Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Podsumowanie

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Streszczenie

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są specyficznym dla pacjenta, proliferacyjnym źródłem komórek, które mogą różnicować się w dowolny typ komórek somatycznych. Bipotencjalne komórki progenitorowe śródbłonka (EP), które mogą różnicować się w typy komórek niezbędne do złożenia dojrzałego, funkcjonalnego układu naczyniowego, pochodzą zarówno z embrionalnych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Jednak komórki te nie zostały rygorystycznie ocenione w środowiskach trójwymiarowych, a ilościowy pomiar ich potencjału naczyniowego pozostaje nieuchwytny. W tym miejscu najpierw przedstawiono wytwarzanie i izolację iPSC-EP poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencyjną, a następnie opisano enkapsulację i hodowlę iPSC-EP w hydrożelach kolagenowych. To mikrośrodowisko naśladujące macierz zewnątrzkomórkową (ECM) sprzyja silnej odpowiedzi naczyniowej; Sieci naczyniowe tworzą się po tygodniu hodowli. Opisano utworzenie potoku obliczeniowego, który wykorzystuje oprogramowanie typu open source do ilościowego określenia tej odpowiedzi naczyniowej. Ten potok został specjalnie zaprojektowany, aby zachować architekturę 3D splotu kapilarnego w celu niezawodnej identyfikacji liczby rozgałęzień, punktów rozgałęzień i całkowitej długości sieci przy minimalnym wkładzie użytkownika.

Wprowadzenie

Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i inne pierwotne typy komórek śródbłonka są wykorzystywane od dwóch dekad do modelowania kiełkowania i rozwoju naczyń krwionośnych in vitro¹. Takie platformy naczyniowe mogą rzucić światło na mechanizmy molekularne i tkankowe chorób sercowo-naczyniowych i mogą dostarczyć fizjologicznego wglądu w rozwój prymitywnych sieci naczyniowych^2,3. Chociaż w dziedzinie modelowania naczyń krwionośnych poczyniono znaczne postępy, "złoty standard" testu, który może ilościowo modelować i oceniać fizjologiczny rozwój naczyń krwionośnych, pozostaje nieuchwytny. Większość opublikowanych protokołów nie podsumowuje odpowiednio niszy naczyniowej, aby zachęcić do tworzenia dojrzałych, funkcjonalnych naczyń krwionośnych lub nie posiada metody ilościowego porównania potencjału naczyniowego ocenianych typów komórek w trzech wymiarach (3D).

Wiele obecnych modeli naczyniowych ma ograniczoną zdolność do naśladowania fizjologicznej niszy naczyniowej. Jedną z najczęściej stosowanych platform in vitro jest test tworzenia probówek na bazie galaretowatej mieszaniny białek. Krótko mówiąc, HUVEC są wysiewane jako pojedyncze komórki na cienkiej warstwie żelu, który składa się z białek zebranych z macierzy zewnątrzkomórkowej mięsaka myszy (ECM); w ciągu jednego do dwóch dni HUVEC samoorganizują się w prymitywne tuby⁴. Jednak proces ten zachodzi w dwóch wymiarach (2D), a komórki śródbłonka (EC) wykorzystane w tym teście nie tworzą zamkniętych, pustych w środku światła, co ogranicza fizjologiczne znaczenie tych badań. Ostatnio EC i komórki wspomagające (np. mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) i perycyty) były hodowane wspólnie w mikrośrodowiskach 3D, które symulują włóknistą architekturę natywnego ECM, takich jak hydrożele kolagenowe lub fibrynowe⁵. Do modelowania rozwoju naczyń krwionośnych w tym mikrośrodowisku zwykle stosuje się kulki polimerowe pokryte ECs⁶. Dodanie egzogennych czynników wzrostu i/lub czynników wzrostu wydzielanych przez inne komórki śródmiąższowo osadzone w hydrożelu może skłonić EC, pokrywające kulki polimerowe, do kiełkowania i tworzenia pojedynczego światła; Następnie można obliczyć liczbę i średnicę kiełków i naczyń. Jednak te kiełki są pojedyncze i nie tworzą zamkniętej, połączonej sieci, jak to widać w warunkach fizjologicznych, a zatem bardziej przypominają model unaczynienia guza. Urządzenia mikroprzepływowe zostały również wykorzystane do naśladowania niszy naczyniowej i promowania tworzenia naczyń krwionośnych w hydrożelach z obciążeniem EC^7,8. Zazwyczaj gradient angiogennego czynnika wzrostu jest stosowany do pożywki do hodowli komórek krążących w celu wywołania migracji EC i kiełkowania. EC, które stanowią światło rozwiniętych naczyń, są wrażliwe na naprężenia ścinające wywołane zastosowaniem przepływu płynu przez urządzenie mikroprzepływowe; W ten sposób te urządzenia mikroprzepływowe wychwytują kluczowe parametry fizjologiczne, które nie są dostępne w modelach statycznych. Urządzenia te wymagają jednak kosztownych zdolności do mikrofabrykacji.

