Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59314

⸱

9 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Macromolecular Structures, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 2Campus Urb. Montepríncipe s/n, Univ. San Pablo CEU, 3Department of Immunology and Oncology, Centro Nacional de Biotecnología, Campus Univ. Autónoma de Madrid, 4Department of Cell Signaling, Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CSIC), 5Meyer Cancer Center, 6Department of Anatomy and Cell Biology, McGill Univ.

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Streszczenie

Śledzenie cząsteczek w sekwencji wideo i późniejsza analiza ich trajektorii jest obecnie powszechną operacją w wielu badaniach biologicznych. Wykorzystując analizę klastrów receptorów błony komórkowej jako model, przedstawiamy szczegółowy protokół dla tego zadania analizy obrazu przy użyciu procedur Fiji (ImageJ) i Matlab w celu: 1) zdefiniowania obszarów zainteresowania i zaprojektowania masek dostosowanych do tych regionów; 2) śledzić cząstki w filmach z mikroskopii fluorescencyjnej; 3) Przeanalizuj charakterystyki dyfuzji i natężenia wybranych utworów. Ilościowa analiza współczynników dyfuzji, rodzajów ruchu i wielkości klastrów uzyskana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i przetwarzania obrazu stanowi cenne narzędzie do obiektywnego określenia dynamiki cząstek i konsekwencji modyfikacji warunków środowiskowych. W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły analizy tych cech. Opisana tutaj metoda nie tylko pozwala na wykrywanie śledzenia pojedynczych cząsteczek, ale także automatyzuje szacowanie parametrów dyfuzji bocznej na błonie komórkowej, klasyfikuje rodzaj trajektorii i umożliwia pełną analizę, pokonując w ten sposób trudności w ilościowym określeniu wielkości plamki na całej jej trajektorii na błonie komórkowej.

Wprowadzenie

Białka błonowe osadzone w dwuwarstwie lipidowej są w ciągłym ruchu z powodu dyfuzji termicznej. Ich dynamika jest niezbędna do regulacji odpowiedzi komórek, ponieważ interakcje międzycząsteczkowe umożliwiają tworzenie kompleksów różniących się wielkością od monomerów do oligomerów i wpływają na stabilność kompleksów sygnałowych. Wyjaśnienie mechanizmów kontrolujących dynamikę białek jest zatem nowym wyzwaniem w biologii komórki, niezbędnym do zrozumienia szlaków transdukcji sygnału i zidentyfikowania nieprzewidzianych funkcji komórki.

Niektóre metody optyczne zostały opracowane do badania tych interakcji w żywych komórkach1. Wśród nich mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF), opracowana na początku lat 80., pozwala na badanie interakcji molekularnych na błonie komórkowej lub bardzo blisko niej2. Do badania parametrów dynamicznych trajektorii białek błonowych uzyskanych z danych TIRF w żywych komórkach wymagana jest metoda śledzenia pojedynczych cząstek (SPT). Chociaż dostępnych jest kilka algorytmów w tym zakresie, obecnie używamy algorytmów opublikowanych przez Jaqamana i in.3, które rozwiązują problem niejednorodności ruchu cząstek w gęstym polu cząstek, łącząc cząstki między kolejnymi ramkami w celu połączenia powstałych segmentów toru w pełne trajektorie (tymczasowe zanikanie cząstek). Oprogramowanie rejestruje łączenie się i rozdzielanie cząstek, które wynikają ze zdarzeń agregacji i dysocjacji3. Jedną z danych wyjściowych tego oprogramowania jest wykrywanie cząstek wzdłuż całej trajektorii poprzez zdefiniowanie ich pozycji X i Y w każdej klatce.

Po wykryciu cząstek, stosujemy różne algorytmy do określenia współczynnika dyfuzji krótkiego opóźnienia (D1-4)4,5. Stosując analizę Spektrum Skalowania Momentów (MSS)6,7,8 lub dopasowując wartość "alfa" poprzez dostosowanie średniego przemieszczenia kwadratowego (MSD) do krzywej9, klasyfikujemy również cząstki według typu trajektorii.

Analiza intensywności plamki na obrazach fluorescencyjnych jest wspólnym celem naukowców w tej dziedzinie10,11. Najczęściej stosowanym algorytmem jest tak zwany liczba i jasność. Metoda ta nie pozwala jednak na prawidłowe wykrywanie intensywności klatka po klatce cząstek we frakcji ruchomej. W związku z tym opracowaliśmy nowy algorytm do oceny intensywności tych cząstek klatka po klatce i określenia ich stanu agregacji. Po wykryciu współrzędnych każdej cząstki za pomocą oprogramowania U-Track2 3, definiujemy jej intensywność w każdej klatce na całej trajektorii, biorąc również pod uwagę tło komórki w każdej klatce. Oprogramowanie to oferuje różne możliwości określania intensywności plamki i tła komórkowego oraz, wykorzystując znane białka monomeryczne i dimeryczne jako odniesienia, oblicza przybliżoną liczbę białek w wykrytej cząsteczce (wielkość klastra).

