Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.
Artykuł metodologiczny
Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie interakcji międzykomórkowych często wymaga dyskretnego etykietowania określonych populacji komórek i precyzyjnej lokalizacji białek. Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym narzędziem do badania takich interakcji z modelem in vivo. Testy immunohistochemiczne i immunofluorescencyjne są często stosowane w zarodkach danio pręgowanego w celu oceny ekspresji białek. Jednak uzyskanie dokładnego mapowania kolokalizowanych białek w przestrzeni trójwymiarowej może być trudne. Ponadto niektóre badania mogą wymagać użycia dwóch przeciwciał, które nie są zgodne z tą samą techniką (np. przeciwciało 1 nadaje się tylko do immunohistochemii, a przeciwciało 2 nadaje się tylko do immunofluorescencji). Celem metody opisanej w niniejszym dokumencie jest przeprowadzenie sekwencyjnej immunofluorescencji i/lub immunohistochemii na poszczególnych kriosekcjach pochodzących z zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju. Tutaj opisujemy zastosowanie sekwencyjnych rund immunofluorescencji, obrazowania, immunohistochemii, obrazowania dla pojedynczej kriosekcji w celu uzyskania precyzyjnej identyfikacji ekspresji białka na poziomie pojedynczej komórki. Metodologia ta jest odpowiednia dla każdego badania na zarodkach danio pręgowanego we wczesnym stadium, które wymaga dokładnej identyfikacji wielu celów białkowych w poszczególnych komórkach.
Wprowadzenie
Danio pręgowany to niezwykle wytrzymały organizm modelowy, który jest obecnie wykorzystywany w wielu różnych dyscyplinach w badaniach biomedycznych. W szczególności szybki rozwój zewnętrzny i przezierność zarodków danio pręgowanego stanowią doskonałe narzędzie do badań in vivo. W niniejszym artykule opisano metodę sekwencyjnych analiz immunofluorescencyjnych (IF) i immunohistochemicznych (IHC) zarodków danio pręgowanego poddanych kriosekcji. Ta nowatorska procedura wykorzystuje sekwencyjne nakładanie dwóch przeciwciał na jednym szkiełku, umożliwiając dokładną identyfikację kolokalizowanych białek na poziomie komórkowym przy jednoczesnej ochronie skrawków tkanki. Protokół ten jest szczególnie przydatny w badaniach na modelu danio pręgowanego, ponieważ stosunkowo niewielka liczba przeciwciał została zwalidowana do stosowania w zastosowaniach IF i/lub IHC u danio pręgowanego w porównaniu z modelami myszymi.
Obserwacja interakcji międzykomórkowych jest kluczowym elementem wielu badań i może dostarczyć kluczowych informacji na temat mechanizmów molekularnych działających na poziomie komórkowym, które leżą u podstaw fenotypów na poziomie organizmu. Ponadto ekspresja białek może dostarczyć informacji o funkcji komórki, zwłaszcza podczas badania ekspresji wielu białek jednocześnie w komórce (kolokalizacja). Chociaż całościowe IHC i IF są powszechnie stosowanymi technikami analizy ekspresji białek w zarodkach danio pręgowanego1,2,3,4,5, procedury całego montażu mogą być problematyczne dla uzyskania precyzyjnych danych kolokalizacji. Z naszego doświadczenia wynika, że rozróżnienie warstw tkanki i wizualizacja ekspresji białek na poziomie pojedynczej komórki w próbkach z całego montażu może być trudne. Programy do obrazowania mogą na ogół nie być w stanie odróżnić barwienia powierzchni od głębszego barwienia. Ekspresje białek niena poziomie powierzchni mogą być przesłonięte przez jaśniej wyrażoną ekspresję na poziomie powierzchni, co prowadzi do niedokładności w kwantyfikacji. Dodatkowo, większość tradycyjnych metod usuwania danio pręgowanego jest dość toksyczna6 i dlatego jest mniej pożądana w użyciu.
Techniki oparte na przeciwciałach, takie jak IF i IHC, są często używane do wykrywania ekspresji białek w podzielonym materiale, upraszczając identyfikację odrębnych populacji komórek, które wyrażają określone białko w złożonych tkankach. IHC jest powszechnie stosowany do kolokalizacji, najczęściej przy użyciu dwóch różnych przeciwciał skoniugowanych w różnych gatunkach gospodarzy i wizualizowanych za pomocą różnych kolorowych chromogenów4,7,8,9,10. Jednak używanie wielu chromogenów może prowadzić do niespecyficznego barwienia tła lub niezgodności kolorów11,12.