Najważniejsze, wszystkie trzy modele naczyniowe (2D, 3D, mikroprzepływowe) w przeważającej mierze wykorzystują pierwotne EC, jak również podstawowe typy komórek wspomagających. Komórki pierwotne nie mogą zostać rozwinięte w skuteczną terapię sercowo-naczyniową, ponieważ komórki wywołałyby odpowiedź immunologiczną po implantacji; ponadto HUVEC i podobne pierwotne typy komórek nie są specyficzne dla pacjenta i nie wychwytują nieprawidłowości naczyniowych, które występują u pacjentów z dyspozycjami genetycznymi lub wcześniej istniejącymi schorzeniami, np. cukrzycą. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pojawiły się w ciągu ostatniej dekady jako specyficzne dla pacjenta, proliferacyjne źródło komórek, które można różnicować we wszystkie komórki somatyczne w ludzkim ciele⁹. W szczególności opublikowano protokoły, które opisują generowanie i izolację komórek progenitorowych śródbłonka pochodzących z iPSC (iPSC-EPs)^10,11; iPSC-EP są bipotencjalne i dlatego mogą być dalej różnicowane w komórki śródbłonka i komórki/perycyty mięśni gładkich, elementy budulcowe dojrzałego, funkcjonalnego układu naczyniowego. Tylko jedno badanie przekonująco szczegółowo opisało rozwój pierwotnego splotu kapilarnego z iPSC-EP w mikrośrodowisku 3D¹²; Chociaż badanie to ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia składania i różnicowania iPSC-EP w naturalnych i syntetycznych hydrożelach, nie porównano ilościowo topologii sieci powstałego układu naczyniowego. W innym niedawnym badaniu wykorzystano model kulek polimerowych do porównania kiełkowania HUVEC i ECs⁵. W związku z tym istnieje wyraźna potrzeba dalszego wyjaśnienia fizycznych i chemicznych mechanizmów sygnalizacyjnych, które regulują waskulogenezę iPSC-EP w mikrośrodowiskach 3D oraz określenia, czy komórki te nadają się do terapii niedokrwiennej i modelowania chorób sercowo-naczyniowych.

W ciągu ostatniej dekady opracowano różne open-source'owe potoki obliczeniowe i algorytmy szkieletyzacji do ilościowego określania i porównywania długości sieci naczyniowej i łączności. Na przykład Charwat i wsp. opracowali potok oparty na Photoshopie w celu wyodrębnienia przefiltrowanego, binaryzowanego obrazu sieci naczyniowych pochodzących z kohodowli komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej i wyrosłych EC w matrycy fibryny^13,14. Być może najczęściej używanym narzędziem do porównywania topologii jest AngioTool, program opublikowany online przez National Cancer Institute¹⁵; Pomimo powszechnego przyjęcia programu i dobrze udokumentowanej wierności, program ogranicza się do analizy struktur podobnych do naczyń w dwóch wymiarach, a inne programy, w tym AngioSys i Wimasis, mają to samo ograniczenie wymiarowości¹⁶. Potężne pakiety oprogramowania, takie jak Imaris, Lucis i Metamorph, zostały opracowane w celu analizy topologii sieci inżynieryjnego mikrokrążenia; Jednak te pakiety są zbyt kosztowne dla większości laboratoriów akademickich i ograniczają dostęp do kodu źródłowego, co może utrudnić użytkownikowi końcowemu dostosowanie algorytmu do konkretnej aplikacji. 3D Slicer, pakiet do obrazowania rezonansu magnetycznego / tomografii komputerowej o otwartym kodzie źródłowym, zawiera zestaw narzędzi do modelowania naczyniowego, który może skutecznie analizować topologię sieci naczyniowych 3D¹⁷; Analiza jest jednak zależna od ręcznego umieszczania przez użytkownika punktów końcowych sieci, co może stać się żmudne podczas analizy dużego zbioru danych i może być uzależnione od podświadomych uprzedzeń użytkownika. W tym manuskrypcie szczegółowo opisano potok obliczeniowy, który może określić ilościowo sieci naczyniowe 3D. Aby przezwyciężyć wyżej opisane ograniczenia, ten potok obliczeniowy typu open source wykorzystuje ImageJ do wstępnego przetwarzania pozyskanych obrazów konfokalnych w celu załadowania woluminu 3D do analizatora szkieletów. Analizator szkieletu wykorzystuje algorytm przerzedzania równoległej osi przyśrodkowej i został pierwotnie opracowany przez Kerschnitzki et al. do analizy długości i połączeń sieci osteocytów¹⁸; Algorytm ten może być skutecznie zastosowany do scharakteryzowania długości i połączeń zaprojektowanego mikrokrążenia

.

