Method Article

Badanie normalnych efektów promieniowania tkanek za pomocą hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej

DOI:

10.3791/59304

⸱

July 24th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Radiation Oncology, Stanford University, 3Depattment of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 4Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę decelularyzacji i późniejszego tworzenia hydrożelu mysich poduszeczek tłuszczowych sutka po napromieniowaniu ex vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Radioterapia to terapia dla pacjentów z potrójnie ujemnym rakiem piersi. Wpływ promieniowania na macierz zewnątrzkomórkową (ECM) zdrowej tkanki piersi i jego rola w miejscowym nawrocie w miejscu pierwotnego guza są nieznane. W tym miejscu przedstawiamy metodę decelularyzacji, liofilizacji i wytwarzania hydrożeli ECM pochodzących z mysich poduszek tłuszczowych sutka. Przedstawiono wyniki dotyczące efektywności procesu decelularyzacji oraz oceniono parametry reologiczne. Komórki raka piersi znakowane GFP i lucyferazy zamknięte w hydrożelach wykazały wzrost proliferacji w napromieniowanych hydrożelach. Wreszcie, barwienie sprzężone z falloidyną zastosowano do wizualizacji organizacji cytoszkieletu zamkniętych w kapsułkach komórek nowotworowych. Naszym celem jest przedstawienie metody wytwarzania hydrożeli do badań in vitro, które naśladują środowisko tkanki piersi in vivo i jej reakcję na promieniowanie w celu zbadania zachowania komórek nowotworowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak charakteryzuje się nadmierną proliferacją komórek, które mogą uniknąć apoptozy, a także przerzutować do odległych miejsc1. Rak piersi jest jedną z najczęstszych form wśród kobiet w USA, z szacunkową liczbą 266 000 nowych przypadków i 40 000 zgonów w 2018 roku2. Szczególnie agresywnym i trudnym do leczenia podtypem jest potrójnie ujemny rak piersi (TNBC), w którym brakuje receptora estrogenowego (ER), receptora progesteronowego (PR) i ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (HER2). Radioterapia jest powszechnie stosowana w raku piersi w celu wyeliminowania resztek komórek nowotworowych po lumpektomii, ale ponad 13% pacjentów z TNBC nadal doświadcza nawrotu w pierwotnym miejscu guza3.

Wiadomo, że radioterapia jest skuteczna w łagodzeniu przerzutów i nawrotów, ponieważ połączenie lumpektomii i radioterapii skutkuje takim samym długoterminowym przeżyciem jak mastektomia4. Jednak ostatnio wykazano, że radioterapia wiąże się z miejscowym nawrotem do pierwotnego miejsca guza w warunkach obniżonej odporności5,6. Wiadomo również, że promieniowanie zmienia macierz zewnątrzkomórkową (ECM) normalnej tkanki poprzez wywołanie zwłóknienia7. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć rolę zmian ECM wywołanych promieniowaniem w dyktowaniu zachowania komórek nowotworowych.

Tkanki bezkomórkowe zostały użyte jako modele in vitro do badania choroby8,9. Te pozbawione komórek tkanki zachowują kompozycję ECM i rekapitulują kompleks in vivo ECM. Ta zdecelularyzowana tkanka ECM może być dalej przetwarzana i trawiona w celu wytworzenia odtworzonych hydrożeli ECM, które można wykorzystać do badania wzrostu i funkcji komórek10,11. Na przykład hydrożele do wstrzykiwań pochodzące z decelularyzowanego ludzkiego lipoaspiratu i tkanki mięśnia sercowego służyły jako nieinwazyjne metody inżynierii tkankowej, a hydrożel pochodzący z tkanki płucnej świni został wykorzystany jako metoda in vitro do badania przyczepu i żywotności mezenchymalnych komórek macierzystych12,13,14. Wpływ normalnego uszkodzenia tkanek przez promieniowanie na właściwości ECM nie został jednak zbadany.