Opracowaliśmy nowy protokół wykrywania wielu białek za pomocą sekwencyjnych IF i IHC na kriosekcji zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium. Kriosekcja jest szczególnie odpowiednia dla delikatnych tkanek, takich jak zarodki danio pręgowanego, a kriosekcje są lepsze niż skrawki zatopione w parafinie w testach opartych na fluorescencji13,14. Zdecydowaliśmy się zoptymalizować połączone IF i IHC zamiast dwukolorowego IF lub IHC, aby obejść problem niezgodności przeciwciał dla jednego typu testu. Problemy te są szczególnie istotne w przypadku badań z udziałem danio pręgowanego ze względu na ograniczoną liczbę dostępnych na rynku przeciwciał, które są zatwierdzone do stosowania u danio pręgowanego. W rzeczywistości badanie przeprowadzone na czterech dużych firmach wykazało, że komercyjnie dostępnych przeciwciał do stosowania u myszy było około 112 000 w porównaniu z około 5 300 do stosowania u danio pręgowanego15. Ostatecznie zdecydowaliśmy się opracować protokół, który można wykonać na pojedynczej kriosekcji, co jest niezbędne podczas pracy z małymi lub ograniczonymi próbkami tkanek, takimi jak te uzyskiwane z zarodków danio pręgowanego.
Ten protokół został zaprojektowany do oceny zachowania proliferacyjnego komórek dawcy w 48 godzinach po zapłodnieniu chimerycznych zarodków danio pręgowanego, które zostały wygenerowane przez przeszczep blastuli do blastuli, jak opisali Carmany-Rampey i Moens16. Zarodki dawcy wstrzykiwano w stadium jednokomórkowym za pomocą znakowanego fluorescencyjnie koniugatu dekstranu przed przeszczepieniem komórek dawcy do zarodków biorcy. Zastosowaliśmy immunofluorescencję dla fosforylowanego histonu H3 Ser 10 (pH3) w celu wykrycia proliferujących komórek, a następnie immunohistochemię dla znakowanego dekstranu w celu wykrycia komórek dawcy w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego. Sekwencyjne wykrywanie pH3 i znakowanego dekstranu w ramach jednej kriosekcji umożliwiło nam identyfikację i ilościowe określenie poszczególnych komórek, które wykazywały ekspresję obu markerów.
Ten sekwencyjny protokół IF/IHC dla kriosekcyjnego danio pręgowanego będzie użytecznym narzędziem dla badaczy danio pręgowanego, którzy pragną protokołu kolokalizacji dla ekspresji białek. Problemy, które ten protokół miał rozwiązać, takie jak małe próbki tkanek i ograniczona dostępność przeciwciał, nie są unikalne dla modelu danio pręgowanego. Metoda ta może być zatem przydatna dla każdego badacza pragnącego przeprowadzić sekwencyjne IF/IHC.
OŚWIADCZENIE ETYCZNE:
Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Protokół
1. Przygotowanie zarodków
- Utrwalić 48 godzin po zapłodnieniu (hpf) chimeryczne zarodki danio pręgowanego wygenerowane przez przeszczep blastuli do blastuli między zarodkami AB danio pręgowanego typu dzikiego w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez noc z kołysaniem w temperaturze 4 °C. Wykonaj dwa 5-minutowe płukania z kołysaniem w temperaturze pokojowej przy użyciu 500 μL 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem zawierającej 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (1x PBSt; patrz Tabela Materiałów)
nuta: Paraformaldehyd jest toksyczny i rakotwórczy i musi być odpowiednio utylizowany zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Praca z paraformaldehydem powinna być wykonywana w kapturze chemicznym i zawsze należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). - Odwodnić zarodki, przemłukując je sekwencyjnie 500 μl 30%, 50% i 70% metanolu (MeOH) rozcieńczonego 1x PBSt przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Inkubować zarodki w 500 μl 100% MeOH w temperaturze -20 °C przez co najmniej 14 godzin
nuta: Metanol jest toksyczny i musi być odpowiednio utylizowany zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Praca z metanolem powinna być wykonywana w kapturze chemicznym i zawsze należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). - Nawodnij zarodki, myjąc sekwencyjnie 500 μl 70%, 50% i 30% MeOH rozcieńczonych 1x PBSt przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Wykonaj dwa 5-minutowe prania z 500 μL 1x PBSt w temperaturze pokojowej z bujaniem.