Podsumowując, ten protokół opisuje tworzenie sieci mikronaczyniowych w mikrośrodowiskach 3D i zapewnia otwarty i wolny od uprzedzeń użytkowników potok obliczeniowy do łatwego porównywania potencjału naczyniowego iPSC-EP.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i roztworów powlekających

1. Aby przygotować roztwór powlekający witronektynę, rozcieńczyć witronektynę w stosunku 1:100 w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.
   UWAGA: Po rozcieńczeniu nie zaleca się przechowywania tego roztworu do wykorzystania w przyszłości.
2. Po otrzymaniu od producenta galaretowatej, wolnej od czerwieni fenolowej mieszaniny białek o obniżonej liczbie czynników wzrostu (patrz tabela materiałów), należy rozmrozić na lodzie w temperaturze 4 °C, aż mieszanina stanie się przezroczysta i płynna. Trzymając mieszaninę na lodzie w okapie z przepływem laminarnym, odpipetować 75 μl mieszaniny do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,8 ml i natychmiast zamrozić w temperaturze -20 °C. Porcje te mogą być przechowywane przez okres do jednego roku.
   UWAGA: Ta galaretowata mieszanina białek staje się bardzo lepka, gdy jest przechowywana w temperaturze pokojowej i zestala się w wyższych temperaturach. Utrzymuj ten roztwór w lodowatym chłodzie.
3. Aby przygotować tę mieszaninę do powlekania, rozmrozić 75 μl podwielokrotności na lodzie i rozcieńczyć 6 ml lodowato zimnego Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12). Tak przygotowana objętość wystarcza do pokrycia 12-dołkowej płytki.
4. Przygotować 100 mg/ml roztworu podstawowego kwasu askorbinowego i fosforanu magnezu (biały liofilizowany proszek) w ultraczystej wodzie, dodając 500 mg proszku do 5 ml wody w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 10 ml. Mieszaj mieszadłem, aż roztwór będzie całkowicie przezroczysty (może to potrwać do godziny). Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku.
5. Stworzyć 10 mM zapasu CHIR99021 (CHIR), rozpuszczając 10 mg liofilizowanego proszku w 1,9928 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i ogrzewając w kąpieli perełkowej (lub wodnej) o temperaturze 37 °C, aż roztwór stanie się przezroczysty. Porcjować do 1,8 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku.
6. Stworzyć 10 mM zapasu Y-27632, inhibitora ROCK (ROCKi), rozpuszczając 10 mg liofilizowanego proszku w 3,1225 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i ogrzewając w kąpieli perełkowej (lub wodnej) o temperaturze 37 °C, aż roztwór stanie się przezroczysty. Porcjować do 1,8 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku.
7. Aby przygotować pożywkę Essential 8 (E8), rozmrozić zamrożone suplementy, dodać do butelki 500 ml pożywki podstawowej i wysterylizować przez filtr. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby nie podgrzewać tego podłoża w temperaturze 37 °C, ponieważ białka w pożywce mogą ulec degradacji przy długotrwałym stosowaniu. Zamiast tego przechowuj to podłoże w temperaturze pokojowej przez 15 do 30 minut przed użyciem.
8. Aby przygotować bufor sortujący, dodaj 1,33 ml 7,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w DPBS i 200 μl 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do 48,5 ml DPBS, aby uzyskać końcowy roztwór 0,5% BSA i 2 mM EDTA.
9. Aby przygotować LaSR Basal, dodaj 300 μl 100 mg/ml kwasu askorbinowego magnezu-2-fosforanu i 5 ml GlutaMAX do 500 ml Advanced DMEM/F12. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
10. Aby przygotować pożywkę Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2), rozmrozić suplementy i dodać do 500 ml butelki podłoża podstawowego. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
11. W celu przygotowania buforu blokującego dodać 500 mg liofilizowanej albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 50 μl odczynnika emulgującego (patrz tabela materiałów) do 48 ml DPBS. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut, aby upewnić się, że BSA nie zbryla się, a następnie nie oddzieli od roztworu.

