Artykuł metodologiczny

Identyfikacja czynników jąderkowych podczas replikacji HIV-1 poprzez immunoprecypitację Rev i spektrometrię mas

DOI:

10.3791/59329

⸱

26 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Department, Beckman Research Institute at the City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, 3Department of Molecular Immunology, Beckman Research Institute and the City of Hope

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy immunoprecypitację Rev w obecności replikacji HIV-1 dla spektrometrii mas. Opisane metody mogą być stosowane do identyfikacji czynników jąderkowych zaangażowanych w cykl zakaźny HIV-1 i mają zastosowanie do innych modeli chorób w celu scharakteryzowania niedostatecznie zbadanych szlaków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cykl zakaźny HIV-1 wymaga interakcji białka wirusa z czynnikami gospodarza, aby ułatwić replikację, pakowanie i uwalnianie wirusa. Cykl infekcyjny wymaga ponadto tworzenia kompleksów białkowych wirus/gospodarz z RNA HIV-1 w celu regulacji splicingu i umożliwienia transportu nukleocytoplazmatycznego. Białko HIV-1 Rev realizuje eksport jądrowy mRNA HIV-1 poprzez multimeryzację z intronicznymi celami cis-działającymi - elementem odpowiedzi Rev (RRE). Sygnał lokalizacji jąderkowej (NoLS) istnieje w końcu COOH motywu bogatego w argininę Rev (ARM), umożliwiając akumulację kompleksów Rev / RRE w jąderku. Spekuluje się, że czynniki jąderkowe wspierają cykl zakaźny HIV-1 poprzez różne inne funkcje, oprócz pośredniczenia w niezależnym od mRNA eksporcie jądrowym i splicingu. Opisano metodę immunoprecypitacji Rev typu dzikiego (WT) w porównaniu z mutacjami jąderkowymi Rev (delecja i jednopunktowe mutacje Rev-NoLS) w obecności replikacji HIV-1 do spektrometrii mas. Czynniki jąderkowe biorące udział w transporcie nukleocytoplazmatycznym (nukleofosmina B23 i nukleolina C23), a także komórkowe czynniki splicingowe, tracą interakcję z Rev w obecności mutacji Rev-NoLS. Stwierdzono, że różne inne czynniki jąderkowe, takie jak snoRNA C/D box 58, tracą interakcję z mutacjami Rev, ale ich funkcja w cyklu replikacji HIV-1 pozostaje nieznana. Przedstawione tutaj wyniki pokazują zastosowanie tego podejścia do identyfikacji czynników jąderkowych wirusa/gospodarza, które utrzymują cykl zakaźny HIV-1. Koncepcje stosowane w tym podejściu mają zastosowanie do innych modeli wirusowych i chorobowych wymagających charakterystyki niedostatecznie zbadanych szlaków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jąderko jest postulowane jako miejsce interakcji różnych czynników komórkowych gospodarza i wirusa, niezbędnych do replikacji wirusa. Jąderko jest złożoną strukturą podzieloną na trzy różne przedziały: przedział fibrylarny, gęsty przedział fibrylarny i przedział ziarnisty. Białko HIV-1 Rev lokalizuje się specyficznie w przedziałach ziarnistych; Jednak przyczyna tego wzorca lokalizacji jest nieznana. W obecności mutacji jednopunktowych w sekwencji NoLS (mutacje Rev 4, 5 i 6), Rev utrzymuje wzór jąderkowy i wcześniej wykazano, że ratuje replikacjęHIV-1 HXB2, jednak ze zmniejszoną wydajnością w porównaniu do WT Rev1. Wszystkie mutacje jednopunktowe nie są w stanie utrzymać cyklu zakaźnegoHIV-1 NL4-3. W obecności wielu mutacji jednopunktowych w sekwencji NoLS (mutacje Rev-NoLS 2 i 9), zaobserwowano, że Rev rozprasza się w jądrze i cytoplazmie i nie był w stanie uratować replikacjiHIV-1 HXB21. Celem tego badania proteomicznego jest rozszyfrowanie jąderkowych i niejądrowych czynników komórkowych zaangażowanych w szlak zakaźny HIV-1 za pośrednictwem Rev. Warunki immunoprecypitacji Rev są optymalizowane poprzez interakcję z jąderkową fosfoproteiną B23, która, jak wykazano wcześniej, traci interakcję z Rev w obecności mutacji jąderkowych.

Rev czynniki komórkowe były intensywnie badane w przeszłości, jednak zostało to zrobione przy braku patogenezy wirusa. Jednym z białek, w szczególności scharakteryzowanym w tym badaniu poprzez interakcję Rev podczas replikacji HIV-1, jest jąderkowa fosfoproteina B23 - zwana również nukleofosminą (NPM), numatyną lub NO38 u2,3,4. B23 jest wyrażony jako trzy izoformy (NPM1, NPM2 i NPM3) - wszyscy członkowie rodziny nukleofosmin/nukleoplazminy opiekuńczych jądrowych5,6. Molekularny chaperon NPM1 funkcjonuje w prawidłowym składaniu nukleosomów, w tworzeniu kompleksów białko/kwas nukleinowych zaangażowanych w struktury chromatyny wyższego rzędu7,8, oraz w zapobieganiu agregacji i nieprawidłowemu fałdowaniu docelowych białek przez N-końcową domenę rdzeniową (reszty 1-120)9. Funkcjonalność NPM1 rozciąga się na genezę rybosomów poprzez transport cząstek prerybosomalnych między jądrem a cytoplazmą10,11, przetwarzanie prerybosomalnego RNA w wewnętrznej transkrybowanej sekwencji dystansowej12,13, oraz zatrzymanie jąderkowej agregacji białek podczas składania rybosomalnego14,15. NPM1 jest zaangażowany w hamowanie apoptozy16 oraz w stabilizację supresorów nowotworów ARF17,18 i p5319, ujawniając swoją podwójną rolę jako czynnika onkogennego i supresora nowotworu. NPM1 uczestniczy w czynnościach komórkowych związanych ze stabilnością genomu, replikacją centrosomów i transkrypcją. NPM1 znajduje się w jąderkach podczas interfazy cyklu komórkowego, wzdłuż obwodu chromosomów podczas mitozy oraz w ciałach przedjądrkowych (PNB) po zakończeniu mitozy. NPM2 i NPM3 nie są tak dobrze zbadane jak NPM1, który ulega zmienionym poziomom ekspresji podczas złośliwości20.

