Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Cody  O. Crosby; Janet Zoldan

doi:10.3791/59342

Method Article

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

DOI:

10.3791/59342

⸱

May 13th, 2019

Cody O. Crosby¹ , Janet Zoldan¹

¹Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są specyficznym dla pacjenta, proliferacyjnym źródłem komórek, które mogą różnicować się w dowolny typ komórek somatycznych. Bipotencjalne komórki progenitorowe śródbłonka (EP), które mogą różnicować się w typy komórek niezbędne do złożenia dojrzałego, funkcjonalnego układu naczyniowego, pochodzą zarówno z embrionalnych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Jednak komórki te nie zostały rygorystycznie ocenione w środowiskach trójwymiarowych, a ilościowy pomiar ich potencjału naczyniowego pozostaje nieuchwytny. W tym miejscu najpierw przedstawiono wytwarzanie i izolację iPSC-EP poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjną, a następnie opisano enkapsulację i hodowlę iPSC-EP w hydrożelach kolagenowych. To mikrośrodowisko naśladujące macierz zewnątrzkomórkową (ECM) sprzyja silnej odpowiedzi naczyniowej; Sieci naczyniowe tworzą się po tygodniu hodowli. Opisano utworzenie potoku obliczeniowego, który wykorzystuje oprogramowanie typu open source do ilościowego określenia tej odpowiedzi naczyniowej. Ten potok został specjalnie zaprojektowany, aby zachować architekturę 3D splotu kapilarnego w celu niezawodnej identyfikacji liczby rozgałęzień, punktów rozgałęzień i całkowitej długości sieci przy minimalnym wkładzie użytkownika.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i inne pierwotne typy komórek śródbłonka są wykorzystywane od dwóch dekad do modelowania kiełkowania i rozwoju naczyń krwionośnych in vitro¹. Takie platformy naczyniowe mogą rzucić światło na mechanizmy molekularne i tkankowe chorób sercowo-naczyniowych i mogą dostarczyć fizjologicznego wglądu w rozwój prymitywnych sieci naczyniowych²^,³. Chociaż w dziedzinie modelowania naczyń krwionośnych poczyniono znaczne postępy, "złoty standard" testu, który może ilościowo modelować i oceniać fizjologiczny rozwój naczyń krwionośnych, pozostaje nie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i roztworów powlekających