- Usunąć 1x PBSt i inkubować w 500 μl 30% sacharozy rozcieńczonej dejonizowaną wodą o temperaturze pokojowej z kołysaniem, aż zarodki opadną na dno probówki (około 1 godzina). Zastąp sacharozę 500 μl 15% żelatyny rybnej/25% sacharozy (15/25; patrz Tabela Materiałów) i inkubuj w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez noc.
- Zastąp około połowy objętości 15/25 pożywką o optymalnej temperaturze cięcia (pożywką OCT) i inkubuj w temperaturze pokojowej z kołysaniem, aż zarodki opadną na dno probówki (około 1 godzina).
- Zastąp około połowy objętości pożywką OCT i inkubuj w temperaturze pokojowej z kołysaniem przez 1 godzinę. Powtórz ten krok jeden raz.
- Podczas etapów inkubacji z pożywką 15/25 i OCT należy odwrócić lub przesunąć probówkę w razie potrzeby, aby połączyć te odczynniki.
2. Osadzanie zarodków i przygotowanie kriosekcji
- Przenieś zarodki do plastikowej formy (patrz tabela materiałów) za pomocą kleszczy, minimalizując transfer mieszaniny 15/25-OCT. Napełnij formę mniej więcej do połowy pożywką OCT i delikatnie wymieszaj zarodki w pożywce OCT.
- Przygotuj oznakowane plastikowe foremki i przenieś pożądane zarodki (zwykle 1-3 zarodki) do pustych, oznakowanych plastikowych foremek, minimalizując przenoszenie pożywki OCT. Gdy pożądane zarodki znajdą się w plastikowej formie, delikatnie napełnij pożywką OCT do górnej części formy.
- Użyj kleszczy lub igieł 25 G, aby ułożyć zarodki w pożądanej orientacji, używając lekkiego mikroskopu stereoskopowego do wizualizacji (Rysunek 1A,B).
- Przygotowane foremki zamrozić na suchym lodzie w izolowanym pojemniku z metalową platformą. Delikatnie umieść wiaderko na lód lub chłodziarkę do pianki na metalowej platformie, aby utworzyć zimną komorę (Rysunek 1C,D)
- Przygotować kriosekcje o grubości 10\12 μm za pomocą kriostatu ustawionego na -20 °C.
- Ustaw jeden blok na raz i użyj pożywki OCT, aby zamrozić blok na dysku/uchwycie z dolną częścią bloku skierowaną w stronę ostrza (Rysunek 2A). Upewnij się, że blok jest całkowicie przymrożony do dysku (podłoże OCT zmieni kolor na biały) przed rozpoczęciem cięcia (Rysunek 2B).
- Umieść kriosekcje na naładowanych szkiełkach (Rysunek 2C, D) i wysusz szkiełka na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej.
3. Immunofluorescencja dla pH3
- Wykonaj trzy 5-minutowe płukania szkiełek w 1x PBS w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin. Jeśli chusteczki nie są dobrze przylegające do szkiełka, należy przeprowadzić płukanie, kładąc szkiełka na płaskiej powierzchni i delikatnie pipetując 500 μl 1x PBS na powierzchnię. Wylej 1x PBS między praniami, delikatnie przechylając szkiełka.
- Obrysuj sekcje pisakiem barierowym lub ołówkiem woskowym, aby utrzymać płyn na szkiełkach (Rysunek 3).
- Ułożyć szkiełka na płaskiej powierzchni w wilgotnej komorze i odpipetować 200 μl buforu blokowego na sekcję na szkiełka. Inkubować w buforze blokowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przygotować rozcieńczenie przeciwciała pierwotnego (przeciwciało anty-pH królika, 1:200; patrz Tabela Materiałów) w buforze blokowym i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Delikatnie przechylić szkiełka, aby spuścić bufor blokowy, wrócić do wilgotnej komory i odpipetować 200 μl roztworu przeciwciał pierwotnych na sekcję na szkiełka. W przypadku kontroli tylko wtórnej należy odpipetować 200 μl bufora blokowego na odpowiednie sekcje.
- Inkubować szkiełka w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze wypełnionej wodą dejonizowaną. Uszczelnij krawędzie wilgotnej komory, aby zatrzymać wilgoć.
- Wykonaj trzy 5-minutowe płukania szkiełek w 1x PBS w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin. Podczas etapów płukania należy przygotować rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowych (koniugat przeciwciała przeciw fluorescencyjnemu fluorescencyjnemu przeciwciału drugorzędowemu przeciwko królikowi, 1:2 000; patrz Tabela Materiałów) w buforze blokowym i dobrze wymieszać przez pipetowanie.
- Położyć szkiełka na płaskiej powierzchni w wilgotnej komorze i odpipetować 200 μl roztworu przeciwciał wtórnych na sekcję na szkiełka. Inkubować szkiełka w wtórnym roztworze przeciwciał w temperaturze pokojowej, osłonięty przed światłem, przez 30 minut.
- Wykonaj trzy 5-minutowe płukania szkiełek w 1x PBS w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik z Coplinu, osłonięty przed światłem. Podczas etapów mycia przygotuj roztwór do barwienia jądrowego (patrz tabela materiałów).
- Umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i odpipetuj 200\u2012500 μl (w zależności od wielkości próbki) roztworu do barwienia jądrowego na każdą sekcję. Inkubować szkiełka w roztworze do barwienia jądrowego przez 10 minut, w osłonie przed światłem.
- Odcedź roztwór do barwienia jądrowego i zamontuj szkiełka za pomocą nietwardniejących fluorescencyjnych mediów montażowych i szklanego szkiełka nakrywkowego. Szkiełka należy utrzymywać w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu wykonania obrazowania.
nuta: Najlepsze wyniki uzyskuje się, gdy slajdy są obrazowane tego samego dnia lub następnego dnia. - Po IF, wizualizuj i zobrazuj preparaty za pomocą konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego i kamery cyfrowej przy użyciu filtrów emisyjnych 555 nm (czerwony) i 645 nm (dalekiej czerwieni) przy 100-krotnym powiększeniu (10-krotne powiększenie gałki ocznej i 10-krotne powiększenie obiektywu). Utrzymuj stałą moc lasera podczas całego obrazowania.
- Po zobrazowaniu umieścić szkiełka w oddzielnych pojemnikach po 1x PBS i przechowywać na płasko w temperaturze 4 °C przez noc, aby przygotować się do usunięcia szkiełka nakrywkowego. Umieszczając szkiełka w 1x PBS, delikatnie porusz szkiełkami, aby pomóc w wyjęciu szkiełka nakrywkowego.
nuta: Nie dociskaj szkiełka nakrywkowego ani nie próbuj usuwać szkiełka nakrywkowego ręcznie, ponieważ może to pogorszyć jakość sekcji. Szkiełka nakrywkowe należy usuwać poziomo przy minimalnym wymuszonym ruchu.
4. Immunohistochemia znakowanego dekstranu
- Po usunięciu szkiełek nakrywkowych delikatnie przenieś szkiełka do nowego 1x PBS w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin. Usuń 1x PBS i wykonaj trzy 5-minutowe inkubacje szkiełek w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris z 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (1x TBSt) w temperaturze pokojowej.
- Przygotować 250 ml 3% nadtlenku wodoru (H2O2) rozcieńczonego w wodzie dejonizowanej w pojemniku o odpowiedniej wielkości. Inkubować szkiełka w 3% roztworze H2O2 w temperaturze pokojowej przez 15 min.
nuta: Nadtlenek wodoru jest i musi być odpowiednio zutylizowany zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Należy zawsze używać odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). - Szybko spłucz szkiełka wodą dejonizowaną. Wykonaj trzy 5-minutowe płukanie szkiełek w 1x TBSt. Ostrożnie osusz obszar wokół odcinków tkanek i umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze. Obrysuj skrawki tkanki pisakiem barierowym lub ołówkiem woskowym, aby w razie potrzeby utrzymać płyn na skrawkach.
- Na każdą sekcję nanieść kroplami gotowy do użycia 2,5% roztwór blokujący surowicę dostarczony z wtórnym zestawem do znakowania przeciwciał (patrz Tabela Materiałów). Szkiełka należy inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
- Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w rozcieńczalniku przeciwciał (dekstran króliczy znakowany antyznakiem, 1:7,500; patrz Tabela Materiałów) i wymieszać przez delikatne pipetowanie. Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć bufor blokowy, osusz obszar wokół sekcji i umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze.