2. Rozmrażanie, konserwacja i przekazywanie iPSC

1. Przed rozmrożeniem kriokonserwowanej fiolki iPSC należy pokryć pojedynczą studzienkę 6-dołkowej płytki 1 ml roztworu witronektyny (przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 1.1). Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Nie pozwól, aby ta powłoka wyschła na powietrzu przed dodaniem podłoża E8 do płytki.
2. Aby rozmrozić iPSC, należy pobrać kriokonserwowaną fiolkę z iPSC z pojemnika do przechowywania ciekłego azotu i rozmrozić w temperaturze 37 °C, aż pozostanie mały kryształ lodu. Ostrożnie (kroplami) przenieść zawartość rozmrożonej fiolki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml lodowatego DMEM/F12. Umyj rozmrożoną fiolkę dodatkiem 1 ml lodowatego DMEM/F12, aby zminimalizować utratę komórek. Wirować przez 5 minut przy 300 x g.
3. Czekając na wirówkę, odessać roztwór witronektyny i dodać 1 ml pożywki E8 (przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 1.6) do studzienki. Następnie usunąć supernatant DMEM/F12 z odwirowanej probówki stożkowej i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki E8. Przenieś komórki na nowo pokrytą płytkę, upewniając się, że mieszasz zawiesinę, aby zapobiec zbrylaniu się kolonii podczas siewu.
4. Po rozmrożeniu zwykle następuje znaczna śmierć komórki. Następnego ranka usuń pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką E8.
   UWAGA: Nawet w optymalnych warunkach iPSC mają tendencję do słabej regeneracji po krioprezerwacji. Zaleca się kriokonserwację prawie zlewającego się 6-dołka do przyszłego wysiewu do pojedynczego 6-dołka. Obecność resztek komórkowych jest normalna przez pierwsze 2-3 dni podczas odzyskiwania komórek.
5. Wymieniaj pożywkę E8 codziennie, aż komórki będą gotowe do pasażowania (70%-80% konfluencji).
6. Aby przejść, najpierw przygotuj studzienki pokryte witronektyną (jak opisano w kroku 2.1).
   1. Gdy studzienki pokryte witronektyną są gotowe (około 1 godzina), odessać pożywkę E8 z dołka, który ma być przepuszczony, i przemyć dwukrotnie 1 ml DPBS. Inkubować z 1 ml 0,5 mM EDTA przez 5–7 minut w temperaturze 37 °C. Podczas inkubacji usunąć roztwór witronektyny z nowo pokrytej studzienki i zastąpić 1–2 ml pożywki E8.
   2. Usunąć roztwór EDTA z dołków, które mają być przepuszczone i odłączyć kolonie, delikatnie przemłukując raz lub dwa razy 1 ml E8. Przenieść 75-200 μl zawiesiny komórek do świeżo pokrytych studzienek zawierających E8, zamieszać płytkę, aby zapewnić równomierne pokrycie, i natychmiast umieścić w inkubatorze.
      UWAGA: Czas inkubacji w przypadku odwarstwienia iPSC jest zależny od linii komórkowej; zaleca się, aby użytkownik tego protokołu testował zakres razy po wystarczającym rozszerzeniu odbieranej/wygenerowanej linii iPSC. 75 μl zawiesiny komórkowej zwykle daje 4 dni między pasażami; 150 μl lub więcej prowadzi do 2-3 dni między pasażami.

3. Generacja komórek progenitorowych śródbłonka pochodzących z iPSC (Rysunek 1).

1. Utrzymując iPSC, upewnij się, że kolonie są dobrze zagęszczone i że w hodowli jest niewielka liczba zróżnicowanych komórek. Jeśli kolonie zaczną się ze sobą kontaktować, najprawdopodobniej komórki są zbyt zlewające się i muszą zostać natychmiast przeprowadzone.
2. Gdy iPSC są zlewne w 70%-80%, pokryj 24-dołkową płytkę galaretowatą mieszanką białek (przygotowaną zgodnie z opisem w 1.2/1.3). Odpipetować 250 μl tej mieszaniny do każdego dołka i przechowywać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
3. Podczas powyższej 1-godzinnej inkubacji wyjmij odpowiednio pożywkę E8 i Y-27632 z lodówki i zamrażarki. Gdy pożywka E8 i Y-27632 osiągną temperaturę pokojową, przygotuj E8 + ROCKi, dodając 13 μL 10 μM Y-27632 do 13 ml E8 w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
4. Usunąć pożywkę E8 z dołków iPSC, przemyć dwukrotnie 1 ml DPBS, a następnie inkubować z 0,5 mM EDTA przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C. Po okresie inkubacji usunąć EDTA i szybko ścinać komórki do zawiesiny jednokomórkowej za pomocą końcówki pipety P1000 z 1 ml pożywki E8 + ROCKi.
5. Policz komórki za pomocą hemocytometru. W przypadku zawiesiny, która może zawierać miliony iPSC, dodać 20 μl zawiesiny komórek do 180 μl błękitu trypanowego. Określ całkowitą liczbę komórek w zawiesinie jednokomórkowej.
6. Przenieś 0,432 x 10⁶ do 1,296 x 10⁶ komórek (10⁴ do 3 x 10⁴ komórek/cm²) do pozostałego podłoża E8 + ROCKi. Usunąć galaretowatą powłokę mieszaniny z nowo pokrytej płytki 12-dołkowej i dodać 500 μl zawiesiny komórek do każdego dołka, upewniając się, że komórki są dobrze rozmieszczone i nie tworzą małych grudek.
   UWAGA: Ten zakres gęstości jest optymalny dla różnicowania komórek CD34-dodatnich; Jednak te gęstości wysiewu są zależne od linii komórkowej i mogą wymagać optymalizacji przez użytkownika tego protokołu.
7. Po 24 godzinach hodowli zastąpić pożywkę 500 μl świeżej pożywki E8. Inkubować przez dodatkowe 24 godziny w tych samych warunkach.
8. Usuń pożywkę E8 i zastąp ją LaSR Basal uzupełnioną 6-12 μM CHIR99021. Ten punkt czasowy jest zdefiniowany jako D0 różniczkowania. Po 24 godzinach hodowli zastąp taką samą pożywką do hodowli komórkowych.
   UWAGA: Jak opisano wcześniej, ilość CHIR99021 dodawanej do tego podłoża będzie zależeć od używanej linii iPSC. Przetestuj zakres stężeń CHIR99021, aby zapewnić optymalne wyniki.
9. Po 48 godzinach inkubacji z CHIR99021 zastąpić 1 ml LaSR Basal.
10. Zastąp pożywkę dziennie 2 ml LaSR Basal na dodatkowe 2-3 dni. W tym punkcie czasowym (D5 różnicowania) znaczna część tych komórek będzie wyrażać CD34 i można je scharakteryzować jako komórki progenitorowe śródbłonka. Schemat tego protokołu jest opisany wraz z reprezentatywnymi wynikami w Rysunek 1 i opisany w pełni przez badaczy, którzy jako pierwsi opublikowali tę metodę ^11,19.
    UWAGA: Ci przodkowie śródbłonka mogą być dalej różnicowani wzdłuż linii śródbłonka (35%-99%) lub linii mięśni gładkich (1%-65%). Skuteczność różnicowania różni się w zależności od rodzaju powłoki ECM i pożywki do hodowli komórkowej użytej podczas różnicowania ²⁰.

