Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Summary

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Abstract

Neurony zróżnicowane w dwuwymiarowej kulturze od ludzkich pluripotencjalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych (NPC) reprezentują potężny system modelowy do badania mechanizmów chorobowych i przeprowadzania badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) w celu zbadania bibliotek związków lub identyfikacji fenotypów mutacji genów. Jednak w przypadku komórek ludzkich przejście od NPC do funkcjonalnego, dojrzałego neuronu trwa kilka tygodni. Synapsy zazwyczaj zaczynają się tworzyć po 3 tygodniach różnicowania w kulturze jednowarstwowej, a kilka białek specyficznych dla neuronów, na przykład późniejszy marker panneuronalny NeuN lub marker neuronu korowego warstwy 5/6 CTIP2, zaczyna ulegać ekspresji około 4-5 tygodni po różnicowaniu. Ten długi czas różnicowania może być niezgodny z optymalnymi warunkami hodowli stosowanymi w przypadku wielodołkowych platform HCS o małej objętości. Wśród wielu wyzwań znajduje się potrzeba dobrze przylegających, równomiernie rozmieszczonych komórek z minimalnym grupowaniem komórek oraz procedury hodowli, które sprzyjają długoterminowej żywotności i funkcjonalnemu dojrzewaniu synaps. Jednym z podejść jest różnicowanie neuronów w formacie o dużej objętości, a następnie ponowne platerowanie ich w późniejszym punkcie czasowym w wielodołkowych pojemnikach kompatybilnych z HCS. Niektóre główne wyzwania związane ze stosowaniem tego podejścia do posiewu dotyczą odtwarzalności i żywotności komórek ze względu na stresujące zakłócenia sieci dendrytycznej i aksonalnej. Tutaj demonstrujemy szczegółową i niezawodną procedurę enzymatycznego ponownego zawieszania neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) po ich różnicowaniu przez 4-8 tygodni w formacie o dużej objętości, przenoszeniu ich na 384-dołkowe płytki mikromiareczkowe i hodowli przez kolejne 1-3 tygodnie z doskonałą przeżywalnością komórek. To ponowne powlekanie ludzkich neuronów nie tylko pozwala na badanie składania i dojrzewania synaps w ciągu dwóch tygodni od ponownego posiewania, ale także umożliwia badania nad regeneracją neurytów i charakterystyką stożków wzrostu. Przedstawiamy przykłady skalowalnych testów neurytogenezy i synaptogenezy przy użyciu platformy 384-dołkowej.

Introduction

Neurony pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) są coraz bardziej istotne w obszarach badań podstawowych, rozwoju leków i medycyny regeneracyjnej. Przepływy pracy i procedury mające na celu optymalizację ich hodowli i utrzymania oraz poprawę efektywności różnicowania w określone podtypy neuronów szybko ewoluują^1,2. Aby poprawić użyteczność i opłacalność neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych jako systemów modelowych podatnych na analizy o wysokiej zawartości w procesie odkrywania leków i walidacji celów, przydatne jest skrócenie czasu hodowli wymaganego do wygenerowania dojrzałych, funkcjonalnych neuronów, przy jednoczesnym zachowaniu maksymalnej odporności, odtwarzalności i istotności fenotypu. Chociaż trójwymiarowe hodowle organoidów są motorem przełomu w badaniach nad neurorozwojem³, 2-wymiarowe hodowle jednowarstwowe są szczególnie kompatybilne z aplikacjami opartymi na zautomatyzowanym obrazowaniu ze względu na ich minimalną grubość tkanki.

Jednak adaptacja metod badań przesiewowych opartych na obrazowaniu do modeli ludzkich chorób neurologicznych i neurorozwojowych stoi przed poważnym wyzwaniem. Wydłużone ramy czasowe, w których ludzki układ nerwowy dojrzewa in vivo, wymagają wydłużenia czasu w hodowli, aby dostosować się do naturalnych programów ekspresji genów i osiągnąć dojrzałość neuronalną.