W tym artykule opisujemy dokładny przewodnik do wykonania tych trzech kroków: 1) wykrywanie i śledzenie pojedynczych cząstek wzdłuż filmu z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą ścieżki U; 2) analiza chwilowego współczynnika dyfuzji (D1-4) tych cząstek oraz rodzaju ruchu (ograniczony, swobodny lub skierowany) cząstek o długich trajektoriach za pomocą MSS; 3) pomiar intensywności plamki wzdłuż filmu skorygowanej o szacowaną fluorescencję tła dla każdego punktu. Pozwala to na oszacowanie wielkości klastra i identyfikację etapów fotowybielania.

Korzystanie z tego protokołu nie wymaga specjalistycznych umiejętności i może być wykonane w każdym laboratorium z hodowlą komórkową, cytometrią przepływową i mikroskopią. Protokół korzysta z ImageJ lub Fiji (dystrybucja ImageJ12), U-track3 i niektórych procedur tworzonych ad hoc (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). Procedury U-track i ad hoc są uruchamiane w Matlabie, który można zainstalować na dowolnym kompatybilnym komputerze.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbek biologicznych

  1. Hoduj komórki Jurkat w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FCS, NaPyr i L-glutaminę (pełne RPMI). Elektroportuj ogniwa Jurkat (20 x 106 komórek/400 μL RPMI 1640 z 10% FCS) z monomerycznym wektorem receptora chemokiny znakowanym GFP (CXCR4-AcGFP, 20 μg), aby umożliwić jego wykrycie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    nuta: Możliwe jest zastosowanie innych monomerycznych białek fluorescencyjnych, takich jak mCherry, mScarlet itp.
  2. 24 godziny po transfekcji przeanalizuj komórki w cytometrze przepływowym, aby określić zarówno żywotność komórek, jak i ekspresję CXCR4-AcGFP.
  3. Wybierz komórki wykazujące niską ekspresję CXCR4-AcGFP poprzez sortowanie komóreko niskim dodatnim poziomie GFP (Rysunek 1), ponieważ niska ekspresja transfekowanego receptora jest wymagana w eksperymentach TIRFM w celu zapewnienia śledzenia pojedynczych cząstek w celu śledzenia indywidualnych trajektorii9.
  4. Określ ilościowo liczbę receptorów na powierzchni komórki.
    nuta: Na przykład13, ~8,500 - 22,000 receptorów/komórkę znakowanych AcGFP, odpowiada ~2 - 4,5 cząstkom/μm2.
  5. Ponownie zawiesić posortowane komórki w pełnym RPMI i inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Odwirować komórki (300 x g, 5 min) i zawiesić je w buforze TIRF (HBSS, 25 mM HEPES, 2% FCS, pH 7,3).
    1. Płytka na 35 mm płytkach mikrostudzienkowych ze szklanym dnem (2-3 x 105 komórek/szalkę) pokrytych fibronektyną (20 μg/ml, 1 h, 37 °C) w obecności lub bez odpowiedniego liganda (tj. CXCL12, 100 nM, 1 h, 37 °C). Inkubować komórki (20 min w temperaturze 37 °C, 5% CO2 ) przed akwizycją obrazu.
  6. Wykonuj eksperymenty przy użyciu mikroskopu TIRF, wyposażonego w kamerę EM-CCD, obiektyw zanurzeniowy w oleju 100x (HCX PL APO 100x/1,46 NA) oraz laser diodowy 488 nm. Mikroskop umożliwia kontrolę temperatury i inkubację z CO2 . Zlokalizuj i skoncentruj komórki za pomocą pokręteł zgrubnego i precyzyjnego ustawiania ostrości, używając jasnego pola, aby zminimalizować efekty fotowybielania. Do precyzyjnej regulacji ostrości w trybie TIRF należy używać lasera o niskiej intensywności, niewystarczającej do wykrywania pojedynczych cząstek lub wywoływania efektów fotowybielania (5% mocy lasera, 28 μW).
  7. Rejestruj filmy (sekwencje obrazów) trwające około 50 s, minimalizując odstęp czasu między klatkami. Penetracja pola ulotnego powinna wynosić 70-90 nm głębokości. Zapisz pozyskane filmy dla każdego warunku eksperymentalnego jako ".lif" (video.lif).
    nuta: Filmy w opisywanym przykładzie zostały zarejestrowane w 49% przy mocy lasera (2 mW) z czasem naświetlania 90 ms i interwałem czasowym 98 ms, przez 49 s (500 klatek). Penetracja wybranej fali ulotnej wynosiła 90 nm.