4. FACS komórek progenitorowych śródbłonka

1. Przed dysocjacją zróżnicowanych komórek D5/D6 należy przygotować bufor sortujący zgodnie z opisem w kroku 1.8 i przechowywać na lodzie.
2. Inkubować zróżnicowane komórki z 250 μl roztworu do oddzielania komórek na basenik (patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
3. Dysocjuj komórki za pomocą końcówki pipety P1000 do zawiesiny pojedynczej komórki w roztworze do odłączania komórek. Skonsolidować mieszaninę roztworu do odrywania komórka-komórka w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 300 x g.
4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl lodowatego buforu sortującego (przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 1.7. Dodać 5 μl stężonego przeciwciała CD34-PE do zawiesiny buforowej do sortowania komórek i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
5. Ponownie zawiesić w 5 ml lodowatego buforu sortującego. Przefiltrować tę zawiesinę przez sitko komórkowe z nasadką 40 μm przed umieszczeniem jej w sortowniku.
6. Na odpowiednim kanale fluorescencyjnym posortuj 10 000 komórek, które nie zostały oznaczone przeciwciałem fluorescencyjnym. Bramka regionu o wysokiej intensywności fluorescencji, który nie zawiera żadnej z tych 10 000 komórek (Rysunek 1D). Będzie to służyć jako kontrola negatywna.
7. Uruchomić próbkę zawierającą iPSC-EP znakowaną roztworem fluorescencyjnym i rozpocząć sortowanie. CD34 ulega silnej ekspresji w tych śródbłonkowych komórkach progenitorowych i łatwo oddziela się od głównej populacji. Po posortowaniu przenieść roztwór do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 300 x g. Usunąć supernatant.
   UWAGA: Jeśli roztwór znajduje się w probówce większej niż probówka do mikrowirówki (np. probówka polistyrenowa o pojemności 5 ml powszechnie stosowana w wielu protokołach FAC), ponownie zawiesić posortowane komórki w 1 ml buforu sortującego i przenieść ten roztwór do probówki mikrowirówkowej. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i usunąć supernatant.
   1. Opcjonalnie: jeśli pożądana jest dalsza charakterystyka iPSC-EP, dodaj inne przeciwciała pierwszorzędowe (np. CD31-APC) jednocześnie z CD34-PE. Upewnij się, że przesłuchy między różnymi kanałami fluorescencyjnymi są zminimalizowane.

5. Enkapsulacja i długoterminowa hodowla hydrożeli kolagenowych zawierających iPSC-EP

1. Przygotować pożywkę wysiewną, dodając 40 μl 10x pożywki 199 do 400 μl śródbłonkowej pożywki wzrostowej (EGM-2) uzupełnionej 10 μM Y-27632 w mikrowirówce o pojemności 1,8 ml i umieścić probówkę na lodzie.
   UWAGA: Chociaż odradza się stosowanie antybiotyków w hodowli komórek macierzystych i utrzymaniu zróżnicowanych komórek, zaleca się dawkowanie Pen/Strep po sortowaniu, ponieważ trudno jest zagwarantować sterylność w środowisku sortowania (jest to bardziej konieczne, jeśli sorter jest współdzielony przez wiele laboratoriów).
2. Usunąć cały supernatant z zawiesiny komórkowej i dodać 200 μl EGM-2 uzupełnionego 10 μM Y-27632. Przenieść zawiesinę komórkową na podłoże wysiewne i energicznie wymieszać.
3. Dodać 350 μl kolagenu do roztworu przygotowanego w kroku 5.2 i dobrze wymieszać. Roztwór stanie się bladożółty.
   UWAGA: Końcowe stężenie kolagenu może mieć znaczący wpływ na tworzenie się splotu naczyń włosowatych. Protokół ten zakłada, że kolagen został dostarczony w ilości 10 mg/ml, a hydrożele mają końcowe stężenie 3,5 mg/ml. Dostosuj te objętości, aby osiągnąć ich końcowe stężenie kolagenu; zaleca się ograniczenie końcowego stężenia kolagenu z 2 mg/ml do 4 mg/ml.
4. Dodać 5 μl 1M NaOH do roztworu przygotowanego w 5.3 i dobrze wymieszać, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Roztwór stanie się jasnoróżowy.
5. Odpipetować 56 μl zobojętnionego roztworu komórek kolagenowych przygotowanego w 5,4 do indywidualnych dołków 96-dołkowej płytki do hodowli komórek w kształcie litery U o bardzo niskim przyłączeniu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Przed dodaniem pożywki należy sprawdzić, czy komórki zostały równomiernie rozłożone, badając próbki pod mikroskopem w jasnym polu.
6. Przygotować 1 ml pożywki hodowlanej składającej się z EGM-2 uzupełnionej 10 μM Y-27632 i 50 ng/ml czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), dodając 1 μl każdego roztworu podstawowego do probówki mikrowirówkowej. Po dokładnym wymieszaniu odpipetować 100 μl tej pożywki do hodowli komórkowych na hydrożele zawierające komórki. Przenieść płytkę do temperatury 37 °C w celu długotrwałej hodowli.
7. Codziennie wymieniaj pożywkę hodowlaną, dodając dodatkowe angiogenne czynniki wzrostu lub inhibitory małocząsteczkowe, zgodnie z celem badania. Aby optymalnie usunąć pożywkę, przechyl płytkę i użyj końcówki P100, aby delikatnie zassać podłoże bez naruszania hydrożelu.