Hydrożele pochodzące z ECM mają największy potencjał do badania in vitro zjawisk in vivo. Badano kilka innych materiałów, w tym kolagen, fibrynę i matrigel, ale trudno jest syntetycznie podsumować skład klasy ECM13. Zaletą stosowania hydrożeli pochodzących z ECM jest to, że ECM zawiera niezbędne białka i czynniki wzrostu dla określonej tkanki14,15. Napromienianie prawidłowej tkanki podczas lumpektomii powoduje znaczące zmiany w ECM, a hydrożele pochodzące z ECM mogą być używane do badania tego efektu in vitro. Metoda ta może prowadzić do bardziej złożonych i dokładniejszych modeli chorób in vitro.

W tym badaniu, poddaliśmy mysie poduszeczki tłuszczowe sutka (MFP) promieniowaniu ex vivo. Urządzenia wielofunkcyjne poddano decelularizacji i przerobiono na roztwór wstępnego żelu. Hydrożele utworzono z osadzonymi komórkami 4T1, mysią linią komórkową TNBC. Zbadano właściwości reologiczne materiału hydrożelowego oraz oceniono dynamikę komórek nowotworowych w obrębie hydrożeli. Hydrożele wytwarzane z napromieniowanych urządzeń wielofunkcyjnych zwiększały proliferację komórek nowotworowych. Przyszłe badania obejmą inne typy komórek, aby zbadać interakcje komórka-komórka w kontekście nawrotu raka po terapii.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Vanderbilt.

1. Przygotowanie i napromienianie ex vivo urządzeń wielofunkcyjnych

  1. Uśmierc atymiczne myszy Nu/Nu (8-10 tygodni) za pomocą uduszenia CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
  2. Oczyść skórę za pomocą 70% etanolu.
  3. Zebrać poduszeczki tłuszczowe sutka (MFP) od ofiarowanych myszy za pomocą wstępnie wysterylizowanych nożyczek i kleszczy w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej kompletne pożywki RPMI (RPMI uzupełnione 1% penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej) (patrz tabela materiałów).
  4. Napromieniować próbki do 20 Gy za pomocą źródła cezu.
  5. Przenieś napromieniowane urządzenia wielofunkcyjne i kompletne nośniki RPMI do szafy bezpieczeństwa biologicznego. Pożywka będzie zależna od linii komórkowej, która ma być hodowana w końcowym hydrożelu. Napełnij naczynia o średnicy 6 cm lub 10 cm wystarczającą ilością nośnika, aby zanurzyć urządzenia wielofunkcyjne. W przypadku naczyń o średnicy 6 cm użyj 8 ml podłoża, a w przypadku naczyń o średnicy 10 cm użyj 20 ml podłoża.
  6. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 przez dwa dni. Czas przebywania w inkubatorze może być dostosowany.
  7. Opłucz tkanki w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), osusz nadmiar wilgoci i umieść urządzenia wielofunkcyjne w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml w celu przechowywania w temperaturze -80 °C do czasu decelularyzacji. Ten etap zamrażania wspomaga etap decelularyzacji, a próbka powinna zostać zamrożona, nawet jeśli kolejne kroki są gotowe w przeciwnym razie.

2. Decelularyzacja (na podstawie referencji12,16,17)

UWAGA: Ta procedura została zaadaptowana z wcześniej opublikowanych metod skoncentrowanych na decelularyzacji tkanki tłuszczowej, które obejmowały deoksycholan sodu, a nie dodecylosiarcan sodu, aby skutecznie usunąć DNA12,16,17.

