Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

DOI:

10.3791/59324

⸱

13 maja 2019

1Biology Department, Luminex Corporation

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test mikrojądrowy in vitro jest dobrze znaną metodą oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii manualnej jest pracochłonna i cierpi z powodu subiektywności i zmienności między punktorami. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test mikrojądrowy in vitro (MN) jest często używany do oceny cytotoksyczności i genotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii ręcznej jest pracochłonna i wprowadza niepewność do wyników z powodu zmienności między oceniającymi. Aby temu zaradzić, wprowadzono zautomatyzowaną mikroskopię skaningową z szkiełkami, a także konwencjonalne metody cytometrii przepływowej, w celu wyeliminowania stronniczości punktora i poprawy przepustowości. Metody te mają jednak swoje nieodłączne ograniczenia, takie jak niemożność wizualizacji cytoplazmy komórki oraz brak wizualnej weryfikacji MN lub przechowywania danych obrazowych za pomocą cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa obrazowania wielospektralnego (MIFC) ma potencjał, aby przezwyciężyć te ograniczenia. MIFC łączy obrazy fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości z mikroskopii z solidnością statystyczną i szybkością konwencjonalnej cytometrii przepływowej. Ponadto wszystkie zebrane obrazy mogą być przechowywane w plikach specyficznych dla danej dawki. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu MN na MIFC. Ludzkie komórki limfoblastoidalne TK6 powiększono za pomocą roztworu hipotonicznego (75 mM KCl), utrwalonego 4% formaliną, a zawartość jądrową wybarwiono Hoechst 33342. Wszystkie próbki poddano badaniu w zawiesinie MIFC, co pozwoliło na uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości wszystkich kluczowych zdarzeń wymaganych do przeprowadzenia testu (np. komórki dwujądrowe z MN i bez niego, a także komórki jednojądrowe i wielojądrowe). Obrazy zostały automatycznie zidentyfikowane, skategoryzowane i zliczone w oprogramowaniu do analizy danych MIFC, co pozwoliło na automatyczną ocenę zarówno cytotoksyczności, jak i genotoksyczności. Wyniki pokazują, że zastosowanie MIFC do przeprowadzenia testu MN in vitro pozwala na wykrycie statystycznie istotnego wzrostu częstości występowania MN na kilku różnych poziomach cytotoksyczności w porównaniu z kontrolami rozpuszczalnikowymi po ekspozycji komórek TK6 na mitomycynę C i kolchicynę, oraz że nie obserwuje się znaczącego wzrostu częstości MN po ekspozycji na mannitol.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test mikrojądrowy in vitro (MN) jest powszechnie stosowanym testem do oceny cytotoksyczności i genotoksyczności jako narzędzie przesiewowe w kilku dziedzinach nauki, takich jak rozwój chemiczny i farmaceutyczny, a także biomonitoring człowieka wśród osób narażonych na różne czynniki środowiskowe, zawodowe lub związane ze stylem życia1,2,3. MN składa się z fragmentów chromosomów lub całych chromosomów powstałych podczas podziału komórki, które nie są włączone do jednego z dwóch głównych jąder potomnych. Po telofazie ten materiał chromosomalny formuje się w indywidualne, zaokrąglone ciało wewnątrz cytoplazmy, które jest oddzielone od któregokolwiek z głównych jąder2. W związku z tym MN są reprezentatywne dla uszkodzeń DNA i są używane od wielu lat jako punkt końcowy w testach genotoksyczności4. Najodpowiedniejszą metodą pomiaru MN jest test mikrojądrowy z blokiem cytokinezy (CBMN). Korzystając z testu CBMN, częstość występowania MN w komórkach dwujądrowych (BNC) można ocenić poprzez włączenie cytochalazyny B (Cyt-B) do próbki. Cyt-B pozwala na podział jądrowy, ale zapobiega podziałowi komórkowemu, a tym samym ogranicza punktację MN do BNC, które podzieliły się tylko raz5.

Protokoły wykorzystujące zarówno mikroskopię, jak i cytometrię przepływową zostały opracowane i zatwierdzone i są rutynowo używane do przeprowadzania testu MN in vitro6,7,8,9,10,11,12,13,14. Mikroskopia korzysta z możliwości wizualnego potwierdzenia, że MN są legalne, ale jest czasochłonna i podatna na różnice między oceniającymi15. Aby rozwiązać ten problem, opracowano zautomatyzowane metody mikroskopii do skanowania preparatów i przechwytywania obrazów jąder i MN16,17,18,19, ale cytoplazmy nie można zobrazować, co utrudnia określenie, czy MN jest rzeczywiście powiązany z konkretną komórką. Ponadto metody te mają trudności z identyfikacją komórek wielojądrowych (POLY) (w tym komórek trój- i czterojądrowych), które są wymagane do obliczenia cytotoksyczności przy użyciu Cyt-B9. Metody cytometrii przepływowej opracowane do wykonywania testu MN wykorzystują fluorescencję, a także intensywność rozpraszania do przodu i na boki do identyfikacji populacji zarówno jąder, jak i MN, które zostały uwolnione z komórki w wyniku lizy20,21,22. Pozwala to na pozyskanie danych z kilku tysięcy komórek w ciągu kilku minut i umożliwia automatyczną analizę23; Jednak brak możliwości wizualizacji komórek uniemożliwia potwierdzenie, że ocenione zdarzenia są autentyczne. Dodatkowo, liza błony komórkowej hamuje użycie Cyt-B, a także tworzenie zawiesiny zawierającej inne zanieczyszczenia, takie jak agregaty chromosomowe lub ciała apoptotyczne i nie ma sposobu, aby je odróżnić od MN24.

W świetle tych ograniczeń, Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) jest idealnym systemem do wykonywania testu MN, ponieważ łączy w sobie obrazy fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości mikroskopii z statystyczną solidnością i szybkością konwencjonalnej cytometrii przepływowej. W MIFC wszystkie ogniwa są wprowadzane do systemu fluidycznego, a następnie są hydrodynamicznie skupiane w środku kuwety z komórką przepływową. Ortogonalne oświetlenie wszystkich ogniw odbywa się za pomocą diody elektroluminescencyjnej (LED) o jasnym polu (BF), lasera o bocznym rozproszeniu i (co najmniej) jednego lasera fluorescencyjnego. Fotony fluorescencyjne są przechwytywane przez jedną z trzech (20x, 40x lub 60x) soczewek obiektywowych o dużej aperturze numerycznej, a następnie przechodzą przez element rozkładu widmowego. Fotony są następnie ogniskowane w kamerze ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości wszystkich komórek przechodzących przez komórkę przepływową. Aby uniknąć rozmycia lub smug, przetwornik CCD działa w trybie integracji z opóźnieniem czasowym (TDI), który śledzi obiekty, przesyłając zawartość pikseli z rzędu do rzędu w dół CCD w synchronizacji z prędkością przepływu komórki. Informacje o pikselach są następnie zbierane z ostatniego rzędu pikseli. Obrazowanie TDI w połączeniu z dekompozycją spektralną pozwala na jednoczesne uchwycenie do 12 obrazów (2 BF, 10 fluorescencyjnych) ze wszystkich komórek przechodzących przez komórkę przepływową. Wszystkie przechwycone obrazy są przechowywane w plikach danych specyficznych dla próbki, co pozwala na przeprowadzenie analizy w dowolnym momencie za pomocą oprogramowania do analizy danych MIFC. Wreszcie, pliki danych zachowują powiązanie między obrazami komórkowymi a kropkami na wszystkich wykresach dwuwymiarowych. Oznacza to, że dowolna kropka na tradycyjnym wykresie dwuwymiarowym może zostać podświetlona, a odpowiadające jej obrazy BF i fluorescencyjne zostaną wyświetlone pod adresem25.

Ostatnio opracowano metody oparte na MIFC do przeprowadzania testu MN zarówno dla biodozymetrii radiacyjnej triage26,27,28,29,30,31 jak i toksykologii genetycznej32,33testowanie. Praca ta wykazała, że obrazy komórkowe głównych jąder, MN i cytoplazmy mogą być obrazowane z większą przepustowością niż inne metody26. Wszystkie typy komórek wymagane do analizy, w tym komórki MONO, BNC (z MN i bez) oraz komórki POLY, mogą być automatycznie identyfikowane w oprogramowaniu do analizy danych MIFC, a implementacja kryteriów punktacji opracowanych przez Fenecha i wsp. odbywa się za pomocą różnych algorytmów matematycznych6,34. Wyniki biodozymetrii wykazały, że krzywe kalibracji dawka-odpowiedź były podobne pod względem wielkości do tych uzyskanych za pomocą innych zautomatyzowanych metod dostępnych w literaturze podczas ilościowego określania szybkości MN na BNC29. Ponadto niedawne prace toksykologiczne wykazały, że obrazy komórek MONO, BNC (z MN i bez MN) oraz komórek POLY mogą być automatycznie rejestrowane, identyfikowane, klasyfikowane i liczone za pomocą MIFC. Protokół i analiza danych umożliwiły obliczenie cytotoksyczności i genotoksyczności po wystawieniu komórek TK6 na działanie kilku klastogenów i aneugenów32.