NPM1 jest udokumentowany w nukleocytoplazmatycznym przenoszeniu różnych białek jądrowych/jąderkowych przez wewnętrzny NES i NLS9,21 i wcześniej zgłoszono, że napędza import jądrowy białek HIV-1 Tat i Rev. W obecności białek fuzyjnych β-galaktozydazy wiążącej domenę B23, Tat nieprawidłowo lokalizuje się w cytoplazmie i traci aktywność transaktywacyjną; Świadczy to o silnym powinowactwie Tat do B232. W innym badaniu ustalono stabilny kompleks Rev/B23 przy braku mRNA zawierających RRE. W obecności mRNA RRE, Rev dysocjuje od B23 i wiąże się korzystnie z RRE HIV, co prowadzi do przemieszczenia B2322. Nie wiadomo, gdzie, na poziomie subjądrowym, zachodzi transaktywacja Tat i proces wymiany Rev witaminy B23 na mRNA wirusa HIV. Postuluje się, że oba białka dostają się do jąderka jednocześnie poprzez interakcję B23. Oczekuje się, że udział innych białek komórkowych gospodarza w szlaku jąderkowym HIV jest niebezpieczny. Metody opisane w tym badaniu proteomicznym pomogą wyjaśnić wzajemne oddziaływanie jąderka z czynnikami komórkowymi gospodarza zaangażowanymi w patogenezę HIV-1.

Badanie proteomiczne zostało zainicjowane poprzez ekspresję jednopunktowych mutacji Rev NoLS (M4, M5 i M6) oraz wielokrotnych podstawień argininy (M2 i M9) do produkcjiHIV-1 HXB2. W tym modelu linia komórkowa HeLa stabilnie eksprymująca HIV-1HXB2 z niedoborem Rev (HLfB) jest transfekowana mutacjami jąderkowymi WT Rev i Rev zawierającymi znacznik flagi na końcu 3'. Obecność WT Rev pozwoli na replikację wirusa w hodowli HLfB, w porównaniu z mutacjami Rev-NoLS, które nie ratują niedoboru Rev (M2 i M9) lub pozwalają na replikację wirusa, ale nie tak wydajnie jak WT Rev (M4, M5 i M6)1. Lizat komórkowy pobiera się 48 godzin później po proliferacji wirusa w obecności ekspresji Rev i poddaje immunoprecypitacji z buforem do lizy zoptymalizowanym pod kątem interakcji Rev / B23. Opisano optymalizację buforu lizy przy użyciu różnych stężeń soli, a metody elucji białek dla HIV-1 Rev są porównywane i analizowane w żelach SDS-PAGE barwionych srebrem lub Coomassie. Pierwsze podejście proteomiczne polega na bezpośredniej analizie eluowanej próbki z ekspresji WT Rev, M2, M6 i M9 za pomocą tandemowej spektrometrii mas. Drugie podejście, w którym eluaty WT Rev, M4, M5 i M6 poddano procesowi ekstrakcji żelu, porównano z pierwszym podejściem. Analizowane jest powinowactwo peptydów do mutacji Rev-NoLS w porównaniu z WT Rev i wyświetlane jest prawdopodobieństwo identyfikacji białka. Podejścia te ujawniają potencjalne czynniki (jąderkowe i niejądrowe), które uczestniczą w transporcie mRNA HIV-1 i splicingu z Rev podczas replikacji HIV-1. Ogólnie rzecz biorąc, opisane warunki lizy komórek, IP i elucji mają zastosowanie do białek wirusowych będących przedmiotem zainteresowania w celu zrozumienia czynników komórkowych gospodarza, które aktywują i regulują szlaki zakaźne. Ma to również zastosowanie do badania czynników gospodarza komórkowego wymaganych do przetrwania różnych modeli choroby. W tym modelu proteomicznym HIV-1 Rev IP jest zoptymalizowany pod kątem interakcji B23 w celu wyjaśnienia czynników jąderkowych zaangażowanych w aktywność wahadłową nukleocytoplazmy i wiązanie mRNA HIV-1. Ponadto można opracować linie komórkowe ze stabilną ekspresją modeli chorób zakaźnych, które są niewystarczające dla kluczowych białek będących przedmiotem zainteresowania, podobnie jak w przypadku linii komórkowej HLfB, w celu zbadania interesujących szlaków zakaźnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