2. Wybór obrazów i tworzenie masek

  1. Dla każdego warunku eksperymentalnego (video.lif) utwórz nowy folder (VideoName), który musi zawierać różne foldery dla każdej serii. Każdy folder będzie zawierał folder "videoSeq" dla obrazów wideo i folder "wyniki" dla wyników analizy. Upewnij się, że struktura plików w tej chwili jest następująca:
    nazwa_filmu/video.lif
    NazwaWideo/Seria1/videoSeq
    NazwaFilmu/Seria1/wyniki
    nuta: Z mikroskopu uzyskuje się różne pliki .lif z kilkoma filmami dla każdego schorzenia (np. FN, FN+SDF). "video.lif" odpowiada plikowi wideo input.lif ze wszystkimi filmami TIRF (seriami) wykonanymi pod mikroskopem. Folder "videoSeq" będzie zawierał 500 klatek filmu, który analizujemy. Folder "wyniki" będzie zawierał wszystkie pliki wynikające z przeprowadzonej analizy. Dokładna nomenklatura i lokalizacja różnych folderów są niezbędne do prawidłowego działania algorytmów. Nazwy pogrubione na powyższej liście są stałe (tzn. muszą być wywoływane w ten sposób, ponieważ są to nazwy poszukiwane przez skrypty). Nazwy, które nie są pogrubione, mogą ulec zmianie, aby odzwierciedlić przeprowadzony eksperyment.
  2. Otwórz wideo TIRFM (plik .lif) z Fiji lub ImageJ, przeciągając i upuszczając plik na pasku menu Fidżi i kliknij OK, aby zaimportować plik lif za pomocą BioFormats (rysunek uzupełniający 1).
  3. Wybierz serię do przetworzenia i kliknij przycisk OK (Rysunek uzupełniający 2A). Aby zaprojektować maskę do analizy tego filmu, zaimportuj również obraz wielokanałowy z różnymi chromoforami (w przykładzie seria 1 to obraz wielokanałowy, a seria 2 to odpowiadający mu film). Film (i obraz wielokanałowy) powinien otworzyć się jako stos ImageJ. W przykładzie (rysunek uzupełniający 2B) obraz znajduje się po lewej stronie, a wideo po prawej.
    nuta: Jeśli tworzenie maski dla filmu nie jest potrzebne, przejdź do kroku 2.5.
  4. Utwórz maskę. Utwórz pojedynczy obraz z kanałami przydatnymi do zaprojektowania maski. W tym przypadku interesującymi kanałami są czerwony, zielony i szary.
    1. Podziel kanały z obrazu wielokanałowego (Rysunek uzupełniający 3A): wybierz Obraz w menu paska i kliknij Kolor | Podziel kanały. Poszczególne kanały będą wyświetlane jako osobne obrazy (rysunek uzupełniający 3B).
    2. Ponownie połącz trzy kanały w jednym obrazie (Rysunek uzupełniający 4A): wybierz Obraz w menu paska i wybierz Kolor | Scalanie kanałów. Wybierz odpowiednie kanały i naciśnij OK (Rysunek uzupełniający 4B). Zostanie wygenerowany nowy, niepiętrowy obraz (rysunek uzupełniający 4C).
    3. Zsynchronizuj oba okna za pomocą narzędzia Synchronizuj system Windows (Rysunek uzupełniający 5A): wybierz opcję Analizuj w menu paska | Narzędzia | Synchronizacja systemu Windows. Zostanie wyświetlone nowe okno z możliwościami synchronizacji obrazu (Rysunek uzupełniający 5B).
    4. Po zsynchronizowaniu dwóch okien (tylko wideo, jeśli nie jest skojarzony obraz wielokanałowy), ten sam region w obu oknach może zostać przycięty. Narysuj obszar zainteresowania za pomocą prostokątnego narzędzia do zaznaczania w ruchomym menu ImageJ. Wybierz Obraz w menu paska i wybierz Przytnij (Rysunek uzupełniający 6A). Dwa przycięte obrazy będą wyświetlane pojedynczo (rysunek uzupełniający 6B).
    5. Anuluj synchronizację obu okien (Rysunek uzupełniający 6B), naciskając przycisk Anuluj synchronizację wszystkich w menedżerze synchronizacji systemu Windows.
  5. Jeśli maska nie została utworzona, jak w kroku 2.4, narysuj obszar zainteresowania za pomocą prostokątnego narzędzia do zaznaczania w ruchomym menu ImageJ.
  6. Zapisz wideo jako sekwencję obrazów w katalogu videoSeq w odpowiednim katalogu wideo (Rysunek uzupełniający 7A): wybierz Plik w menu paska i kliknij Zapisz jako | Sekwencja obrazów.... Zmień nazwy etykiet sekwencji wideo na video0000.tif, video0001.tif, ..., video0499.tif (Rysunek uzupełniający 7B): w polu Nazwa zmień nazwę na wideo i kliknij przycisk OK. Sekwencja musi znajdować się samodzielnie w swoim katalogu, aby mogła zostać pomyślnie użyta przez U-track.
    nuta: Jeśli nie projektujesz maski do filmu, przejdź do kroku 2.8.
  7. Zaprojektuj maskę. Wybierz obraz wielokanałowy i otwórz wtyczkę Edytora segmentacji (Rysunek uzupełniający 8A): wybierz Wtyczki w menu paska i wybierz Segmentacja | Edytor segmentacji. W razie potrzeby dodaj i zmień nazwy etykiet segmentacji, klikając prawym przyciskiem myszy etykiety edytora segmentacji (rysunek uzupełniający 8B,C).
    1. Wybierz odpowiednie narzędzie do zaznaczania w ruchomym menu ImageJ (tutaj użyj odręcznie), wybierz etykietę (zieloną) i zaprojektuj najpierw najbardziej zewnętrzną maskę (rysunek uzupełniający 9A). Po zaprojektowaniu naciśnij przycisk + w opcji Wybór w oknie kompozytowym, a wybrana maska zostanie wyświetlona w przeglądarce (Rysunek uzupełniający 9A). Powtórz ten krok z następnymi etykietami (Wnętrze, na czerwono) (Rysunek uzupełniający 9B).
      nuta: Po zaprojektowaniu maski dla etykiet Zielony i Wewnętrzny, maska Zewnętrzna zajmie pozostałą część obrazu.
    2. Maski są zakodowane na obrazie jako regiony 0, 1, 2, ... zgodnie z kolejnością etykiet w oknie etykiet RGB. Po zaprojektowaniu wszystkich masek dla różnych etykiet zapisz maskę o tej samej nazwie pliku co wideo, o nazwie mask.tif (Rysunek uzupełniający 9C): wybierz Plik w menu paska i wybierz Zapisz jako | Tiff....
      nuta: Wybrane maski zostaną wykorzystane do obliczenia współczynników dyfuzji i klasyfikacji trajektorii (patrz krok 4.2).
  8. Sprawdź, czy struktura plików w tej chwili jest następująca:
    nazwa_filmu/video.lif
    Nazwa filmu/Seria1/ mask.tif
    NazwaFilmu/Seria1/ Sekwencja wideo/ video0000.tif
    VideoName/Seria1/ videoSeq/ video0001.tif
    Z drugiej strony,
    VideoName/Seria1/ videoSeq/ video0499.tif
    NazwaFilmu/Seria1/ wyniki
    nuta: mask.tif jest obrazem z maską zgodnie z opisem w krokach 2.4 i 2.7. Plik video*.tiff to film zapisany w kroku 2.6. Jak wyżej, nazwy pogrubione na powyższej liście są stałe, tzn. muszą być wywoływane w ten sposób, ponieważ są to nazwy poszukiwane przez skrypty. Nazwy, które nie są pogrubione, mogą ulec zmianie, aby odzwierciedlić przeprowadzony eksperyment.