Protokół przedstawiony w tym artykule opisuje metodę przeprowadzania testu MN in vitro przy użyciu MIFC. Technika przetwarzania próbki zastosowana w tej pracy wymaga mniej niż 2 godziny na przetworzenie pojedynczej próbki i jest stosunkowo łatwa do wykonania w porównaniu z innymi metodami. Analiza danych w oprogramowaniu do analizy MIFC jest skomplikowana, ale utworzenie szablonu analizy można wykonać w ciągu kilku godzin, postępując zgodnie z krokami opisanymi w tym dokumencie. Co więcej, po utworzeniu szablonu można go automatycznie zastosować do wszystkich zebranych danych bez żadnych dalszych prac. Protokół przedstawia wszystkie kroki wymagane do wystawienia komórek TK6 na działanie klastogenów i aneugenów, opisuje sposób hodowli, przetwarzania i barwienia komórek oraz pokazuje, jak uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości za pomocą MIFC. Ponadto w artykule przedstawiono aktualne najlepsze praktyki w zakresie analizy danych w oprogramowaniu MIFC w celu automatycznej identyfikacji i oceny komórek MONO, BNC i komórek POLY w celu obliczenia zarówno cytotoksyczności, jak i genotoksyczności.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej i hodowla komórek TK6

UWAGA: Niektóre substancje chemiczne używane w tym protokole są toksyczne. Wdychanie, połykanie lub kontakt ze skórą z cytochalazyną B może być śmiertelny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i dwie pary rękawic nitrylowych. Po użyciu dokładnie umyć ręce. Formalina/formaldehyd jest toksyczny w przypadku wdychania lub połknięcia; działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę; i może powodować uczulenie przez wdychanie lub kontakt ze skórą. Istnieje ryzyko poważnego uszkodzenia oczu. Jest to potencjalny czynnik rakotwórczy.

  1. Przygotuj 565 ml pożywki hodowlanej 1x RPMI. Dodaj 5 ml aminokwasów endogennych MEM (100x), 5 ml pirogronianu sodu (100 mM), 5 ml penicyliny-streptomycyny-glutaminy (100x) i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 500 ml butelki 1x pożywki RPMI 1640. Przygotować pożywkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego i przechowywać w temperaturze 2-8 °C. Podgrzać pożywkę do 37 °C przed dodaniem jej do komórek TK6 (patrz Tabela materiałów).
  2. Rozmrozić 1 ml komórek TK6 (przechowywanych w temperaturze -80 °C w DMSO) w 10 ml pożywki. Odwirować komórki przy 200 x g przez 8 minut i odessać supernatant. Przenieść komórki do 50 ml pożywki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Czas podwajania komórek TK6 waha się od ~ 12-18 godzin i potrzeba kilku (3 lub 4) pasaży, aby komórki osiągnęły maksymalną szybkość proliferacji (patrz Tabela materiałów).
  3. Hodowla 100 ml komórek do stężenia ~7-8 x 105 komórek/ml.

2. Przygotowanie klastogenów i/lub aneugenów oraz cytochalazyny B

  1. Przygotuj odpowiednie stężenia zapasowe pożądanych klastogenów i aneugenów. Na przykład w przypadku mitomycyny C należy rozpuścić pełną butelkę 2 mg w 10 ml sterylnej wody, aby osiągnąć końcowe stężenie wyjściowe 200 μg/ml. Mitomicyna C może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez trzy miesiące (patrz tabela materiałów).
  2. W dniu eksperymentu przygotuj rozcieńczenia pożądanych substancji chemicznych, które są 10-krotnie lub 100-krotnie wyższe niż pożądane stężenia ekspozycji, jeśli rozcieńcza się odpowiednio w sterylnej wodzie lub DMSO.
  3. W przypadku mitomycyny C należy przygotować 3 ml roztworów 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 i 5,0 μg/ml w sterylnej wodzie. W przypadku kolchicyny należy przygotować 3 ml roztworów 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 i 0,5 μg/ml w sterylnej wodzie. Na koniec, w przypadku mannitolu, przygotuj 3 ml rozcieńczeń w sterylnej wodzie o stężeniach 5, 10, 20, 30, 40 i 50 mg/ml.
  4. Przygotować podstawowe stężenie cytochalazyny B w stężeniu 200 μg/ml, rozpuszczając butelkę 5 mg w 25 ml DMSO. Cytochalazyna B może być przechowywana w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy.

3. Narażenie komórek na klastogeny i/lub aneugeny

  1. Dodaj 1 ml pożądanej substancji chemicznej (np. Mitomycyny C) do 9 ml komórek w temperaturze ~ 7-8x105 komórek/ml w kolbie T25. Do próbek kontrolnych dodać 1 ml sterylnej wody. Umieścić kolby w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 3 godziny < / > UWAGA: Jeśli chemikalia są rozcieńczane w DMSO, dodaj tylko 100 μl substancji chemicznej do każdej kolby i dodaj 100 μl DMSO do kontroli. Każda kolba powinna zawierać 9.900 ml komórek.
  2. Po 3 godzinach wyjąć kolby z inkubatora i przenieść komórki do probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 8 minut, odessać supernatant i przenieść komórki do nowych kolb T25 zawierających łącznie 10 ml świeżej pożywki hodowlanej. Dodać 150 μl stężenia podstawowego (200 μg/ml) cytochalazyny B do każdej kolby, aby uzyskać końcowe stężenie 3 μg/ml.
  3. Umieścić kolby z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na czas odzyskiwania równy 1,5-2,0 razy podwojenia, zgodnie z zaleceniami wytycznych OECD9. W przypadku ogniw TK6 użytych w tej pracy czas rekonwalescencji wynosił 24 h.
    UWAGA: Czas podwojenia użytych tutaj ogniw TK6 wynosił 15 godzin, a czas odzyskiwania wynosił 24 godziny (1,6 czasu podwojenia). Czas odzysku krótszy niż 1,5 czasu podwojenia zmniejszy proliferację w próbkach narażonych na wyższe dawki wpływające na liczbę BNC. I odwrotnie, czasy odzyskiwania większe niż 2,0 spowodują nieproporcjonalną liczbę komórek wielojądrowych w próbkach kontrolnych, zniekształcając obliczenia cytotoksyczności.

4. Przygotowanie do utrwalania i znakowania zawartości DNA (patrz Tabela Materiałów)

  1. Przygotuj 75 mM chlorku potasu (KCl), dodając 2,79 g do 500 ml ultraczystej wody. Mieszać roztwór przez 5 minut za pomocą mieszadła magnetycznego i sterylnego filtra przez filtr 200 μm. Roztwór KCl o stężeniu 75 mM może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  2. Przygotuj wystarczającą ilość 4% formaliny do eksperymentu, przewidując, że do każdej próbki należy dodać łącznie 2,1 ml. Na przykład, aby przygotować 10 ml 4% formaliny, dodaj 4 ml 10% bulionu formalinowego do 6 ml 1x buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej Dulbecco bez Ca2+ lub Mg2+ (PBS). Ta 4% formalina może być przechowywana w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.
  3. Przygotuj 510 ml buforu do płukania (2% FBS w 1X PBS), dodając 10 ml FBS do 500 ml butelki 1x PBS.
  4. Przygotować 10 ml o stężeniu 100 μg/ml Hoechst 33342, dodając 100 μl stężenia podstawowego (1 mg/ml) do 9,900 μl 1X PBS. Roztwór Hoechst 33342 może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.

5. Przetwarzanie próbek: hipotoniczne pęcznienie, utrwalanie, liczenie komórek i znakowanie zawartości DNA

  1. Pod koniec okresu rekonwalescencji wyjąć wszystkie kolby z inkubatora i przenieść wszystkie próbki do probówek polipropylenowych o pojemności 15 ml. Odwirować wszystkie próbki o masie 200 x g przez 8 minut.
  2. Odessać supernatant, ponownie zawiesić komórki i dodać 5 ml 75 mM KCl. Delikatnie wymieszać przez trzykrotne odwrócenie i inkubować w temperaturze 4 °C przez 7 minut.
  3. Do każdej próbki dodać 2 ml 4% formaliny, delikatnie wymieszać trzykrotnie przez odwrócenie i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Ten krok działa jak "miękka fiksacja".
  4. Odwirować wszystkie próbki przy 200 x g przez 8 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl 4% formaliny na 20 minut. Ten krok działa jak "twarda fiksacja".
  5. Dodać 5 ml buforu do przemywania i odwirować przy 200 x g przez 8 min. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w 100 μl buforu do przemywania .
  6. Przenieść wszystkie próbki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  7. Wykonaj zliczanie komórek na każdej próbce, aby określić liczbę komórek w próbce. Próbki będą wysoce skoncentrowane, więc prawdopodobnie wymagane będzie rozcieńczenie 1:100 w 1x PBS (10 μl próbki w 990 μL PBS) w celu uzyskania dokładnego zliczenia.
    UWAGA: W tym momencie najlepiej jest wykonać zliczanie komórek za pomocą hemocytometru. Dodanie KCl nadaje cytoplazmie półprzezroczysty wygląd, co utrudnia automatyczne liczniki komórek ich rozpoznanie. Ponadto automatyczne liczniki mają trudności z oceną komórek wielojądrowych ze względu na ich rozmiar.
  8. Jeżeli próbki nie zostaną natychmiast poddane testowi MIFC, mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez kilka dni. Gdy próbki będą gotowe do badania, dodaj 5 μl po 100 μg/ml na 1x106 komórek/ml do każdej próbki. Dodać również 10 μl z 500 μg/ml RNazy na 100 μl próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg/ml. Próbki inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 minut.
  9. Mikrowirować wszystkie próbki o masie 200 x g przez 8 minut i za pomocą pipety usunąć supernatant, pozostawiając ~30 μl. Użyj pipety, aby ponownie zawiesić wszystkie próbki przed uruchomieniem na MIFC, upewniając się, że w probówce nie ma pęcherzyków. Nie wirować.