  1. Utrzymuj HLfB w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM L-glutaminy i 1 mM pirogronianu sodu w płytkach 100 mm poddanych działaniu kultur tkankowych. Hodowle komórkowe należy przechowywać w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5%CO2. Przejście zlewających się komórek do gęstości komórek 1 x 106 komórek/ml.
  2. Wyrzuć pożywkę do hodowli komórkowych. Delikatnie przepłucz komórki 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Usuń i wyrzuć 1x PBS bez naruszania warstwy komórek.
  3. Dodaj 2 ml 1x roztworu trypsyny-EDTA do komórek. Kołysz naczyniem, aby pokryć monowarstwę i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze przez 5 minut.
  4. Mocno postukaj dłonią w bok naczynia, aby odłączyć komórki. Ponownie zawiesić oderwane komórki w 8 ml świeżej pożywki hodowlanej. Wiruj komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut.
  5. Wyrzuć pożywkę hodowlaną bez naruszania osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml świeżej pożywki hodowlanej. Subkultura 1 ml skoncentrowanych komórek z 9 ml świeżej pożywki hodowlanej na płytkach 100 mm poddanych działaniu kultur tkankowych.
    UWAGA: Dla każdej mutacji Rev-NoLS, 3 płytki hodowlane HLfB lub HeLa o średnicy 100 mm dadzą wystarczającą ilość lizatu białkowego do analizy western blot i spektrometrii mas. Dodaj dodatkowe płytki do kontroli pozytywnej i kontroli ujemnej WT Rev. Objętość komórek subkultur będzie wymagała optymalizacji przy użyciu różnych typów komórek.

2. Ekspresja mutacji flagi Rev-NoLS-3 podczas replikacji HIV-1

  1. Hoduj hodowlę komórkową HLfB do gęstości komórek 2 x 106 komórek/ml. Przygotować 4 ml zawiesiny DNA fosforanu wapnia na każdą płytkę o średnicy 100 mm w następujący sposób.
    1. Oznacz dwie probówki o pojemności 15 ml jako 1 i 2. Dodaj 2 ml 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl i 1,5 mM Na2HPO4 [pH 7,12]) do probówki 1. Dodaj TE 79/10 (1 mM Tris-HCl i 0,1 mM EDTA [pH 7,9]) do probówki 2. Objętość TE 79/10 wynosi 1,760 ml - objętość DNA.
    2. Dodać 20 μg plazmidu zawierającego mutację flagi Rev-NoLs-3 do probówki 2 i wymieszać jej zawartość przez ponowne wymieszanie. Dodać 240 μl 2 M CaCl2 do probówki 2 i ponownie wymieszać przez ponowne wymieszanie.
    3. Przenieść mieszaninę z probówki 2 do probówki 1 kroplami, delikatnie mieszając. Pozostawić zawiesinę w temperaturze pokojowej na 30 minut. Wirować opady.
  2. Dodać kroplami 1 ml zawiesiny do każdej z 3-komórkowych kultur o średnicy 100 mm, delikatnie obracając pożywkę. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze i pozostawić mieszaninę do transfekcji na 6 godzin. Zastąp mieszaninę transfekcji 10 ml świeżej pożywki hodowlanej i inkubuj komórki przez 42 godziny.

3. Zbiór lizatu białek wirusa

  1. Wyrzuć pożywkę komórkową 48 godzin po transfekcji. Umieść każdą płytkę o średnicy 100 mm na warstwie lodu. Oznacz probówki o pojemności 15 ml dla każdej próbki mutacji Rev-NoLS i umieść probówki na lodzie.
  2. Delikatnie przepłucz komórki 10 ml wstępnie schłodzonego 1x PBS, nie naruszając warstwy komórkowej. Wyrzuć 1x PBS. Dodać 3 ml buforu do lizy (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl i 1% detergentu X-100 [patrz tabela materiałów]), potraktowanego koktajlem inhibitorów proteazy, do każdej z płytek o średnicy 100 mm.
  3. Użyj skrobaka do komórek, aby zakłócić warstwę komórkową. Przechyl talerz i delikatnie zeskrob i zbierz komórki do basenu. Zebrać lizat komórkowy za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl i wymieszać lizaty komórkowe z każdej z trzech płytek o średnicy 100 mm w wstępnie oznakowanej probówce o pojemności 15 ml.
  4. Inkubować lizat komórkowy na lodzie przez 15 minut, wirując co 5 minut. Odwirować lizat komórkowy przy 15 000 x g przez 5 minut.
  5. Zebrać supernatant białkowy bez naruszania osadu z resztek komórek i przenieść go do innej sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Stężenie lizatu białka wirusa należy obliczyć metodą Bradforda (patrz punkt 4).
  6. Zachowaj podwielokrotność próbki wejściowej (20 μg) do analizy Western Immunoblot. Dodać 2x bufor próbki (20% glicerolu, 0,02% błękitu bromofenolowego, 125 mM Tris-Cl [pH 6,8], 5% SDS i 10% 2-merkaptoetanolu) do końcowej objętości. Gotować w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a wsadową próbkę przechowywać w temperaturze -20 °C.

4. Test Bradforda

UWAGA: Przygotuj 10x albuminę surowicy bydlęcej (BSA) ze 100x zapasu BSA przed wygenerowaniem standardowych krzywych białka.