Jedną z praktycznych konsekwencji długotrwałego programu różnicowania neuronów jest to, że utrzymanie kultur jednowarstwowych pochodzących z hiPSC musi być utrzymywane przez wiele tygodni, aby osiągnąć odpowiednią dojrzałość synaps. W tym czasie neuronalne komórki progenitorowe, które pozostają niezróżnicowane, nadal się dzielą. Mogą one szybko przerosnąć kulturę i przywłaszczyć sobie zawartość składników odżywczych niezbędną do utrzymania żywotnych neuronów postmitotycznych. Energicznie dzielące się nerwowe komórki progenitorowe (NPC) mogą również konkurować z neuronami o substrat wzrostu. Może to spowodować, że takie kultury będą narażone na problemy ze słabą adhezją, co jest stanem nieodpowiednim do testów opartych na obrazowaniu. Co więcej, wielu badaczy stwierdza, że im mniejsza objętość hodowli, tym większa trudność w utrzymaniu zdrowych populacji zróżnicowanych neuronów wystarczająco długo, aby zaobserwować późne stadia różnicowania neuronów. Innymi słowy, testy dojrzewania synaps przy użyciu metod badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) mogą być bardzo trudne dla neuronów pochodzenia ludzkiego.

Aby obejść niektóre z tych problemów, zastosowano procedurę ponownego zawieszania i ponownego powlekania wcześniej zróżnicowanych neuronów pochodzących z hiPSC. Po pierwsze, pozwala na badanie wzrostu neurytów (a dokładniej ich regeneracji) w populacji w pełni zaangażowanych neuronów. Po drugie, ponowne rozszczepienie wcześniej zróżnicowanych neuronów z formatu o dużej objętości (np. płytki 10 cm lub większej) do formatów o małej objętości (takich jak 96- lub 384-dołkowe płytki mikromiareczkowe zgodne z HCS) umożliwia znaczne skrócenie całkowitego czasu hodowli w warunkach małej objętości. Ułatwia to badanie montażu i dojrzewania synaps w kolejnych tygodniach in vitro.

Jednak ponowne tworzenie dojrzałych neuronów, które już mają długie neuryty i złożoną sieć połączeń, stanowi kilka wyzwań, jednym z nich jest czasami wysokie i zmienne tempo śmierci komórek. W tym miejscu opisujemy procedurę ponownego powlekania, która skutkuje doskonałą przeżywalnością i odtwarzalnością komórek. Zwykle neurony są wystawione na działanie enzymów proteolitycznych przez krótkie okresy inkubacji (zwykle ~ 3-10 min) w celu odłączenia komórek od substratu przed roztarciem. Ten krótki czas proteolizy jest zwyczajowo używany do ponownego zawieszania i przechodzenia wielu typów dzielących się komórek, w tym komórek nieneuronalnych i niezróżnicowanych komórek progenitorowych^4,5,6. Jednak w przypadku zróżnicowanych neuronów zawierających długie, połączone ze sobą neuryty, konieczne jest nie tylko oderwanie komórek od substratu, ale także przerwanie sieci dendrytycznej i aksonalnej w celu wyizolowania pojedynczych komórek przy jednoczesnej minimalizacji uszkodzeń. Rzeczywiście, gruba siatka neuronów zwykle ma tendencję do odrywania się od podłoża jako pojedynczy arkusz, a nie jako pojedyncze komórki. Jeśli nie zadba się o rozluźnienie gęstej sieci neurytów, neurony nie tylko ulegają nieodwracalnemu uszkodzeniu podczas trituracji, ale wiele z nich nie przechodzi przez filtr używany do usuwania grudek, co skutkuje słabą wydajnością komórek. Poniżej opisujemy prostą modyfikację szeroko stosowanej procedury inkubacji proteazy, aby przeciwdziałać tym trudnościom.

