Method Article

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

DOI:

10.3791/59335

⸱

August 9th, 2019

 ,  ,  , 
1Ann Romney Center for Neurologic Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Center for Gastrointestinal Biology, Federal University of Minas Gerais

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Węzły chłonne (LN) to narządy rozsiane w organizmie, gdzie wrodzone reakcje immunologiczne mogą łączyć się z odpornością adaptacyjną. W rzeczywistości LN są strategicznie umieszczane na ścieżce naczyń limfatycznych, umożliwiając intymny kontakt antygenów tkankowych ze wszystkimi rezydującymi komórkami odpornościowymi w LN. W ten sposób zrozumienie składu, dystrybucji, lokalizacji i interakcji komórkowych za pomocą obrazowania ex vivo całego LN wzbogaci wiedzę na temat tego, w jaki sposób organizm koordynuje miejscowe i ogólnoustrojowe odpowiedzi immunologiczne. Protokół ten przedstawia strategię obrazowania ex vivo po podaniu in vivo przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie, która umożliwia bardzo powtarzalną i łatwą do wykonania metodologię przy użyciu konwencjonalnych mikroskopów konfokalnych i odczynników podstawowych. Poprzez podskórne wstrzyknięcie przeciwciał możliwe jest znakowanie różnych populacji komórek w drenażowych LN bez wpływu na struktury tkankowe, które mogą zostać potencjalnie uszkodzone przez konwencjonalną technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Węzły chłonne (LN) to jajowate narządy, szeroko obecne w całym ciele, z kluczową funkcją łączenia wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. LN filtrują limfę w celu zidentyfikowania obcych cząstek i komórek rakowych w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciwko nim1. Komórki prezentujące antygen (APC), limfocyty T i limfocyty B współpracują ze sobą w celu wytworzenia przeciwciał specyficznych dla antygenu (odporność humoralna) i limfocytów cytotoksycznych (odporność komórkowa) w celu wyeliminowania obcych cząstek i komórek rakowych2. W związku z tym zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych obecnych w układzie limfatycznym będzie miało ważne implikacje dla opracowania szczepionki i immunoterapii nowotworów.

Pojawienie się potężnych mikroskopów - w tym nowych mikroskopów konfokalnych i superrozdzielczych - pozwoliło na niezwykły postęp w zrozumieniu, jak różne populacje komórek odpornościowych zachowują się w swoim naturalnym środowisku3. Obecnie możliwe jest obrazowanie kilku jednoczesnych podtypów komórek za pomocą kombinacji sond z genetycznie zmodyfikowanymi myszami, które wyrażają białka fluorescencyjne pod kontrolą określonych celów4,5. W rzeczywistości techniki wielowymiarowe, w tym cytometria masowa i wieloparametryczna analiza przepływu, miały kluczowe znaczenie dla poszerzenia naszej wiedzy na temat różnych przedziałów i funkcjonalności komórek odpornościowych w zdrowiu i chorobie6,7. Jednak, aby przygotować próbki do tych technik, tkanki muszą zostać strawione, a komórki są oddzielane od swojego naturalnego środowiska w celu analizy w zawiesinach komórkowych. Aby przezwyciężyć te ograniczenia i umożliwić lepszą translację w biologii, celem proponowanego tutaj protokołu jest zastosowanie prostej metodologii do obrazowania ex vivo całych węzłów chłonnych przy użyciu standardowych mikroskopów konfokalnych z korzyścią dla lepszej szybkości, zachowania struktury tkankowej i żywotności komórek w porównaniu z konwencjonalnym barwieniem immunofluorescencyjnym. Stosując to podejście, byliśmy w stanie wykazać, że myszy z niedoborem limfocytów T γδ, podtypu limfocytów T zaangażowanych we wczesną obronę gospodarza przed patogenami4, mają naruszone pęcherzyki i strefy limfocytów T w porównaniu z myszami typu dzikiego. Te odkrycia pozwoliły nam kontynuować badanie, w którym wykazaliśmy, że limfocyty T γδ odgrywają kluczową rolę w homeostazie narządów limfatycznych i humoralnej odpowiedzi immunologicznej4. Co więcej, protokół ten zapewnia fizjologiczną ścieżkę dla sond i przeciwciał, aby dotrzeć do węzła chłonnego, ponieważ są one podawane podskórnie i rozpraszają się w tkankowym krążeniu limfatycznym, opierając się na poprzednich raportach, w których stosowano znakowanie in situ przeciwciałami w celu wizualizacji struktur związanych z limfą8,9, dynamika centrum zarodkowego10,11,12, a cele łatwo dostępne dla przepływu krwi13,14,15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół został zatwierdzony przez Stały Komitet ds. Zwierząt w Harvard Medical School oraz Brigham and Women's Hospital, protokół 2016N000230.

