Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ortotopowy model raka endometrium z limfadenopatią zaotrzewnową wykonany z rozmnożonych i hodowanych in vivo komórek VX2

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59340

⸱

12 września 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia ustandaryzowaną metodę hodowli komórek VX2 w hodowli i stworzenia ortotopowego modelu VX2 raka endometrium z przerzutami do węzłów chłonnych zaotrzewnowych u królików. Ortotopowe modele raka endometrium są ważne dla badań przedklinicznych nad nowymi metodami obrazowania w diagnostyce przerzutów do węzłów chłonnych.

Streszczenie

Rak endometrium jest najczęstszym nowotworem ginekologicznym w Ameryce Północnej, a częstość jego występowania rośnie na całym świecie. Leczenie polega na zabiegu chirurgicznym z terapią uzupełniającą lub bez niej, w zależności od zajęcia węzłów chłonnych określonego przez limfadenektomię. Limfadenektomia jest zabiegiem chorobowym, który nie wykazał korzyści terapeutycznych u wielu pacjentów, dlatego konieczna jest nowa metoda diagnozowania przerzutów do węzłów chłonnych. Aby przetestować nowe środki do obrazowania, potrzebny jest wiarygodny model raka endometrium z przerzutami do węzłów chłonnych zaotrzewnowych. Model raka endometrium VX2 był często opisywany w literaturze; Istnieją jednak znaczne różnice w odniesieniu do metody ustanawiania modeli. Co więcej, żadne badania nie wykazały wykorzystania hodowanych komórek VX2 do stworzenia tego modelu, ponieważ wcześniej używano tylko komórek rozmnażanych in vivo. W niniejszym artykule przedstawiamy standaryzowaną metodę chirurgiczną i metodę monitorowania pooperacyjnego w celu ustalenia modelu raka endometrium VX2 oraz informujemy o pierwszym zastosowaniu hodowanych komórek VX2 do stworzenia tego modelu.

Wprowadzenie

Rak endometrium, czyli rak błony śluzowej macicy, jest drugim najczęstszym nowotworem ginekologicznym na świecie i najczęściej występującym nowotworem złośliwym w krajach rozwiniętych1. Częstość występowania raka endometrium stale rosła, zwiększając się o 2,3% rocznie w latach 2005-2013, co odpowiada wzrostowi śmiertelności o 2,2%1,2,3. Rozpoznanie przerzutów do węzłów chłonnych jest najważniejsze, ponieważ obecność dodatnich węzłów chłonnych jest silnym negatywnym predyktorem przeżycia4,5,6,7 i może kierować podawaniem terapii uzupełniającej8,9,10,11,12,13. Przerzuty do węzłów chłonnych są obecnie diagnozowane poprzez chirurgiczne usunięcie tkanki limfatycznej pokrywającej główne naczynia krwionośne w miednicy i jamie brzusznej. Ta procedura, znana jako limfadenektomia, jest kontrowersyjna ze względu na sprzeczne dane dotyczące przeżycia z dwóch dużych badań14,15,16,17,18 oraz znane ryzyko śródoperacyjnej15,19,20 i zachorowalność pooperacyjna21,22,23. Ponieważ obecne nieinwazyjne metody obrazowania nie mają wymaganej czułości i swoistości, aby zastąpić rozwarstwienie węzłów chłonnych24, pojawił się nacisk na opracowanie nowych technik obrazowania diagnostycznego. Aby przetestować te nowatorskie techniki w warunkach przedklinicznych, potrzebny jest wiarygodny model raka endometrium z przerzutami do węzłów chłonnych zaotrzewnowych.

Model guza VX2 u królika jest dobrze znanym modelem, który był szeroko stosowany do badania wielu nowotworów ludzkich narządów litych25 w tym płuca26, głowa i szyja27,28, wątroba29, nerka30, bone31,32, brain33, trzustka34 i uterus35,36,37. Model VX2 został pierwotnie opracowany w 1940 roku przez Kidda i Rous38 poprzez udane przeszczepienie wirusa brodawczaka królika bawełnianego odkrytego przez Shope w 1933 roku39. Od tego czasu model VX2 jest utrzymywany in vivo, wymagający seryjnego przejścia w mięśniu czworogłowym białych królików nowozelandzkich40. Ostatnio jednak wiele grup z powodzeniem wyhodowało komórki VX2 in vitro40,41,42 i wykazało zachowaną rakotwórczość hodowanej linii komórkowej31,42,43. Guzy VX2 są histologicznie definiowane jako anaplastyczne raki płaskonabłonkowe 44 i zawierają cechy gruczołowe przypominające gruczolakoraka26. Guzy charakteryzują się łatwością implantacji, szybkim wzrostem i hiperunaczynieniem44,45 i niezawodnie dają przerzuty, najczęściej do regionalnych i odległych węzłów chłonnych45. Podobieństwa w anatomii naczyń krwionośnych i limfatycznych macicy46, a także ortotopowe miejsce wzrostu zapewniają, że wzór przerzutowy raka VX2 królika naśladuje ludzki rak endometrium, co czyni model VX2 wiarygodnym modelem do badania ludzkiej choroby przerzutowej. Ponadto cechy histologiczne, takie jak nieprawidłowa proliferacja mikronaczyniowa47 , a także immunologiczne48 i podobieństwa genetyczne49,50 między ludźmi a królikami sugerują, że mikrośrodowisko guza może odzwierciedlać mikrośrodowisko ludzkiego raka endometrium.