W opisanym poniżej protokole, neurony są inkubowane przez 40-45 minut z łagodną proteazą, taką jak enzym proteolityczny (np. Accutase). W ciągu pierwszych 5-10 minut po dodaniu enzymu sieć neuronalna unosi się z podłoża w postaci arkusza. Inkubacja z proteazą trwa dodatkowe 30-40 minut, a następnie przechodzi do delikatnego rozcierania i filtrowania. Ten dodatkowy czas inkubacji pomaga zapewnić, że trawienie materiału rozluźnia sieć międzykomórkową, zapewniając w ten sposób, że późniejsze trituration wytwarza zawieszenie poszczególnych komórek. Ta procedura maksymalizuje jednorodność rozmieszczenia komórek po ponownym posiewaniu, jednocześnie minimalizując śmierć komórki. Z powodzeniem zastosowaliśmy tę metodę remembraningu do kultur neuronalnych pochodzących z hiPSC generowanych przez różne protokoły różnicowania^7,8 oraz z różnych linii hiPSC. Procedura jest nominalnie odpowiednia do stosowania z większością lub wszystkimi liniami neuronów pochodzących z komórek macierzystych. Zaobserwowaliśmy, że wydłużony czas inkubacji proteazy nie jest absolutnie niezbędny do ponownego posiewu kultur z płytek małoformatowych (np. o średnicy 35 mm); Jednak, jak pokazujemy tutaj, zapewnia to znaczące korzyści podczas ponownego powlekania z płytek o dużej średnicy (np. o średnicy 10 cm lub większej), prawdopodobnie dlatego, że neuryty w takich płytkach mogą rozciągać bardzo długie procesy i tworzyć gęsto połączony układ.

Tutaj demonstrujemy tę metodę i krótko ilustrujemy jej zastosowanie w testach wczesnej neurytogenezy i dojrzewania synaps, które obejmują grupowanie białek pre- i postsynaptycznych wzdłuż dendrytów i aksonów, a następnie ich późniejszą kolokalizację w miejscach synaptycznych. Przykłady te podkreślają korzyści, jakie oferuje ten protokół w zakresie zachowania żywotności i odtwarzalności komórek. Po pierwsze, pozwala badaczom badać wczesne etapy neurytogenezy człowieka. Warunki eksperymentalne są podobne do powszechnie stosowanych pierwotnych kultur neuronów korowych lub hipokampowych gryzoni, w których komórki są ekstrahowane z mózgu późnego płodu lub wczesnego okresu poporodowego, dysocjowane przez triturację po delikatnym leczeniu proteazą i pozwalają na inicjację neurytów lub regenerację neurytów, które zostały odcięte w procedurze9^,10. Podobnie jak w przypadku takich pierwotnych neuronów gryzoni, neurony pochodzące z hiPSC zaczynają tworzyć lub regenerować swoje neuryty w ciągu kilku godzin po ponownym posiewaniu, umożliwiając obrazowanie stożków wzrostu i morfologii neurytów w środowisku optymalnym dla obrazowania w czasie o dużej liczbie otaczających niezróżnicowanych komórek. Zaobserwowaliśmy, że wzrost neurytów jest bardziej zsynchronizowany w porównaniu ze zmiennymi opóźnieniami i różnymi wskaźnikami wzrostu obserwowanymi, gdy neurony po raz pierwszy zaczynają różnicować się od populacji progenitorowej. Ponadto ponowne powlekanie umożliwia testowanie neuronów wyrażających markery podtypu neuronalnego, które zwykle pojawiają się później w rozwoju neuronalnym, takie jak czynnik transkrypcyjny warstwy korowej 5/6 CTIP2 (białko oddziałujące z czynnikiem transkrypcyjnym promotora białka 2 w warstwie kurzej) lub marker panneuronalny NeuN¹¹. Szczególnie przydatną cechą podejścia opartego na posiewach jest to, że synaptogeneza przebiega w ramach czasowych zgodnych z HCS.

Protocol

1. Okres różnicowania przed powtórzeniem

1. Różnicuj neurony na 10-centymetrowych szalkach, korzystając z wybranego protokołu^7,8, aż neurony utworzą grubą sieć ze swoimi procesami i nie wyrażają nie tylko wczesne markery neuronalne, takie jak MAP2 lub TuJ1, ale także późne markery, takie jak NeuN.
2. Zmieniaj połowę wybranej pożywki co 4 dni podczas procesu różnicowania neuronów.
   UWAGA: Bardziej rozległe lub częste zmiany podłoża rozcieńczają istotne czynniki troficzne i mogą niekorzystnie wpływać na dojrzewanie.
   1. W przypadku neuronów WT126 pochodzących z iPSC należy użyć następujących pożywek do hodowli po różnicowaniu: 5 ml 100x suplementu N2, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 μg / ml lamininy, 200 μM kwasu askorbinowego, 1 μM dibutyryl-cAMP i 10 ml SM1 dla 500 ml zmodyfikowanej mieszanki Eagle / składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12). Stopniowo, stosując zmiany półpożywki, zastąp je podstawowym podłożem neuronalnym (Tabela materiałów) i tymi samymi suplementami.
   2. W przypadku neuronów CVB WT pochodzących z iPSC należy użyć następującej pożywki do hodowli po różnicowaniu: 500 ml neuronalnej podstawowej pożywki A (tabela materiałów) i 500 ml pożywki DMEM/F12 z 2 μg/ml lamininy, 10 ml suplementu glutaminy (tabela materiałów), 0,75 mg/ml wodorowęglanu sodu, 5 ml minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) aminokwasów endogennych, 0,2 mM kwasu askorbinowego, 10 ng/ml BDNF, 20 ml 50x B27 i 10 ml 100x suplement N2.