6. Uruchamianie i kalibracja MIFC

  1. Upewnij się, że osłona, odczynnik do kalibracji systemu, pojemnik na bąbelk, środek czyszczący i sterylizator są pełne, a zbiornik na odpady jest pusty. Włącz system i kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania MIFC. Kliknij przycisk Uruchamianie i upewnij się, że pole wyboru Rozpocznij wszystkie kalibracje i testy jest zaznaczone. Spowoduje to przepłukanie systemu, załadowanie osłony i odczynników do kalibracji systemu oraz skalibrowanie systemu (patrz Tabela materiałów).

7. Uruchamianie próbek na MIFC

UWAGA: Ta sekcja zakłada użycie MIFC z 2 kamerami. W przypadku korzystania z MIFC z 1 kamerą, należy zapoznać się z Suplementem 1 - Pełny protokół, sekcja 7, aby uzyskać informacje na temat tworzenia działek podczas pozyskiwania

  1. Uruchom oprogramowanie do akwizycji danych MIFC (patrz tabela materiałów). Rysunek 1 pokazuje ustawienia instrumentu. Włącz laser 405 nm i ustaw moc lasera na 10 mW (A). Wyłącz wszystkie inne lasery (w tym SSC) i ustaw BF na kanały 1 i 9 (B). Upewnij się, że suwak powiększenia jest ustawiony na 60x (C), wybrany jest tryb wysokiej czułości (D) i że w galerii obrazów wyświetlane są tylko kanały 1, 7 i 9.
  2. Kliknij ikonę Wykres rozrzutu. Wybierz opcję Cała populacja i wybierz opcję Obszar M01 na osi X i Współczynnik proporcji M01 na osi Y. Kliknij ikonę Kwadratowy region i narysuj region wokół pojedynczych komórek. Nazwij ten region Pojedyncze komórki. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres i wybierz Regiony. Podświetl obszar Pojedyncze komórki i zmień współrzędne x na 100 i 900 oraz zmień współrzędne y na 0,75 i 1 (Rysunek 1I).
  3. Kliknij ikonę Wykres rozrzutu. Wybierz opcję Pojedyncze komórki jako populację nadrzędną, wybierz opcję Gradient RMS M01 na osi X i Gradient RMS M07 na osi Y. Kliknij ikonę Kwadratowy region i narysuj region wokół większości komórek. Nadaj temu regionowi nazwę Focused Cells. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres i wybierz Regiony. Podświetl obszar Focused Cells i zmień współrzędne x na 55 i 75 oraz zmień współrzędne y na 9.5 i 20 (Rysunek 1J).
  4. Kliknij ikonę histogramu. Wybierz populację skoncentrowanych komórek i wybierz Intensywność M07 jako funkcję. Kliknij ikonę Region liniowy i narysuj region w poprzek głównego szczytu na histogramie. Nazwij ten region DNA-dodatnim. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres i wybierz Regiony. Podświetl region DNA-dodatni i zmień współrzędne na 2 x 105 i 2 x 106. Zakres może wymagać dostosowania w zależności od wartości szczytowej intensywności na histogramie (Rysunek 1K).
  5. Ustaw parametry akwizycji (Rysunek 1E). Określ nazwę pliku i folder docelowy, zmień liczbę zdarzeń na 20 000 i wybierz populację DNA-dodatnią.
  6. Kliknij przycisk Załaduj (Rysunek 1F) i umieść próbkę kontrolną w MIFC. Kliknij przycisk Pobierz, aby zebrać dane (Rysunek 1G). Po zakończeniu akwizycji kliknij przycisk Return, aby zwrócić próbkę (Rysunek 1H). Wyjmij probówkę z próbką z przyrządu. Powtórz ten proces dla wszystkich pozostałych próbek w eksperymencie.

8. Otwieranie pliku danych w IDEAS

  1. Uruchom pakiet oprogramowania do analizy MIFC (patrz tabela materiałów). Kliknij przycisk Rozpocznij analizę, aby uruchomić Kreatora otwierania plików. Wybierz plik danych, przechodząc do żądanego pliku obrazu RAW (.rif). Kliknij przycisk Otwórz i kliknij Dalej.
  2. Ponieważ jest to test pojedynczego koloru, kompensacja nie jest konieczna, więc kliknij przycisk Dalej, aby pominąć krok kompensacji. Na tym etapie nie ma szablonu analizy do zastosowania, więc ponownie kliknij przycisk Dalej. Jeśli szablon analizy został pobrany z materiału dodatkowego, wybierz go teraz. Te szablony działają tylko z 2 kamerami MIFC z BF ustawionym na kanały 1 i 9 oraz obrazami jądrowymi w kanale 7 podczas akwizycji.
  3. Domyślnie nazwy plików .cif i .daf są generowane automatycznie tak, aby były zgodne z .rif. Nie zaleca się zmiany nazw .cif i .daf. Kliknij Dalej. Ustaw właściwości wyświetlania obrazu, wybierając wartości 01 i 07. Kliknij Dalej. Nie ma kreatora dla tej aplikacji, więc kliknij przycisk Zakończ. Bardzo ważne jest, aby często zapisywać plik analizy danych (.daf) i szablon analizy (.ast) podczas sekcji 9–14, aby uniknąć utraty postępu.

9. Tworzenie masek i funkcji do identyfikacji BNC

  1. Kliknij ikonę Właściwości galerii obrazów (niebiesko-biała ikona). Na karcie Właściwości wyświetlania kliknij opcję Ustaw zakres na Dane pikseli, a następnie zmień kolor na żółty. Kliknij przycisk OK. Obrazy Hoechst są teraz łatwiejsze do oglądania na czarnym tle.
  2. Utwórz wykres komórek nieapoptotycznych.
    1. Kliknij kartę Analiza, a następnie kliknij opcję Maski. Kliknij przycisk Nowy, a następnie kliknij przycisk Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz Próg, w obszarze Maska wybierz M07 i ustaw wartość procentową intensywności na 50. Kliknij przycisk OK, a następnie ponownie przycisk OK. Kliknij przycisk Zamknij.
    2. Kliknij kartę Analiza, kliknij opcję Obiekty, a następnie kliknij przycisk Nowy. W polu Typ elementu wybierz opcję Obszar. W polu Maska wybierz Próg(M07,Ch07,50). Kliknij opcję Ustaw nazwę domyślną, a następnie kliknij przycisk OK. Kliknij przycisk Zamknij, aby rozpocząć obliczanie wartości elementów.
    3. Kliknij ikonę Wykres punktowy. Wybierz opcję Cała populacja. Dla funkcji osi X wybierz funkcję Contrast_M01_Ch01, a dla funkcji osi Y wybierz Area_Threshold(M07,Ch07,50). Kliknij przycisk OK.
    4. Kliknij przycisk Kwadratowy region i narysuj region wokół większości komórek. Nazwij ten region nieapoptozą. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres i kliknij Regiony. Podświetl obszar nieapoptozyjny. Ustaw współrzędne x na 0 i 15, a współrzędne y na 50 i 300. Kliknij przycisk Zamknij.
  3. Utwórz maskę BNC (kroki 9.3.1-9.3.5), aby zidentyfikować komórki, które zawierają tylko dwa jądra.
    1. Wyszukaj BNC w galerii zdjęć i kliknij na niego. Ma to na celu wizualizację tworzenia maski w kanale Hoechst.
    2. Kliknij kartę Analiza, a następnie kliknij opcję Maski. Kliknij przycisk Nowy, a następnie kliknij przycisk Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz opcję LevelSet, w obszarze Maska wybierz M07, wybierz przycisk radiowy Maska poziomu środkowego i ustaw Skalę szczegółów konturu na wartość 3,00. Kliknij przycisk OK, a następnie ponownie przycisk OK.
    3. Kliknij przycisk Nowy, a następnie kliknij przycisk Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz opcję Rozszerz, a w obszarze Maska wybierz pozycję LevelSet(M07,Ch07,Middle,3). Ustaw obraz do wyświetlenia na Ch07 i ustaw liczbę pikseli na 2. Kliknij przycisk OK, a następnie ponownie przycisk OK.
    4. Kliknij przycisk Nowy, a następnie kliknij przycisk Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz pozycję Zlewnia, a w obszarze Maska wybierz pozycję Dilate(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3)2). Ustaw obraz do wyświetlenia na Ch07 i ustaw Grubość linii na 1. Kliknij przycisk OK, a następnie ponownie przycisk OK.
    5. Kliknij przycisk Nowy, a następnie kliknij przycisk Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz Zakres, w obszarze Maska wybierz Watershed(Dilate(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3))). Ustaw obraz do wyświetlenia na Ch07. Ustaw minimalne i maksymalne wartości obszaru odpowiednio na 115 i 5000. Ustaw minimalne i maksymalne wartości współczynnika proporcji odpowiednio na 0,4 i 1. Kliknij przycisk OK. W polu Name (Nazwa) zmień tekst na BNC, a następnie kliknij przycisk OK.
  4. Utwórz obiekty i wykresy, aby uzyskać ostateczną populację BNC
    1. Funkcja BNC zliczania punktowego: Kliknij kartę Analiza, następnie Funkcje, a następnie Nowy. W polu Typ elementu wybierz opcję Liczba punktów dodatkowych. W polu Mask (Maska) wybierz ostateczną maskę BNC utworzoną w wersji 9.3.5. Ustaw Connectedness (Połączenie) na Four (Cztery) i zmień nazwę na Spot Count BNC. Kliknij przycisk OK, a następnie Zamknij, aby obliczyć wartości elementów.
    2. Histogram BNC liczby plamek. Kliknij ikonę histogramu. Wybierz opcję Nieapoptotyczne jako populację nadrzędną. Dla funkcji osi X wybierz funkcję BNC Spot Count. Kliknij przycisk OK. Kliknij ikonę Region liniowy. Narysuj region w poprzek kosza 2. Nazwij ten region 2N.
      UWAGA: Zapoznaj się z sekcją 9 w Suplemencie 1 - Pełny Protokół, aby utworzyć pozostałe maski, cechy i wykresy w celu zidentyfikowania końcowej populacji BNC