- Nie myć przed zastosowaniem roztworu przeciwciała pierwotnego. Pobrać pipetę 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na sekcję na szkiełka i inkubować przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C. W przypadku kontroli tylko wtórnej należy pobrać pipetę z 200 μl rozcieńczalnika przeciwciał na odpowiednie sekcje.
- Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć roztwór przeciwciała pierwotnego i umieść w 1x TBSt w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin. Wykonaj dwa 5-minutowe mycie szkiełek w 1x TBSt. Osusz obszar wokół sekcji i umieść płasko w wilgotnej komorze.
- Nałóż kroplami na każdą sekcję gotowy do użycia odczynnik blokujący redukujący tło (patrz Tabela materiałów). Szkiełka należy inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
- Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć bufor blokowy, ostrożnie osusz obszar wokół sekcji i umieść szkiełka płasko w wilgotnej komorze. Nie myć przed nałożeniem roztworu przeciwciał drugorzędowych.
- Kroplami nanieść gotowy do użycia roztwór przeciwciała wtórnego (przeciwciało drugorzędowe polimeru anty-peroksydazy króliczka-chrzanu (HRP); patrz tabela materiałów) do każdej sekcji i inkubować w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Delikatnie przechyl szkiełka, aby odsączyć wtórny roztwór przeciwciał i umieść w 1x TBSt w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin. Wykonaj dwa 5-minutowe mycie szkiełek w 1x TBSt.
- Podłoże chromogenne HRP należy przygotować bezpośrednio przed użyciem zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela Materiałów).
- Osusz obszar wokół sekcji, umieść szkiełka na płaskiej powierzchni i nałóż 200 μl podłoża chromogenicznego HRP na każdą sekcję. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, uruchamiając timer, gdy substrat zostanie nałożony na pierwsze szkiełko (Rysunek 4).
- Odcedź roztwór substratu i krótko spłucz szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 1x PBS. Umieść szkiełka w wodzie dejonizowanej w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin i wykonaj dwa 5-minutowe mycia w wodzie dejonizowanej z delikatnym mieszaniem.
- Przeciwbarwić szkiełka, umieszczając je w roztworze barwiącym hematoksyliną na maksymalnie 30 s.
nuta: Hematoksylina jest toksyczna i musi być utylizowana zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Należy zawsze używać odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). - Umieść szkiełka w wodzie dejonizowanej w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin i wykonaj trzy 5-minutowe mycia w wodzie dejonizowanej. Przenieś szkiełka do pojemnika zawierającego wodę z kranu Scotta (patrz Tabela Materiałów) i inkubuj przez 1 minutę.
- Umieść szkiełka w wodzie dejonizowanej w odpowiednim pojemniku, takim jak słoik Coplin i wykonaj trzy 5-minutowe mycia w wodzie dejonizowanej.
- Odwodnić szkiełka za pomocą szeregu gatunków etanolu (EtOH) (rozcieńczonych w wodzie dejonizowanej) i ksylenu w kapturze chemicznym. Wykonaj jedną 2-minutową inkubację w 70% EtOH, dwie 1-minutową inkubację w 95% EtOH, dwie 1-minutową inkubację w 100% EtOH i trzy 1-minutową inkubację w ksylenie. Zdjąć szkiełka z ksylenu i umieścić szkiełko nakrywkowe, gdy jest mokre z podłożem montażowym na bazie toluenu w kapturze chemicznym.
nuta: Ksylen i toluen są toksyczne i łatwopalne i muszą być odpowiednio utylizowane zgodnie z przepisami instytucjonalnymi. Praca z ksylenem i toluenem powinna być wykonywana w kapturze chemicznym i zawsze należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). - Podążając za IHC, wizualizuj i obrazuj preparaty za pomocą mikroskopu światła złożonego i kamery cyfrowej przy 100-krotnym powiększeniu (10-krotne powiększenie oczne i 10-krotne powiększenie obiektywu). (Rysunek 5).