3. Śledzenie cząsteczek

  1. Śledź wszystkie cząsteczki widoczne w wybranych filmach za pomocą U-track.
  2. Otwórz Matlab i dodaj katalog U-track do ścieżki za pomocą polecenia Ustaw ścieżkę | Dodaj z opcją Podfoldery w menu. Zapisz ścieżkę, aby w przyszłych wykonaniach Matlab U-track znajdował się w ścieżce. To ustawienie ścieżki należy wykonać tylko raz.
  3. Zmień katalog roboczy na katalog zawierający serię, która ma być analizowana. Wywołaj ścieżkę U, wpisując w konsoli (Rysunek uzupełniający 10) movieSelectorGUI i naciśnij Enter. Otworzy się okno wyboru filmu (Rysunek uzupełniający 11A).
  4. Naciśnij przycisk Nowy film, a pojawi się okno Edycja filmu (Rysunek uzupełniający 11B).
  5. Naciśnij Dodaj kanał, aby wybrać katalog z filmem (VideoName/Series1/video) i wypełnić parametry informacji o filmie. Ustaw katalog wyjściowy dla wyników ścieżki U na Results (nazwa_wideo/seria1/wyniki).
    nuta: Parametry informacji o filmie można uzyskać z mikroskopu i warunków akwizycji.
  6. Naciśnij Zaawansowane ustawienia kanału i wypełnij parametry związane z akwizycją. Przyjrzyj się wartościom parametrów w przykładzie (rysunek uzupełniający 11C).
  7. Naciśnij Zapisz w oknie Zaawansowane ustawienia kanału i Zapisz w oknie Edycja filmu. Program poprosi o potwierdzenie zapisania pliku o nazwie movieData.mat w katalogu wyników. Potwierdzić.
  8. Po utworzeniu filmu naciśnij Kontynuuj w oknie wyboru filmu. U-track zapyta o typ obiektu, który ma być analizowany. Wybierz Pojedyncze cząstki (Rysunek uzupełniający 12). Pojawi się okno Panel sterowania (Rysunek uzupełniający 13A).
    1. Wybierz pierwszy krok Krok 1: Wykrywanie i naciśnij Ustawienia. Pojawi się okno Setting Gaussian Mixture-Model Fitting (Ustawianie dopasowania modelu mieszaniny Gaussa) (Rysunek uzupełniający 13B). W tym przykładzie wartość "Wartość alfa do porównania z tłem lokalnym" jest ustawiona na 0,001, a "Uśrednianie czasu w oknie kroczącym" na 3 (rysunek uzupełniający 13B).
    2. Naciśnij Zastosuj w oknie Ustawienia Dopasowanie modelu mieszaniny gaussowskiej i Uruchom w panelu sterowania. W przypadku konfiguracji przedstawionej na rysunku uzupełniającym 13 uruchamiany jest tylko krok Detekcja. Ten krok zajmuje kilka (2-5) minut. Sprawdź wyniki, naciskając przycisk Wynik w Kroku 1 (Wykrywanie, Rysunek Uzupełniający 14).
      nuta: Jak pokazano powyżej, film pokazuje czerwone kółka na wykrytych cząstkach. Jeśli nie jest pokazane żadne czerwone kółko, oznacza to, że ten krok nie zadziałał poprawnie.
  9. Wykonaj identyfikację ścieżek, czyli scalenie cząstek wykrytych w poprzednim kroku w ścieżki obejmujące wiele klatek. To jest Krok 2: Śledzenie toru U, którego ustawienia muszą być zdefiniowane, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 15A-C. Ustawienia funkcji kosztu kroku 2 dla łączenia ramka-ramka oraz zamykania, scalania i dzielenia odstępów w przykładzie są pokazane odpowiednio na rysunku uzupełniającym 15B i C.
  10. Po ustawieniu parametrów dla kroku 2 naciśnij przycisk Uruchom w panelu sterowania, a zostanie uruchomiony tylko krok 2 (Rysunek uzupełniający 16).
  11. Wykonaj analizę ścieżki, krok 3. Zdefiniuj ustawienia, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 17 (prawy panel). Następnie naciśnij Zastosuj w panelu Ustawienia-Analiza ruchu i Uruchom w Panelu sterowania-U-Track. Ten krok zajmuje kilka sekund.
  12. Sprawdź za pomocą przycisku Wynik w kroku 3, czy proces poprawnie zidentyfikował wszystkie ścieżki. W tym celu kliknij opcję Pokaż numer ścieżki w oknie Opcje filmu i sprawdź klatka po klatce, czy każda ścieżka została poprawnie zidentyfikowana (Rysunek uzupełniający 18). Ręcznie opisuj te cząstki, które nie są prawdziwymi cząstkami.
    nuta: Jeśli ten ręczny wybór nie zostanie wykonany, słabszy wybór automatyczny może zostać wykonany później, gdy obliczany jest współczynnik dyfuzji (patrz krok 4).