Wiele grup zgłosiło użycie VX2 do stworzenia modelu raka endometrium z przerzutami do komórek zaotrzewnowych z wysokim wskaźnikiem sukcesu36,51,52; jednak w obecnej literaturze istnieją znaczne różnice w odniesieniu do metody tworzenia modelu. Dawki zawiesiny komórkowej tak niskie, jak 4 x 105 komórek/róg macicy51 i tak wysokie, jak 5 x 109 komórek/róg macicy37,53 zostały zgłoszone bez standardowego konsensusu co do wymaganej dawki komórkowej VX2. Opisano również różne metody inokulacji, w tym mikrochirurgiczne wszczepienie guza do mięśniówki macicy36, wstrzyknięcie zawiesiny komórek VX237,44,52,53 a w niektórych przypadkach dodanie szycia rogu macicy przed innokulacją52. Wreszcie, żadna grupa nie zgłosiła użycia hodowanych komórek VX2 do stworzenia tego modelu. Dlatego celem tego badania jest zademonstrowanie skutecznej standaryzowanej metody tworzenia modelu VX2 i przedstawienie pierwszego zastosowania hodowanych komórek VX2 do stworzenia modelu raka endometrium z przerzutami zaotrzewnowymi u królika.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Głębokie zamknięcie ściany brzucha: Zidentyfikuj wierzchołek nacięcia otrzewnej i chwyć otrzewną, mięsień prosty i powięź za pomocą kleszczyków tkankowych. Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone w zatwierdzonych przez Animal Resource Center (ARC) obiektach University Health Network i zgodnie z zatwierdzonymi protokołami użytkowania i opieki nad zwierzętami (AUP #3994/#4299). Linia komórkowa VX2 została uzyskana z laboratorium dr Akena w University Health Network.