6. Utrwalanie, barwienie immunologiczne i wizualizacja sieci naczyniowych opartych na EP

1. Po tygodniu hodowli dodaj 250 μl 4% roztworu paraformaldehydu (PFA) do 48-dołkowej płytki. Napełnij tyle studzienek, ile jest hydrożeli. Usuń pożywkę z hydrożeli (PFA) i użyj pęsety z cienką końcówką, aby przenieść hydrożele do studzienek zawierających PFA. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć PFA przez szybkie przemycie PBS.
2. Przepuszczalność przez dodanie 250 μl 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć dwukrotnie 250 μl PBS uzupełnionego 300 mM glicyny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut na każdym etapie prania, aby zapewnić usunięcie nadmiaru detergentu. Blokować, zanurzając hydrożele w 250 μl buforu blokującego na 30 minut.
3. Inkubować z pożądanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C. Na przykład, w przypadku barwienia immunologicznego falloidyną i kadheryną VE, rozcieńczyć odpowiednio 1:40 i 1:200 w buforze blokującym.
4. Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć dwukrotnie 0,5% odczynnikiem emulgującym w DPBS. Przykryj folią aluminiową i inkubuj z przeciwciałem drugorzędowym specyficznym dla gatunku (np. 1:200 Alexa Fluor 488 w PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
5. Usunąć wtórny roztwór przeciwciała i przemyć dwukrotnie 0,5% odczynnikiem emulgującym w DPBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut na każdym etapie mycia, aby zapewnić usunięcie wolnych fluoroforów.
6. Aby uwidocznić jądra komórkowe, rozcieńczyć 4', 6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) 1:10000 w PBS i dodać do próbki (próbek).
   1. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i dwukrotnie przemyć PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut na każdym etapie mycia, aby zapewnić usunięcie wolnych fluoroforów.
7. Przenieś próbki do szkiełka do angiogenezy μ-Slide lub na płytkę Petriego ze szklanym dnem za pomocą pęsety z cienką końcówką. Upewnij się, że pod hydrożelem nie są uwięzione pęcherzyki powietrza.
8. Obraz pod mikroskopem konfokalnym poprzez uzyskanie stosów Z, które rozciągają się od dołu do góry próbki. Upewnij się, że detektor nie jest nasycony i że używane jest najmniejsze dostępne powiększenie (pożądane jest duże pole widzenia).
   UWAGA: Do przyszłego przetwarzania upewnij się, że stosy z są zapisane z minimalną kompresją (np. .czi).