2. Powlekanie wielostudzienek

1. Dzień przed ponownym poszyciem pokryć poli-L-ornityną (PLO). Rozpuścić PLO w sterylnej wodzie, aby uzyskać roztwór podstawowy (10 mg/ml). Przechowuj ten bulion w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć PLO w stosunku 1:100 w wodzie, aby uzyskać stężenie 50 μg/ml podczas powlekania szkła i w stosunku 1:1 000 (10 μg/ml) podczas powlekania tworzywa sztucznego.
2. Powłokę należy nakładać bezpośrednio na płyty docelowe. Użyć objętości powłoki odpowiedniej do wielkości płytki (tj. w przypadku płytki 24-dołkowej należy zastosować 500 μl roztworu PLO na dołek).
3. Pozostaw talerze na noc w ciemności w temperaturze pokojowej.
4. Pobrać powlekane płytki w dniu ponownego powlekania i przenieść do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego.
5. Zassać roztwór PLO i spłukać dwukrotnie sterylną wodą.
6. Rozcieńczyć lamininę (1,15 mg/ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w rozcieńczeniu 1:400.
   nuta: Rozmrozić lamininę w temperaturze 4 °C i szybko dodać do PBS, aby uniknąć agregacji lamininy i nierównomiernego powlekania.
7. Odessać sterylną wodę i nałożyć 500 μl powłoki lamininowej na studzienki uprzednio pokryte PLO.
8. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na minimum 4-6 godzin. W przypadku powierzchni szklanych należy stosować dłuższe inkubacje, do 16 godzin. Stosuj stałe czasy inkubacji.