1. Myszy użyte do eksperymentu

  1. Do podawania mieszanki przeciwciał należy użyć 8-tygodniowych samców i samic myszy na tle witaminy B6.
  2. Użyj myszy CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT, aby określić, czy obrazowanie ex vivo całego LN można również zastosować u myszy reporterowych bez podawania mieszanki przeciwciał, a także do zbadania obecności komórek jednojądrzastych, w tym komórek prezentujących antygen i fagocytów, oraz ich dystrybucji w LN.
    UWAGA: Myszy reporterowe CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT mają wstawione białko zielonej fluorescencji (GFP) i białko czerwonej fluorescencji (RFP) pod kontrolą odpowiednio promotorów CX3CR1 i CCR2. Myszy reporterowe mogą być używane z wstrzyknięciem mieszanki przeciwciał lub bez niej. Zobacz reference4 dla wstrzykiwania mieszanki przeciwciał w myszy reporterowej. Przejdź do operacji, jeśli nie zostanie wstrzyknięte przeciwciało.

2. Przygotowanie i wstrzyknięcie mieszanki przeciwciał

UWAGA: Wykonaj te kroki na myszach opisanych w kroku 1.1.

  1. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 fioletu brylantowego (BV) 421 anty-CD4 (GK1,5; 0,2 mg/ml), 1:10 błękitu brylantowego (BB) 515 anty-CD19 (1D3; 0,2 mg/ml) i 1:20 fikoerytryny (PE) anty-F4/80 (T45-2342; 0,2 mg/ml) w PBS o odpowiedniej objętości końcowej do wstrzyknięcia do wewnętrznej strony uda (w celu zobrazowania pachwinowego) lub do opuszki łapy (w celu uzyskania obrazu podkolanowego) limfy.
    UWAGA: Stosować jako izotypy: BV421 IgG2b myszy, k Kontrola izotypu (R35-38; 0,2 mg/mL); PE IgG2a Szczur, kontrola izotypu κ (R35-95; 0,2 mg/ml); BB515 Szczur IgG2a, kontrola izotypu κ (R35-95; 0,2 mg / ml). W przypadku zmiany przeciwciała barwiącego należy użyć prawidłowego izotypu.
  2. Aby zobrazować pachwinowy LN, wstrzyknij 100 μl mieszanki przeciwciał podskórnie w wewnętrzną stronę uda (Ryc. 1A). Alternatywnie, wstrzyknąć podskórnie 50 μl mieszanki przeciwciał do opuszki łapy, aby zobrazować podkolanowy LN (Figura 2A). Używaj delikatnych strzykawek insulinowych o pojemności 1 ml (insulina U-100) z igłą o rozmiarach 0,30 mm × 13 mm (30 G × 1/2 cala).
    UWAGA: Upewnij się, że wstrzyknięcie do pachwinowego barwienia LN jest podskórne, a nie domięśniowe (i.m.), ponieważ mieszanina przeciwciał nie zostanie prawidłowo opróżniona, jeśli zostanie wykonane podanie domięśniowe.
  3. Nie należy znieczulać zwierząt przed wstrzyknięciem mieszanki przeciwciał.
  4. Odczekać co najmniej 3 godziny (dLN pachwinowe) i 12 godzin (dLN podkolanowe) po wstrzyknięciu, aby usunąć narządy.
  5. Jeśli znakowanie komórek LN nie jest w pełni obserwowane przy użyciu dużych polimerowych barwników fluorescencyjnych, takich jak fiolet brylantowy lub błękit brylantowy, należy użyć mniejszych fluoroforów, w tym izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), PE i allofikocyjaniny (APC) jako alternatywy.