1. Stworzenie linii komórkowej VX2 in vitro

  1. Zbierz guz VX2 z mięśnia czworogłowego kości udowej królika i wzrostu w boku myszy.
    1. Rozmrozić zamrożone bloki nowotworowe VX2 (1 cm x 1 cm), zmielić na płytce hodowlanej za pomocą ostrza skalpela i przecedzić przez filtr 70 μm, dodając sekwencyjnie niewielkie ilości zbalansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby upewnić się, że wszystkie komórki są odcedzone do końcowej objętości 1 ml.
    2. Policz komórki i rozcieńczyć 0,9% buforowanym roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym do stężenia 1 x10 7/ml i umieścić na lodzie w sterylnej probówce.
      UWAGA: Bloki nowotworowe uzyskano od współpracownika laboratoryjnego z wcześniejszej propagacji guzów VX2 w mięśniach czworogłowych uda królika.
    3. Znieczulić samicę białego królika nowozelandzkiego (o wadze 2,5-3,5 kg) 2-5% wziewnym izofluranem, usunąć sierść pokrywającą miejsce wstrzyknięcia i oczyścić miejsce wstrzyknięcia roztworem jodu powidonu. Wstrzyknąć 500 μl przygotowanej zawiesiny komórek VX2 (5 x 106 komórek/ml) do mięśnia czworogłowego uda. Monitoruj klinicznie królika pod kątem wzrostu guza, począwszy od 10 dnia.
    4. Eutanazja królików po tym, jak guzy osiągną średnicę 1-1,5 cm (mierzoną zewnętrznie suwmiarką) przy użyciu metody zatwierdzonej przez lekarza weterynarii. Potwierdź eutanazję, sprawdzając parametry życiowe, w tym tętno i częstość oddechów. Wyciąć guz za pomocą sterylnych narzędzi po oczyszczeniu obszaru roztworem betadyny.
    5. W komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą sterylnych narzędzi zmielić guz na małe kawałki (0,2 cm) na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej za pomocą ostrza skalpela. Przepuścić fragmenty guza przez sitko do komórek o wielkości 70 μm, używając 1 ml HBSS, jak opisano w kroku 1.1.1. Policz komórki i rozcieńcz 0,9% roztworem soli, aby uzyskać 7,5 x 105 komórek w 200 μl.
    6. Znieczulenie samców myszy gamma NOD scid (waga 25 g) przy użyciu 4% izofluranu w dawce 1 l/min i utrzymanie znieczulenia za pomocą 2% izofluranu. Po znieczuleniu myszy wstrzyknij 200 μl roztworu z kroku 1.1.5 do tkanki podskórnej boku myszy za pomocą igły o rozmiarze 27.
  2. Pobieranie i pasażowanie komórek VX2 in vitro
    1. Monitoruj wzrost ksenoprzeszczepu klinicznie dwa razy w tygodniu, aż guzy osiągną średnicę 1 cm za pomocą suwmiarki.
    2. Poddaj myszy eutanazji, umieszczając je w komorze CO2 lub wykonując zwichnięcie szyjki macicy po znieczuleniu 4% gazem izofluranowym. Wyciąć guzy w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Zmiel guzy skalpelem na 1-2 mm kawałki w 6-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 3 ml pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/Ham's F12+ 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    4. Pozostaw fragmenty guza w spokoju w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez dwa dni, aż komórki zaczną wyrastać z kawałków guza. Następnie codziennie sprawdzaj hodowane płytki za pomocą mikroskopii świetlnej pod kątem zbieżności komórek. Po osiągnięciu 70% zbiegu trypsynizuj komórki, dodając 1 ml 0,05% trypsyny do kolby i umieszczając z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.
    5. Zneutralizować trypsynę za pomocą 6 ml pożywki DMEM/Ham's F12 + 10% FBS, zebrać komórki i odwirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 300 x g. Usuń supernatant i ponownie zawiesić osad w 3,5 ml nowej pożywki F12 + 10% FBS firmy DMEM/Ham. Nasiona świeże 6 cm pokryte kolagenem I płytki 1,6 x 106 komórek na płytkę, aby osiągnąć około 50% gęstości wysiewu komórek.
      UWAGA: 50% gęstości komórek odnosi się do komórek zajmujących 50% powierzchni płytki po przymocowaniu.
    6. Wczesne pasażowanie: Powtórz powyższy proces (trypsynazacja, wysiew), aż komórki zostaną pasażowane 5 razy, a następnie oceń czystość linii komórkowej za pomocą PCR przy użyciu ilościowego testu PCR w celu odróżnienia genomowego DNA królika od genomowego DNA myszy (patrz krok 1.3.1-1.3.4).
      UWAGA: Po 8 pasażach komórki można rozmnażać na niepokrytych kolagenem regularnie przylegających płytkach do hodowli tkankowych.
    7. Pasażować, trypsynizować i zamrażać podwielokrotności komórek w DMEM/HAM F12 + 30% FBS + 10% DMSO w stężeniu 2 x 106 na fiolkę. Przechowuj komórki w ciekłym azocie do czasu, gdy będą potrzebne do eksperymentów.
  3. Potwierdzenie pochodzenia VX2 komórek, które przeżyły:
    1. Stworzenie standardowego lekarstwa z oczyszczonego genomowego DNA myszy i królika (Krok 1.3.2 i Krok 1.3.3). Stosować startery, które są ukierunkowane na sekwencje specyficzne dla gatunku w drugiej otwartej ramce odczytu elementu retrotranspozonowego LINE-1.
      UWAGA: Sekwencje starterów dla CRPV E6 to: 5'- GATCCTGGACCCAACCAGTG i 5'-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Zastosowano elementy retrotranspozonowe LINE-1. Sekwencje starterów dla królika LINE-1 to: 5'-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC i 5'-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGTGT Sekwencje starterów dla myszy LINE-1 to: 5'-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG i 5'-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
    2. Aby utworzyć krzywą standardową dla CRPV E6, oczyść lizat komórek nowotworowych VX2 (krok 1.1.1) za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta. Określ ilościowo to DNA za pomocą komercyjnego testu. Wykonaj 6 seryjnych rozcieńczeń od 225 pg/μL do 0,925 pg/μL w buforze o niskiej zawartości EDTA-TE. Aby utworzyć krzywą standardową dla genomowego DNA myszy, rozcieńczyć 100 μg komercyjnego genomowego DNA myszy w buforze o niskiej zawartości EDTA-TE w 5 rozcieńczeniach od 125 pg/μL do 0,0125 pg/μL.
    3. Umieścić 4 μl z każdego rozcieńczonego roztworu z próbek z kroku 1.3.2 w studzienkach i uruchomić próbki w termocyklerze PCR. Użyj wartości Cq z każdego cyklu wraz z ilościami DNA na studzienkę, aby obliczyć krzywą standardową przy użyciu ustawień automatycznego progu oprogramowania termocyklera.
    4. Użyj standardowych procedur qPCR, aby wykonać PCR z 40 cyklami 2-etapowych cykli (98 °C i 60 °C) na termocyklerze. Ustal wartości progowe i ustaw wartości delta Ct na >35, aby upewnić się, że w linii komórkowej królika VX2 występuje minimalne zanieczyszczenie myszy. Całkowita objętość każdej reakcji wynosiła 10 μl, składająca się z 5 μl 2x Mastermix, 1 μl starterów do przodu + do tyłu z końcowym stężeniem startera w reakcji przy 250 nM i 4 μl próbki DNA.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat wykonywania PCR można znaleźć w references54,55. Ustala się wartości progowe, a wartości delta Ct ustala się na >35, aby zapewnić minimalne zanieczyszczenie myszy w linii komórkowej VX2 królika. Zalecany poziom DNA VX2 do wiarygodnego wykrywania za pomocą qPCR wynosi 1-10 pg.

2. Hodowla komórkowa VX2 i tworzenie zawiesiny komórkowej

  1. Rozmrozić fiolki zawierające komórki VX2 (zamrożone w kroku 1.2.7) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 minutę i przenieść komórki do stożkowej probówki wirówkowej z 10 ml pożywki hodowlanej (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS i 1% penicylina-streptomycyna). Wirować przez 8 minut przy 107 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 9 ml pożywki.
  2. Przenieść ponownie zawieszone komórki do dużej kolby hodowlanej. Inkubować komórki bez wstrząsania w temperaturze 37 °C. Codziennie sprawdzać komórki pod kątem zbieżności za pomocą mikroskopii świetlnej i zmieniać pożywkę hodowlaną co trzy dni.
  3. Tworzenie hodowlanej zawiesiny komórek VX2 do wstrzykiwań
    1. Trypsynizuj komórki, dodając 3 ml 0,25% trypsyny do kolby, gdy komórki osiągną 80% zbieżności. Umieścić kolbę w inkubatorze (37 °C) na 5 minut. Przenieść roztwór do stożkowej probówki wirówkowej i wirować przez 8 minut przy 107 x g, a następnie usunąć supernatant.
    2. Przemyć granulki komórek 3 razy 9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, odwirować i usunąć supernatant jak powyżej. Policz komórki i rozcieńczyć 0,9% roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem do stężenia 4 x 107 komórek/ml i umieścić w sterylnej stożkowej probówce wirówkowej na lodzie.
  4. Tworzenie namnażonej in vivo zawiesiny komórek VX2 do wstrzykiwań
    1. Rozmrozić zamrożone bloki guza VX2 (1 cm x 1 cm), zmielić na płytce hodowlanej za pomocą ostrza skalpela i przecedzić przez filtr 70 μm, jak w kroku 1.1.1. Dodawaj sekwencyjnie niewielkie ilości HBSS, aby upewnić się, że wszystkie komórki są napięte do końcowej objętości 1 ml. Policz komórki i rozcieńczyć 0,9% roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem do stężenia 1 x107/ml i umieścić na lodzie w sterylnej probówce.
      UWAGA: Bloki nowotworowe uzyskano od współpracownika laboratoryjnego z wcześniejszej propagacji guzów VX2 w mięśniach czworogłowych uda królika.

3. Ustanowienie modelu chirurgicznego

  1. Ustalenie znieczulenia chirurgicznego i przygotowanie przedoperacyjne
    1. Samice białych królików nowozelandzkich (2,5-3,5 kg) należy poddać premedykacji na 1 godzinę przed planowanym zabiegiem chirurgicznym za pomocą zastrzyków z acepromazyny (1 mg/kg domięśniowo) i meloksykamu (0,2 mg/kg mc. m.kw.). Samicę białego królika nowozelandzkiego (o wadze 2,5-3,5 kg) należy znieczulić 2-5% wziewnym izofluranem, usunąć sierść pokrywającą miejsce wstrzyknięcia i oczyścić miejsce wstrzyknięcia roztworem jodu powidonu.
    2. Zaintubuj znieczulone króliki za pomocą maski krtaniowej (LMA) i zabezpiecz taśmą, utrzymując głębokie znieczulenie, zwiększając wziewną dawkę izofluranu w zakresie 2-5%. Regularnie monitoruj znieczulenie chirurgiczne przez cały czas trwania zabiegu, sprawdzając parametry życiowe (częstość oddechów, napełnianie naczyń włosowatych, saturacja tlenem, jeśli jest dostępna) i monitorując objawy sugerujące ból (ruch, wycofanie się z bodźców, hałasy) lub lekkie znieczulenie (ruch, żucie rurki LMA).
      UWAGA: Powinien to zrobić ktoś z doświadczeniem w monitorowaniu znieczulenia chirurgicznego.
    3. Umieść cewnik do żył usznych o rozmiarze 22 w brzeżnej żyle grzbietowej. Cefazolinę (20 mg/kg) podawać dożylnie 10 minut przed chirurgicznym nacięciem skóry.
    4. Przypnij włosy na miednicy i brzuchu przed umieszczeniem królika na stole operacyjnym, a następnie ułóż króliki w pozycji grzbietowej na stole operacyjnym. Oczyść pole operacyjne za pomocą 3-etapowego chirurgicznego przygotowania skóry (mydło betadynowe, roztwór chlorheksydyny, roztwór betadyny). Ułóż pole operacyjne serwetami laparotomijnymi po wyznaczeniu górnej części kości łonowej, pozostawiając odsłonięty obszar dolnej części brzucha o wymiarach 5 cm x 5 cm.
  2. Wykonanie nacięcia po laparotomii i identyfikacja rogów macicy
    1. Załóż czepek chirurgiczny i maskę na twarz. Szoruj ręce za pomocą chlorheksydyny lub betadyny roztworu do peelingu chirurgicznego. Stosując sterylną technikę, załóż sterylny fartuch i sterylne rękawice chirurgiczne.
    2. Za pomocą skalpela z 11 ostrzami # wykonaj nacięcie o długości 2,5 cm 1 cm czaszki do spojenia łonowego przez skórę i tkankę podskórną brzucha królika. Naciąć powięź prostą i wyciąć mięśnie proste z boku, aby odsłonić leżącą pod spodem otrzewną. Wejdź ostro do otrzewnej po upewnieniu się, że spód jest wolny od jelit lub innych narządów jamy brzusznej.
    3. Zlokalizuj rogi macicy identyfikujące pęcherz moczowy i przesuwając palec w rękawiczce wyżej, z tyłu i z boku nad wierzchołkiem pęcherza.
      UWAGA: W razie potrzeby pełny pęcherz można opróżnić za pomocą cyfrowego ciśnienia. Po zlokalizowaniu przeprowadź rogi macicy przez nacięcie brzucha, aby spoczęły na ścianie brzucha.
    4. Za pomocą plecionego szwu wchłanialnego 3-0 wykonaj pojedyncze podwiązanie szwów każdego rogu macicy około 1,5-2,0 cm dystalnie do szyjki macicy. Umieść szew tylko przyśrodkowo do tętnic macicznych, które biegną wzdłuż bocznej części każdego rogu. Zawiąż szwy ciasno, aby zakryć dystalne rogi macicy (Rysunek 1).
  3. Inokulacja mięśniówki VX2
    1. Za pomocą igły o rozmiarze 27 wstrzyknąć 0,5 ml wcześniej przygotowanej zawiesiny komórek VX2 z etapu 2.3.2 (dla modelu VX2 z hodowlą) lub 2.4 (dla modelu VX2 rozmnażanego in vivo) do mięśniówki macicy każdego rogu macicy proksymalnie do miejsca szwu (między miejscem szwu a szyjką macicy). Wstrzykiwać przez 1 minutę i upewnić się, że komórki nie są wstrzykiwane do leżącej poniżej jamy macicy. Znieczulenie zwierząt za pomocą wziewnego izofluranu (2-5%) i urządzenia znieczulającego z obwodem Baina.
    2. Uciskaj miejsce wstrzyknięcia mięśniówki macicy przez 30 s po wstrzyknięciu, aby zminimalizować wyciek komórek. Sprawdź miejsca wstrzyknięcia i szwów pod kątem hemostazy i umieść rogi macicy z powrotem w jamie brzusznej.
  4. Zamykanie nacięcia chirurgicznego
    1. Głębokie zamknięcie ściany brzucha: Zidentyfikuj wierzchołek nacięcia otrzewnej i chwyć otrzewną, mięsień prosty i powięź za pomocą kleszczyków tkankowych.
      1. Aby to zrobić, zakotwiczyć szew na jednym wierzchołku nacięcia, zszywając powierzchownie do głębokości po jednej stronie nacięcia i głęboko do powierzchownie po drugiej. Zawiąż węzeł. Za pomocą dołączonego szwu wykonaj ściegi biegnące prostopadle do nacięcia przez warstwy ściany brzucha, pracując krok po kroku wzdłuż nacięcia z boku na bok. Zawiąż szew i wytnij.
    2. Powierzchowne zamknięcie ściany brzucha: Zidentyfikuj wierzchołek nacięcia skóry i zszyj skórę brzucha za pomocą zakopanego, biegnącego, podskórnego wchłanialnego szwu polifilamentowego 3-0. Nałóż klej chirurgiczny na zamknięte nacięcie, aby przeciwdziałać krawędziom skóry.
      1. Aby to zrobić, zakotwiczyć szew na jednym wierzchołku nacięcia, zszywając głęboko do powierzchownego po jednej stronie nacięcia i powierzchownie do głębokiego po drugiej. Zawiąż węzeł. Za pomocą dołączonych szwów wykonaj szwy biegnące w warstwie skórnej równolegle do nacięcia, pracując krok po kroku wzdłuż nacięcia z boku na bok. Zawiąż szew i wytnij.
  5. Opieka pooperacyjna
    1. Budzenie się ze znieczulenia: Wyłącz izofluran po zamknięciu nacięcia i pozwól królikowi oddychać tlenem przez maskę, jednocześnie monitorując oznaki przebudzenia (np. ruchy spontaniczne, ruchy otwierania oczu i żucia dróg oddechowych maski krtaniowej). Ekstubuj królika po zauważeniu tych objawów i dostarczaj tlen za pomocą maski i ciepłego koca, aż króliki będą czujne i będą w stanie samodzielnie siedzieć.
    2. Monitorowanie pooperacyjne: Monitoruj króliki dwa razy dziennie przez 4 dni i codziennie przez dodatkowe 10 dni po operacji. Aby monitorować, oceń ich ogólny stan, spożycie pokarmu i wody, wydalanie moczu i kału, ocenę bólu, wagę, parametry życiowe (tętno, częstość oddechów) oraz miejsce operacji w poszukiwaniu obrzęku, rumienia, wydzieliny lub rozejścia się.
    3. Kontrola bólu pooperacyjnego: Meloksykam należy podawać codziennie (0,2 mg/kg m.c.) przez 48 godzin po operacji, a następnie w razie potrzeby na podstawie oceny bólu. Buprenorfinę podawać bezpośrednio po operacji i co 12 godzin (0,01-0,05 mg/kg m.kw.) przez 24 godziny, a następnie w razie potrzeby na podstawie oceny bólu
    4. Antybiotyki (enrofloksacyna 5 mg/kg domięśniowo) mogą być podawane codziennie przez siedem dni po operacji, aby zapobiec zakażeniu rany, zgodnie z zaleceniami lekarza weterynarii. Podawać płyny podskórne (15 ml SQ) dwa razy dziennie w razie potrzeby w celu odwodnienia, a miękkie pokarmy lub inne suplementy diety są dostarczane codziennie, w zależności od potrzeb do utraty wagi.