  1. Podwielokrotność wody do probówek do mikrowirówek dla następujących prób i wzorców: Ślepa próba = 800 μL; Norma 1 = 2 mg/ml, 798 μl; Norma 2 = 4 mg/ml, 796 μl; Wzorzec 3 = 6 mg/ml, 794 μl; Norma 4 = 8 mg/ml, 792 μl; Wzorzec 5 = 10 mg/ml, 790 μl. Podwielokrotność 10x BSA do następujących wyznaczonych wzorców: Wzorzec 1 = 2 μL; Norma 2 = 4 μL; Norma 3 = 6 μL; Norma 4 = 8 μL; Norma 5 = 10 μL.
  2. Przygotować mieszaninę próbek białka, mieszając 795 μl wody z 5 μl próbek białka. Dodać 200 μl odczynnika do oznaczania białek (patrz Tabela materiałów) do każdej próbki ślepej, wzorcowej i białkowej. Krótko zawirować próbki w celu uzyskania równomiernej mieszaniny i inkubować w temperaturze pokojowej (18–20 °C) przez 5 minut.
  3. Przenieś ślepą próbę, wzorce i próbki białka do kuwet. Zmierzyć stężenia białka przy OD 595 nm.

5. Koimmunoprecypitacja flagi Rev-NoLS-3

  1. Przepłukać 25 μl kulek żelowych o powinowactwie M2 (patrz tabela materiałów) 500 μl buforu do lizy, potraktowanego koktajlem inhibitorów proteazy. Wypłucz więcej kulek żelowych powinowactwa dla każdej próbki mutacji i kontroli.
    UWAGA: Przygotuj wystarczającą ilość kulek żelowych o powinowactwie M2 na dwa żele (50 μL) - jeden do analizy zachodnich immunoblotów, a drugi do barwienia białek i spektrometrii mas.
  2. Wirować w temperaturze 820 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant. Spłucz jeszcze 2x.
  3. Dodać wirusowy lizat białkowy (1 mg/ml w 5 ml całkowitej objętości) do wstępnie wypłukanych kulek powinowactwa M2. Dostosuj całkowitą objętość za pomocą buforu do lizy.
  4. Inkubować reakcję przez 3 godziny, obracając się w temperaturze 4 °C. Odwirować kulki powinowactwa M2/lizat białka wirusa przy 820 x g przez 1 minutę.
  5. Zebrać supernatant i zapisać podwielokrotność próbki post-IP (20 μg) do analizy Western immunoblot. Zmierzyć stężenie białka w lizacie po IP. Zbierz 20 μg do zachodniego immunoblottingu.
  6. Dodaj 2x bufor próbki do końcowej objętości. Gotować w temperaturze 95 °C przez 10 minut i przechowywać próbkę po IP w temperaturze -20 °C.
  7. Przepłukać kulki M2 750 μl buforu do lizy i myć je na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odwirować kulki M2 przy 820 x g i wyrzucić supernatant.
  8. Powtórz kroki 5.7 dla dwóch kolejnych prań na rotatorze w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Po trzecim płukaniu usuń wszelkie ślady buforu do lizy z kompleksu M2 perełek/co-IP za pomocą długiej końcówki ładującej żel.
    UWAGA: Ściśnij koniec końcówki ładującej żel płaską pęsetą przed usunięciem jakichkolwiek śladowych ilości buforu do lizy. Zapobiegnie to zakłóceniom i wchłanianiu kulek M2.
  9. Zawieś kulki M2 w 55 μl 2x bufora ładującego. Gotować próbkę w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  10. Załadować 25 μl eluatu na dwa oddzielne żele SDS-PAGE (jeden żel do zachodniego immunoblottingu, a drugi do barwienia Coomassie).

6. Przygotowanie żeli SDS-PAGE

  1. Odlać dwa 15% żele rozdzielcze akryloamidu SDS, mieszając następujące odczynniki w probówce o pojemności 50 ml (przy końcowej objętości 40 ml, wystarczającej na cztery żele): 4,16 ml wody ultraczystej, 15 ml 40% akryloamidu: bisakryloamidu (29:1), 10 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 400 μL 10% SDS, 400 μL 10% nadsiarczanu amonu, i 40 μl TEMED.
  2. Wymieszaj żel rozdzielczy, kilkakrotnie odwracając probówkę o pojemności 50 ml. Odpipetować mieszaninę żelu rozdzielczego do wstępnie oczyszczonego zachodniego aparatu żelowego (cztery żele - trzy do zachodniego immunoblottingu i jeden do barwienia Coomassie/srebra).
  3. Delikatnie odpipetować tyle wody, aby pokryć wierzchnią warstwę mieszaniny żelu. Pozostawić rozdzielczy żel do polimeryzacji.
  4. Wylej warstwę wody z żelu rozdzielczego, używając delikatnej wycieraczki (patrz Tabela Materiałów), aby wchłonąć nadmiar wody.
  5. Odlać dwa 5% żele akryloamidowe SDS, mieszając następujące odczynniki w probówce o pojemności 50 ml (przy końcowej objętości 20 ml, wystarczającej na cztery żele): 11,88 ml wody ultraczystej, 2,5 ml 40% akryloamidu: bisakryloamidu (29:1), 5,2 ml 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8), 200 μL 10% SDS, 200 μL 10% nadsiarczanu amonu, i 20 μl TEMED.
  6. Wymieszaj żel do układania w stos, kilkakrotnie odwracając probówkę o pojemności 50 ml. Odpipetować mieszaninę żelu do układania w stos nad żelem rozdzielczym do górnej części aparatu.
  7. Umieść grzebień kasety z żelem zawierającym odpowiednią liczbę pasów w żelu do układania. Nadmiar mieszanki żelowej wchłonąć za pomocą delikatnej wycieraczki roboczej (patrz Tabela materiałów). Poczekaj, aż żel do układania w stos całkowicie się spolimeryzuje.
  8. Zalej zachodni aparat żelowy 1x zachodnim buforem biegowym (5x stężenie: 250 mM Tris-Cl [pH 8,3], 1,92 M glicyny, 0,5% SDS i 10 mM EDTA).
  9. Delikatnie wyciągnij grzebień kasety z żelem do układania w stos. Pozwól, aby 1x zachodni bufor uruchomiony wypełnił studnie załadunkowe. Przepłukać każdą studzienkę 1x zachodnim buforem za pomocą strzykawki przed załadowaniem próbek.
  10. Załaduj zachodnie próbki immunoblot do każdego odpowiedniego żelu (próbki wejściowe, próbki koimmunoprecypitowane i próbki po IP). Załaduj zachodnie markery białkowe żelu.
  11. Załaduj próbki z koimmunoprecypitacją do barwienia Coomassie/srebra do innego żelu. Załaduj zachodnie markery białkowe żelu.
  12. Podłącz urządzenie do biegania żelu do źródła zasilania i uruchom żele pod napięciem 100 V, aż barwnik ładujący dotrze do żelu rozdzielczego. Zwiększ napięcie do 140 V, aż barwnik zasilający dotrze do dna żelu rozdzielczego.