Wyniki
Opracowaliśmy ten protokół w celu identyfikacji i analizy ekspresji białek w poszczególnych komórkach dawcy w chimerycznych embrionach zebrafish 48 h po zapłodnieniu, które zostały wytworzone poprzez transplantację blastuli do blastuli pomiędzy embrionami zebrafish szczepu AB typu dzikiego. Pomyślna analiza ekspresji białek na poziomie pojedynczej komórki wymagała przygotowania krioprzecięć z odpowiednio zorientowanymi embrionami (Rycina 1 i Rycina 2) oraz starannego, sekwencyjnego zastosowania technik IF i IHC na tych krioprzecięciach (Rycina 3 i Rycina 4). Zastosowanie specyficznych przeciwciał do jednoczesnego wykrywania komórek proliferujących (anty-pH3, Rycina 5A,B) oraz komórek dawcy (anty-znakowany dekstran, Rycina 5D) może służyć do identyfikacji i kwantyfikacji aktywnie proliferujących komórek dawcy (Rycina 5E). Niezbędne jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów zarówno po IF (Rycina 2A,B), jak i IHC (Rycina 2D), aby dokładnie zidentyfikować poszczególne komórki. Do nałożenia obrazów na siebie (Rycina 5E>) należy użyć programu do analizy obrazu. W zależności od zastosowanego programu do analizy obrazu możliwe może być przeprowadzenie automatycznego przeliczenia znakowanych komórek, jeśli wymagana jest kwantyfikacja.
Rysunek 1: Przygotowanie mrożonych bloków OCT. (A) Widok mikroskopowy (50x) embrionów w OCT w formie kriogenicznej przygotowanej do zamrażania. Czerwona strzałka wskazuje położenie głowy embrionu danio przebrzuchłego względem dolnej powierzchni formy; czarna strzałka wskazuje ogon skierowany w górę, w stronę użytkownika. (B) Plastikowe formy z zarodkami i OCT umieszczone na schłodzonej platformie metalowej. (C) Piankowy kubełek z lodem umieszczony nad plastikowymi formami w celu utworzenia komory mrożącej. (D) Gdy blok zostanie całkowicie zamrożony, OCT zmienia kolor z przezroczystego na biały. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Kriosekcjonowanie zamrożonych bloków OCT. (A), nałożenie świeżego OCT na dysk kriostatu i umieszczenie zamrożonego bloku na OCT, w pozycji obróconej 180° z orientacji zamrażania bloku. (B) Widok z boku bloku zamrożonego do tarczy sekcyjnej. (C) Widok bloku do sekcjonowania z płytką rolującą w odpowiedniej pozycji. (D) Pobieranie skrawków z metalowej platformy kriotomu za pomocą naładowanego szkiełka. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Widok przygotowanych skrawków po umieszczeniu ich na szkiełku. Strzałka wskazuje barierę hydrofobową, a linia przerywana wyznacza strefę zawierającą przekroje wewnątrz obrysu bariery. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek 4: Przygotowanie do aplikacji substratu chromogennego podczas IHC. Preparat umieszcza się na płaskiej powierzchni pokrytej folią spożywczą, aby umożliwić równomierne naniesienie substratu chromogennego i zapobiec rozlaniu materiałów niebezpiecznych. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
Rysunek 5: Reprezentatywne znakowanie IF i IHC krioprzekrojów chimerycznych zarodków danio przebrwonionego w 48. godzinie rozwoju (hpf), otrzymanych w wyniku transplantacji z blastuli do blastuli pomiędzy zarodkami danio przebrwonionego typu dzikiego AB. (A) IF w celu wykrycia ekspresji fosforylowanej histony H3 w obrębie Ser 10 (anty-pH3, 1:20) w chimerycznym zarodku zebrafish w 48. hpf. Kolor czerwony = komórki pH3-dodatnie; kolor niebieski = jądra komórkowe. Żółte strzałki wskazują przykłady komórek dodatnich. (BOdjęcie niebieskiego barwnika jądrowego w obrazie cyfrowym (oprogramowanie ImageJ) poprawia wizualizację komórek pH3-dodatnich w celu ich ilościowego oznaczenia oraz nałożenia obrazów.C) Kontrola negatywna (wyłącznie przeciwciało wtórne) dla analizy IF w krioprzekroju chimerycznego zarodka ryby danio w 48 hpf. Pasek skali reprezentuje 50 µm (dotyczy wszystkich paneli). (D) IHC w celu wykrycia znakowanego