4. Monitorowanie wzrostu guza

  1. Monitorowanie kliniczne: Monitoruj króliki co 2 dni pod kątem klinicznych objawów wzrostu guza, począwszy od 14. dnia po operacji. Kliniczne objawy wzrostu guza mogą obejmować zmniejszone spożycie doustne, letarg, tkliwość brzucha, wyczuwalną masę brzuszną i utratę cekotrofii.
  2. Obrazowanie i monitorowanie inwazyjne
    1. Obrazowanie CT: W dniu pooperacyjnym 21-28 należy wstępnie przystosować medykację, znieczulić i zaintubować króliki, jak opisano wcześniej w 3.1.1-3.1.2. Ułóż króliki w pozycji grzbietowej w przedklinicznym tomografie komputerowym i uzyskaj obrazy miednicy i brzucha po podaniu dożylnym 10 ml środka kontrastowego joheksolu.
    2. Monitorowanie chirurgiczne: Przenieś króliki na salę operacyjną po obrazowaniu, będąc jeszcze w znieczuleniu ogólnym. Ułożyć, przygotować i ułożyć króliki zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 3.1.4 i wykonać powtórne nacięcie laparotomijne o długości około 1,5 cm przez poprzednie nacięcie. Zidentyfikuj rogi macicy i dokładnie zbadaj pod kątem guza. Zamknij nacięcie i zapewnij opiekę pooperacyjną, jak opisano wcześniej w kroku 3.5.2-3.5.4.
    3. Zastosowanie modelu królika: Jeśli okaże się, że króliki mają guzy w czasie monitorowania chirurgicznego, użyj modeli raka endometrium królika do zaplanowanych eksperymentów. Użyj królików stworzonych z rozmnożonych komórek in vivo do dodatkowych eksperymentów po 4 tygodniach od inokulacji i użyj modeli królików utworzonych z hodowanych komórek VX2 około 5-6 tygodni po inokulacji, aby uwzględnić wolniejszy wzrost guza. Eutanazja królików po osiągnięciu przez guzy średnicy 1-1,5 cm (mierzonej zewnętrznie suwmiarką) przy użyciu metody zatwierdzonej przez weterynarza. Potwierdź eutanazję, sprawdzając parametry życiowe, w tym tętno i częstość oddechów. Wyciąć guz za pomocą sterylnych narzędzi po oczyszczeniu obszaru roztworem betadyny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do stworzenia modelu raka endometrium wykorzystano dwudziestu ośmiu królików. Średnia masa królików w momencie rozpoczęcia eksperymentu wynosiła 2,83 kg (2,71-3,58 kg). Guzy macicy wyrosły pomyślnie u 21 królików, co dało całkowitą skuteczność modelu na poziomie 75%. Przed wprowadzeniem do protokołu szycia macicy skuteczność wynosiła 57%, w porównaniu do 81% po dodaniu szycia macicy. Szycie macicy wprowadzono do protokołu po 7th króliku w odpowiedzi na początkowo niską skuteczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym artykule opisaliśmy standaryzowaną metodę chirurgiczną służącą do ustanowienia modelu raka endometrium VX2 i informowaliśmy o pierwszym zastosowaniu hodowanych komórek VX2 do stworzenia tego modelu. Wskaźnik przyjmowania guza wynoszący 75% jest niższy niż 100% wskaźnik procentowy wcześniej opisany w literaturze 35,37,53,56; Jednak 90% wskaźnik patologicznie potwierdzonych przerzutó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Terry Fox Research Institute (PPG#1075), Canadian Institute of Health Research (Foundation Grant #154326), Canadian Cancer Society Research Institute (704718), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Christiana Foundation for Innovation oraz Princess Margaret Cancer Foundation.

Chciałbym podziękować dr Marguerite Akens za dostarczenie początkowych komórek VX2 do stworzenia początkowego modelu VX2 i zamrożonych bloków nowotworowych VX2. Chciałbym podziękować Marco DiGrappie za pomoc w przeprowadzeniu wstępnych eksperymentów z hodowlą komórkową VX2 oraz Lili Ding za pomoc w hodowli komórek VX2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Skalpel z 11 ostrzami, sterylny, jednorazowyAspen Surgical (VWR)80094-086
Cewnik do żył usznych 22-gagueCDMV14332
3-0 wchłanialny szew z poliwłókien (Polysorb)Covidien356718
3-0 pleciony szew wchłanialny (Polysorb)Sitko do komórek Covidien356718
70uM, Indywidualnie pakowane, NylonFalcon352350
Acepromazyna (Atravet)CDMV1047
Mydło Betadine (Jod Poviodone 7,5%)CDMV4363
Roztwór betadyny (Jod Poviodone 10%)UHN Sklepy457955
BuprenorfinaUniwersytet
CefazolinUHN apteka stacjonarnaNie Kot # Potrzebny
Roztwór chlorheksydynyCDMV119872
Corning BioCoatCellware, Kolagen typu I, półka 100 mmMarka Corning354450nieważna
Corning BioCoatCellware, Kolagen typu I, płytki 24-dołkoweMarka Corning354408nieważna
Corning BioCoatCellware, Kolagen typu I, płytki 6-dołkoweMarka Corning354400nie ważne
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *bez LDEV, 10 mLCorning354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320marka nieważna
DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Enrofloksacyna (Baytril do wstrzykiwań)CDMV11242
Falcon TubeCorning Centri-Star430828
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, pochodzenia kanadyjskiego, 500 mlLife Technologies12483020Marka/źródło nieważne
IzofluranUHN w aptece stacjonarnejNie kot # Potrzebny
kontrast izoheksoluGE Healthcare407141210
Meloksykam (Metacam 0,5%)CDMV104674
Normalna marka soli fizjologicznej(UofT Medstore)1011
PBSMulticell lub Sigma331-010-CL lub D8537-500mL
Penicylina/Streptomycyna (100mL; 10000U Penicylina, 10000ug Streptomycyna)Corning-CellgroCA45000-652
Sterylny Hanks Zrównoważony roztwór soli (-Ca++, -Mg++, -Czerwień fenolowa)T.C.M.F (Dr Bristow)28-Jan-11
Klej chirurgiczny (klej tkankowy)3M Vetbond14695B
Trypsyna (0,25%), Klasa proteomicznaSigmaT-6567-5X20UG
Trypsin-EDTA, 0,05%, 100mlBisent Inc325-542-ELMarka nie ma znaczenia
McGill