7. Transfer Western blot

  1. Zdemontuj zachodni aparat żelowy. Pokrój i wyrzuć żel do układania w stosy, pozostawiając żel rozdzielczy nienaruszony.
  2. Delikatnie przenieś rozdzielcze żele na czystą tackę wypełnioną zachodnim buforem transferowym (25 mM Tris, 194 mM glicyny, 0,005% SDS, 20% metanolu) i moczyć je przez 15 minut.
  3. Zmontuj aparat do przenoszenia żelu w następujący sposób.
    1. Przyciąć trzy membrany transferowe PVDF i sześć kawałków bibuły filtracyjnej (patrz Tabela materiałów) do rozmiaru żelu rozdzielczego.
    2. Namocz membranę PVDF w metanolu na 5 minut. Uwodnij ją w wodzie na 5 minut. Umieść membranę PVDF w zachodnim buforze transferowym, aż będzie gotowa do użycia.
    3. Umieść kasetę z uchwytem żelu w szklanej blasze do pieczenia częściowo wypełnionej zachodnim buforem transferowym, czarną stroną na dole.
    4. Umieść podkładkę piankową nasączoną zachodnim buforem transferowym po czarnej stronie kasety z uchwytem żelu.
    5. Zwilż kawałek bibuły filtracyjnej w zachodnim buforze transferowym i umieść go na podkładce piankowej. Umieść żel rozdzielczy na bibule filtracyjnej.
      UWAGA: Umieść żel rozdzielczy we właściwej orientacji ładowania, aby został przeniesiony na membranę PVDF.
    6. Umieść jedną membranę transferową PVDF na wierzchu żelu rozdzielczego. Zwilż kawałek bibuły filtracyjnej zachodnim buforem transferowym i umieść go na membranie transferowej PVDF.
    7. Umieść kolejną podkładkę piankową nasączoną zachodnim buforem transferowym na bibule filtracyjnej. Ostrożnie złóż białą stronę kasety z uchwytem żelu na wierzchu nasączonej podkładki piankowej. Mocno zablokuj kasetę.
    8. Umieść kasetę z uchwytem żelu w zespole elektrody aparatu transferowego. Powtórzyć kroki 7.3.4-7.3.8 dla każdego pozostałego żelu rozdzielczego.
    9. Napełnić zbiornik aparatu transferowego zachodnim buforem transferowym. Umieść mieszadło w zbiorniku aparatu.
    10. Umieść zbiornik aparatu na górze płytki mieszającej. Ustaw mieszanie na 5-6, upewniając się, że mieszadło nie jest zablokowane ani nie uderza w kasety z uchwytami żelu.
    11. Podłączyć aparat do przenoszenia żelu do źródła zasilania i przesyłać żel pod napięciem 100 V przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.

