Method Article

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

DOI:

10.3791/59305

⸱

August 28th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of California, San Diego, 2Sanford Consortium for Regenerative Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony zróżnicowane w dwuwymiarowej kulturze od ludzkich pluripotencjalnych komórek progenitorowych pochodzących z komórek macierzystych (NPC) reprezentują potężny system modelowy do badania mechanizmów chorobowych i przeprowadzania badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS) w celu zbadania bibliotek związków lub identyfikacji fenotypów mutacji genów. Jednak w przypadku komórek ludzkich przejście od NPC do funkcjonalnego, dojrzałego neuronu trwa kilka tygodni. Synapsy zazwyczaj zaczynają się tworzyć po 3 tygodniach różnicowania w kulturze jednowarstwowej, a kilka białek specyficznych dla neuronów, na przykład późniejszy marker panneuronalny NeuN lub marker neuronu korowego warstwy 5/6 CTIP2, zaczyna ulegać ekspresji około 4-5 tygodni po różnicowaniu. Ten długi czas różnicowania może być niezgodny z optymalnymi warunkami hodowli stosowanymi w przypadku wielodołkowych platform HCS o małej objętości. Wśród wielu wyzwań znajduje się potrzeba dobrze przylegających, równomiernie rozmieszczonych komórek z minimalnym grupowaniem komórek oraz procedury hodowli, które sprzyjają długoterminowej żywotności i funkcjonalnemu dojrzewaniu synaps. Jednym z podejść jest różnicowanie neuronów w formacie o dużej objętości, a następnie ponowne platerowanie ich w późniejszym punkcie czasowym w wielodołkowych pojemnikach kompatybilnych z HCS. Niektóre główne wyzwania związane ze stosowaniem tego podejścia do posiewu dotyczą odtwarzalności i żywotności komórek ze względu na stresujące zakłócenia sieci dendrytycznej i aksonalnej. Tutaj demonstrujemy szczegółową i niezawodną procedurę enzymatycznego ponownego zawieszania neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) po ich różnicowaniu przez 4-8 tygodni w formacie o dużej objętości, przenoszeniu ich na 384-dołkowe płytki mikromiareczkowe i hodowli przez kolejne 1-3 tygodnie z doskonałą przeżywalnością komórek. To ponowne powlekanie ludzkich neuronów nie tylko pozwala na badanie składania i dojrzewania synaps w ciągu dwóch tygodni od ponownego posiewania, ale także umożliwia badania nad regeneracją neurytów i charakterystyką stożków wzrostu. Przedstawiamy przykłady skalowalnych testów neurytogenezy i synaptogenezy przy użyciu platformy 384-dołkowej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) są coraz bardziej istotne w obszarach badań podstawowych, rozwoju leków i medycyny regeneracyjnej. Przepływy pracy i procedury mające na celu optymalizację ich hodowli i utrzymania oraz poprawę efektywności różnicowania w określone podtypy neuronów szybko ewoluują1,2. Aby poprawić użyteczność i opłacalność neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych jako systemów modelowych podatnych na analizy o wysokiej zawartości w procesie odkrywania leków i walidacji celów, przydatne jest skrócenie czasu hodowli wymaganego do wygener....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Okres różnicowania przed powtórzeniem

  1. Różnicuj neurony na 10-centymetrowych szalkach, korzystając z wybranego protokołu7,8, aż neurony utworzą grubą sieć ze swoimi procesami i nie wyrażają nie tylko wczesne markery neuronalne, takie jak MAP2 lub TuJ1, ale także późne markery, takie jak NeuN.
  2. Zmieniaj połowę wybranej pożywki co 4 dni podczas procesu różnicowania neuronów.
    UWAGA:     Bardziej rozległe lub częste zmiany podłoża rozcieńczają istotne czynniki troficzne i mogą niekorzystnie wpływać na dojrzewanie.
    1. W przypadku neuronów WT126 pochodzących z iPSC....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponowne platerowanie neuronów pochodzących z hiPSC, które były różnicowane przez wiele tygodni, ma kilka zalet. Jednak odłączanie i ponowne powlekanie zróżnicowanych neuronów, które mają długie, połączone ze sobą dendryty i aksony (Rysunek 1A) może spowodować wysoki odsetek nieodwracalnie uszkodzonych neuronów.

Jak opisano w sekcji protokołu, użyliśmy inkubacji z enzymem proteolitycznym do odłączenia neuronów od substratu. Zazwyczaj, ze względu na i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazaliśmy prostą procedurę ponownego zawieszania i ponownego powlekania ludzkich kultur neuronalnych, która optymalizuje żywotność, sukces różnicowania i obrazowanie subkomórkowe w sposób zgodny z platformami przesiewowymi o wysokiej zawartości i innymi testami istotnymi dla odkrywania leków. Rysunek 6 ilustruje ogólny przepływ pracy i przykłady takich zastosowań.