  1. W dniu 1 wyjmij zamrożone urządzenia wielofunkcyjne z temperatury -80 °C i rozmroź w temperaturze pokojowej.
  2. Po rozmrożeniu wysusz urządzenia wielofunkcyjne na krótko na delikatnej ściereczce. Zważ urządzenia wielofunkcyjne za pomocą wagi analitycznej.
  3. Za pomocą kleszczy z nożyczkami lub skalpelem podziel tkankę na próbki o wymiarach 3 mm x 3 mm x 3 mm w celu zbadania nienaruszonego ECM i pozostałej tkanki do produkcji hydrożelu.
    UWAGA: Liczba próbek zależy od liczby metod badawczych, np. pobranie dwóch próbek opisano poniżej: jedną do zatapiania parafiny (krok 2.5) i jedną do zamrażania w podłożu do zatapiania kriostatu, jeśli jest to pożądane (patrz tabela materiałów i krok 2.6).
  4. Zważ tkanki. W przypadku zatapiania w parafinie w celu przekroju, przejdź do kroku 2.5. W przypadku zamrażania w podłożu do zatapiania kriostatu w celu przekrojenia, przejdź do kroku 2.6.
  5. W kapturze chemicznym zanurzyć tkankę w 10% obojętnej buforowanej formalinie (NBF) (patrz Tabela Materiałów) na 24 godziny w temperaturze 4 °C. Umyć 3 razy w PBS przez 5 minut każdy. Zanurzyć tkankę w 30% sacharozie na 48 godzin w temperaturze 4 °C.
    1. Zważ tkankę teraz, gdy ten kawałek został usunięty. Przejdź do kroku 2.6.
  6. W okapie chemicznym umieść elementy MFP w oznakowanej kasecie przygotowanej z podłożem do zatapiania kriostatu. Dodaj więcej podłoża do zatapiania kriostatu, aby pokryć tkankę.
    1. Umieść kasetę w zlewce z 2-metylobutanem (patrz tabela materiałów), która jest wstępnie schłodzona ciekłym azotem. Zlewka powinna mieć wystarczającą ilość 2-metylobutanu, aby pokryć dno, ale nie wystarczająco, aby zanurzyć kasetę, ponieważ podłoże do zatapiania kriostatu nie powinno dotykać 2-metylobutanu. Pozostaw kasetę w 2-metylobutanie, aż podłoże zatapiające kriostat zamarznie i stanie się nieprzezroczyste.
    2. Zawiń kasetę (kasety) w folię, etykietę i pozostaw w temperaturze -80 °C do momentu użycia do podziału.
      UWAGA: Tkanki umieszczone bezpośrednio w pożywce do zatapiania kriostatu podzielono na sekcje z prędkością 5 μm, natomiast tkanki inkubowane w sacharozie podzielono na sekcje z prędkością 30 μm, aby zachować morfologię adipocytów.
  7. Użyj kleszczy, aby ręcznie masować pozostałą tkankę.
    UWAGA: Kawałki tkanek można również umieścić w 10% NBF na 24–48 godzin, przepłukać w PBS i pozostawić w 70% etanolu do momentu zatopienia w parafinie. Po zatopieniu, skrawki 5 μm mogą być użyte do barwienia hematoksyliną i eozyną (H i E) (patrz sekcja 7 poniżej).
  8. Umieść urządzenia wielofunkcyjne w 6-centymetrowych naczyniach z 5 ml 0,02% roztworu trypsyny/0,05% EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Spryskaj i przetrzyj naczynia 70% etanolem przed umieszczeniem w inkubatorze.
  9. Użyj sitek o średnicy 0,7 mm, aby umyć urządzenia wielofunkcyjne wodą dejonizowaną (DI), trzykrotnie zalewając chusteczkę wodą. Użyj kleszczy, aby ręcznie masować tkankę między myciami.
  10. Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Umieść chusteczki w wstępnie autoklawizowanej zlewce zawierającej mieszadło o odpowiedniej wielkości. Przykryj tkanki 60 ml 3% t-oktylofenoksypolietylenu (patrz Tabela Materiałów) na 1 g tkanki i mieszaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Użyj co najmniej 20 ml.
  11. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka. Opłucz zlewkę wodą demineralizowaną i wylej na chusteczki. Powtórz jeszcze dwa razy. Użyj kleszczy, aby ręcznie masować tkankę między płukaniami.
  12. Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Umieść chusteczki i kostki mieszadła z powrotem w tych samych zlewkach i przykryj 60 ml 4% kwasu dezoksycholowego na 1 g tkanki. Mieszaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Użyj co najmniej 20 ml.
  13. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka siatkowego. Opłucz zlewkę wodą demineralizowaną i wylej na chusteczki. Powtórz jeszcze dwa razy. Użyj kleszczy, aby ręcznie masować tkankę między płukaniami.
  14. Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ.
  15. Umieść tkanki w tej samej zlewce ze świeżą wodą demineralizowaną uzupełnioną 1% penicyliną-streptomycyną. Przykryj szczelnie folią parafinową. Pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
  16. Umyj sitka i zlewki do użycia następnego dnia.
  17. W 2. dniu odcedź zawartość zlewki na sitko. Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ.
  18. Umieść urządzenia wielofunkcyjne w tej samej zlewce z mieszadłem o odpowiedniej wielkości. Przykryj 60 ml 4% roztworu etanolu/0,1% kwasu nadoctowego na 1 g tkanki. Użyj co najmniej 20 ml. Mieszaj przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  19. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka o średnicy 0,7 mm. Użyj kleszczy do ręcznego masażu tkanki. Umieść zawartość z powrotem w zlewce. Umyj chusteczkę, przykrywając ją 60 ml 1x PBS na 1 g chusteczki. Użyj co najmniej 20 ml. Mieszaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz raz.
  20. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka o średnicy 0,7 mm. Użyj kleszczy do ręcznego masażu tkanki. Umieść zawartość z powrotem w zlewce. Umyj chusteczkę, zalewając ją 60 ml wody DI na 1 g chusteczki. Użyj co najmniej 20 ml. Mieszaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz raz.
  21. Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka. Użyj kleszczy do ręcznego masażu tkanki.
  22. Umieść zawartość z powrotem w zlewce. Przykryj tkanki 60 ml 100% n-propanolu na 1 g tkanki. Użyj co najmniej 20 ml. Mieszaj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  23. Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka o średnicy 0,7 mm. Użyj kleszczy do ręcznego masażu tkanki.
  24. Umieść zawartość z powrotem w zlewce. Umyj chusteczkę, przykrywając ją 60 ml wody demineralizowanej na 1 g chusteczki. Użyj co najmniej 20 ml. Mieszaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz trzy razy.
  25. Wrzuć chusteczkę i zawartość do sitka. Powtórz kroki 2.3–2.6, aby zebrać kawałki tkanki do inkubacji i zamrażania sacharozy w pożywce do zatapiania kriostatu.
  26. Krótko osusz chusteczkę na delikatnej chusteczce i zważ. Umieść w oznaczonej probówce o pojemności 15 ml. Zamrażać w temperaturze -80 °C przez noc.

