Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Summary

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Abstract

Śledzenie cząsteczek w sekwencji wideo i późniejsza analiza ich trajektorii jest obecnie powszechną operacją w wielu badaniach biologicznych. Wykorzystując analizę klastrów receptorów błony komórkowej jako model, przedstawiamy szczegółowy protokół dla tego zadania analizy obrazu przy użyciu procedur Fiji (ImageJ) i Matlab w celu: 1) zdefiniowania obszarów zainteresowania i zaprojektowania masek dostosowanych do tych regionów; 2) śledzić cząstki w filmach z mikroskopii fluorescencyjnej; 3) Przeanalizuj charakterystyki dyfuzji i natężenia wybranych utworów. Ilościowa analiza współczynników dyfuzji, rodzajów ruchu i wielkości klastrów uzyskana za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i przetwarzania obrazu stanowi cenne narzędzie do obiektywnego określenia dynamiki cząstek i konsekwencji modyfikacji warunków środowiskowych. W tym artykule przedstawiamy szczegółowe protokoły analizy tych cech. Opisana tutaj metoda nie tylko pozwala na wykrywanie śledzenia pojedynczych cząsteczek, ale także automatyzuje szacowanie parametrów dyfuzji bocznej na błonie komórkowej, klasyfikuje rodzaj trajektorii i umożliwia pełną analizę, pokonując w ten sposób trudności w ilościowym określeniu wielkości plamki na całej jej trajektorii na błonie komórkowej.

Introduction

Białka błonowe osadzone w dwuwarstwie lipidowej są w ciągłym ruchu z powodu dyfuzji termicznej. Ich dynamika jest niezbędna do regulacji odpowiedzi komórek, ponieważ interakcje międzycząsteczkowe umożliwiają tworzenie kompleksów różniących się wielkością od monomerów do oligomerów i wpływają na stabilność kompleksów sygnałowych. Wyjaśnienie mechanizmów kontrolujących dynamikę białek jest zatem nowym wyzwaniem w biologii komórki, niezbędnym do zrozumienia szlaków transdukcji sygnału i zidentyfikowania nieprzewidzianych funkcji komórki.

Niektóre metody optyczne zostały opracowane do badania tych interakcji w żywych komórkach^....

Protocol

1. Przygotowanie próbek biologicznych

1. Hoduj komórki Jurkat w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FCS, NaPyr i L-glutaminę (pełne RPMI). Elektroportuj ogniwa Jurkat (20 x 10⁶ komórek/400 μL RPMI 1640 z 10% FCS) z monomerycznym wektorem receptora chemokiny znakowanym GFP (CXCR4-AcGFP, 20 μg), aby umożliwić jego wykrycie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
   nuta: Możliwe jest zastosowanie innych monomerycznych białek fluorescencyjnych, takich jak mCherry, mScarlet itp.
2. 24 godziny po transfekcji przeanalizuj komórki w cytometrze przepływowym, aby określić zarówno żywotność komórek, jak i ekspresję CXCR4-AcGFP.

Results

Użycie tego protokołu pozwala na automatyczne śledzenie cząstek wykrytych na filmach z mikroskopii fluorescencyjnej i analizę ich dynamicznych charakterystyk. Początkowo komórki są transfekowane białkiem sprzężonym fluorescencyjnie, które ma być śledzone. Odpowiedni poziom receptorów obecnych na powierzchni komórki, który umożliwia SPT, uzyskuje się przez sortowanie komórek (Rysunek 1). Wybrane komórki są analizowane za pomocą mikroskopii TIRF, która generuje filmy w f.......

Discussion

Opisana metoda jest łatwa do wykonania nawet bez wcześniejszego doświadczenia w pracy z Matlabem. Jednak procedury Matlaba wymagają niezwykle dokładności w zakresie nazewnictwa różnych poleceń i lokalizacji różnych folderów używanych przez program. W procedurze analizy śledzenia (krok 3) można modyfikować wiele parametrów. Okno "Setting Gaussian-Mixture Model Fitting" (krok 3.8) kontroluje, w jaki sposób ścieżka U będzie wykrywać pojedyncze cząstki na wideo. Odbywa się to poprzez dopasowanie modelu mieszaniny Gaussa, jak.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ludzkie komórki Jurkata	ATCC	CRL-10915	Ludzka linia komórek T. Za pomocą tego oprogramowania można analizować każdy inny typ komórek
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Za pomocą tego rutynowego elektroporatora Gene Pulse X Cell można śledzić i analizować różne białka fluorescencyjne
nbsp;	BioRad		Do ogniw Jurkat używamy napięcia 280 V, 975 mF.  Użyj metody transfekcji, która najlepiej sprawdza się w Twoich rękach.
Cytometr przepływowy Cytomics FC 500	Sortownik komórkowy Beckman Coulter
MoFlo Astrios	Beckman Coulter		W zależności od poziomu transfekcji, sortowanie komórek może nie być wymagane.  Można również zastosować komórki o stabilnej ekspresji odpowiedniego poziomu receptora będącego przedmiotem zainteresowania.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Służy do ilościowego określania liczby receptorów na powierzchni komórki.
Naczynia mikrostudzienkowe ze szklanym dnem	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Ludzka fibronektyna z plazmy	Sigma-Aldrich	F0895
Rekombinowana ludzka CXCL12	PeproTech	300928A
Odwrócona Leica AM TIRF	Kamera Leica
EM-CCD	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	Oprogramowanie MathWorks, Natick, MA
U-Track2	Oprogramowanie Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2			Narzędzie Matlab.  Aby zainstalować, pobierz .zip plik ze strony internetowej (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) i rozpakuj plik w wybranym katalogu
GraphPad Prism	Oprogramowanie