4. Obliczanie współczynników dyfuzji i klasyfikacja trajektorii

  1. Upewnij się, że wszystkie skrypty są wywoływane z katalogu analizowanego wideo (w przykładzie VideoName/Serie1).
  2. Odczytaj wszystkie trajektorie, aby obliczyć współczynniki dyfuzji, wydając w konsoli Matlab polecenie: trajectories=readTrajectories(0.1), gdzie 0.1 to czas w sekundach między dwiema kolejnymi klatkami (przedział czasowy, pokazany w panelu Informacje o filmie, Rysunek uzupełniający 11B).
  3. Wyklucz trajektorie odpowiadające nieprawidłowo zidentyfikowanym punktom/trajektoriom. Podaj listę miejsc, które mają zostać wykluczone. Na przykład, aby wykluczyć miejsca 4, 5 i 28, wpisz: trajectories=readTrajectories(0.1, [4, 5, 28]).
  4. Oblicz chwilowe współczynniki dyfuzji dla każdej ze ścieżek tej komórki. W takim przypadku oblicz współczynnik dyfuzji dla opóźnienia czasowego = 4, zwanego D1-4. W tym celu uruchom w konsoli Matlaba polecenie: D=calculateDiffusion(trajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha'), gdzie trajektorie są trajektoriami uzyskanymi w kroku 3, 113.88e-3 to rozmiar piksela pozyskanych obrazów w mikronach, 0.0015 to górna granica współczynników dyfuzji nieruchomych cząstek mierzonych w μm2/s, a 'alfa' jest dopasowanym modelem, jak wyjaśniono poniżej.
    nuta: Korzystając z szybszej kamery i potrzebując więcej klatek do obliczenia parametru dyfuzji, zwiększ go, np. do 20, o D=calculateDiffusion(trajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', '', 20). Parametr ciągu przed 20, w powyższym przykładzie '', jest sufiksem dodanym do plików wyjściowych. Przyrostek ten może być używany do rozróżniania różnych analiz.
  5. Dopasuj MSD do innej funkcji, wywołując ponownie funkcję calculateDiffusion z innym trybem dopasowania ("ograniczony", "swobodny" lub "skierowany"). W tym przykładzie 'ograniczony': D=calculateDiffusion(trajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'ograniczony').
  6. Uzyskaj wyniki dopasowania dla modelu kierowanego, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 20.
  7. Podziel trajektorie na krótkie i długie. Użyj polecenia: [shortTrajectories, longTrajectories]=separateTrajectoriesByLength(trajectories,50), gdzie 50 to minimalna długość w klatkach trajektorii, która ma być uznana za długą (w pokazanym przykładzie).
  8. Badaj krótkie trajektorie, korzystając z tej samej procedury dopasowania, która została opisana w kroku 4.3: D=calculateDiffusion(shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'skierowany', 'Krótki'). Analizuj krótkie i nietypowe trajektorie za pomocą polecenia: D=calculateDiffusion(shortTrajectories, 113.88e-3, 0.0015, 'alpha', 'Short').
  9. Analizuj długie trajektorie, aby sklasyfikować typ ruchu za pomocą ich spektrum skalowania momentów (MSS)7. Polecenie: trajectoriesClassification=classifyLongTrajectories(longTrajectories,113.88e-3,0.0015,'Long') pokazuje analizę na ekranie i generuje plik o nazwie trajectoryClassification.txt w katalogu results\TrackingPackage\tracks.

5. Obliczanie wielkości klastra na podstawie gęstości cząstek

UWAGA: Upewnij się, że wszystkie skrypty są wywoływane z katalogu analizowanego filmu (w pokazanym przykładzie VideoName/Serie1).