Bibliografia

  1. Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136, E359-E386 (2015).
  2. Canada, S. Canadian Cancer Statistics Special topic: Pancreatic cancer. , (2017).
  3. Siegel, R. Cáncer Statistics. Cáncer Journal. 67, 7-30 (2017).
  4. Creasman, W. T., et al. Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 60, 2035-2041 (1987).
  5. Morrow, C. P., et al. Relationship between surgical-pathological risk factors and outcome in clinical stage I and II carcinoma of the endometrium: A gynecologic oncology group study. Gynecologic Oncology. 40, 55-65 (1991).
  6. Hicks, M., et al. The National Cancer Data Base report on Endometrial carcinoma in African-American women. Cancer. 83, 2629-2637 (1998).
  7. Barrena Medel, N. I., et al. Comparison of the prognostic significance of uterine factors and nodal status for endometrial cancer. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 204, 1-7 (2011).
  8. Randall, M. E., et al. Randomized phase III trial of whole-abdominal irradiation versus doxorubicin and cisplatin chemotherapy in advanced endometrial carcinoma: A gynecologic oncology group study. Journal of Clinical Oncology. 24, 36-44 (2006).
  9. Galaal, K., Al Moundhri, M., Bryant, A., Lopes, A. D., Lawrie, T. A. Adjuvant chemotherapy for advanced endometrial cancer. Cochrane Database of Systematic Reviews. 2014, 2-4 (2014).
  10. Orr, J. W., Holimon, J. L., Orr, P. F. Stage I corpus cancer: is teletherapy necessary? American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176, discussion 788-789 777-788 (1997).
  11. Ng, T. Y., Perrin, L. C., Nicklin, J. L., Cheuk, R., Crandon, A. J. Local recurrence in high-risk node-negative stage I endometrial carcinoma treated with postoperative vaginal vault brachytherapy. Gynecologic Oncology. 79, 490-494 (2000).
  12. Mohan, D. S., et al. Long-term outcomes of therapeutic pelvic lymphadenectomy for stage I endometrial adenocarcinoma. Gynecologic Oncology. 70, 165-171 (1998).
  13. Straughn, J. M., et al. Stage IC adenocarcinoma of the endometrium: Survival comparisons of surgically staged patients with and without adjuvant radiation therapy. Gynecologic Oncology. 89, 295-300 (2003).
  14. Panici, P. B., et al. Systematic pelvic lymphadenectomy vs no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: Randomized clinical trial. Journal of the National Cancer Institute. 100, 1707-1716 (2008).
  15. ASTEC study group,, et al. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomised study. The Lancet. 373, 125-126 (2009).
  16. Kilgore, L., et al. Adenocarcinoma of the Endometrium: Survival comparisons of patients with and without pelvic node sampling. Gynecologic Oncology. 56, 29-33 (1995).
  17. Trimble, E. L., Kosary, C., Park, R. C. Lymph node sampling and survival in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 71, 340-343 (1998).
  18. Chan, J. K., et al. The outcomes of 27,063 women with unstaged endometrioid uterine cancer. Gynecologic Oncology. 106, 282-288 (2007).
  19. Cragun, J. M., et al. Retrospective analysis of selective lymphadenectomy in apparent early-stage endometrial cancer. Journal of Clinical Oncology. 23, 3668-3675 (2005).
  20. Piovano, E., et al. Complications after the treatment of endometrial cancer: A prospective study using the French-Italian glossary. International Journal of Gynecological Cancer. 24, 418-426 (2014).
  21. Abu-Rustum, N. R., et al. The incidence of symptomatic lower-extremity lymphedema following treatment of uterine corpus malignancies: A 12-year experience at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center. Gynecologic Oncology. , 714-718 (2006).
  22. Todo, Y., et al. Risk factors for postoperative lower-extremity lymphedema in endometrial cancer survivors who had treatment including lymphadenectomy. Gynecologic Oncology. 119, 60-64 (2010).
  23. Beesley, V., Janda, M., Eakin, E., Obermair, A., Battistutta, D. Lymphedema after gynecological cancer treatment: Prevalence, correlates, and supportive care needs. Cancer. 109, 2607-2614 (2007).
  24. Haldorsen, I. S., Salvesen, H. B. What Is the Best Preoperative Imaging for Endometrial Cancer? Current Oncology Reports. 18, 1-11 (2016).
  25. Aravalli, R., Cressman, E. Relevance of Rabbit VX2 Tumor Model for Studies on Human Hepatocellular Carcinoma: A MicroRNA-Based Study. Journal of Clinical Medicine. 4, 1989-1997 (2015).
  26. Kreuter, K. A., et al. Development of a rabbit pleural cancer model by using VX2 tumors. Comparative Medicine. 58, 287-293 (2008).
  27. Li, S., Ren, G., Jin, W., Guo, W. Establishment and characterization of a rabbit oral squamous cell carcinoma cell line as a model for in vivo studies. Oral Oncology. 47, 39-44 (2011).
  28. Muhanna, N., et al. Multimodal Nanoparticle for Primary Tumor Delineation and Lymphatic Metastasis Mapping in a Head-and-Neck Cancer Rabbit Model. Advanced Healthcare Materials. 4, 2164-2169 (2015).
  29. Tong, H., Duan, L., Zhou, H., Feng, S. Modification of the method to establish a hepatic VX2 carcinoma model in rabbits. Oncology Letters. 15, 22-23 (2018).
  30. Bimonte, S., et al. Induction of VX2 para-renal carcinoma in rabbits: generation of animal model for loco-regional treatments of solid tumors. Infectious Agents and Cancer. 11, 1-8 (2016).
  31. Handal, J. A., et al. Creation of rabbit bone and soft tissue tumor using cultured VX2 cells. Journal of Surgical Research. 179, e127-e132 (2013).
  32. Pezeshki, P. S., et al. Bone targeted bipolar cooled radiofrequency ablation in a VX-2 rabbit femoral carcinoma model. Clinical and Experimental Metastasis. 32, 279-288 (2015).
  33. Wang, Y., et al. Magnetic resonance imaging-navigated argon-helium cryoablation therapy against a rabbit VX2 brain tumor. Experimental and Therapeutic. 9, 2229-2234 (2015).
  34. Zhang, W., et al. Laparotomy cryoablation in rabbit VX2 pancreatic carcinoma. Pancreas. 46, 288-295 (2017).
  35. Xu, L. -Q., Huang, Y. -W., Luo, R. -Z., Zhang, Y. -N. Establishment of the retroperitoneal lymph node metastasis model of endometrial VX2 carcinoma in rabbits and observation of its metastatic features. World Journal of Surgical Oncology. 13, 109(2015).
  36. Duan, P., Lü, J. Q., Tu, Q. M., Yu, Z. K. Magnetic resonance evaluation of transplanted endometrial carcinoma and its lymph node metastasis in rabbits. Chinese Journal of Cancer Research. 19, 201-205 (2007).
  37. Huang, Y. -W., et al. VEGF-c expression in an in vivo model of orthotopic endometrial cancer and retroperitoneal lymph node metastasis. Reproductive Biology and Endocrinology. 11, 49(2013).
  38. Kidd, J. G., Rous, P. A transplantable rabbit carcinoma originating in a virus-induced papilloma and containing the virus in masked or altered form. J Exp Med. 71 (6), 813-838 (1940).
  39. Shope, B. R. E., Hurst, B. E. W. Infectious papillomatosis of rabbits. , (1933).
  40. Galasko, C. S. B., Haynes, D. W. Survival of VX2 carcinoma cells in vitro. European Journal of Cancer. 12 (1965), 1025-1026 (1965).
  41. Osato, B. Y. T., Ito, Y. In vitro Cultivation And Immunofluorescent Studies Of Transplantable Carcinomas Vx2 And Vx7. , Laboratory of Viral Oncology, Research Institute, Aichi Cancer Center. Nagoya, Japan. (1967).
  42. Easty, D. M., Easty, G. C. Establishment of an in vitro cell line from the rabbit VX2 carcinoma. Virchows Archiv B Cell Pathology Including Molecular Pathology. 39, 333-337 (1982).
  43. Liu, X., et al. Establishment and characterization of a rabbit tumor cell line VX2. Zhonghua bing li xue za zhi Chinese Journal of Pathology. 34, 661-663 (2005).
  44. Parvinian, A., Casadaban, L. C., Gaba, R. C. Development, growth, propagation, and angiographic utilization of the rabbit VX2 model of liver cancer: a pictorial primer and “how to” guide. Diagnostic and Interventional Radiology. 20, 335-340 (2014).
  45. Pascale, F., et al. Modified model of VX2 tumor overexpressing vascular endothelial growth factor. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 23, 809-817 (2012).
  46. Oshiro, H. The role of the lymphatic system in rabbit models for cancer metastasis research a perspective from comparative anatomy. Okajimas Folia Anatomica Japonica. , 6-7 (2014).
  47. Guan, L., Xu, G. Destructive effect of HIFU on rabbit embedded endometrial carcinoma tissues and their vascularities. Oncotarget. 8, 19577-19591 (2017).
  48. Oshiro, H., et al. Establishment of successively transplantable rabbit VX2 cancer cells that express enhanced green fluorescent protein. Medical Molecular Morphology. 48, 13-23 (2015).
  49. Graur, D., Duret, L., Gouyt, M. Phylogenetic position of the order Lagomorpha (rabbits, hares and allies). Nature. 379, 333-335 (1996).
  50. Bõsze, Z., Houdebine, L. M. Application of rabbits in biomedical research: A review. World Rabbit Science. 14, 1-14 (2006).
  51. Kyotani, S., et al. A study of cis-diamminedichloroplatinum(II) suppositories for the treatment of rabbit uterine endometrial carcinoma. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 16, 55-58 (1993).
  52. Harima, Y., Harima, K., Hasegawa, T., Shikata, N., Tanaka, Y. Histopathological changes in rabbit uterus carcinoma alter transcatheter arterial embolization using cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 38, 317-322 (1996).
  53. Huang, Y. W., et al. Tumor-induced VEGF-C overexpression in retroperitoneal lymph nodes in VX2 carcinoma-bearing rabbits. Drug Design, Development and Therapy. 9, 5949-5956 (2015).
  54. Bio-Rad. Real-Time PCR Applications Guide. , Bulletin 5279 (2006).
  55. Taylor, S., et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform to the MIQE guidelines. BioRad Bulletin. , 5859(2009).
  56. Rhee, T. K., et al. Rabbit VX2 Tumors as an Animal Model of Uterine Fibroids and for Uterine Artery Embolization. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 18, 411-418 (2007).
  57. Takahashi, K., et al. Development of a mouse model for lymph node metastasis with endometrial cancer. Cancer Science. 102, 2272-2277 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rak endometrium VX2kom rki propagowane in vivoiniekcja do rogu macicyustanowienie modelu chirurgicznegoprzerzuty do w z w ch onnychprzygotowanie hodowli kom rkowejanaliza histologicznasterylna technika chirurgiczna
Ortotopowy model raka endometrium z limfadenopatią zaotrzewnową wykonany z rozmnożonych i hodowanych in vivo komórek VX2
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.