, aby zrobić podkładkę. Poczekaj, aż agaroza stwardnieje, a następnie zdejmij górny szkiełko. Podkładka agarozowa jest gotowa do użycia.

9. Obserwacja lokalizacji SKN-1 w odpowiedzi na zakażenie Streptococcus

UWAGA: Kroki związane z tym testem są przedstawione w Rysunek 2. Lokalizację SKN-1 określono przy użyciu transgenicznego szczepu robaka SKN-1B/C::GFP. Wykazanie lokalizacji SKN-1 w wyniku wytwarzaniaH2O2przez grupę mitis, typu dzikiego (WT), Δ spxB i szczepu dopełniacza ΔspxB; Zastosowano spxB+ S. gordonii. Ponadto wykorzystano transgeniczny szczep reporterowy SKN-1B/C::GFP i technikę interferencji RNAi, aby wykazać, że składniki szlaku p38 MAPK regulują lokalizację SKN-1.

  1. Podgrzej płytki THY o wymiarach 35 mm x 10 mm do temperatury 37 °C. Dodać 80 μl wyhodowanych przez noc kultur pożądanych szczepów paciorkowców i całkowicie rozprowadzić bakterie po powierzchni agaru za pomocą sterylnego rozsiewacza. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w słoiku ze świecą przez noc (~18 h). Jako kontrolę, wysiewaj trzy płytki NGM o wymiarach 35 mm x 10 mm z 80 μl wyhodowanych na noc kultur E. coli OP50. Inkubować te płytki w temperaturze 37 °C przez ~18 godzin.
  2. Następnego dnia wyjmij płytki ze słoika ze świecą i pozwól im ostygnąć do temperatury RT przez 10-15 minut. Umyj larwy L4 za pomocą M9W z płytek do karmienia NGM i NGM RNAi. Zbierz robaki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
  3. Wirować probówki o masie 450 x g przez 1 minutę. Zdekantować supernatant i dodać 10 ml M9W.
  4. Powtórz krok 9.3 jeszcze trzy razy.
  5. Ponownie zawiesić robaki w ~250 μL M9W i umieścić trzy krople zawiesiny robaków po 5 μl na czystej pokrywie szalki Petriego i oszacuj liczbę robaków na μl za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
  6. Dodaj ~ 100 larw L4 do każdej płytki wysiewanej paciorkowcami THY i NGM E. coli. Użyj trzech płytek na szczep bakterii. Inkubować płytki przez 2-3 godziny w temperaturze 25 °C.
  7. Następnie wyjmij płytki z inkubatora, umyj je M9W i zbierz robaki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
  8. Umyj robaki 3 razy, jak opisano w krokach 9.3.
  9. Usunąć większość M9W przez aspirację i dodać 500 μl M9W zawierającego 2 mM azydku sodu lub 2 mM chlorowodorek tetramizolu do osadu robaka. Spowoduje to znieczulenie robaków, zapewniając, że podczas obrazowania pod mikroskopem nie wystąpi żaden ruch.
    ostrożność: Podczas pracy z azydkiem sodu należy stosować środki ochrony osobistej (PPE). Przygotuj roztwór azydku pod kapturem chemicznym.
  10. Inkubować granulki robaków w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie naniec 15 μl zawiesiny ślimakowej na przygotowaną podkładkę agarozową. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe nr 1,5 na waduszce agarozowej zawierającej znieczulone robaki.
  11. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zwizualizuj lokalizację SKN-1 za pomocą filtrów FITC i DAPI. Robaki obrazu przy powiększeniach 10x i 20x.
  12. Oceniaj robaki na podstawie poziomu lokalizacji SKN-1. Brak lokalizacji jądrowej, lokalizacja SKN-1B / C: : GFP w przedniej lub tylnej części robaka oraz lokalizacja jądrowa SKN-1B / C: : GFP we wszystkich komórkach jelitowych są klasyfikowane odpowiednio jako niski, średni i wysoki poziom lokalizacji.
  13. Po nacięciu mikrofotografii fluorescencyjnych określ różnice statystyczne za pomocą testów chi-kwadrat i dokładnych testów Fishera za pomocą oprogramowania statystycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Członkowie grupy mitis S. mitis, S. oralis i S. gordonii szybko zabili robaki, w przeciwieństwie do S. mutans, S. salivarius i niepatogennego E. coli OP50 (Rysunek 3A). Mediana przeżycia dla S. mitis, S. oralis i S. gordonii wynosiła odpowiednio 300 min, 300 min i 345 min. Aby ustalić, czy w zabijaniu pośredniczył H2O2, katalazę uzupełniono ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane metody mogą być stosowane w odniesieniu do innych bakterii chorobotwórczych, takich jak Enterococcus faecium, które również wytwarzająH2O2uprawiane w warunkach beztlenowych lub mikroaerofilnych26. Zazwyczaj w przypadku większości organizmów chorobotwórczych przeprowadzenie testów przeżycia zajmuje od kilku dni do kilku tygodni. Jednak ze względu na intensywne wytwarzanieH2O2przez członków grupy mitis, testy te można było wykonać w ciągu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Bing-Yan Wang, dr Gena Tribble (Uniwersytet Teksański, Szkoła Stomatologii), dr Richardowi Lamontowi (Uniwersytet w Louisville, Szkoła Stomatologii) i dr Samuelowi Shelburne'owi (MD Anderson Cancer Center) za dostarczenie laboratoryjnych i klinicznych szczepów paciorkowców z grupy mitis. Dziękujemy również dr Keithowi Blackwellowi (Wydział Genetyki, Harvard Medical School) za szczepy C. elegans. Na koniec dziękujemy dr Danielle Garsin i jej laboratorium (The University of Texas, McGovern Medical School) za dostarczenie odczynników i szczepów robaków do przeprowadzenia badania. Niektóre szczepy robaków zostały dostarczone przez CGC, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Media i chemikalia