  1. Przeanalizuj intensywność każdej cząstki wzdłuż jej trajektorii. W tym celu wywołaj skrypt, wpisując w konsoli Matlab: analyzeSpotIntensities, który przyjmuje jako dane wejściowe trajektorie obliczone przez U-track w pierwszej sekcji. W najbardziej podstawowej formie po prostu wywołaj skrypt bez żadnego argumentu z katalogu analizowanego wideo (w pokazanym przykładzie VideoName/Series1) analyzeSpotIntensities(). Skonfiguruj to podstawowe zachowanie na wiele różnych sposobów, podając argumenty do skryptu, jak w: analyzeSpotIntensities('Arg1', Value1, 'Arg2', Value2, ...). Wyświetlane są poprawne argumenty wraz z odpowiadającymi im wartościami zmiennych ("ArgN", ValueN).
    1. ('spotRadius', 1)
      Przeanalizuj intensywność fluorescencji przy użyciu spotRadius wynoszącej 1 piksel (domyślnie), która odpowiada plamie o rozmiarze 3x3 wyśrodkowanej w plamce ((2*spotRadius+1)x(2*spotRadius+1)).
      nuta: W przypadku łaty o wymiarach 5x5 wyśrodkowanej w miejscu wybierz promień plamki równy 2 itd.
    2. ('onlyInitialTrajectories', 1)
      Jeśli ten argument jest podany (prawda, wartość 1), analizuj tylko trajektorie, które zaczynają się w pierwszej klatce filmu. Jest to przydatne do analizowania obrazów kontrolnych (domyślnie 0, false).
    3. ('trackTrajectory', 0)
      Jeśli ten argument jest ustawiony na 0 (fałsz), to zachowaj współrzędne punktu w jego pierwszej ramce dla wszystkich ramek (jest to przydatne dla miejsc nieruchomych). Jeśli argument jest ustawiony na 1 (domyślnie 1, prawda), to punkt jest śledzony wzdłuż wideo zgodnie ze współrzędnymi obliczonymi przez U-track.
    4. ('excludeTrajectories', [4,5,28])
      Należy uwzględnić numer trajektorii wykluczonych w kroku 4.3 (w przykładzie 4, 5, 28).
    5. ('extendTrajectory ', 1)
      Jeśli ten argument jest ustawiony na 1 (prawda), przeanalizuj intensywność w łacie do końca filmu (nawet jeśli trajektoria zatrzyma się wcześniej). Współrzędna punktu jest albo ostatnią współrzędną trajektorii (jeśli trackTrajectory jest prawdziwa), albo pierwszą współrzędną trajektorii (jeśli trackTrajectory jest fałszywa). Domyślnie ten argument ma wartość false (0).
    6. ('subtractBackground', 1)
      Jeśli ten parametr jest ustawiony, należy skorygować surową fluorescencję zmierzoną w każdym punkcie przez oszacowanie fluorescencji tła dla tego punktu (patrz poniżej). Ten argument ma domyślnie wartość true (1).
    7. ('meanLength', numer ramki)
      Jeśli ten parametr jest ustawiony, to punkt o średniej intensywności jest mierzony na wskazanej długości. Ustaw wartość "meanLength", 20, aby zmierzyć średnią intensywność plamki w pierwszych 20 klatkach. Jeśli argument nie jest ustawiony, intensywność plamki jest obliczana dla całej trajektorii (domyślnie na całej długości).
    8. ('showIntensityProfiles', 1)
      Ustaw ten parametr na 1 (domyślnie 0, false), aby wykreślić profil intensywności wzdłuż różnych klatek, a także ich tła.
      nuta: Wykresy te są bardzo przydatne do identyfikacji fotowybielania, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 21. Dla każdej ścieżki procedura automatycznie analizuje, czy możliwe jest, że doszło do fotowybielania. Odbywa się to poprzez porównanie wartości intensywności z t Studenta w pierwszej i ostatnich N klatkach na ścieżce. Domyślnie N wynosi 10, ale tę wartość można zmodyfikować za pomocą argumentu "Nbleach".
    9. ('backgroundMethod', wartość)
      Ustaw ten parametr, aby określić tło każdego miejsca. Można to zrobić na kilka sposobów, a który z nich użyć, można wybrać zmieniając "wartość":
      1. ('backgroundMethod', 0)
        Użyj tej wartości, aby ręcznie zidentyfikować tło dla całego filmu. Pozwól, aby wybrać 8 punktów w pierwszej klatce wideo. Plama wokół tych punktów jest analizowana na całym filmie, a 95% kwantyl wszystkich tych intensywności jest wybierany jako intensywność tła dla wszystkich miejsc.
      2. ('backgroundMethod', 1)
        Ta wartość służy do ręcznego identyfikowania tła dla każdej klatki. Wybierz 8 punktów dla każdego miejsca i każdej klatki. Jest to czasochłonne zadanie, ale daje użytkownikowi dużą kontrolę. Kwantyl 95% intensywności w tych plamach jest wybierany jako intensywność tła dla tego miejsca w tym kadrze.
      3. ('backgroundMethod', 2)
        Użyj tej wartości, aby obliczyć tło każdego punktu oszacowane na podstawie 8 punktów znajdujących się w okręgu wokół punktu o promieniu kontrolowanym przez argument 'backgroundRadius' (domyślnie 4*spotRadius).
      4. ('backgroundMethod', 3)
        Użyj tej wartości, aby obliczyć tło dla każdej klatki, najpierw lokalizując komórkę w filmie, a następnie analizując intensywność komórki w każdej klatce (rysunek uzupełniający 22).