Aby przygotować roztwór powlekający witronektynę, rozcieńczyć witronektynę w stosunku 1:100 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
UWAGA: Po rozcieńczeniu nie zaleca się przechowywania tego roztworu do wykorzystania w przyszłości.
Po otrzymaniu od producenta galaretowatej, wolnej od czerwieni fenolowej mieszaniny białek o obniżonej liczbie czynników wzrostu (patrz tabela materiałów), należy rozmrozić na lodzie w temperaturze 4 °C, aż mieszanina stanie się przezroczysta i płynna. Trzymając mieszaninę na lodzie w okapie z p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po różnicowaniu (Rysunek 1), FACS i enkapsulacji iPSC-EP w hydrożelach kolagenowych, komórki zazwyczaj pozostają zaokrąglone przez 24 godziny, zanim zaczną migrować i tworzyć początkowe lumeny. Po około 6 dniach hodowli prymitywny splot kapilarny będzie widoczny w hydrożelu podczas oglądania pod mikroskopem jasnego pola (Ryc. 2). Po zobrazowaniu utrwalonych, barwionych hydrożeli obciążonych komórkami pod mikroskopem konfokalnym (film 1, film.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten obejmuje długoterminową hodowlę komórek w trzech typach pożywek do hodowli komórkowych: E8, LaSR Basal i EGM-2. Dlatego należy dołożyć wszelkich starań, aby odpowiednio wysterylizować wszystkie materiały. Ponadto fartuchy laboratoryjne i rękawice oczyszczone etanolem powinny być zawsze noszone podczas pracy w kapturze z przepływem laminarnym laboratorium. Zaleca się częste przeprowadzanie testów na obecność zakażenia mykoplazmą; jeśli podczas hodowli iPSC zaobserwuje się dużą ilość zanieczyszczeń lub odnotuj.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez American Heart Association (grant numer 15SDG25740035, przyznany J.Z.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) of the National Institutes of Health (grant numer EB007507, przyznany C.C.) oraz Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T, grant numer 1 P2C HD086843-01, przyznany J.Z.). Serdecznie dziękujemy prof. Jeanne Stachowiak (The University of Texas at Austin) za jej doradztwo techniczne w zakresie mikroskopii konfokalnej. Jesteśmy również wdzięczni za rozmowy z Samuelem Mihelicem (The University of Texas at Austin), dr Alicią Allen (The University of Texas at Austin), dr Julie Rytle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	Płaska, szklana płytka do hodowli tkankowej ze ściankami bocznymi umożliwia łatwe obrazowanie konfokalne
96 dołków, okrągłe dno, mikropłytka o bardzo niskim mocowaniu, sterylna	Corning	7007	Zapobiega wiązaniu się hydrożeli kolagenowych obciążonych komórkami z naczyniem do hodowli komórkowej
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Delikatny roztwór do odrywania komórek; nie degraduje epitopów zewnątrzkomórkowych niezbędnych dla FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	Podłoże bazowe do różnicowania iPSC-EP.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	; inne można łatwo zastąpić
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej, 7,5% w DPBS, sterylnie filtrowany, BioXtra, odpowiedni do hodowli komórkowych	Fisher Scientific	A8412	Aby zachować żywotność komórek podczas sortowania FAC
CD34-PE, człowiek (klon: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Przeciwciało stosowane do izolacji FAC iPSC-EP
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Indukuje tworzenie mezodermy z pluripotencjalnych komórek macierzystych
Kolagen I Ogon szczura Wysoka zawartość białka 100 mg	VWR	354249	Główny składnik mikrośrodowiska 3D
Stożkowe probówki wirówkowe (15/50 ml)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Służy do przechowywania i mieszania stosunkowo dużych ilości odczynników i pożywek
do hodowli komórkowychDAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Do przeciwbarwienia i wizualizacji jąder komórkowych
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	Do rozcieńczania Matrigelu i rozmrażania pluripotencjalnych komórek macierzystych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	Do mycia kultur jednowarstwowych
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	Do pasażowania pluripotencjalnych kolonii komórek macierzystych i zapobiegania agregacji komórek podczas sortowania FAC
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2	PromoCell	C-22011	Wspomaga żywotność i proliferację komórek śródbłonka
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Do utrzymania pluripotencjalnych komórek macierzystych
Glicyna,BioUltra, do biologii molekularnej, >=99,0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizuje pozostały detergent
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat soli, >=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Składnik podłoża różnicującego iPSC-EP
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Wieloparadygmatowe środowisko obliczeń numerycznych (bezpłatne dostępne w większości instytucji akademickich)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 ml (galaretowata mieszanina białek)	Fisher Scientific	356231	Rozcieńczony w DMEM/F12 do powlekania płytek w celu różnicowania iPSC-EP
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Służy do równoważenia końcowej osmolarności hydrożelowej i pH
Probówki do mikrowirówek (1,7 ml)	VWR	87003-294	Przechowuje małe ilości odczynników
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	Główny składnik roztworów do barwienia immunologicznego
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antybiotyk stosowany po sortowaniu w celu usunięcia ewentualnego zanieczyszczenia z instrumentu FACS
Rekombinowane ludzkie białko VEGF 165 R	& D Systems	293-VE	Mitogen, który stymuluje proliferację komórek śródbłonka i tubuogenezę
Rodamina falloidyna	Themo Fisher Scientific	R415	Aby zidentyfikować osadzanie się F-aktyny, a tym samym nakreślić granice sieci naczyniowych
Triton X-100 (niejonowy środek powierzchniowo czynny)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergent stosowany do delikatnej przepuszczalności komórek
Tween-20 (odczynnik emulgujący)	Fisher Scientific	BP337	Zwiększa swoistość wiązania dodanych przeciwciał
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	Identyfikacja światła śródbłonka 3D w hydrożelach kolagenowych
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	Do utrzymania pluripotencjalnych komórek macierzystych
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Zachowuje żywotność pluripotencjalnych komórek macierzystych i iPSC-EP po dysocjacji i ponownym wysianiu

System oczyszczania wody

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
Kant, R. J., Coulombe, K. L. K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles