Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Summary

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Abstract

Węzły chłonne (LN) to narządy rozsiane w organizmie, gdzie wrodzone reakcje immunologiczne mogą łączyć się z odpornością adaptacyjną. W rzeczywistości LN są strategicznie umieszczane na ścieżce naczyń limfatycznych, umożliwiając intymny kontakt antygenów tkankowych ze wszystkimi rezydującymi komórkami odpornościowymi w LN. W ten sposób zrozumienie składu, dystrybucji, lokalizacji i interakcji komórkowych za pomocą obrazowania ex vivo całego LN wzbogaci wiedzę na temat tego, w jaki sposób organizm koordynuje miejscowe i ogólnoustrojowe odpowiedzi immunologiczne. Protokół ten przedstawia strategię obrazowania ex vivo po podaniu in vivo przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie, która umożliwia bardzo powtarzalną i łatwą do wykonania metodologię przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów konfokalnych i odczynników podstawowych. Poprzez podskórne wstrzyknięcie przeciwciał możliwe jest znakowanie różnych populacji komórek w drenażowych LN bez wpływu na struktury tkankowe, które mogą zostać potencjalnie uszkodzone przez konwencjonalną technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Introduction

Węzły chłonne (LN) to jajowate narządy, szeroko obecne w całym ciele, z kluczową funkcją łączenia wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. LN filtrują limfę w celu zidentyfikowania obcych cząstek i komórek rakowych w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko nim¹. Komórki prezentujące antygen (APC), limfocyty T i limfocyty B współpracują ze sobą w celu wytworzenia przeciwciał specyficznych dla antygenu (odporność humoralna) i limfocytów cytotoksycznych (odporność komórkowa) w celu wyeliminowania obcych cząstek i komórek rakowych². W związku z tym zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych obecnych....

Protocol

Protokół został zatwierdzony przez Stały Komitet ds. Zwierząt w Harvard Medical School oraz Brigham and Women's Hospital, protokół 2016N000230.

1. Myszy użyte do eksperymentu

1. Do podawania mieszanki przeciwciał należy użyć 8-tygodniowych samców i samic myszy na tle witaminy B6.
2. Użyj myszy CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT, aby określić, czy obrazowanie ex vivo całego LN można również zastosować u myszy reporterowych bez podawania mieszanki przeciwciał, a także do zbadania obecności komórek jednojądrzastych, w tym komórek prezentujących antygen i fagocytów, oraz ich dystrybucji w LN.
   UWAGA: Myszy report....

Results

Ten manuskrypt pokazuje techniki usuwania węzłów chłonnych pachwinowych i podkolanowych bez uszkadzania ich struktury po wstrzyknięciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie w celu zabarwienia określonych populacji komórek w tych narządach (Rysunek 1 i Rysunek 2).

Potężna kombinacja immunoznakowania komórek LN z anty-CD4 BV421 i BB515 anty-CD19 oraz analiza obrazowania konfokalnego zdefiniowała lokalizację limfocytów T (CD4+) i limfoc.......

Discussion

Połączenie obrazowania z innymi technikami, w tym biologią molekularną i wysokowymiarowym immunofenotypowaniem, zwiększyło naszą zdolność do badania komórek odpornościowych w ich naturalnym kontekście. W rzeczywistości, podczas gdy inne podejścia mogą wymagać trawienia tkanek i izolacji komórek – co może prowadzić do utraty integralności tkanek – zastosowanie obrazowania in vivo lub ex vivo daje ogromną przewagę w badaniu różnych podtypów komórek w sposób geograficzny ^3,16

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BV421 anty-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0,2 mg mL-1
BB515 anty-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0,2 mg mL-1
BB515 Szczur IgG2a, κ Kontrola izotypu	BD Horizon	564418	R35-95; 0,2 mg mL-1
BV421 Mysz IgG2b, K Kontrola izotypu	BD Horizon	562603	R35-38 0,2 mg mL-1
Cellview naczynie hodowlane	Greiner-Bio	627861	35x10 mm ze szklanym dnem
Strzykawki insulinowe	BD Plastipak-Insulina		U-100
Kimwipes	Marka Naukowa Kimtech	7557	rozmiar 21 x 20 cm / 100 arkuszy w pudełku
Zakrzywione kleszcze mikrochirurgiczne	Instrumenty chirurgiczne WEP	wykonane na zamówienie	12,5 cm
Zakrzywione nożyczki do mikrochirurgii	Instrumenty chirurgiczne WEP	wykonane na zamówienie	11,5 cm
Igła	BD PrecisionGlide-30		miernik i czasy; ½ cal
Nikon Eclipse Te + A1R głowica konfokalna	Nikon	-	załadowane 4 głównymi liniami laserowymi (405, 488, 543 i 647 nm)
PE anty-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0,2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0,2 mg mL-1
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 710 Zeiss			4 głównymi liniami laserowymi (405, 488, 543 i 647 nm)