3. Liofilizacja

  1. Wyjmij probówki o pojemności 15 ml z temperatury -80 °C i umieść na suchym lodzie. Próbki należy przechowywać zamrożone na suchym lodzie do czasu umieszczenia ich w liofilizarze.
  2. Usuń nasadki. Użyj gumki, aby przymocować delikatną chusteczkę zadaniową do góry, aby zakryć otwór. Umieść próbki na liofilizatorze na co najmniej 2 dni.
  3. Wyjmij próbki z liofilizatora i umieść probówki na suchym lodzie. Usuń delikatne chusteczki robocze, zważ każdą próbkę na wadze analitycznej. Załóż nakrętki i umieść na noc w temperaturze -80 °C.

4. Frezowanie

  1. Napełnij płytki pojemnik ciekłym azotem. Wyjąć próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C. Zważ każde liofilizowane urządzenie wielofunkcyjne.
  2. Umieść jedną próbkę w moździerzu. Użyj rękawicy kriogenicznej, aby przytrzymać zaprawę w ciekłym azocie.
  3. Użyj tłuczka dołączonego do ręcznej wiertarki, aby zmielić próbkę. Miel w 1-minutowych odstępach, aby sprawdzić postęp i wyjmij dłoń w rękawiczce z ciekłego azotu. Mielenie przez minimum 5 min.
  4. Powtórzyć te czynności dla wszystkich próbek. Spryskaj i przetrzyj moździerz i tłuczek etanolem między każdą próbką.
  5. Próbki sproszkowane należy przechowywać w probówkach o pojemności 15 ml w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do użycia.
    UWAGA: Próbki mogą być zużyte natychmiast lub przechowywane przez noc.