8. Immunoblotting

  1. Wyjmij kasetę z uchwytem na żel i połóż czarną stroną do dołu na czystej szklanej blasze do pieczenia. Otwórz kasetę i ostrożnie wyrzuć podkładkę piankową i bibułę filtracyjną. Zaznacz róg membrany PVDF, aby określić prawidłową orientację obciążenia. Utrzymuj membranę mokrą.
    UWAGA: Membranę PVDF można suszyć na powietrzu i przechowywać w czystym, szczelnie zamkniętym pojemniku. Ponownie uwodnić membranę, powtarzając kroki 7.3.2.
  2. Umieść membranę w 100 ml roztworu blokującego (5% mleka, 1x TBS i 0,1% Tween 20). Zablokuj membranę, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej (18-20 °C) przez 1 godzinę.
  3. Przeciąć w poprzek błony powyżej markera białkowego 25 kDa. Umieścić górną część błony, zawierającą prążki białkowe większe niż 25 kDa, w roztworze blokującym zawierającym mysią monoklonalną IgG1 B23 (rozcieńczenie 1:500). Blokuj przez noc, kołysząc się w temperaturze 4 °C.
  4. Umieścić dolną część błony, zawierającą prążki białkowe mniejsze niż 25 kDa, w roztworze blokującym zawierającym mysią monoklonalną IgG1 M2 (rozcieńczenie 1:1000, patrz tabela materiałów). Blokuj przez noc, kołysząc się w temperaturze 4 °C.
  5. Umyj membranę 3x przez 10 min w 25 ml zachodniego roztworu myjącego (1x TBS, 0,1% Tween 20) na bujanej platformie.
  6. Inkubować błony w koziej anty-mysiej IgG1-HRP (rozcieńczenie 1:5 000) rozcieńczonej w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Myj membranę 3x przez 10 min w 25 ml zachodniego roztworu myjącego na bujanej platformie.
  7. Przygotować substrat do chemiluminescencji western blott. Użyj mikropipety p1000, aby dodać substrat do membrany.
  8. Rozwijaj każdą membranę w podłożu do chemiluminescencji western blotting przez 5 minut. Usuń membranę z podłoża. Nadmiar podłoża wchłonąć za pomocą delikatnej wycieraczki roboczej (patrz tabela materiałów).
  9. Umieść membranę w czystym ochraniaczu na arkusz przyklejonym taśmą do wnętrza kasety. Zabierz kasetę do ciemnego pomieszczenia i umieść w niej jeden arkusz filmu. Zablokuj kasetę na miejscu i inkubuj przez 5–15 minut. Wyjmij film z kasety i wywołaj go.

9. Barwienie Coomassie

  1. Zdemontuj zachodni aparat żelowy. Pokrój i wyrzuć żel do układania w stosy, pozostawiając żel rozdzielczy nienaruszony. Delikatnie przenieś żel rozdzielczy na czystą tackę wypełnioną 25 ml ultraczystej wody.
  2. Inkubuj żel na bujanej platformie przez 15 minut. Delikatnie kołysz, aby zapobiec pękaniu rozdzielczego żelu. Wylej ultraczystą wodę i powtórz etap prania jeszcze 2 razy.
    UWAGA: Jeśli po etapach prania pozostaną bąbelki SDS, żel można prać w ultraczystej wodzie przez noc. Resztki SDS mogą powodować silne zabarwienie tła żelu.
  3. Wymieszaj odczynnik do barwienia Coomassie, odwracając butelkę (patrz Tabela materiałów). Umieść 100 ml odczynnika barwiącego Coomassie, aby przykryć żel rozdzielczy i inkubuj żel na platformie bujanej przez 1 godzinę. Wyrzuć odczynnik do barwienia Coomassie i umyj żel w dejonizowanej wodzie na bujanej platformie przez 15 minut.
  4. Wyrzuć wodę dejonizowaną. Powtórz krok prania jeszcze 2x. Kontynuuj mycie żelu, aż do uzyskania pożądanej rozdzielczości pasm białkowych.

10. Barwienie srebra

  1. Zdemontuj zachodni aparat żelowy. Pokrój i wyrzuć żel do układania w stosy, pozostawiając żel rozdzielczy nienaruszony. Delikatnie przenieś żel rozdzielczy na czystą tackę wypełnioną 25 ml ultraczystej wody.
  2. Inkubuj żel na bujanej platformie przez 15 minut. Delikatnie kołysz, aby zapobiec pękaniu rozdzielczego żelu. Wylej ultraczystą wodę i powtórz etap prania jeszcze 2 razy.
    UWAGA: Jeśli po etapach prania pozostaną bąbelki SDS, żel można prać w ultraczystej wodzie przez noc. Resztki SDS mogą powodować silne zabarwienie tła żelu.
  3. Utrwal żel w 30% roztworze etanolu: 10% kwasu octowego (6:3:1 woda: etanol: kwas octowy) przez noc w temperaturze pokojowej. Żel myć w 10% roztworze etanolu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wymień roztwór etanolu i myj przez kolejne 5 minut.
  4. Przygotuj roztwór roboczy uczulacza z zestawu Pierce Silver Stain Kit, mieszając jednoskładnikową część uczulacza na srebrną plamę z 500 częściami ultraczystej wody (50 μl uczulacza z 25 ml ultraczystej wody). Żel rozdzielczy inkubować w roztworze roboczym uczulającym przez 1 minutę. Umyj żel w ultraczystej wodzie przez 1 minutę, wymień wodę i ponownie umyj żel przez 1 minutę.
  5. Przygotuj roztwór do usuwania plam, mieszając jednoskładnikową srebrną odplamiacz z 50 częściami srebrnej plamy (500 μl wzmacniacza z 25 ml srebrnej bejcy). Inkubować żel w roztworze barwiącym przez 30 minut.
  6. Przygotuj roztwór roboczy dla wywoływacza, mieszając 1 część polepszacza do barwienia srebra z 50 częściami wywoływacza srebrnego (500 μl wzmacniacza z 25 ml wywoływacza). Przygotować 5% roztwór kwasu octowego jako roztwór zatrzymujący. Umyj żel ultraczystą wodą przez 1 minutę, wymień wodę i myj żel przez dodatkową 1 minutę.
  7. Zastąp wodę roztworem roboczym wywoływacza i inkubuj, aż pożądana intensywność pasma białkowego ustąpi (5 min). Zastąp roztwór roboczy wywoływacza roztworem zatrzymującym i inkubuj przez 10 minut.