        nuta: Tło jest wybierane jako wartość szarości w danym kwantylu tego rozkładu (domyślnie 0,5 (=50%), chociaż ten parametr może być kontrolowany za pomocą argumentu 'backgroundPercentile', wartość ta może być ustawiona wyższa, na przykład 0,9 (=90%), jeśli chcesz, aby większość komórki była traktowana jako tło. Aby pomóc w identyfikacji komórki, wskaż, jaka jest maksymalna oczekiwana wartość tła wzdłuż klatek, używając argumentu "maxBackground" (na przykład we wszystkich analizowanych filmach wartość tła zwykle nigdy nie przekracza 6000)13. Domyślnie ta opcja jest ustawiona na 0, co oznacza, że ta pomoc nie jest używana domyślnie. Zobacz, która komórka jest wykrywana i obszar wybrany do oszacowania tła, ustawiając argument "showImages" na 1 (zatrzymaj wykonywanie w dowolnym momencie, naciskając CTRL-C).
  2. Zbierz informacje o dyfuzji i intensywności dla wszystkich trajektorii obliczonych odpowiednio w krokach 4 i 5.1, używając gatherDiffusion.AndIntensity (). Zbierz tylko informacje o dyfuzji i intensywności dla krótkich trajektorii. W tym celu należy użyć sufiksów użytych w kroku 4.7 i wpisać: gatherDiffusionAndIntensity ("Short"), gdzie "Short" to sufiks użyty w kroku 4.7.
  3. Zbierz informacje o skalowaniu widma momentu i intensywności, wpisując: gatherTrajectoryClassificationAndIntensity('Long'), gdzie 'Long' jest sufiksem używanym w kroku 4.7. Podsumowanie wszystkich plików wygenerowanych przy użyciu tego protokołu znajduje się w Rysunek 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie niniejszego protokołu umożliwia zautomatyzowane śledzenie cząsteczek wykrytych w filmach z mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizę ich charakterystyki dynamicznej. W pierwszej kolejności komórki są transfekowane białkiem sprzężonym z fluoroforem, które ma być śledzone. Odpowiedni poziom receptorów obecnych na powierzchni komórki, umożliwiający przeprowadzenie SPT, uzyskuje się poprzez sortowanie komórek (Rycina 1). Wybrane komórki są analizowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana metoda jest łatwa do wykonania nawet bez wcześniejszego doświadczenia w pracy z programem Matlab. Należy jednak pamiętać, że procedury w Matlabie wymagają niezwykłej precyzji w nazewnictwie poszczególnych komend oraz w lokalizacji folderów wykorzystywanych przez program. W procedurze analizy śledzenia (krok 3) można zmodyfikować wiele parametrów. Okno „Setting Gaussian-Mixture Model Fitting” (krok 3.8) steruje tym, w jaki sposób U-track będzie wykrywać pojedyncze cząsteczki na filmie. Odbywa się to poprzez dopaso...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni Carlo Manzo i Marii García Parajo za ich pomoc i kod źródłowy analizy współczynnika dyfuzji. Prace te były częściowo wspierane przez granty hiszpańskiego Ministerstwa Nauki, Innowacji i Uniwersytetów (SAF 2017-82940-R) oraz program RETICS Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 i RD16/0012/0006; RIER). LMM i JV są wspierane przez program COMFUTURO Fundación General CSIC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ludzkie komórki JurkataATCCCRL-10915Ludzka linia komórek T. Za pomocą tego oprogramowania można analizować każdy inny typ komórek
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFPClontech632469Za pomocą tego rutynowego elektroporatora Gene Pulse X Cell można śledzić i analizować różne białka fluorescencyjne
nbsp;BioRad Do ogniw Jurkat używamy napięcia 280 V, 975 mF.  Użyj metody transfekcji, która najlepiej sprawdza się w Twoich rękach. 
Cytometr przepływowy Cytomics FC 500 Sortownik komórkowy Beckman Coulter
MoFlo Astrios Beckman CoulterW zależności od poziomu transfekcji, sortowanie komórek może nie być wymagane.  Można również zastosować komórki o stabilnej ekspresji odpowiedniego poziomu receptora będącego przedmiotem zainteresowania.
Dako QifikitDakoCytomationK0078Służy do ilościowego określania liczby receptorów na powierzchni komórki.
Naczynia mikrostudzienkowe ze szklanym dnemMatTek corporationP35G-1.5-10-C
Ludzka fibronektyna z plazmySigma-AldrichF0895
Rekombinowana ludzka CXCL12PeproTech300928A
Odwrócona Leica AM TIRFKamera Leica
EM-CCDAndor DU 885-CSO-#10-VP
MATLABOprogramowanie MathWorks, Natick, MA
U-Track2Oprogramowanie Danuser Laboratory
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
FiJiFiJIhttps://imagej.net/Fiji)
u-Track2Narzędzie Matlab.  Aby zainstalować, pobierz .zip plik ze strony internetowej (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) i rozpakuj plik w wybranym katalogu
GraphPad PrismOprogramowanie
& GraphPad