3. Zabieg chirurgiczny usunięcia węzła chłonnego drenującego pachwinę

  1. Eutanazja myszy za pomocą uduszenia CO2 , a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
  2. Unieruchomić myszy na scenie akrylowej za pomocą taśmy klejącej i nałóż olej mineralny za pomocą bawełnianego wacika na skórę brzucha, aby zapobiec osadzaniu się sierści wokół nacięcia (Rysunek 1B). Usuwanie sierści nie jest konieczne.
  3. Wykonaj nacięcie linii środkowej za pomocą zakrzywionych nożyczek mikrochirurgicznych (11,5 cm) i zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych (12,5 cm) w jamie brzusznej od łona do wyrostka mieczykowatego (Ryc. 1C).
  4. Oddziel mięśnie brzucha od skóry (Rysunek 1D).
  5. Wykonaj poziome nacięcia skóry u góry i u dołu pionowej linii nacięcia, aby utworzyć płaty skóry po stronie zainteresowania (zgodnie ze stroną wstrzyknięcia mieszanki przeciwciał) i odchyl skórę, aby uwidocznić węzeł chłonny (Rysunek 1E).
  6. Przyklej płat skóry do akrylowej płytki (Rysunek 1F).
  7. Usuń pachwinowy węzeł chłonny drenujący za pomocą zakrzywionych kleszczy mikrochirurgicznych (Ryc. 1F). Węzeł chłonny pojawi się jako półprzezroczysta, zwykle dwuskrzydłowa kula pod skórą.

4. Zabieg chirurgiczny usunięcia węzła chłonnego drenującego podkolanowy

  1. Eutanazja myszy za pomocą uduszenia CO2 , a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
  2. Unieruchom myszy w pozycji leżącej na akrylowej scenie za pomocą taśmy klejącej i nałóż olej mineralny za pomocą bawełnianego wacika w łydkę i kolano (Rysunek 2A-D).
  3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej łydki od pięty do kolana (Rysunek 2E,F).
  4. Oddziel muskulaturę łydki od skóry (Rysunek 2F,G).
  5. Odsłoń dół podkolanowy (Rysunek 2G). Węzeł chłonny podkolanowy pojawi się jako półprzezroczysta kula w dole podkolanowym.
  6. Usuń węzeł chłonny podkolanowy za pomocą zakrzywionych kleszczyków mikrochirurgicznych (Rysunek 2G).
  7. Alternatywnie, obróć mysz w pozycji leżącej na plecach i zbliż się do dołu podkolanowego między mięśniem dwugłowym uda a półścięgnistym w celu usunięcia LN podkolanowego, wykonując nacięcie w linii środkowej łydki od pięty do kolana, a następnie dysocjację mięśni łydki od skóry.
    UWAGA: Dół podkolanowy to płytkie zagłębienie zlokalizowane w tylnej części stawu kolanowego. Otwórz ostrożnie, aby zobaczyć węzeł chłonny podkolanowy.

5. Przygotowanie węzłów chłonnych

  1. Umieść cały narząd w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem (35 mm x 10 mm) i usuń tłuszcz otaczający narząd za pomocą zakrzywionych kleszczyków mikrochirurgicznych (Rysunek 1G-I i Rysunek 2H).
  2. Wyśrodkuj narząd na środku naczynia (Ryc. 1J i Ryc. 2H).
  3. Przykryj narząd fragmentem delikatnych wycieraczek i nasącz go solą fizjologiczną o temperaturze pokojowej 0,9% lub roztworem buforu fosforanowego (Rysunek 1KM i Rysunek 2H).
    UWAGA: Nie jest konieczne mycie węzłów chłonnych po usunięciu ani wykonywanie ekstrakcji węzłów chłonnych w kapturze.

6. Mikroskopia konfokalna ex-vivo (obrazowanie)

  1. Umieść szalkę Petriego w szczelinie odwróconego mikroskopu konfokalnego (Rysunek 1N i Rysunek 2H).
  2. Obraz LN pod mikroskopem konfokalnym (Rysunek 1O i Rysunek 2H).
  3. Po pierwsze, uzyskaj prawidłową ostrość, używając konwencjonalnego światła mikroskopu konfokalnego z obiektywem 4x lub 10x. Następnie zmień funkcję światła na tryb laserowy.
    UWAGA: Jeśli mikroskop konfokalny nie jest wyposażony w obiektyw 4x, ostrość można uzyskać za pomocą obiektywu 10x.
  4. Dostosuj moc lasera, przesunięcie i wzmocnienie za pomocą próbki barwionej izotypem, niebarwionej lub niefluorescencyjnej (Tabela 1), aby usunąć autofluorescencję i niespecyficzne barwienie z przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie, takich jak te użyte na obrazach pokazanych w tym manuskrypcie (BV-421 anty-CD4, BB515 anty-CD19 i PE anty-F4/80).
  5. Dostosuj pozycje Z i XY, używając odpowiednio mikrometrii i rydwanu, w obszarze zainteresowania w węźle chłonnym.
  6. Rób zdjęcia pod obiektywami 4x, 10x i 20x, koncentrując się na strukturze LN i dystrybucji komórkowej. Użyj rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli.
    UWAGA: Zdobądź co najmniej pięć obrazów w różnych polach na cel dla każdego zwierzęcia.
  7. Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania do obsługi obrazów, aby oddzielić kanały, dodać skalę i kolory będące przedmiotem zainteresowania oraz zrekonstruować widok 3D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten manuskrypt pokazuje techniki usuwania węzłów chłonnych pachwinowych i podkolanowych bez uszkadzania ich struktury po wstrzyknięciu przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie w celu zabarwienia określonych populacji komórek w tych narządach (Rysunek 1 i Rysunek 2).