11. Redukcja, alkilowanie i trawienie w żelu pasków żelowych barwionych Coomassie

  1. Odetnij żelowe paski od żelu za pomocą czystej żyletki. Pokrój każdą gumkę na kostkę o średnicy około 5 mm i umieść je w czystej probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
  2. Odbarwić kawałki żelu, pokrywając je 100 mM wodorowęglanem amonu w wodzie acetonitrylu w stosunku 1:1 o temperaturze pokojowej przez 15 minut. Wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok.
  3. Suszyć kawałki żelu przez 5 minut w wirówce próżniowej. Zredukować białka, pokrywając wysuszone kawałki żelu 10 mM ditiotreitolem w 100 mM wodorowęglanie amonu i inkubując je przez 1 godzinę w temperaturze 56 °C.
  4. Odpipetować nadmiar białka. Alkilować białka, pokrywając kawałki żelu 100 mM jodoacetamidem w wodzie i inkubując je przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  5. Odpipetować supernatant i obkurczyć kawałki żelu, przykrywając je acetonitrylem i delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Odpipetować supernatant i ponownie napęczniać kawałki żelu, pokrywając je 100 mM wodorowęglanem amonu i delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej przez 15 min.
  6. Powtórz krok 11.5. Suszyć kawałki żelu przez 5 minut w wirówce próżniowej.
  7. Przykryj kawałki żelu zmodyfikowaną trypsyną o stężeniu 50 ng/μl (patrz tabela materiałów) w 100 mM wodorowęglanie amonu. Pozwól żelowi pęcznieć przez 5 minut; Następnie odpipetować pozostały roztwór. Przykryj kawałki żelu 100 mM wodorowęglanem amonu i pozwól im całkowicie spęcznieć, dodając dodatkowe 100 mM wodorowęglanu amonu, aby kawałki żelu były całkowicie pokryte.
  8. Inkubować kawałki żelu przez noc w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję, dodając 1/10 objętości 10% kwasu mrówkowego do wody. Pobrać supernatant z każdej probówki.
  9. Ekstrahuj kawałki żelu, pokrywając je 1% kwasem mrówkowym w 60% acetonitrylu i inkubując przez 15 minut z delikatnym wstrząsaniem.
  10. Zmniejszyć objętość połączonych supernatantów do mniej niż 20 μl w wirówce próżniowej, uważając, aby nie dopuścić do całkowitego wysuszenia supernatantów. Dodaj 1% kwasu mrówkowego, aby przywrócić całkowitą objętość do 20 μl.

12. Chromatografia cieczowa/spektrometria mas

UWAGA: Próbki były analizowane za pomocą spektrometru mas wyposażonego w ultra HPLC, źródła nanospray i kolumny (zobacz Tabelę Materiałów). Rozpuszczalniki A i B to odpowiednio 0,1% kwas mrówkowy w wodzie i acetonitrylu.

  1. Załaduj strawione białka do fiolek z polipropylenu o wysokim stopniu odzysku. Załadować fiolki do menedżera próbek systemu UPLC.
  2. Wstrzyknąć 6 μl każdej próbki. Załadować każdą próbkę do kolumny wychwytującej nanopłytki na 1,5 minuty przy 8 μl/min, używając 99% rozpuszczalnika A/1% rozpuszczalnika B.
  3. Eluować peptydy do spektrometru mas z gradientem liniowym od 3% do 35% rozpuszczalnika B przez 30 minut, a następnie gradientem od 35% do 50% rozpuszczalnika B przez 4 minuty i 50% do 90% rozpuszczalnika B przez 1 minutę. Utrzymać 90% acetonitrylu przez 3 minuty, a następnie zmniejszyć %B z powrotem do 3% w ciągu 5 minut.
  4. Uzyskaj dane o specyfikacji masy profilu jonów dodatnich w trybie rozdzielczości (rozdzielczość 20 000). Pozyskuj dane od 100 do 2 000 Da z szybkością jednego skanowania co 0,6 s. Pozyskiwanie danych w trybie MSE poprzez naprzemienne skanowanie bez energii kolizji i skanowanie ze zwiększoną energią zderzenia.
  5. Aby uzyskać podwyższoną energię zderzenia, zwiększ energię zderzenia w komórce pułapki z 15 V do 40 V. Skanuj masę blokady co 30 s, używając jonu +2 [Glu1]-Fibrynopeptydu B jako masy zamka. Pobrać plik danych za pomocą ślepego wstrzyknięcia rozpuszczalnika A, stosując tę samą metodę pobierania między każdą parą próbek w celu kontrolowania przeniesienia.