Bibliografia

  1. Yu, J. Single-molecule studies in live cells. Annual Review of Pysical Chemistry. 67 (565-585), (2016).
  2. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. Journal of Cell Science. 123 (Pt 21), 3621-3628 (2010).
  3. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  4. Bakker, G. J., et al. Lateral mobility of individual integrin nanoclusters orchestrates the onset for leukocyte adhesion. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (13), 4869-4874 (2012).
  5. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophysical Journal. 65 (5), 2021-2040 (1993).
  6. Ferrari, R. M., Manfroi, A. J., Young, W. R. Strongly and weakly self-similar diffusion. Physica D. 154, 111-137 (2001).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151 (2), 182-195 (2005).
  8. Ewers, H., et al. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  9. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Report on Progress in Physics. 78 (12), 124601(2015).
  10. Calebiro, D., et al. Single-molecule analysis of fluorescently labeled G-protein-coupled receptors reveals complexes with distinct dynamics and organization. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (2), 743-748 (2013).
  11. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94 (6), 2320-2332 (2008).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Martinez-Munoz, L., et al. Separating Actin-Dependent Chemokine Receptor Nanoclustering from Dimerization Indicates a Role for Clustering in CXCR4 Signaling and Function. Molecular Cell. 70 (1), 106-119 (2018).
  14. Destainville, N., Salome, L. Quantification and correction of systematic errors due to detector time-averaging in single-molecule tracking experiments. Biophysical Journal. 90 (2), L17-L19 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Śledzenie pojedynczych cząsteczekśledzenie cząstekanaliza dyfuzjianaliza wielkości klastrówobszar zainteresowaniaprojektowanie masekFiji ImageJrutyny MATLAB
Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.