3. Odtwarzanie zróżnicowanych neuronów

1. Raz delikatnie przepłukać płytkę zróżnicowanych neuronów PBS. Delikatnie rozprowadź PBS wzdłuż ścianki płytki, a nie bezpośrednio na komórkach, aby uniknąć ich zakłócenia.
2. Delikatnie zasysaj PBS, uważając, aby nie dotykać komórek bezpośrednio, ale odsysać od krawędzi naczynia, przechylając je w kierunku badacza.
3. Nałożyć co najmniej 1 ml enzymu proteolitycznego (tabela materiałów) na 10 cm płytkę i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze. Dodaj nieco większe objętości, jeśli pomieszczenie do hodowli tkankowej wykazuje wysoką szybkość parowania z powodu niskiej wilgotności.
4. Inkubuj komórki enzymem proteolitycznym przez 40-45 minut, aby oderwać je od płytki i odłączyć od innych neuronów w sieci neuronalnej.
   nuta: Czas na tym etapie ma kluczowe znaczenie. Zbyt wczesne wygaszenie proteazy może prowadzić do zwiększonej śmierci komórki po ponownym posianiu. Producent enzymu proteolitycznego zaleca, aby w przypadku pasażowania linii komórkowych (np. przez noc w temperaturze 4 °C stosować temperatury znacznie niższe niż 37 °C przy dłuższych okresach inkubacji). Należy jednak unikać obchodzenia się z neuronami w temperaturze 4 °C, ponieważ często wykazują one słabą przeżywalność po ekspozycji na zimno. Producent podaje również, że 60-minutowa inkubacja z enzymem w temperaturze 37 °C prowadzi do jego enzymatycznej inaktywacji. Jednak z doświadczenia autorów wynika, że 40-45 minutowa inkubacja kultur neuronalnych pochodzących z hiPSC w temperaturze 37 °C jest wystarczająca do skutecznej dysocjacji i doskonałego przeżycia neuronów po ponownym posiewie.
5. Sprawdź neurony pod mikroskopem z kontrastem fazowym w czasie inkubacji i pozwól na kontynuowanie leczenia proteazą, dopóki sieć neuronowa całkowicie nie odłączy się od płytki i nie zacznie rozpadać się na mniejsze arkusze po krótkim potrząśnięciu płytką pod mikroskopem.
6. Stłumić aktywność proteazy za pomocą 5 ml świeżej pożywki DMEM na 1 ml proteazy na 10 cm płytce, aby zatrzymać trawienie. Delikatnie rozcieraj komórki na płytce 5-8 razy, aby przerwać sieć, używając pipet serologicznych. Uważaj, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku podczas trituringu, ponieważ zróżnicowane neurony są delikatne. Nie używaj końcówki P1000, ponieważ jej koniec jest zbyt ostry i wąski, a tym samym może prześwitywać lub uszkodzić neurony.
7. Roztwór z komórkami należy nakładać kropla po kropli przez sitko o średnicy 100 μm do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
8. Przepłucz sitko dodatkowymi 5 ml świeżej pożywki DMEM, po przefiltrowaniu komórek.
9. Wirować komórki w wirówce stołowej przy 1 000 x g przez 5 minut.
10. Włóż stożkową rurkę z powrotem do szafy bezpieczeństwa biologicznego i odessaj większość pożywki, pozostawiając około 250 μl, aby zapewnić zatrzymanie wilgoci przez komórki.
11. Delikatnie zawieś komórki w 2 ml świeżej pożywki DMEM. Nie pipetować granulki do boku probówki. Zamiast tego delikatnie odwróć stożkowy 2-3 razy i przepuść komórki przez koniec pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby je usunąć.
12. Nałóż 10 μl zawieszonych neuronów na krawędź hemocytometru.
13. Dodać 8-10 μl błękitu trypanowego do kropelki komórek, aby ocenić żywotność komórek na tym etapie ponownego zawieszania. Nanieść 10 μl tej mieszaniny na hemocytometr lub inne automatyczne liczniki komórek. Oceń jako żywotne te komórki, które są jasne fazowo i wykluczają barwnik błękitu trypanowego.
14. Określ ilość żywotnych komórek/ml i przygotuj się do rozcieńczenia zawartości stożkowej probówki zgodnie z pożądaną gęstością komórek.
15. Płytka ~ 10 000 komórek na dołek dla płytki 384-dołkowej; płytka ~ 150 000-200 000 komórek na studzienkę dla płytki 24-dołkowej.
16. Dodać świeży DMEM do stożkowej probówki z zawieszonymi komórkami, aby uzyskać odpowiednie rozcieńczenie i dodać dodatkowe odpowiednie suplementy, takie jak B27 i/lub BDNF, w zależności od wymagań konkretnej linii komórkowej.
17. Delikatnie przechyl stożkową rurkę, aby wymieszać 2-3 razy.
18. Odessać powłokę lamininową z płytki 24-dołkowej lub z płytki wielodołkowej 384-dołkowej za pomocą 16-kanałowej pipety i przepłukać raz PBS.
19. Zassać PBS za pomocą P1000 w przypadku płytki 24-dołkowej lub pipety 16-kanałowej w przypadku płytek 384-dołkowych.
20. Nałóż roztwór komórkowy do każdej studzienki ruchem ósemkowym, aby uniknąć zbrylania. Jednorodność posiewu można również zoptymalizować za pomocą zautomatyzowanych urządzeń do obsługi cieczy.
    nuta: Dodanie lamininy do pożywki rozpoczynające się 2-4 dni po ponownym posiewie pomaga również w utrzymaniu jednorodnego rozmieszczenia komórek.
21. Powtórz kroki 3.19 i 3.20 dla każdej studzienki.
22. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze ustawionym na temperaturę 37 °C i 5% CO_{2 .}
23. Po 2 dniach należy rozpocząć wymianę połowy pożywki co 4 dni, używając pożywek do hodowli po różnicowaniu opisanych w punkcie 1.2. Po upływie pożądanego czasu dojrzewania utrwalić kultury przy użyciu 3,7% formaldehydu w temperaturze 37 °C i wybarwić komórki zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi.