13. Analiza danych dla spektrometrii mas

  1. Skopiuj pliki z wynikami spektrometrii mas do komputera, na którym działa ilościowa i jakościowa platforma badawcza proteomiki (np. ProteinLynx Global Server). Analiza danych jest bardzo obciążająca procesor i powinna być wykonywana na oddzielnym, wysokowydajnym komputerze do analizy danych.
  2. Utwórz nowy projekt dla danych. Utwórz nową płytkę do mikromiareczkowania reprezentującą płytkę automatycznego podajnika próbek. Przypisać próbki do tej samej pozycji na płytce mikromiareczkowej, co ich pozycja w automatycznym podajniku próbek.
  3. Przypisz parametry przetwarzania każdej próbki. Parametry, które należy zastosować, to automatyczna chromatograficzna szerokość piku i rozdzielczość MSTOF; próg niskiej energii, 100 zliczeń; podwyższony próg energetyczny, 5 zliczeń; Próg intensywności, 500 zliczeń.
  4. Przypisz parametry przepływu pracy dla każdej próbki. Parametry, które należy użyć, to baza danych, połączone ludzkie SwissProt i HIV, z odwróconymi sekwencjami; automatyczna tolerancja peptydów i fragmentów; Min. dopasowania jonów fragmentacyjnych na peptyd, 3; minimalne dopasowania jonów fragmentów na białko, 7; min dopasowania peptydów na białko, 1; podstawowy odczynnik trawiący, trypsyna; pominięte dekolty, 1; odczynniki modyfikujące o stałym tonie, karbamidometyl C; odczynniki o zmiennym modyfikatorze, utlenianie M; Wskaźnik fałszywych odkryć, 100.
  5. Wybierz przykłady i wybierz pozycję Przetwarzaj najnowsze dane nieprzetworzone. Po zakończeniu wyszukiwania wybierz przykłady i wybierz pozycję Eksportuj dane do szkieletu (wersja 3). Otwórz Scaffold, utwórz nowy plik i zaimportuj każdy plik wyeksportowany z platformy proteomicznej jako nową biopróbkę przy użyciu kwantyfikacji jonów prekursorowych.
  6. Po zaimportowaniu wszystkich plików przejdź do ekranu Załaduj i przeanalizuj dane. Wybierz tę samą bazę danych, która jest używana do wyszukiwania i importowania danych przy użyciu punktacji LFDR i standardowego grupowania białek w całym eksperymencie. Ustaw opcje wyświetlania na Prawdopodobieństwo identyfikacji białka, próg białka na 20%, minimalną liczbę peptydów na 1, a próg peptydowy na 0% podczas analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedno- i wielopunktowe mutacje argininy Rev-NoLS, odpowiadające różnorodnym wzorcom lokalizacji subkomórkowej, zostały zbadane pod kątem ich zdolności do interakcji z czynnikami gospodarza komórkowego w porównaniu z WT Rev. Flaga WT Rev-3 i wektor flagi pcDNA uległy ekspresji w hodowli HLfB. Kompleksy białkowe przetworzono z całkowitego lizatu komórkowego i wybarwiono odczynnikiem do barwienia srebrem. Flaga Rev-NoLS-3 jest wykrywalna (około 18 kDa) w trzech różnych warunkach bufora lizy zawierających różne stęż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analizy spektrometrii mas porównujące mutacje Rev-NoLS i WT Rev w obecności HIV-1 oceniono w celu zrozumienia czynników jąderkowych zaangażowanych w cykl replikacji wirusa. Pozwoliłoby to zidentyfikować składniki jąderkowe niezbędne do zakaźności wirusa. Jądro B23 ma wysokie powinowactwo do Rev-NoLS i działa w jąderkowej lokalizacji Rev3 i nukleocytoplazmatycznym transporcie mRNA HIV związanych z Rev22. Powinowactwo B23 z mutacjami Rev-NoLS, które zawierały pojedyncze lub w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr Barbarze K. Felber i dr George'owi N. Pavlakisowi za kulturę przylegającą do HLfB dostarczoną przez National Institutes of Health (NIH) AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), NIH. Autorzy wymieniają również źródła finansowania zapewnione przez NIH, Granty AI042552 i AI029329.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyFisher ChemicalA38S-212
AcetonitrylFisher ChemicalA955-500
Akrylamid: bisakryloamidBioRad1610158
Wodorowęglan amonuFisher ChemicalA643-500
Nadsiarczan amonuSigma-Aldrich7727-54-0
Powinowactwo ANTI-Flag M2 żelSigma-AldrichA2220
mysi monoklonalny IgG przeciw Flag M2Sigma-AldrichF3165
BioMax MS filmCarestream8294985
Bio-Rad Koncentrat odczynnika do oznaczania białek Bio-Rad, 450 mlBio-Rad5000006
B23 mysi monoklonalny IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
Błękit bromofenolowySigma-AldrichB0126
Goździk beztłuszczowe mleko w proszkuNestleN/A
Skrobak do komórekThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey kolumna nanoTileWody186003763
Corning 100-mm naczynia hodowlane z powłoką TCFisher Scientific08-772-22
DithiothreitolThermo NaukoweJ1539714
1 x DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Podłoże do bibułowania EsternPierce32106
Etanol, 200 proofFisher ChemicalA409-4
FBSGibco16000044
Kwas mrówkowyOdczynnikA117-50
GelCodeThermoFisher24590
GlicerolFisher Chemical56-81-5
kozio-anty-mysie IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
JodoacetamidACROS Organics122270050
KimWipe delikatna wycieraczka do zadańKimberly Clark Professional34120
L-glutaminaGibco
MetanolFisher Chemical67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15-mL Polipropylenowa rurka stożkowaFalcon352097
Prestained Protein Ladder, 10 do 180 kDaThermo Scientific26616
Koktajl inhibitorów proteazyRoche4693132001
Oczyszczony BSANew England BiolabsB9001
PVDF  Membrana Western blottingRoche3010040001
Pirogronian soduGibco11360070
10 x TBSFisher BioodczynnikiBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 roztwór detergentuBioRad1610407
źródło trizaikuN/A
trypsyna-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20Spektrometr masowy BioRad1706531
Synapt G2WodyNie dotyczy
Bibuła filtracyjna WhatmanTischScientific 10427813
do niebieskiej plamy Fisher Chemical 25030081

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

HIV 1 Revmutacje Rev NoLStransport nukleocytoplazmatycznynukleofosmina B23nukleolina C23snoRNA C D box 58barwienie Coomassie

Powiązane artykuły