Chociaż tutaj skupiliśmy się na neuronach pochodzących z hiPSC, które są skierowane na los neuronów.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest częścią National Cooperative Reprogrammed Cell Research Groups (NCRCRG) do badania chorób psychicznych i była wspierana przez grant NIH U19MH107367. Początkowe prace były również wspierane przez grant NIH NS070297. Dziękujemy doktorom Carol Marchetto i Fredowi Gage'owi z Instytutu Salka za dostarczenie linii komórek progenitorowych WT 126 oraz doktorom Eugene'owi Yeo i Lawrence'owi Goldsteinowi z UC San Diego za dostarczenie linii komórek progenitorowych CVB WT24. Dziękujemy Deborah Pre z laboratorium dr Anne Bang z Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute za przydatne dyskusje.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Post Replating Media
L-Ascorbic AcidSigmaA4403Dodaj 1 ml 200 mM bulionu do 1 l pożywki N2B27
Dibutyryl-cAMPSigmaD0627Dodaj 1 &mikro; M
Human BDNFPeprotech450-0210 ng/ml stężenie końcowe
B27 (50x)Thermofisher Scientific17504044Dodać 20 ml do 1 l pożywki N2B27
DMEM/F12 z GlutamaxThermofisher Scientific31331093Dodać N2 i rozprowadzić w 50 ml stożkach; pokrywki do owijania parafilmu
Human GDNFPeprotech450-1010 ng/ml stężenie końcowe
GlutamaxThermofisher Scientific35050038Dodać 10 ml do 1 l pożywki N2B27; suplement glutaminy
Mysz LamininSigmaP3655-10mgDodaj 100 &mikro; L do 50 ml N2B27
MEM Aminokwasy endogenneThermofisher Scientific11140035Dodaj 5 ml do 1 l pożywki N2B27 Suplement N2B27
17502048Dodaj5 ml do 500 ml
Neurobaseal AThermofisher Scientific10888022Połącz z DMEM/F12, aby wygenerować pożywkę N2B27 dla komórek CVB wt; neuronalny podstawowy A
media NeuropodstawowyThermofisher Scientific21103049do komórek WT126; Neuronalne podłoże podstawowe
SM1 SuplementStemCell Technologies5711Dodaj 1:50 do podłoża
Wodorowęglan soduThermofisher Scientific25080-094Dodać 10 ml do 1 l N2B27 pożywka
talerz Przygotowanie
10 cm Naczynia do hodowli tkankowychFisher Scientific08772-EPlastikowe naczynia poddane działaniu TC
6-dołkowe naczynia do hodowli tkankowychThomas Scientific1194Y80Talerze NEST
Mysz LamininLife Technologies23017-015Dodaj 1:400 na plastiku
Poli-OrnitynaSigmaP3655-10mgDodaj 1:1,000 na plastiku
UltraPure Distilled WaterLife Technologies10977-015Do rozcieńczenia Odczynniki
< odczynników > odczynników
100 mM Sitko do komórekCorning431752Sterylna, pojedynczo pakowana
płytka 384-dołkowa, niepowlekanaPerkinElmer6007550Coat z PLO i Lamininą
DPBSLife Technologies14190144soli fizjologicznej
buforowanej fosforanem DulbeccoPłytki 384-dołkowe powlekane poli-D-lizynąPerkinElmer6057500Spłukać przed pokryciem lamininą
StemPro AccutaseLife TechnologiesA1110501Nakładać 1 ml/10 cm płytkę przez 30-45 min; enzym proteolityczny
< strong> materiały utrwalające< / strong>
37% FormaldehydFisher ScientificF79-1rozpuszczony w PBS
SacharozaFisher ScientificS5-120,8 g na 10 ml utrwalacza
immunologicznego materiału barwiącego
Alexa Fluor 488 Koza anty-mysieprzeciwciało drugorzędoweInvitrogenA-11001
Alexa Fluor 568 Koza anty-kurczakInvitrogenA-11041przeciwciało drugorzędowe
Alexa Fluor 647 Koza anty-kurczakPrzeciwciałodrugorzędoweA-21449
Alexa Fluor 561 Koza antyszczuradrugorzędoweInvitrogenA-11077
DAPIBiotium40043wizualizuje DNA
Mysie przeciwciało przeciwko b3-tubulinie (TuJ-1)NeuromikaMO15013marker neuronalny wczesnego stadium
Przeciwciało szczura przeciwko CTIP2Abcamab18465warstwa 5/6 korowa neurony
Przeciwciało kurczaka przeciwko MAP2LifeSpan BiosciencesLS-B290marker neuronalny wczesnego stadium
Przeciwciało kurczaka przeciwko markerowineuronalnemu późnego stadiumMilliporeABN91
Przeciwciało królika przeciwko MAP2Shelley HalpainN/Amarker neuronalny wczesnego stadium
Mysie przeciwciało przeciwko markerowi postsynaptycznemu PSD-95SigmaP-246
Przeciwciało królicze przeciwko synapsynie 1MilliporeAB1543marker presynaptyczny
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)GE Healthcare Life SciencesSH30574,0210% w PBS do blokowania
Titon X-100Sigma9002931Rozcieńczony do 0,2% na PBS w celu przepuszczalności
Markery żywotności
Vivafix 649/660Biorad135-1118marker śmierci komórkowej
Calcium Imaging
Nazwa odczynnika/ Firma produkująca sprzętkatalogowyUwagi/
Opis AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRETHE SALK INSTITUTE, GT3 Core FacilityN/Areporter wapnia w systemie dostarczania wirusa
hiPSC NPC pochodzący z hiPSC
WT 126 (Y2610)Gage labN/AMarchetto et al., 2010
CVB WT24Yeo i Goldstein labsN/Anieopublikowane
podłoża Media do Invitrogen Przeciwciało NeuN Numer

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
  2. Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem Cell derived NeuronsNeurite RegenerationSynapse MaturationHigh content ScreeningProtease IncubationCell ReplatingViability AssessmentNeuronal DifferentiationCalcium ImagingMultielectrode Array

Related Articles