10. Tworzenie masek i funkcji identyfikujących MN w populacji BNC

  1. Utwórz maskę MN. Wyszukaj BNC, który zawiera MN w galerii obrazów i kliknij na niego. Ma to na celu wizualizację tworzenia maski MN w kanale Hoechst. Kliknij kartę Analiza, a następnie kliknij opcję Maski.
    1. Utwórz maskę identyfikacyjną miejsca 1:
      1. Kliknij przycisk Nowy, a następnie kliknij przycisk Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz opcję Punktowy i upewnij się, że wybrano przycisk radiowy Jasny. W obszarze Maska wybierz M07, ustaw stosunek plamki do tła komórki na 2.00. Ustaw minimalny promień na 2, a maksymalny promień na 6. Kliknij przycisk OK, a następnie ponownie przycisk OK.
      2. Kliknij przycisk Nowy, a następnie kliknij przycisk Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz pozycję Zakres, a w obszarze Maska wybierz pozycję LevelSet(M07,Ch07,Middle,3). Ustaw obraz do wyświetlenia na Ch07. Ustaw minimalny i maksymalny obszar odpowiednio na 80 i 5000. Ustaw minimalny i maksymalny współczynnik proporcji odpowiednio na 0 i 1. Kliknij przycisk OK, a następnie ponownie przycisk OK.
      3. Kliknij przycisk Nowy, a następnie kliknij przycisk Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz opcję Rozszerz, w obszarze Maska wybierz pozycję Zakres(LevelSet(M07,Ch07,Middle,3),80-5000,0-1). Ustaw obraz do wyświetlenia na Ch07. Ustaw liczbę pikseli na 2. Kliknij przycisk OK, a następnie ponownie przycisk OK.
      4. Kliknij przycisk Nowy. Kliknij dwukrotnie maskę Spot (M07, Ch07, Bright, 2, 6, 2), aby dodać ją do definicji maski. Kliknij operator I, a następnie operator Nie. Kliknij dwukrotnie maskę Dilate(Range(LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2), aby dodać ją do definicji maski. Kliknij przycisk OK.
      5. Kliknij Nowy, a następnie Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz Zakres, a pod maską wybierz maskę utworzoną w 10.1.1.4:
        1. Wybierz Spot (M07, Ch07, Jasny, 2, 6, 2) i nie rozszerzaj (Range(LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1), 2).
        2. Ustaw obraz do wyświetlenia na Ch07. Ustaw Minimalny i Maksymalny obszar odpowiednio na 10 i 80. Ustaw minimalny i maksymalny współczynnik proporcji odpowiednio na 0,4 i 1. Kliknij przycisk OK, a następnie ponownie przycisk OK. Maska identyfikacyjna miejsca 1 jest kompletna.
          UWAGA: Patrz sekcja 10 w Suplemencie 1 - Pełny Protokół, aby utworzyć maski, cechy i wykresy w celu identyfikacji końcowej populacji MN

11. Tworzenie masek, cech i wykresów w celu identyfikacji populacji jednojądrowych i wielojądrowych

  1. Utwórz maskę POLY. Kliknij Analiza, następnie Maski, następnie Nowy, a następnie Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz Zakres, w obszarze Maska wybierz Watershed(Dilate(LevelSet(M07, Ch07, Middle, 3), 2)). Ustaw obraz do wyświetlenia na Ch07. Ustaw wartości Obszar minimalny i maksymalny odpowiednio na 135 i 5000. Ustaw wartości Minimalny i Maksymalny współczynnik proporcji odpowiednio na 0,4 i 1. Kliknij przycisk OK. W polu Nazwa zmień tekst na POLY, a następnie kliknij przycisk OK, a następnie przycisk Zamknij. Maska komórki wielojądrowej jest kompletna.
  2. Utwórz maski komponentów POLY.
    1. Maska komponentu POLY 1: Kliknij kartę Analiza, następnie Maski, następnie Nowa, a następnie Funkcja. W obszarze Funkcja wybierz opcję Komponent, a w obszarze Maska wybierz maskę POLY. W polu Funkcja klasyfikacji wybierz opcję Obszar, a w polu Porządek sortowania kliknij przycisk radiowy Malejąco. Ustaw rangę na 1. Kliknij przycisk OK, a następnie ponownie przycisk OK.
    2. Maski komponentów POLY 2, 3 i 4: Powtórz wszystkie kroki opisane w 11.2.1 z wyjątkiem ustawienia Rangi na 2, 3 i 4, aby utworzyć poszczególne maski komponentów.
  3. Liczenie punktowe za pomocą maski POLY.
    1. Kliknij kartę Analiza, następnie Obiekty, a następnie Nowy. W polu Typ elementu wybierz opcję Liczba punktów punktowych. W polu Maska wybierz maskę POLY i ustaw wartość Connectedness na 4. Kliknij opcję Ustaw nazwę domyślną, a następnie kliknij przycisk OK, a następnie Zamknij, aby obliczyć wartości elementów.
    2. Kliknij ikonę histogramu. Wybierz populację nieapoptotyczną. Dla funkcji osi X wybierz funkcję Spot Count_POLY_4
      3. .
    3. Obszar zliczania plamek MONO. Kliknij ikonę Region liniowy. Narysuj region w poprzek kosza 1 na histogramie utworzonym w wersji 11.3.2. Nazwij ten region 1N.
    4. Region zliczania plamek TRI. Kliknij ikonę Region liniowy. Narysuj region w poprzek kosza 3 na histogramie utworzonym w wersji 11.3.2. Nazwij ten region 3N.
    5. Region liczby plamek QUAD MONO. Kliknij ikonę Region liniowy. Narysuj region w poprzek kosza 4 na histogramie utworzonym w wersji 11.3.2. Nazwij ten region 4N.
  4. Zidentyfikuj populację MONO.
    1. Utwórz funkcję współczynnika proporcji MONO. Kliknij kartę Analiza, następnie Obiekty, a następnie Nowy. W obszarze Typ elementu wybierz funkcję Współczynnik proporcji, a w obszarze Maska wybierz opcję Komponent(1, Obszar, POLY, Malejąco). Kliknij przycisk Ustaw nazwę domyślną, a następnie kliknij przycisk OK.
    2. Utwórz funkcję cyrkularności MONO. Mając nadal otwarte okno Menedżer funkcji, kliknij przycisk Nowy. W obszarze Typ elementu wybierz funkcję Kołowość, a w obszarze Maska wybierz opcję Komponent(1, Obszar, POLY, Malejąco). Kliknij opcję Ustaw nazwę domyślną, a następnie kliknij przycisk OK, a następnie kliknij przycisk Zamknij, aby obliczyć wartości elementów.
    3. W przypadku okrągłego wykresu punktowego komórek MONO kliknij ikonę Wykres punktowy. Wybierz 1N jako populację nadrzędną. Dla elementu osi X wybierz opcję Circularity_Component(1, Obszar, POLY, malejąco), a dla elementu osi Y wybierz Aspekt Ratio_Component(1, Obszar, POLY, malejąco). Kliknij przycisk OK. Kliknij przycisk Kwadratowy region i narysuj region wokół populacji komórek w kierunku prawej górnej części wykresu. Nazwij ten region Circular_1N. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres i kliknij Regiony. Podświetl region Circular_1N. Zmień współrzędne X na 20 i 55 oraz zmień współrzędne Y na 0,85 i 1,0. Kliknij przycisk Zamknij.
    4. Utwórz element Obszar POLY/Area_M07. Kliknij kartę Analiza, następnie Obiekty, a następnie Nowy. W obszarze Typ elementu wybierz element Obszar, a następnie w obszarze Maska wybierz Komponent(1, Obszar, POLY, Malejąco). Kliknij przycisk Ustaw nazwę domyślną, a następnie kliknij przycisk OK.
    5. Mając otwarte okno Menedżer funkcji, kliknij przycisk Nowy, a następnie w obszarze Typ elementu kliknij przycisk radiowy Połączone. Na liście obiektów podświetl Area_Component(1, Obszar, POLY, Malejąco) i kliknij strzałkę w dół, aby dodać ją do definicji obiektu. Kliknij symbol dzielenia (/). Wybierz Area_M07 element i kliknij strzałkę w dół, aby dodać go do definicji elementu. Kliknij opcję Ustaw nazwę domyślną, a następnie kliknij przycisk OK. Kliknij przycisk Zamknij, aby rozpocząć obliczanie wartości elementów.
    6. Aby wyświetlić końcowy wykres kropkowy populacji MONO, kliknij ikonę wykresu kropkowego. Wybierz Circular_1N jako populację nadrzędną. Dla funkcji osi X wybierz opcję Aspect Ratio_M07, a dla funkcji osi Y wybierz opcję Area_Component(1, Area, POLY, Descending) / Area_M07. Kliknij przycisk OK. Kliknij przycisk Kwadratowy region i narysuj region wokół większości komórek. Nazwij ten region Monojądrowy. Kliknij prawym przyciskiem myszy wykres i kliknij Regiony. Podświetl obszar monojądrowy. Zmień współrzędne X na 0,85 i 1,0 oraz zmień współrzędne Y na 0,55 i 1,0. Kliknij przycisk Zamknij.
      UWAGA: Zapoznaj się z sekcją 11 w Suplemencie 1 - Pełny Protokół, aby utworzyć maski, cechy i wykresy do identyfikacji końcowych populacji trójjądrowych i wielojądrowych.