4. Testy żywotności komórek po ponownym posiewie

1. Dodać reporter wczesnej śmierci komórki (VivaFix: 0,5 μl roztworu podstawowego 50 μl na 500 μl pożywki hodowlanej na basenik) po krótkim wirowaniu roztworu podstawowego.
2. Zobrazować żywe i martwe komórki hodowane na studzienkach ze szklanym dnem, po 20 minutach, bez żadnego etapu mycia, ponieważ barwnik fluoryzuje tylko raz wewnątrz komórek, lub utrwalić i wybarwić za pomocą 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) i / lub innych przeciwciał przed obrazowaniem przy użyciu mikroskopu konfokalnego.

5. Barwienie immunologiczne

1. Utrwal kultury z 3,7% formaldehydem w PBS plus 120 mM sacharozy przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
2. Płukać i przepuszczać przez 0,2% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie blokować na 30 minut 2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA).
3. Odessać BSA bez płukania i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z króliczym przeciwciałem anty-MAP2 1:1,000, mysim przeciwciałem anty-β3-tubulinowym (TuJ1) 1:2,000, przeciwciałem anty-NeuN kurczaka (1:100) i szczurzym przeciwciałem anty-CTIP2 (1:500) lub z mysim przeciwciałem anty-PSD95 (1:200), króliczą antysynapsyną 1 (1:200) i przeciwciałem anty-MAP2 kurczaka do barwienia synaptycznego.
4. Przepłukać PBS i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluorem Alexa oraz DAPI przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
5. Na koniec przemyj dwukrotnie PBS przed obrazowaniem.

6. Obrazowanie wapnia

1. Zakażone hodowane komórki za pomocą AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (The Salk Institute for Biological Studies, GT3 Core Facility) po 10 dniach od ponownego posiewu i obrazowanie w celu oceny spontanicznych stanów przejściowych wapnia po 3-4 tygodniach od ponownego posiewu.

7. Akwizycja i analiza obrazu

UWAGA: Szczegółowe informacje na temat systemu akwizycji można znaleźć w Calabrese et al.¹².

1. Do pomiarów morfometrycznych należy użyć modułu obrazowania do ręcznej lub automatycznej akwizycji obrazu oraz modułu oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak CellProfiler¹³.
2. Oblicz średnią długość neurytów TuJ1 dodatnich i dendrytów dodatnich MAP2, mierząc całkowitą długość na pole widzenia podzieloną przez liczbę neuronów (komórki dodatnie DAPI + MAP2 lub TuJ1) w tym samym polu.

Results

Ponowne platerowanie neuronów pochodzących z hiPSC, które były różnicowane przez wiele tygodni, ma kilka zalet. Jednak odłączanie i ponowne powlekanie zróżnicowanych neuronów, które mają długie, połączone ze sobą dendryty i aksony (Rysunek 1A) może spowodować wysoki odsetek nieodwracalnie uszkodzonych neuronów.

Jak opisano w sekcji protokołu, użyliśmy inkubacji z enzymem proteolitycznym do odłączenia neuronów od substratu. Zazwyczaj, ze względu na i...

Discussion

Wykazaliśmy prostą procedurę ponownego zawieszania i ponownego powlekania ludzkich kultur neuronalnych, która optymalizuje żywotność, sukces różnicowania i obrazowanie subkomórkowe w sposób zgodny z platformami przesiewowymi o wysokiej zawartości i innymi testami istotnymi dla odkrywania leków. Rysunek 6 ilustruje ogólny przepływ pracy i przykłady takich zastosowań.