5. Tworzenie hydrożelu

  1. W przypadku przechowywania w temperaturze -80 °C przez noc wyjąć i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Podczas rozmrażania należy obliczyć niezbędną masę pepsyny (patrz tabela materiałów) i objętość kwasu solnego (HCl) potrzebną dla każdej próbki, w wyniku której otrzymuje się roztwór zawierający 1% w/v proszku próbki i 0,1% w/v pepsyny w 0,01 M HCl. Dodać pepsynę do HCl, aby utworzyć roztwór pepsyny-HCl.
  2. Dodać próbkę proszku i roztwór pepsyny-HCl do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj mały mieszadło i mieszaj przez 48 godzin.
  3. Umieść probówki na lodzie na 5 minut. Oblicz niezbędną objętość 10x PBS potrzebną dla każdej próbki, co daje roztwór o stężeniu 1x PBS. Dodaj odpowiednią objętość 10x PBS do każdej probówki.
  4. Dodać 10% v/v 0,1 M NaOH do każdego roztworu, aby osiągnąć pH 7,4. Użyj papieru pH do indywidualnego testu.
    UWAGA: Roztwór żelu może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez tydzień.

6. Kapsułkowanie komórek w hydrożelach

  1. Korzystanie z komórek znakowanych GFP i lucyferazy
    1. Używając roztworu żelu o pH 7,4, ponownie zawiesić granulowane komórki 4T1 znakowane GFP i lucyferazy do stężenia 500 000 lub 1 000 000 komórek/ml roztworu żelu. Dodać 16 μl roztworu komórek żelowych do każdego dołka 16-dołkowego szkiełka podstawowego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dodaj 100 μl kompletnej pożywki RPMI do każdej studzienki. Kontynuować inkubację przez 48 godzin w temperaturze 37 °C. Komórki znakowane GFP i lucyferazą można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po 0 godzinach, 24 godzinach i 48 godzinach po żelowaniu.
      UWAGA: Proliferację komórek można zmierzyć dla zastosowanych tutaj komórek 4T1 znakowanych GFP i lucyferazy, dodając sól potasową kwasu (S)-4,5-dihydro-2-(6-hydroksy-2-benzotiazolylo)-4-tiazolekarboksylowego (patrz tabela materiałów) do studzienek przez 10 minut i wykonując obrazowanie bioluminescencyjne za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego (patrz tabela materiałów). Po obrazowaniu bioluminescencyjnym można uwidocznić cytoszkielet (patrz punkt 10).
  2. Korzystanie z komórek bez etykiet
    1. Używając roztworu żelu o pH 7,4, ponownie zawiesić granulowane, nieznakowane komórki 4T1 do stężenia 500 000 lub 1 000 000 komórek/ml roztworu żelu. Dodać 16 μl roztworu komórek żelowych do każdego dołka 16-dołkowego szkiełka podstawowego i płytki 96-dołkowej. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 100 μl pożywki do każdego dołka. Kontynuować inkubację przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Można zmierzyć żywotność komórek (patrz punkt 11). Szkiełko z 16-dołkową komorą może być używane do obrazowania, a 96-dołkowa płytka może być używana do oznaczania ilościowego.