12. Utwórz niestandardowy widok, aby sprawdzić maski BNC i MN

  1. Kliknij przycisk Właściwości galerii obrazów, a następnie kliknij kartę Widok. Kliknij kartę Kompozyty, a następnie kliknij przycisk Nowy. W polu Nazwa wpisz Ch01/Ch07. Kliknij przycisk Dodaj obraz. W obszarze Obraz wybierz Ch01 i ustaw wartość Procent na 100. Kliknij ponownie przycisk Dodaj obraz, w obszarze Obraz wybierz Ch07 i ustaw wartość Procent na 100.
  2. Kliknij przycisk Nowa, a następnie w obszarze Nazwa wpisz maski BNC i MN
  3. Kliknij przycisk Dodaj kolumnę. W obszarze Typ obrazu wybierz Ch01, a w obszarze Maska wybierz Brak
  4. Kliknij przycisk Dodaj kolumnę. W obszarze Image Type (Typ obrazu) wybierz Ch07, a w obszarze Mask (Maska) wybierz opcję Brak
  5. Kliknij przycisk Dodaj kolumnę. W obszarze Image Type (Typ obrazu) wybierz Ch07, a w obszarze Mask (Maska) wybierz BNC
  6. Kliknij przycisk Dodaj kolumnę. W obszarze Image Type (Typ obrazu) wybierz Ch07, a w obszarze Mask (Maska) wybierz MN mask (Maska
    7. )
  7. Kliknij przycisk Dodaj kolumnę. W obszarze Typ obrazu kliknij przycisk radiowy Kompozyt. Obraz kompozytowy Ch01/Ch07 powinien zostać automatycznie dodany do widoku. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno Właściwości galerii obrazów.

13. Utwórz niestandardowy widok, aby zbadać maskę POLY

  1. Zapoznaj się z sekcją 13 w Suplemencie 1 - Pełny protokół, aby utworzyć niestandardowy widok do zbadania maski POLY

14. Utwórz tabelę statystyk, aby wyliczyć kluczowe zdarzenia

  1. Kliknij kartę Raporty, a następnie kliknij opcję Zdefiniuj raport statystyczny. W nowym oknie kliknij Dodaj kolumny.
  2. Dodaj statystykę zliczania BNC. W obszarze Statystyka wybierz pozycję Liczba, a następnie w obszarze Wybrana populacja wybierz populację BNC. Kliknij przycisk Dodaj statystyki, aby dodać statystykę do listy.
  3. Powtórz krok 14.2, aby utworzyć osobne kolumny dla populacji MN BNC, MONO, TRI i POLY. Kliknij przycisk Zamknij, a następnie kliknij przycisk OK.
  4. Szablon analizy danych jest kompletny (Rysunek 2). Zapisz szablon (Plik, Zapisz jako szablon). Pełna lista masek znajduje się w Suplemencie 2 - Lista masek.

15. Pliki eksperymentu procesu wsadowego przy użyciu szablonu analizy danych

  1. W menu Narzędzia kliknij polecenie Batch Data Files (Pliki danych wsadowych), a następnie kliknij polecenie Add Batch (Dodaj wsad) w nowym oknie.
  2. W nowym oknie kliknij Dodaj pliki, aby wybrać pliki eksperymentu (.rif), które chcesz dodać do wsadu. W obszarze opcji Wybierz szablon lub plik analizy danych (.ast, .daf) kliknij ikonę otwartego folderu, aby przejść do szablonu analizy danych (pliku .ast) zapisanego w kroku 14.4 i otworzyć go.
  3. Kliknij przycisk Podgląd raportu statystycznego, aby wyświetlić podgląd tabeli statystyk. W tym miejscu nie zostaną wyświetlone żadne wartości, ponieważ nie zostały one jeszcze obliczone. Jednak ten krok służy jako sprawdzenie, czy przed uruchomieniem partii został wybrany właściwy szablon analizy.
  4. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć bieżące okno. Następnie kliknij przycisk Prześlij partie, aby rozpocząć przetwarzanie wsadowe wszystkich plików.
  5. Po zakończeniu przetwarzania wsadowego plik .txt będzie dostępny w folderze zawierającym wszystkie pliki rif . Statystyki te służą do obliczania genotoksyczności i cytotoksyczności.

16. Obliczanie parametrów genotoksyczności i cytotoksyczności

  1. Obliczanie genotoksyczności: Aby obliczyć genotoksyczność, należy skorzystać z tabeli statystycznej utworzonej w ppkt 15.5. Podziel liczbę komórek w populacji MN BNCs przez liczbę komórek w populacji BNC, a następnie pomnóż przez 100:
    figure-protocol-1
  2. Obliczanie cytotoksyczności: Określ całkowitą liczbę komórek POLY, sumując liczbę komórek TRI i QUAD.
    1. Obliczyć wskaźnik proliferacji bloku cytokinezy (CBPI), używając liczby komórek w MONO, BNC i POLY w następujący sposób:
      figure-protocol-2
    2. Na koniec należy obliczyć cytotoksyczność każdej kultury, stosując wartości CBPI z kultur kontrolnych (C) i kultur narażonych chemicznie (T) w następujący sposób:
      figure-protocol-3

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda analizy opisana w tym artykule pozwala na automatyczną identyfikację i ocenę BNC, z MN i bez MN, w celu obliczenia genotoksyczności. Ponadto komórki MONO i POLY są również automatycznie identyfikowane i oceniane w celu obliczenia cytotoksyczności. Opublikowane kryteria punktacji6,34, które muszą być przestrzegane podczas oceniania tych zdarzeń, są zaimplementowane w oprogramowaniu do analizy danych MIFC. Przedstawione wyniki wskazują, że statystycznie istotny wzrost częstości występowania MN wraz ze wzrostem cytotoksyczności można wykryć po ekspozycji ludzkich komórek limfoblastoidalnych TK6 na dobrze znane substancje chemiczne indukujące MN (mitomycyna C i kolchicyna). Podobne wyniki dla dodatkowych badanych substancji chemicznych zostały przedstawione w osobnej publikacji32. Ponadto wyniki stosowania mannitolu pokazują, że substancje chemiczne inne niż MN mogą być również prawidłowo zidentyfikowane przy użyciu opisanej tutaj metody MIFC. Parametry opisane w protokole w celu stworzenia wszystkich masek, cech i granic regionów prawdopodobnie będą musiały zostać dostosowane, jeśli do przeprowadzenia testu zostaną użyte różne typy komórek (np. komórki chomika chińskiego).

Rysunek 3 pokazuje cztery wybrane panele do identyfikacji BNC (Rysunek 3A-3D). Pokazany tutaj jest histogram, który umożliwia wybór komórek z dwoma jądrami (Rysunek 3A) i wykresami dwuwymiarowymi, które umożliwiają wybór BNC o podobnej kołowości (Rysunek 3B), podobnych obszarach i intensywnościach (Rysunek 3C) oraz BNC, które mają dobrze oddzielone, nienakładające się jądra (Rysunek 3D) zgodnie z kryteriami punktacji6,34. Rysunek 3E pokazuje obrazy BF i Hoechst, a także maski BNC i MN, co wskazuje, że BNC z pojedynczym lub wielokrotnym MN mogą być zidentyfikowane i wyliczone. Pozwala to na obliczenie genotoksyczności poprzez określenie częstości mikrojądrowych BNC w końcowej populacji BNC. Rysunek 4 pokazuje zastosowanie funkcji Spot Count przy użyciu maski POLY do identyfikacji komórek MONO, TRI i QUAD. Liczbę komórek TRI i QUAD można następnie zsumować, aby uzyskać ostateczną liczbę komórek POLY (Tabela 1). Umożliwia to obliczenie cytotoksyczności przy użyciu wzoru przedstawionego w protokole. W związku z tym każdy punkt dawki w doświadczeniu może być oceniany zarówno na podstawie parametrów genotoksyczności, jak i cytotoksyczności.