Chociaż tutaj skupiliśmy się na neuronach pochodzących z hiPSC, które są skierowane na los neuronów...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Post Replating Media
L-Ascorbic Acid	Sigma	A4403	Dodaj 1 ml 200 mM bulionu do 1 l pożywki N2B27
Dibutyryl-cAMP	Sigma	D0627	Dodaj 1 &mikro; M
Human BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml stężenie końcowe
B27 (50x)	Thermofisher Scientific	17504044	Dodać 20 ml do 1 l pożywki N2B27
DMEM/F12 z Glutamax	Thermofisher Scientific	31331093	Dodać N2 i rozprowadzić w 50 ml stożkach; pokrywki do owijania parafilmu
Human GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/ml stężenie końcowe
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050038	Dodać 10 ml do 1 l pożywki N2B27; suplement glutaminy
Mysz Laminin	Sigma	P3655-10mg	Dodaj 100 &mikro; L do 50 ml N2B27
MEM Aminokwasy endogenne	Thermofisher Scientific	11140035	Dodaj 5 ml do 1 l pożywki N2B27 Suplement N2B27
17502048	Dodaj		5 ml do 500 ml
Neurobaseal A	Thermofisher Scientific	10888022	Połącz z DMEM/F12, aby wygenerować pożywkę N2B27 dla komórek CVB wt; neuronalny podstawowy A
media Neuropodstawowy	Thermofisher Scientific	21103049	do komórek WT126; Neuronalne podłoże podstawowe
SM1 Suplement	StemCell Technologies	5711	Dodaj 1:50 do podłoża
Wodorowęglan sodu	Thermofisher Scientific	25080-094	Dodać 10 ml do 1 l N2B27 pożywka
talerz Przygotowanie
10 cm Naczynia do hodowli tkankowych	Fisher Scientific	08772-E	Plastikowe naczynia poddane działaniu TC
6-dołkowe naczynia do hodowli tkankowych	Thomas Scientific	1194Y80	Talerze NEST
Mysz Laminin	Life Technologies	23017-015	Dodaj 1:400 na plastiku
Poli-Ornityna	Sigma	P3655-10mg	Dodaj 1:1,000 na plastiku
UltraPure Distilled Water	Life Technologies	10977-015	Do rozcieńczenia Odczynniki
< odczynników > odczynników
100 mM Sitko do komórek	Corning	431752	Sterylna, pojedynczo pakowana
płytka 384-dołkowa, niepowlekana	PerkinElmer	6007550	Coat z PLO i Lamininą
DPBS	Life Technologies	14190144	soli fizjologicznej
buforowanej fosforanem DulbeccoPłytki 384-dołkowe powlekane poli-D-lizyną	PerkinElmer	6057500	Spłukać przed pokryciem lamininą
StemPro Accutase	Life Technologies	A1110501	Nakładać 1 ml/10 cm płytkę przez 30-45 min; enzym proteolityczny
< strong> materiały utrwalające< / strong>
37% Formaldehyd	Fisher Scientific	F79-1	rozpuszczony w PBS
Sacharoza	Fisher Scientific	S5-12	0,8 g na 10 ml utrwalacza
immunologicznego materiału barwiącego
Alexa Fluor 488 Koza anty-mysie	przeciwciało drugorzędowe	Invitrogen	A-11001
Alexa Fluor 568 Koza anty-kurczak	Invitrogen	A-11041	przeciwciało drugorzędowe
Alexa Fluor 647 Koza anty-kurczak	Przeciwciało	drugorzędowe	A-21449
Alexa Fluor 561 Koza antyszczura	drugorzędowe	Invitrogen	A-11077
DAPI	Biotium	40043	wizualizuje DNA
Mysie przeciwciało przeciwko b3-tubulinie (TuJ-1)	Neuromika	MO15013	marker neuronalny wczesnego stadium
Przeciwciało szczura przeciwko CTIP2	Abcam	ab18465	warstwa 5/6 korowa neurony
Przeciwciało kurczaka przeciwko MAP2	LifeSpan Biosciences	LS-B290	marker neuronalny wczesnego stadium
Przeciwciało kurczaka przeciwko markerowi	neuronalnemu późnego stadium	Millipore	ABN91
Przeciwciało królika przeciwko MAP2	Shelley Halpain	N/A	marker neuronalny wczesnego stadium
Mysie przeciwciało przeciwko markerowi postsynaptycznemu PSD-95	Sigma	P-246
Przeciwciało królicze przeciwko synapsynie 1	Millipore	AB1543	marker presynaptyczny
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	GE Healthcare Life Sciences	SH30574,02	10% w PBS do blokowania
Titon X-100	Sigma	9002931	Rozcieńczony do 0,2% na PBS w celu przepuszczalności
Markery żywotności
Vivafix 649/660	Biorad	135-1118	marker śmierci komórkowej
Calcium Imaging
Nazwa odczynnika/ Firma produkująca sprzęt		katalogowy	Uwagi/
Opis AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE	THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility	N/A	reporter wapnia w systemie dostarczania wirusa
hiPSC NPC pochodzący z hiPSC
WT 126 (Y2610)	Gage lab	N/A	Marchetto et al., 2010
CVB WT24	Yeo i Goldstein labs	N/A	nieopublikowane