Potężna kombinacja immunoznakowania komórek LN z anty-CD4 BV421 i BB515 anty-CD19 oraz analiza obrazowania konfokalnego zdefiniowała lokalizację limfocytów T (CD4+) i limfoc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Połączenie obrazowania z innymi technikami, w tym biologią molekularną i wysokowymiarowym immunofenotypowaniem, zwiększyło naszą zdolność do badania komórek odpornościowych w ich naturalnym kontekście. W rzeczywistości, podczas gdy inne podejścia mogą wymagać trawienia tkanek i izolacji komórek – co może prowadzić do utraty integralności tkanek – zastosowanie obrazowania in vivo lub ex vivo daje ogromną przewagę w badaniu różnych podtypów komórek w sposób geograficzny 3,16

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH (R01 AI43458 do H.L.W.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BV421 anty-CD4BD Horizon562891GK1.5; 0,2 mg mL-1
BB515 anty-CD19BD Horizon5645091D3; 0,2 mg mL-1
BB515 Szczur IgG2a, κ Kontrola izotypuBD Horizon564418R35-95; 0,2 mg mL-1
BV421 Mysz IgG2b, K Kontrola izotypuBD Horizon562603R35-38 0,2 mg mL-1
Cellview naczynie hodowlaneGreiner-Bio62786135x10 mm ze szklanym dnem
Strzykawki insulinoweBD Plastipak-InsulinaU-100
KimwipesMarka Naukowa Kimtech7557rozmiar 21 x 20 cm / 100 arkuszy w pudełku
Zakrzywione kleszcze mikrochirurgiczneInstrumenty chirurgiczne WEPwykonane na zamówienie12,5 cm
Zakrzywione nożyczki do mikrochirurgiiInstrumenty chirurgiczne WEPwykonane na zamówienie11,5 cm
IgłaBD PrecisionGlide-30miernik i czasy; ½ cal
Nikon Eclipse Te + A1R głowica konfokalnaNikon-załadowane 4 głównymi liniami laserowymi (405, 488, 543 i 647 nm)
PE anty-F4/80BD Pharmigen565410T45-2342; 0,2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype ControlBD Pharmigen553930R35-95; 0,2 mg mL-1
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 710 Zeiss4 głównymi liniami laserowymi (405, 488, 543 i 647 nm)
z

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
  2. Tas, J. M., et al. Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers. Science. 351, 1048-1054 (2016).
  3. David, B. A., et al. Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice. Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).
  4. Rezende, R. M., et al. gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation. Nature Communications. 9, 3151(2018).
  5. Nakagaki, B. N., et al. Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).
  6. Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).
  7. Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
  8. McElroy, M., et al. Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo. Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).
  9. Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity. The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).
  10. Hauser, A. E., et al. Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns. Immunity. 26, 655-667 (2007).
  11. Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. Imaging of germinal center selection events during affinity maturation. Science. 315, 528-531 (2007).
  12. Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress. Nature. 493, 684-688 (2013).
  13. Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
  14. Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport. Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).
  15. Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids. Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).
  16. Nakagaki, B. N., et al. Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function. Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).
  17. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  18. Roozendaal, R., et al. Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles. Immunity. 30, 264-276 (2009).
  19. Sarder, P., et al. All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes. Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lymph Node ImagingEx Vivo Confocal MicroscopyFluorescent Antibody LabelingCellular LocalizationT Cell B Cell VisualizationLymph Node Structure AnalysisSubcutaneous Antibody InjectionMicrosurgery Lymph Node HarvestConfocal Microscopy ImagingImmunolabeling Analysis

Related Articles