7. Wykorzystanie potoku obliczeniowego do analizy i porównania topologii sieci naczyniowych

1. Sprawdź każdy stos z, aby upewnić się, że plasterki zawierają tylko naczynia. Otwórz stos z w ImageJ i zwiększ kontrast, klikając Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast. Granice statków są teraz wyraźnie wyznaczone, a poziom tła jest zminimalizowany. Często wymiary z nie pasują do wymiarów x/y. Aby rozwiązać ten problem, kliknij opcję Obraz > Dostosuj rozmiar > i zmień liczbę plasterków z tak, aby odległość między każdym plasterkiem była równa jednemu pikselowi w x/y. ImageJ będzie interpolować automatycznie. Jeśli ten krok nie zostanie wykonany poprawnie, końcowe woluminy 3D będą wyświetlane jako skompresowane.
   UWAGA: EC będą migrować w kierunku krawędzi żelu i utworzą małe kolonie kostki brukowej. Chociaż są one przydatne do oszacowania granic hydrożelu, będą zakłócać końcową analizę obrazu i powinny zostać usunięte.
   UWAGA: ImageJ to oparte na Javie oprogramowanie do analizy obrazów typu open source, opracowane wspólnie przez National Institutes of Health i Laboratory for Optical and Computational Instrumentation. Zaleca się pobranie Fiji, który jest po prostu ImageJ w pakiecie z przydatnymi wtyczkami (https://fiji.sc/).
2. W ImageJ rozmyj obraz w 3 wymiarach, klikając opcję Process > Filters > Gaussian Blur 3D, a następnie ustawiając wartości sigma we wszystkich 3 wymiarach na 2,0 (ta wartość może wymagać dostosowania przez użytkownika końcowego).
3. W programie ImageJ kliknij pozycję Process > Binary (Przetwarzaj binarny) > opcję Make Binary (Utwórz binarny), a następnie wybierz odpowiedni algorytm progowania. Algorytm progowania entropii krzyżowej opracowany przez Li et al. jest skuteczny w oddzielaniu naczyń od tła²¹. Oblicz próg dla każdego obrazu i ustaw tło na "Domyślne".
4. W ImageJ usuń fałszywy szum i wypełnij "" w lumenach, klikając Przetwarzaj > szum > Usuń wartości odstające.
   UWAGA: Usunięcie "jasnych" wartości odstających wypełni małe w połączonych naczyniach; Usunięcie "ciemnych" wartości odstających spowoduje usunięcie martwych komórek. Wielkość promienia usuwania będzie się różnić w zależności od powiększenia i wielkości naczyń. W przypadku obrazów uzyskanych obiektywem szerokokątnym o wymiarach 512 x 512 pikseli promienie zwykle wynoszą od 4 do 6 pikseli.
5. Przetwórz wszystkie pliki RAW (np. rozszerzenie czi) i przekonwertuj na pliki .tif przed przejściem do kroku 7.6. Aby pomóc w tym przetwarzaniu, do tego rękopisu dołączono skrypt ImageJ "Binarize and Filter.ijm".
6. Przetworzone pliki .tif należy zapisać w tym samym folderze, co plik "BatchProcessSkeleton.m", dostępny do pobrania w rękopisie. Ten skrypt, opracowany przez autorów, wywołuje funkcje opublikowane przez Phillipa Kollmannsbergera²² i przeprowadza dodatkową manipulację plikami.
7. Pobierz i rozpakuj wszystkie pliki powiązane z dwiema głównymi funkcjami "Skel2Graph3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43527-skel2graph-3d) i "Skeleton3D" (https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/43400-skeleton3d). Zapisz wszystkie funkcje w tym samym folderze, w którym otwarty jest przetworzony stos z.
8. Otwórz wieloparadygmatowe środowisko obliczeń numerycznych (patrz Spis materiałów) i przejdź do folderu, w którym zostały zapisane wszystkie opisane powyżej pliki.
9. Uruchom polecenie "BatchProcessSkeleton.m", wpisując BatchProcessSkeleton w oknie poleceń lub otwierając skrypt i naciskając przycisk Uruchom (zielona strzałka skierowana w prawo) w Editor.
   UWAGA: Aby przeanalizować duży zestaw danych za pomocą jednego polecenia, upewnij się, że ciąg wewnątrz funkcji dir w wierszu 6 zawiera gwiazdkę (np. '*.tif'). W przeciwnym razie zastąp gwiazdkę nazwą pliku, jeśli pożądana jest analiza pojedynczego pliku.
10. Czas potrzebny na wykonanie tego skryptu będzie się znacznie różnić w zależności od dostępnej mocy obliczeniowej. Zaleca się przeprowadzenie tej analizy na komputerze z co najmniej 8 GB pamięci RAM, aby użytkownik mógł uzyskać dostęp do innych programów podczas działania skryptu.
    UWAGA: Chociaż nie jest to absolutnie konieczne, sporządzenie wykresu oryginalnej akwizycji konfokalnej (w kolorze szarym) i nałożenie tej matrycy obrazu na macierz szkieletu (w kolorze czerwonym) może pomóc w ocenie wydajności algorytmu szkieletyzacji. Ponadto czytnik może utworzyć wykres węzłowy, zaimplementowany przez Kollmannsbergera i wsp., w celu oceny dokładności analizy sieci. Utworzenie obu wykresów, choć przydatne, znacznie wydłuży czas działania skryptu i będzie wymagało dodatkowej pamięci; Jeśli użytkownik po prostu potrzebuje końcowej analizy topologii i nie chce wizualizować zestawu danych, po prostu zakomentuj linie od 44 do 61 (wykres szkieletowy) i wiersze od 104 do 143 (wykres topologii).
11. Po zakończeniu macierz danych, widoczna w obszarze roboczym, zawiera teraz przetworzone dane. Kliknij dwukrotnie Dane i otwórz tę komórkę w edytorze zmiennych.
    1. Zauważ, że ta macierz będzie zawierać, od lewej do prawej: 1) nazwę pliku, 2) liczbę węzłów (punkty rozgałęzień + punkty końcowe), 3) punkty rozgałęzień, 4) połączenia (tj. naczynia), 5) długość sieci (w tym naczynia izolacyjne) i 6) liczbę wycinków zawartych w stosie z. Zapisz te dane jako plik .csv i wyeksportuj do dalszej analizy do dowolnego wybranego oprogramowania.