Rysunek 5 pokazuje wartości genotoksyczności i cytotoksyczności dla aneugenu Colchicine, klastogenu Mitomycyny C i dla kontroli negatywnej, Mannitolu. W przypadku kolchicyny (Rysunek 5A) dawki od 0,02 do 0,05 μg / ml powodowały statystycznie istotny wzrost częstości występowania MN, odpowiednio od 1,28% do 2,44% w stosunku do kontroli rozpuszczalnika (Tabela 1). W przypadku mitomycyny C (Rysunek 5B) dwie górne dawki 0,4 i 0,5 μg / ml powodowały statystycznie istotne częstości MN w porównaniu z kontrolnymi rozpuszczalnikami. Częstość występowania MN wynosiła 0,93% przy stężeniu 0,4 μg/ml i 1,02% przy stężeniu 0,5 μg/ml (Tabela 2). Wreszcie, w przypadku mannitolu (Rysunek 5C), żadne badane dawki nie wywołują cytotoksyczności powyżej 30%, ani nie powodują znaczącego wzrostu częstości MN w porównaniu z kontrolami rozpuszczalnika, zgodnie z oczekiwaniami (Tabela 3).

figure-results-1
Rysunek 1: Ustawienia instrumentu MIFC. Zrzut ekranu przedstawiający ustawienia MIFC zgodnie z opisem w kroku 7 protokołu. (A) Ustawienie mocy lasera 405 nm na 10 mW. (B) Ustawianie kanałów BF 1 i 9. (C) Wybór soczewki obiektywowej o powiększeniu 60x. (D) Wybór najmniejszej prędkości przepływu, która generuje obrazy o najwyższej rozdzielczości. (E) Określenie liczby zdarzeń, które mają zostać zebrane, do 20 000. (F) Kliknięcie przycisku Załaduj, aby rozpocząć proces ładowania próbki. (G) Kliknięcie przycisku Pobierz, aby rozpocząć pobieranie obrazów. (H) Kliknięcie przycisku Return w celu zwrócenia niewykorzystanej próbki. (I) Wykres rozrzutu współczynnika proporcji BF w funkcji obszaru BF dla wyboru pojedynczych komórek. (J) Wykres rozrzutu gradientu Hoechsta RMS w funkcji BF Gradient RMS dla wyboru skoncentrowanych komórek. (K) Histogram intensywności Hoechsta dla selekcji komórek DNA dodatnich. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Strategia bramkowania w oprogramowaniu do analizy. Zrzut ekranu przedstawiający strategię bramkowania opisaną w sekcji 9 protokołu. Regiony są pokazane w kolejności sekwencyjnej w celu identyfikacji komórek dwujądrowych (czerwona ramka), mikrojąder (żółta ramka) oraz komórek jedno- i wielojądrowych (niebieska ramka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Identyfikacja i punktacja BNC z i bez MN. (A) Selekcja komórek, które mają dwa odrębne jądra. (B) Identyfikacja komórek dwujądrowych (BNC), które mają dwa wysoce okrągłe jądra za pomocą funkcji intensywności współczynnika proporcji. (C) Wybór BNC, które mają jądra o podobnych powierzchniach i natężeniach. Osiąga się to poprzez obliczenie stosunku powierzchni obu jąder do stosunku proporcji obu jąder. (D) Wykorzystanie cech Współczynnika Kształtu i Współczynnika Kształtu do identyfikacji BNC, które mają dwa dobrze oddzielone jądra. (E) Funkcja zliczania punktowego z wykorzystaniem maski mikrojądrowej (MN) wykazująca, że BNC z pojedynczym lub wielokrotnym MN mogą być zidentyfikowane i policzone. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Identyfikacja i punktacja komórek MONO i POLY. Wykorzystanie funkcji zliczania punktowego do identyfikacji i zliczania komórek jedno-, trój- i czterojądrowych. Maska komponentu 1 umożliwia identyfikację komórek jednojądrowych (górne zdjęcie). Maski składowe od 1 do 3 umożliwiają identyfikację komórek trójjądrowych (środkowy obraz). Maski składowe od 1 do 4 umożliwiają identyfikację komórek czterojądrowych (dolny obraz). Ten rysunek został zmodyfikowany z Rodrigues 201832. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Kwantyfikacja cytotoksyczności. Cytotoksyczność określona ilościowo za pomocą wskaźnika proliferacji bloku cytokinezy (czarne kółka) i genotoksyczność określona ilościowo przy użyciu procentowej zawartości MN (przezroczyste paski) po 3-godzinnym narażeniu i 24-godzinnym odzysku dla (A) kolchicyny, (B) mitomycyny C i (C) mannitolu. Statystycznie istotny wzrost częstości występowania MN w porównaniu z grupą kontrolną są oznaczone gwiazdkami (test chi-kwadrat; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Wszystkie wielkości są średnią z dwóch kontrprób w każdym punkcie dawki. Ten rysunek został zmodyfikowany z Rodrigues 201832. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Tabela 1: Parametry wymagane do obliczenia cytotoksyczności (liczba komórek jedno-, dwu- i wielojądrowych) oraz genotoksyczności (liczba i procent mikrojądrowych komórek dwujądrowych) dla kolchicyny. Wszystkie obliczone wielkości są średnią z dwóch kontrprób w każdym punkcie dawkowania.

figure-results-7
Tabela 2: Parametry wymagane do obliczenia cytotoksyczności (liczba komórek jedno-, dwu- i wielojądrowych) oraz genotoksyczności (liczba i procent mikrojądrowych komórek dwujądrowych) dla mitomycyny C. Wszystkie obliczone wielkości są średnią z dwóch kontrprób w każdym punkcie dawkowania.

figure-results-8
Tabela 3: Parametry wymagane do obliczenia cytotoksyczności (liczba komórek jedno-, dwu- i wielojądrowych) oraz genotoksyczności (liczba i procent mikrojądrowych komórek dwujądrowych) dla mannitolu. Wszystkie obliczone wielkości są średnią z dwóch kontrprób w każdym punkcie dawkowania.

Suplement 1: Pełny protokół. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Suplement 2: Lista masek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niedawnej publikacji Verma i in. podkreślili znaczenie opracowania systemu, który łączy zalety cytometrii przepływowej o wysokiej przepustowości z korzyściami płynącymi z analizy obrazu i przechowywania danych35. Test MIFC in vitro MN opisany w tym artykule spełnia ten cytat i ma potencjał do przezwyciężenia wielu z wyżej wymienionych wyzwań w metodach mikroskopii i cytometrii przepływowej. Opisany tutaj protokół pokazuje, że zarówno cytotoksyczność, jak i genotoksyczność mogą być oceniane za pomocą MIFC. Przygotowanie próbki, barwienie komórkowe i zbieranie danych są proste, ale w protokole jest kilka krytycznych kroków, które zawsze powinny być wdrażane. Dodanie chlorku potasu (KCl) do komórek ma kluczowe znaczenie dla pęcznienia komórek, powodując separację między głównymi jądrami. Dzięki temu algorytm maskujący może zidentyfikować wszystkie pojedyncze jądra w komórkach BNC i POLY (komórkach POLY), co jest niezbędne do ich zliczenia. Dodatkowo KCL zapewnia separację między jądrami a MN, co jest niezbędne do dokładnego maskowania MN i oceny ilościowej. Co więcej, stosowanie formaliny po dodaniu KCl zapobiega lizie komórek podczas wirowania. Dodanie cytochalazyny B powoduje, że komórki TK6, które przeszły więcej niż jeden podział jądrowy, są dość duże. W rezultacie cytoplazma staje się krucha i może ulegać lizie, jeśli wirowanie zostanie przeprowadzone natychmiast po dodaniu KCl. Ponadto bardzo ważne jest, aby wprowadzić Hoechst do próbki zgodnie z liczbą komórek w próbce, a nie zgodnie ze stężeniem końcowym. Na przykład końcowe stężenie 10 μg/ml Hoechst równomiernie zabarwi próbkę 1 x 106 komórek, ale może nie zabarwić odpowiednio próbki zawierającej 5 x 106 komórek i może spowodować, że wiele komórek będzie miało słabo zabarwione jądra, co utrudni analizę. Ważne jest również, aby pamiętać, że Hoechst można zastąpić innym barwnikiem DNA, takim jak DAPI, jeśli MIFC jest wyposażony w laser wzbudzający 405 nm lub DRAQ5, jeśli MIFC jest wyposażony w laser wzbudzający 488 nm i/lub 642 nm. W przypadku modyfikowania barwienia jądrowego bardzo ważne jest miareczkowanie barwienia w celu znalezienia odpowiedniego stężenia dla wymaganej/pożądanej mocy lasera.