Agaroza Sigma AldrichA9539-50G
Pepton bakto Fisher ScientificDF0118-17-0
BD Bacto Todd Hewitt RosółFisher ScientificDF0492-17-6
BD BBL Krew owcza, defibrynowana   Fisher ScientificB11947
BD Difco Agar Fisher ScientificDF0145-17-0
BD Difco LB BulionFisher ScientificDF0446-17-3
Agar do krwi (TSA z krwią owczą)Fisher ScientificR01200
Chlorek wapniaFisher ScientificBP510-500
KarbenicylinaFisher ScientificBP26481
Katalaza Sigma AldrichC1345-1G
CholesterolFisher ScientificICN10138201
IPTGFisher ScientificMP21021012
Siarczan magnezuFisher ScientificBP213-1
NystatynaAcros organicsAC455500050
Fosforan potasu dwuzasadowyFisher ScientificBP363-500
Fosforan potasu jednozasadowyFisher ScientificBP362-500
Azydek soduSigma AldrichS2002-25G
Chlorek sodu Fisher ScientificBP358-1
Wodorotlenek soduFisher ScientificSS266-1
8,25% Podchloryn sodu Fosforan
sodu Dibasic Fisher ScientificBP332-500
Siarczan streptomycyny Fisher ScientificBP910-50
TetracyklinaSigma Aldrich87128-25G
(−)-Chlorowodorek tetramizoluSigma AldrichL9756
Ekstrakt drożdżowyFisher ScientificBP1422-500 
materiały eksploatacyjne 
15 mL stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu Fisher Scientific12-565-269
Jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu 10 mlFisher Scientific07-200-574
Jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu 25 mlFisher Scientific07-200-575
Bakteriologiczne szalki Petriego Falcon z pokrywką (35 mm x 10 mm)Fisher Scientific08-757-100A
Nr 1.5  18 mm x 18 mm Osłona PłytkiFisher Scientific12-541A
przezroczystą pokrywką (60 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875713A
Petriego z przezroczystą pokrywką (100 mm x 15 mm)Fisher Scientific
ze szkła zwykłego (75 mm x 25 mm)Fisher Scientific12-544-4
Oprogramowanie 
PrismGraphpad
Bacterial Strain
S. oralis ATCC 35037
S. mitis ATCC 49456
S. gordonii DL1 Challis   
E. coli OP50
E. coli HT115
szczepy robaków
szczep<silny>GenotypTransgen<silny>Źródło
N2C. elegans izolatCGC
EU1skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?( n754) niech -?] (IV;V)CGC
LD002IdIs1SKN-1B/C::GFP + ROL-6(su1006)Keith Blackwell
Petriego z szalki Szkiełka mikroskopowe FB0875712 dziki

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
  2. Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
  3. Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
  4. Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
  5. Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
  6. van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
  7. Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
  8. Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
  9. Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
  10. Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843(2012).
  11. Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136(2014).
  12. Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
  13. Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
  14. Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
  15. Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233(2018).
  16. Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
  17. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
  18. Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
  19. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
  20. Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, Sup 1 59-63 (2015).
  21. Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, Pt B 290-301 (2015).
  22. Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
  23. Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
  24. An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
  25. An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
  26. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  27. Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
  28. Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

C elegansnadtlenek wodoruSKN 1 GFPtest prze ywalno cimikroskopia fluorescencyjnatraktowanie katalazmutant spxBszlak p38 MAPK

Powiązane artykuły