7. Barwienie H & E

  1. W przypadku tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie, zanurz szkiełka zawierające skrawki 5 μm dwukrotnie w 100% ksylenie (5–10 min) w celu odparafinowania. Uwodnij się, zanurzając w 100%, 95%, 85% i 70% etanolu na 5 minut, a następnie w wodzie DI na 5 minut. Przejdź do kroku 7.6.
  2. W przypadku zamrożonych skrawków tkanek należy pobrać skrawki bezpośrednio z zamrażarki i zanurzyć je w 10% NBF na 10 minut. Umyć w 1x PBS trzy razy po 5 minut każdy. Płukać w wodzie przez 5 min.
  3. Jądra barwić hematoksyliną przez 3 min. Płukać pod bieżącą wodą z kranu.
  4. Rozróżnić, zanurzając 1-2 razy w 0,3% kwaśnym alkoholu (0,3% HCl w 70% etanolu). Płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.
  5. Dodawać środek niebieszczący przez 30 s. Płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Zanurzyć w 95% etanolu na 30 s.
  6. Inkubować z eozyną przez 90 s w temperaturze pokojowej. Odwodnić w 3 przemianach 100% etanolu przez 5 minut każda.
  7. Zanurz dwukrotnie w 100% ksylenie na 5 minut każdy. Dodać do szkiełka materiał montażowy z plastyrenem-plastyfikatorem i ksylenem (DPX0) i dodać szkiełko nakrywkowe. Pozwól mu utwardzić się przez noc przed obrazowaniem.

8. Barwienie 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naftol

  1. Przygotować roztwór 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naftolu.
    1. Dodać 0,5 g proszku 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naftol do zlewki ze 100 ml glikolu propylenowego. Podgrzać do 95–100 °C, mieszając przez co najmniej 30 minut. Nie dopuścić do przekroczenia temperatury 100 °C.
    2. Zdjąć zlewkę z ognia i pozostawić do lekkiego ostygnięcia. Przelać roztwór przez jakościową bibułę filtracyjną klasy 4, aby usunąć wszelkie pozostałości cząstek stałych.
      UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej i należy go przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,45 μm bezpośrednio przed barwieniem.
  2. Zabarwić zamrożone skrawki tkanek.
    1. Wyjmij szkiełka z zamrażarki w temperaturze -80 °C i susz na powietrzu przez 30 minut. Wstępnie schłodzić 10% NBF w temperaturze -20 °C przez 30 minut w słoiku Coplin. Zamocuj szkiełka w temperaturze pokojowej na 10 minut. Umyj w wodzie DI 3 razy po 5 minut.
    2. Usuń nadmiar wody za pomocą delikatnej chusteczki roboczej przed zanurzeniem w glikolu propylenowym 2 razy na 5 minut każdy. Usuń szkiełka z glikolu propylenowego. Nie spłukiwać.
    3. Umieścić szkiełka w przefiltrowanym strzykawką roztworze barwiącym Oil Red O na 3 godziny w temperaturze pokojowej.
    4. Rozróżnić, umieszczając szkiełka w 85% glikolu propylenowym na 5 minut. Próbki należy płukać w PBS dwukrotnie przez 5 minut każda.
    5. Próbki należy barwić hematoksyliną przez 30 sekund. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut, a następnie umieścić szkiełka w wodzie DI.
    6. Umieść próbki za pomocą wodnego podłoża montażowego i pozostaw pożywkę do wyschnięcia przez noc przed obrazowaniem.

9. Reologia

  1. Przynieś roztwory żelu wstępnego z kroku 5.4 do reometru na lodzie.
  2. Przymocuj ramię i płytkę 25 mm do reometru. Otwórz oprogramowanie reologiczne na komputerze podłączonym do reometru.
  3. Wykonaj mapowanie obrotowe i określ przerwę zerową. Po zakończeniu podnieś ramię.
  4. Odpipetować 500 μl żelu wstępnego na płytkę. Opuść ramię, aż roztwór żelu wstępnego całkowicie zajmie szczelinę między płytką a ramieniem. Zachowaj ostrożność, ponieważ opuszczenie ramienia powyżej tego punktu spowoduje wylanie się roztworu żelu z boku.
  5. Przeprowadzić przemiatanie częstotliwości roztworu wstępnego żelu w zakresie od 0,1 do 100 Hz po pozostaniu w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  6. Po zakończeniu podnieś ramię reometru. Wytrzyj płyn delikatną chusteczką zadaniową. Spłucz wodą DI i przetrzyj delikatną chusteczką zadaniową. Powtórzyć kroki 9.4–9.6 z dodatkowymi próbkami.