Wyniki

Po różnicowaniu (Rysunek 1), FACS i enkapsulacji iPSC-EP w hydrożelach kolagenowych, komórki zazwyczaj pozostają zaokrąglone przez 24 godziny, zanim zaczną migrować i tworzyć początkowe lumeny. Po około 6 dniach hodowli prymitywny splot kapilarny będzie widoczny w hydrożelu podczas oglądania pod mikroskopem jasnego pola (Ryc. 2). Po zobrazowaniu utrwalonych, barwionych hydrożeli obciążonych komórkami pod mikroskopem konfokalnym (film 1, film...

Dyskusja

Protokół ten obejmuje długoterminową hodowlę komórek w trzech typach pożywek do hodowli komórkowych: E8, LaSR Basal i EGM-2. Dlatego należy dołożyć wszelkich starań, aby odpowiednio wysterylizować wszystkie materiały. Ponadto fartuchy laboratoryjne i rękawice oczyszczone etanolem powinny być zawsze noszone podczas pracy w kapturze z przepływem laminarnym laboratorium. Zaleca się częste przeprowadzanie testów na obecność zakażenia mykoplazmą; jeśli podczas hodowli iPSC zaobserwuje się dużą ilość zanieczyszczeń lub odnotuj...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	Płaska, szklana płytka do hodowli tkankowej ze ściankami bocznymi umożliwia łatwe obrazowanie konfokalne
96 dołków, okrągłe dno, mikropłytka o bardzo niskim mocowaniu, sterylna	Corning	7007	Zapobiega wiązaniu się hydrożeli kolagenowych obciążonych komórkami z naczyniem do hodowli komórkowej
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Delikatny roztwór do odrywania komórek; nie degraduje epitopów zewnątrzkomórkowych niezbędnych dla FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	Podłoże bazowe do różnicowania iPSC-EP.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	; inne można łatwo zastąpić
Roztwór albuminy surowicy bydlęcej, 7,5% w DPBS, sterylnie filtrowany, BioXtra, odpowiedni do hodowli komórkowych	Fisher Scientific	A8412	Aby zachować żywotność komórek podczas sortowania FAC
CD34-PE, człowiek (klon: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Przeciwciało stosowane do izolacji FAC iPSC-EP
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Indukuje tworzenie mezodermy z pluripotencjalnych komórek macierzystych
Kolagen I Ogon szczura Wysoka zawartość białka 100 mg	VWR	354249	Główny składnik mikrośrodowiska 3D
Stożkowe probówki wirówkowe (15/50 ml)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Służy do przechowywania i mieszania stosunkowo dużych ilości odczynników i pożywek
do hodowli komórkowychDAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Do przeciwbarwienia i wizualizacji jąder komórkowych
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	Do rozcieńczania Matrigelu i rozmrażania pluripotencjalnych komórek macierzystych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	Do mycia kultur jednowarstwowych
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	Do pasażowania pluripotencjalnych kolonii komórek macierzystych i zapobiegania agregacji komórek podczas sortowania FAC
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka 2	PromoCell	C-22011	Wspomaga żywotność i proliferację komórek śródbłonka
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Do utrzymania pluripotencjalnych komórek macierzystych
Glicyna,BioUltra, do biologii molekularnej, >=99,0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutralizuje pozostały detergent
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydrat soli, >=95%	Sigma-Aldrich	A8960	Składnik podłoża różnicującego iPSC-EP
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Wieloparadygmatowe środowisko obliczeń numerycznych (bezpłatne dostępne w większości instytucji akademickich)
Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 ml (galaretowata mieszanina białek)	Fisher Scientific	356231	Rozcieńczony w DMEM/F12 do powlekania płytek w celu różnicowania iPSC-EP
Medium-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Służy do równoważenia końcowej osmolarności hydrożelowej i pH
Probówki do mikrowirówek (1,7 ml)	VWR	87003-294	Przechowuje małe ilości odczynników
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	Główny składnik roztworów do barwienia immunologicznego
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antybiotyk stosowany po sortowaniu w celu usunięcia ewentualnego zanieczyszczenia z instrumentu FACS
Rekombinowane ludzkie białko VEGF 165 R	& D Systems	293-VE	Mitogen, który stymuluje proliferację komórek śródbłonka i tubuogenezę
Rodamina falloidyna	Themo Fisher Scientific	R415	Aby zidentyfikować osadzanie się F-aktyny, a tym samym nakreślić granice sieci naczyniowych
Triton X-100 (niejonowy środek powierzchniowo czynny)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergent stosowany do delikatnej przepuszczalności komórek
Tween-20 (odczynnik emulgujący)	Fisher Scientific	BP337	Zwiększa swoistość wiązania dodanych przeciwciał
VE-Cadherin (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	Identyfikacja światła śródbłonka 3D w hydrożelach kolagenowych
Vitronectin	ThermoFisher	A14700	Do utrzymania pluripotencjalnych komórek macierzystych
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Zachowuje żywotność pluripotencjalnych komórek macierzystych i iPSC-EP po dysocjacji i ponownym wysianiu