Podczas zbierania danych na temat MIFC ważne jest, aby określić optymalne granice regionów dla funkcji Gradient RMS. Granice przedstawione w tym protokole mogą wymagać korekty ze względu na pewne niewielkie różnice między instrumentami MIFC. Zastosowanie tej funkcji podczas zbierania danych jest niezbędne, aby zapewnić przechwytywanie wysoce ostrych obrazów. Jeśli pliki danych zawierają wiele rozmytych lub nieostrych obrazów, istnieje prawdopodobieństwo, że algorytmy maskowania w oprogramowaniu analitycznym nieprawidłowo podświetlą artefakty barwienia w rozmytych obszarach, co doprowadzi do dużej liczby artefaktów fałszywie dodatnich ocenianych jako MN. Chociaż opisane tutaj techniki przetwarzania obrazu mogą być trudne, po opracowaniu szablonu analizy w oprogramowaniu MIFC, przetwarzanie wsadowe pozwala na automatyczną analizę plików danych, eliminując interwencję użytkownika, a tym samym stronniczość oceniającego. Ponadto, jeśli do przeprowadzenia testu zostanie użyta linia komórkowa inna niż komórki TK6, konieczna będzie modyfikacja masek i granic regionów, ponieważ właściwości morfologiczne (np. rozmiar) komórek będą się różnić od komórek TK6.

Przedstawione tutaj wyniki (ryc. 5) pokazują statystycznie istotny wzrost indukcji MN podczas wystawiania komórek TK6 na działanie różnych dawek mitomycyny C i kolchicyny. Statystycznie istotne zwiększenie częstości występowania MN w porównaniu z kontrolnymi rozpuszczalnikami zaobserwowano dla kilku dawek w obu substancjach chemicznych. Ponadto, żadna dawka mannitolu nie wywołała cytotoksyczności powyżej 30%, ani statystycznie istotnego wzrostu częstości występowania MN w porównaniu z kontrolnymi rozpuszczalnikami, zgodnie z oczekiwaniami. Protokół opisany w tym artykule wykorzystujący MIFC do przeprowadzenia testu MN in vitro daje oczekiwane wyniki zarówno dla pozytywnych, jak i ujemnych substancji chemicznych kontrolnych. Bardzo ważne jest przeprowadzenie szeregu eksperymentów z użyciem zarówno kontroli rozpuszczalników, jak i chemikaliów kontroli ujemnej w celu opracowania wartości wyjściowych zarówno częstości MN, jak i wskaźnika proliferacji bloku cytokinezy (CBPI). W przypadku genotoksyczności statystycznie istotne zwiększenie częstości występowania MN określa się poprzez porównanie z wyjściowymi częstościami występowania MN, które muszą być dobrze znane dla wykorzystywanego typu komórki. Ponadto wszystkie obliczenia cytotoksyczności opierają się na CBPI próbek kontrolnych i dlatego wyjściowe wskaźniki komórek MONO, BNC i POLY muszą być dobrze określone ilościowo w kontrolach.

Kilka ograniczeń i zalet stosowania MIFC w kontekście testu MN zostało opisanych w poprzednich pracach29,32. Główne ograniczenia dotyczą niższych częstotliwości MN w porównaniu z mikroskopią, co prawdopodobnie wynika zarówno z braku elastyczności przy implementacji kryteriów punktacji w oprogramowaniu analitycznym, jak i ograniczonej głębi ostrości MIFC. Dobrze wyprofilowane maski mogą być tworzone w celu dokładnej identyfikacji głównych jąder, ale MN, które stykają się (lub bardzo blisko) głównych jąder, mogą zostać uchwycone w masce BNC. Dodatkowo, bardzo małe MN, które można dość łatwo ocenić za pomocą mikroskopii, są prawdopodobnie nieprawidłowo pomijane podczas korzystania z MIFC ze względu na dolny limit parametru powierzchni maski MN, aby uniknąć punktacji małych artefaktów. Oprócz trudności związanych z analizą danych opartych na obrazie, ze względu na swoją konstrukcję, MIFC uzyskuje dwuwymiarowe obrazy projekcyjne trójwymiarowych obiektów komórkowych. To prawdopodobnie powoduje, że niektóre MN są rejestrowane z inną głębokością ostrości niż dwa główne MN, co sprawia, że wydają się one bardzo ciemne i niemożliwe do usunięcia za pomocą maskowania. Co więcej, niewielka frakcja MN może znajdować się za jednym z dwóch głównych jąder, co uniemożliwia ich wizualizację i ocenę. Dlatego, biorąc pod uwagę te trudności, należy zachować ostrożność przy interpretacji znacznego wzrostu częstości występowania MN przy niskich dawkach.

Pomimo tych niedociągnięć, opisana tutaj metoda MIFC oferuje kilka zalet w porównaniu z innymi technikami. Fenech i wsp. zaproponowali kryteria i wytyczne, które należy wziąć pod uwagę przy opracowywaniu zautomatyzowanych systemów i metodologii oznaczania MN36. Obejmują one między innymi bezpośrednią wizualizację głównych jąder i cytoplazmy, określenie częstotliwości MN na podstawie różnych dawek badanej substancji chemicznej lub czynnika oraz możliwość ilościowego określenia morfologii i określenia położenia wszystkich jąder i MN w celu upewnienia się, że znajdują się w cytoplazmie. W artykule wykazano, że metoda MIFC opracowana do wykonywania testu MN in vitro spełnia (lub ma potencjał do spełnienia) te kryteria. W szczególności obrazy jąder i MN mogą być rejestrowane przez lasery fluorescencyjne, podczas gdy obrazy cytoplazmatyczne można uzyskać za pomocą BF LED. Obrazowanie komórek o normalnej morfologii jądrowej może być automatycznie odróżnione od komórek o nieregularnej morfologii przy użyciu kombinacji zaawansowanych masek i cech. Wyniki przedstawione dla kolchicyny i mitomycyny C (ryc. 5) pokazują, że zarówno genotoksyczność, jak i cytotoksyczność mogą być oceniane przy różnych dawkach w porównaniu z kontrolami z rozpuszczalnikiem i że statystycznie istotne częstości występowania MN obserwuje się tam, gdzie się tego spodziewano. Ponadto w wytycznej OECD dotyczącej badań nr 487 zaleca się ocenę 2 000 BNC na stężenie testowe w celu oceny obecności MN w celu określenia genotoksyczności oraz co najmniej 500 komórek na stężenie testowe w celu określenia cytotoksyczności9; Może to zająć ponad 1 godzinę przy użyciu mikroskopii ręcznej. Protokół i wyniki w tym artykule pokazują, że średnio około 6 000 komórek BNC, 16 000 komórek MONO i 800 komórek POLY zostało przechwyconych i ocenionych na stężenie testowe w ciągu około 20 minut. Szybkie tempo pozyskiwania danych i duża liczba komórek kandydujących uzyskanych w tak krótkim czasie podkreślają kolejną ważną zaletę stosowania MIFC do przeprowadzania testu MN in vitro.