10. Barwienie F-aktyny sprzężone z falloidyną

  1. Doprowadzić sprzężony roztwór falloidyny do temperatury pokojowej. Krótko odwirować na niskich obrotach przed otwarciem. Podwielokrotność roztworu wystarczającą do oznaczenia, a resztę przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Rozcieńczyć 1000x sprzężony roztwór podstawowy falloidyny z 1x roztworem roboczym, dodając 1 μl roztworu podstawowego do 1 ml 1x PBS + 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). To wystarcza na 10 dołków (100 μl / studzienkę).
    UWAGA: Można użyć zwykłego 1x PBS, ale preferowany jest 1x PBS + BSA, aby zapobiec przywieraniu koniugatu falloidyny do probówki. Nie przechowywać tego roztworu po wykonaniu testu. 1 μl roztworu roboczego z niebieskim barwnikiem fluorescencyjnym (patrz Tabela materiałów) można dodać do barwienia jąder. Roztwór roboczy można przygotować przez zmieszanie 1 μL 20 mM niebieskiego barwnika fluorescencyjnego z 11,3 μL 1x PBS.
  3. Odessać pożywkę ze studzienek (krok 6.1). Przepłukać studzienki 1x PBS.
  4. Dodaj 10% NBF. Inkubować studzienki z 10% NBF przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant. Myć 3 razy PBS przez 5 minut za każdym razem.
  5. Dodać 0,1% t-oktylofenoksypolietylenu w PBS przez 5 min. Odessać i przemyć 3 razy PBS przez 5 min za każdym razem.
  6. Dodać 100 μl roztworu roboczego z kroku 10.2 do każdego dołka. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać i przemyć 3 razy PBS przez 5 minut za każdym razem. Pozostawić w PBS w temperaturze 4 °C.
  7. Zassać i wyjąć studzienki z uszczelki na suwaku komory. Użyj pęsety z końcówką igłową, aby usunąć uszczelkę z suwaka. Mocować i nakrywać próbki za pomocą wodnego podłoża mocującego. Pozostawić do utwardzenia (5 min).
  8. Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym przy wzbudzeniu/emisji 590/618 nm.

11. Test żywotności

  1. Przepłukać komórki PBS (DPBS) firmy Dulbecco. Do każdej studzienki dodać 100 μl DPBS zawierającego 1 μM kalceinę AM i 2 μM homodimer etydyny. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Zobrazuj 16-dołkowe szkiełko komorowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Acetoksymetyl kalceiny (kalceina AM) można zaobserwować przy wzbudzeniu/emisji = 494/517 nm. Homodimer etydyny można zaobserwować przy wzbudzeniu/emisji = 528/645 nm.
  3. Odczytaj 96-dołkową płytkę na czytniku płytek, używając tych samych długości fal co w kroku 11.2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MFP zostały zdecelulowane po napromieniowaniu przy użyciu procedury pokazanej na rysunku 1A. Pokazano urządzenia wielofunkcyjne przed decelularyzacją (rysunek 1B) i po decelularyzacji (rysunek 1C). Decelularyzacja została potwierdzona za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H i E), a barwienie 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naftol zastosowano barwienie 1-([4-(Xylylazo)xylyl]-2-naftol (ryc. 2). Właściwości reologiczne hy...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda tworzenia hydrożelu jest w dużej mierze zależna od ilości tkanki wyjściowej. Mysie urządzenia wielofunkcyjne są małe, a proces decelularizacji powoduje znaczne zmniejszenie ilości materiału (tabela 1). Proces można powtórzyć z większą liczbą urządzeń wielofunkcyjnych, aby zwiększyć ostateczną wydajność. Frezowanie to kolejny ważny krok, który może prowadzić do strat materiału. Inni odnieśli sukces z młynem kriogenicznym, ale ten protokół opiera się na mieleniu za pomocą ręcznego moździerza i wi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr Laurze L. Bronsart za dostarczenie komórek GFP i lucyferazy-4T1, dr Edwardowi L. LaGory za porady dotyczące barwienia 1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naftol, Dr. Craigowi L. Duvallowi za zastosowanie IVIS i liofilizatora oraz dr Scottowi A. Guelcherowi za użycie reometru. Badania te były wspierane finansowo przez #R00CA201304 grantu NIH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10% neutralna buforowana formalina, kostka z króćcemVWR16004-128-2-metylobutan
Alfa Aesar19387-AR
2000ex ReometrTA Instruments10D4335reometr
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA1933-25G-kalceina
acetoksymetylowa (kalceina AM)Sondy molekularne, Inc.C1430-D-Lucyferin
Firefly, sól potasowaBiosynth Chemia i BiologiaL-8820(S)-4,5-dihydro-2-(6-hydroksy-2-benzotiazolylo)-4-tiazolokarboksyl sól potasowa
DPX Uchwyt do histologiiSigma-Aldrich06522-500ML-Sól
fizjologiczna buforowana fosforanami DulbeccoGibco
14040133-Eozyna-Y z floksynąRichard-Allan Scientific71304homodimer
eozyny etydynySondy molekularne, Inc.E1169ethidium homodimer-1 (EthD-1)
Płodowa surowica bydlęcaSigma-AldrichF0926-500ML-Fisher
Healthcare Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571podłoże do zatapiania kriostatu
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01wodne podłoże montażowe
FreeZone 4.5Labconco7751020liofilizator
Hoechst 33342 Roztwór (20 mM)Thermo Scientific62249niebieski barwnik fluorescencyjny
Kwas solnySigma-Aldrich258148-500ML-IVIS
Lumina IIIobrazowania bioluminescencyjnegoElmerCLS136334
Kimtech Science KimwipesKimberly Clarkdelikatne chusteczki
do zadańn-propanol (bez nadtlenku/sekwencjonowania), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1130-500-Oil
Red OSigma-AldrichO0625-25G1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinderOPS Diagnostics, LLCCG-08-02-PBS
(10X), pH 7,4Quality Biological, Inc.119-069-151Sól fizjologiczna buforowana fosforanami
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122-Pepsyna
z błony śluzowej żołądka świniPepsynaSigma-AldrichP6887-5G
Kwas nadoctowySigma-Aldrich77240-100ML-Phalloidin-iFluor
594 Odczynnik (ab176757)abcamab176757koniugat
falloidynyGlikol propylenowySigma-AldrichW294004-1KG-K-Richard-Allan
Odczynnik do odniebieszczenia Scientific Signature SeriesRichard-Allan Scientific7301Lniebieszczący
Richard-Allan Scientific Signature Series Hematoxylin 7211Richard-Allan Scientific7211-RPMI
Medium 1640Gibco11875-093-Deoksycholan
sodu, 98%Frontier ScientificJK559522kwas deoksycholowy
SacharozaSigma-AldrichS5016-Triton
x-100Sigma-AldrichX100-100MLem>t-oktylofenoksyetoksyetanol
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco25200-056-Whatman
jakościowa bibuła filtracyjna, klasa 4Whatman1004-110jakościowa bibuła filtracyjna klasy 4
Ksyleny (certyfikowany ACS), Fisher ChemicalFisher ScientificX5-4-
System środek <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
  4. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
  5. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  6. Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
  7. Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
  8. Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
  9. Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
  12. Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
  13. Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
  14. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
  15. Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
  16. Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
  17. Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
  18. Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
  19. Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
  20. Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Matrix HydrogelsRadiation EffectsDecellularization ProcessMurine Mammary Fat PadHydrogel FabricationRheological PropertiesCell Proliferation AssayPhalloidin Conjugate StainingFluorescence MicroscopyScanning Electron Microscopy

Related Articles