Chociaż wyniki przedstawione w tym artykule są zachęcające, są one reprezentatywne dla wczesnej metody weryfikacji koncepcji. Prace te powinny być kontynuowane przez bardziej szczegółowe badania większego, bardziej zróżnicowanego zestawu chemicznego, który obejmuje wiele klas i mechanizmów genotoksyczności i cytotoksyczności, takich jak te sugerowane przez Kirklanda i wsp.37 Prowadzenie takich badań jest czasochłonne i pracochłonne, a także wykracza poza zakres tego artykułu. Te badania na większą skalę dostarczą cennych informacji na temat zdolności metody do wiarygodnej identyfikacji czynników o słabo genotoksycznych właściwościach. Przedstawiona tutaj metodologia nie została jeszcze zminiaturyzowana do formatu mikrostudzienki, co pozwoliłoby na szybsze i skuteczniejsze badania przesiewowe w większym zakresie dawek. W związku z tym, w swojej obecnej formie, przedstawiony tutaj test MN in vitro oparty na MIFC może najlepiej nadawać się do pracochłonnych badań kontrolnych lub badań nad dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Jednak metoda będzie nadal optymalizowana i walidowana, a także ma potencjał, aby pozwolić na zwiększenie elastyczności w wykrywaniu specyficznych zdarzeń chemicznych związanych z morfologią, takich jak ekspozycja na aneugen, która zwiększa odsetek komórek z niekolistymi jądrami, które są nadal podatnena korozję 38. Wreszcie, metoda MIFC stwarza możliwość wprowadzenia dodatkowych biomarkerów do testu MN (np. barwienie kinetochorem), aby zapewnić bardziej wszechstronny obraz mechanizmu indukcji MN.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor jest zatrudniony przez firmę Luminex Corporation, producenta cytometru przepływowego do obrazowania wielospektralnego ImageStream, który został wykorzystany w tej pracy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor dziękuje Christine Probst (Luminex Corporation) za jej wysiłki w rozwijaniu poprzednich form szablonu analizy danych, a także dr Haley Pugsley (Luminex Corporation) i dr Philowi Morrisseyowi (Luminex Corporation) za przejrzenie i redakcję manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka wirówkowa 15 mlFalcon352096
Cleanser - Coulter Clenz Beckman Coulter8546931Pojemnik do napełniania 200 ml środka czyszczącego.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
ColchicineMilliporeSigma64-86-8
Filtr próżniowy do butelek Corning MilliporeSigmaCLS430769filtr 0,22 um, butelka 500 ml
Cytochalazyna BMiliporeSigma14930-96-2Butelka 5 mg
Debubbler - 70% IsopropanolEMD Millipore1.3704Napełnij pojemnik 200 ml Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimetylosulfotlenek (DMSO)MiliporeSigma67-68-5
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1XEMD MiliporBSS-1006-BPBS Ca++MG++ Wolny 
Hyklon płodowej surowicy bydlęcejSH30071.03
Formaldehyd, 10%, bez metanolu, Ultra PurePolysciences, Inc.04018To jest to, co jest używane do 4% i 1% formaliny. UWAGA: Formalina/formaldehyd toksyczny przez drogi oddechowe i po połknięciu. Działa drażniąco na oczy, drogi oddechowe i skórę. Może powodować uczulenie przez drogi oddechowe lub kontakt ze skórą. Ryzyko poważnego uszkodzenia oczu. Potencjalne zagrożenie rakiem.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Hoechst 33342Thermo FisherH357010 mg/ml roztwór
Miliporowy mannitolSigma69-65-8
MEM Aminokwasy endogenne 100XHyklonSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IIEMD Millipore100220A 2 ImageStreamX Mark II wyposażoną w lasery 405nm, 488nm i 642nm. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
Oprogramowanie do analizy MIFC - IDEASEMD Millipore100220Oprogramowanie towarzyszące MIFC ( Oprogramowanie ImageStreamX MKII)
MIFC - INSPIREEMD Millipore100220Jest to oprogramowanie, które uruchamia MIFC (ImageStreamX MKII)
Mitomycyna CMiliporeSigma50-07-7
NEAA Mieszanina 100XLonza BioWhittaker13-114E
Penicllin/Streptomycyna/Glutamina roztwór 100XGibco15070063
Chlorek potasu ( KCl)MilliporeSigmaP9541
Rinse - Woda ultraczysta lub woda dejonizowanaNAMożeszużyć dowolnej wody ultraczystej lub wody dejonizowanej.  Napełnij pojemnik 900 ml płukania.
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1XHyCloneSH30027.01
Osłona - PBSEMD MilliporeBSS-1006-BTo jest to samo, co sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1X  Ca++MG++ za darmo.  Napełnij pojemnik 900 ml osłony.
HyCloneSH30529.01sterylnej wody
- 0,4-0,7% podchlorynuVWRJT9416-1Jest to zdecydowanie 10% wybielacz Clorox, który można uzyskać, rozcieńczając wybielacz Clorox wodą.  Napełnij pojemnik 200 ml sterylizatora.
Odczynnik do kalibracji systemu - SpeedBeadEMD Millipore400041Każda probówka mieści ~10 ml.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
Kolba T25Falcon353109
Kolba T75Falcon353136
Ogniwa TK6MilliporeSigma95111735
Zastosowano kamerę Sterylizator

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonassi, S., et al. An increased micronucleus frequency in peripheral blood lymphocytes predicts the risk of cancer in humans. Carcinogenesis. 28 (3), 625-631 (2007).
  2. Fenech, M. The in vitro micronucleus technique. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 455 (1-2), 81-95 (2000).
  3. Fenech, M. The Lymphocyte Cytokinesis-Block Micronucleus Cytome Assay and its Application in Radiation Biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 234-243 (2010).
  4. Hintzsche, H., et al. Fate of micronuclei and micronucleated cells. Mutation Research - Reviews in Mutation Research. 771, 85-98 (2017).
  5. Fenech, M. The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method. Mutation Research. 392 (1-2), 11-18 (1997).
  6. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  7. Fenech, M., Holland, N., Chang, W. P., Zeiger, E., Bonassi, S. The HUman MicroNucleus Project - An international collaborative study on the use of the micronucleus technique for measuring DNA damage in humans. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 428 (1-2), 271-283 (1999).
  8. Kirsch-Volders, M., et al. Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 540 (2), 153-163 (2003).
  9. OECD Library. Test No. 487: In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4. , (2016).
  10. Aardema, M. J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. III. Using CHO cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 61-87 (2006).
  11. Clare, M. G., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 37-60 (2006).
  12. Lorge, E., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 13-36 (2006).
  13. Oliver, J., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. V. Using L5178Y cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 125-152 (2006).
  14. Wakata, A., et al. SFTG international collaborative study on in vitro micronucleus test. IV. Using CHL cells. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 607 (1), 88-124 (2006).
  15. Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: Results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 45-64 (2003).
  16. Decordier, I., et al. Automated image analysis of cytokinesis-blocked micronuclei: an adapted protocol and a validated scoring procedure for biomonitoring. Mutagenesis. 24 (1), 85-93 (2009).
  17. Decordier, I., et al. Automated image analysis of micronuclei by IMSTAR for biomonitoring. Mutagenesis. 26 (1), 163-168 (2011).
  18. Schunck, C., Johannes, T., Varga, D., Lorch, T., Plesch, A. New developments in automated cytogenetic imaging: unattended scoring of dicentric chromosomes, micronuclei, single cell gel electrophoresis, and fluorescence signals. Cytogenetic and Genome Research. 104 (1-4), 383-389 (2004).
  19. Rossnerova, A., Spatova, M., Schunck, C., Sram, R. J. Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis. 26 (1), 169-175 (2011).
  20. Nüsse, M., Marx, K. Flow cytometric analysis of micronuclei in cell cultures and human lymphocytes: Advantages and disadvantages. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 392 (1-2), 109-115 (1997).
  21. Avlasevich, S. L., Bryce, S. M., Cairns, S. E., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus scoring by flow cytometry: Differential staining of micronuclei versus apoptotic and necrotic chromatin enhances assay reliability. Environmental and Molecular Mutagenesis. 47 (1), 56-66 (2006).
  22. Bryce, S. M., Bemis, J. C., Avlasevich, S. L., Dertinger, S. D. In vitro micronucleus assay scored by flow cytometry provides a comprehensive evaluation of cytogenetic damage and cytotoxicity. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 630 (1-2), 78-91 (2007).
  23. Bryce, S. M., et al. Flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay with human TK6 cells: Protocol optimization and transferability assessment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 54 (3), 180-194 (2013).
  24. Fenech, M. Commentary on the SFTG international collaborative study on the in vitro micronucleus test: to Cyt-B or not to Cyt-B. Mutation Research. 607 (1), 9-12 (2006).
  25. Basiji, D. A. Methods in Molecular Biology. 1389, 13-21 (2016).
  26. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Automated analysis of the cytokinesis-block micronucleus assay for radiation biodosimetry using imaging flow cytometry. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 273-282 (2014).
  27. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Kutzner, B. C., Wilkins, R. C. Multi-parameter dose estimations in radiation biodosimetry using the automated cytokinesis-block micronucleus assay with imaging flow cytometry. Cytometry Part A. 85 (10), 883-893 (2014).
  28. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Validation of the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Health Physics. 110 (1), 29-36 (2016).
  29. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. Optimized automated data analysis for the cytokinesis-block micronucleus assay using imaging flow cytometry for high throughput radiation biodosimetry. Cytometry Part A. 89 (7), 653-662 (2016).
  30. Rodrigues, M. A., Probst, C. E., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C. The effect of an optimized imaging flow cytometry analysis template on sample throughput in the reduced culture cytokinesis-block micronucleus assay. Radiation Protection Dosimetry. 172 (1-3), 223-229 (2016).
  31. Wang, Q., et al. Automated Triage Radiation Biodosimetry: Integrating Imaging Flow Cytometry with High-Throughput Robotics to Perform the Cytokinesis-Block Micronucleus Assay. Radiation Research. 191 (4), 342-351 (2019).
  32. Rodrigues, M. A. Automation Of The In vitro Micronucleus Assay Using The ImageStream® Imaging Flow Cytometer. Cytometry Part A. 93, 706-726 (2018).
  33. Rodrigues, M. A., Beaton-Green, L. A., Wilkins, R. C., Fenech, M. F. The potential for complete automated scoring of the cytokinesis block micronucleus cytome assay using imaging flow cytometry. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 836, 53-64 (2018).
  34. Fenech, M., et al. HUMN project: Detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures. Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 534 (1-2), 65-75 (2003).
  35. Verma, J. R., et al. Evaluation of the automated MicroFlow® and Metafer™ platforms for high-throughput micronucleus scoring and dose response analysis in human lymphoblastoid TK6 cells. Archives of Toxicology. 91 (7), 2689-2698 (2017).
  36. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  37. Kirkland, D., et al. Updated recommended lists of genotoxic and non-genotoxic chemicals for assessment of the performance of new or improved genotoxicity tests. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 795, 7-30 (2016).
  38. Verma, J. R., et al. Investigating FlowSight® imaging flow cytometry as a platform to assess chemically induced micronuclei using human lymphoblastoid cells in vitro. Mutagenesis. 33 (4), 283-289 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytotoxicity GenotoxicityHoechst 33342 StainingCytochalasin B TreatmentHypotonic Solution TreatmentBinucleated Cell AnalysisPolynucleated Cell IdentificationAutomated Scoring MethodImage Data Storage

Powiązane artykuły