dekstranu (anty-znakowany dekstran, 1:7 50) w chimerycznym zarodku danio pręgowanego o wieku 48 hpf, otrzymanym w wyniku przeszczepu z blastuli do blastuli pomiędzy zarodkami danio pręgowanego typu dzikiego AB. Zarodki dawcy zostały wstrzyknięte fluorescencyjnym koniugatem dekstranu w stadium jednego komórki przed wykonaniem przeszczepu z blastuli do blastuli. Kolor czerwony oznacza komórki znakowane koniugatem dekstranu; kolor niebieski oznacza jądra komórkowe. Żółte strzałki wskazują przykłady komórek dodatnich. (E) Nałożenie panelu B (IF dla pH3) i panelu C (IHC dla znakowanego dekstranu), wykazujące kolokalizację ekspresji pH3 i znakowania dekstranem w pojedynczych komórkach. Żółte strzałki wskazują przykłady komórek podwójnie dodatnich. (F) Kontrola negatywna (wyłącznie przeciwciało wtórne) dla analizy IHC w mrożonych sekcjach embrionu chimerycznego rybki zebrafish w 48 hpf. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Zaprezentowaliśmy nowatorską metodę łączonej immunofluorescencji i immunohistochemii, która stanowi ważny krok naprzód w przeprowadzaniu eksperymentów kolokalizacyjnych na kriosekcyjnych zarodkach danio pręgowanego. Istnieje krytyczny brak istniejących protokołów kolokalizacji, które są zoptymalizowane do stosowania z małymi zarodkami i materiałem poddanym kriosekcji17,18, które są powszechnie stosowane w badaniach molekularnych14. Istniejące protokoły kolokalizacji koncentrują się głównie na jednoczesnej wizualizacji dwóch fluoroforów17,18. Chociaż protokoły te mogą działać dobrze, ich przydatność jest ograniczona przez dostępność przeciwciał, które (i) mogą być stosowane u danio pręgowanego i (ii) są zgodne z IF.
Uważamy, że zastosowanie kriosekcji w przypadku zarodków danio pręgowanego zapewnia znaczącą przewagę pod względem zachowanej morfologii tkanek. Z uwagi na to, że IHC jest częściej wykonywany na skrawkach parafiny niż na kriosekcjach 7,8, uzasadnione jest dalsze badanie metod IHC opartych na kriosekcji w celu wykrywania ekspresji białek. Zastosowanie całego wierzchowania IF jest powszechną metodą wizualizacji poziomów ekspresji w zarodkach danio pręgowanego i jest częściej opisywane w literaturze niż IF przy użyciu kriosekcji 1,2,3,4,19. Jednak protokoły całego montażu mają ograniczenia, w tym brak dokładnej lokalizacji białek ulegających ekspresji w głębokich tkankach i możliwość ekspresji na poziomie powierzchniowym do zaciemnienia ekspresji białek w głębszych tkankach. Konsekwentnie obserwowaliśmy doskonałe utrzymanie morfologii komórkowej po krioprezerwacji, sekcjach i sekwencyjnych IF i IHC. W przypadku zastosowań, które wymagają precyzyjnej lokalizacji ekspresji białka na poziomie pojedynczej komórki, procedury oparte na sekcjach mają znaczną przewagę, jak opisaliśmy w tym protokole. Osadzanie żywicy stanowi alternatywną opcję wykonywania testów IF lub IHC na wycinkach zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadiumrozwoju 20. Skrawki żywicy zapewniają lepsze zachowanie morfologii tkanek w porównaniu z kriosekcjami i można przygotować stosunkowo cieńsze skrawki tkanki. Jednak producenci na ogół nie zalecają stosowania skrawków żywicy do testów immunologicznych, ponieważ niektórych składników żywic nie można usunąć z odcinków i mogą one maskować miejsca wiązania przeciwciał21.
Chociaż cały protokół jest niezbędny do dokładnej i skutecznej analizy wzorców ekspresji, kilka konkretnych kroków ma kluczowe znaczenie dla sukcesu eksperymentu. Pierwszym krytycznym krokiem jest postępowanie z zarodkami podczas osadzania w OCT 13,14. Orientacja każdego zarodka w tej samej płaszczyźnie poprzecznej, tak aby sekcje były wycinane z mniej więcej tego samego obszaru dla wszystkich zarodków, może być trudne. Odkryliśmy, że używanie igieł o małej średnicy do wykonywania małych, celowych ruchów przez lepką pożywkę OCT w celu orientacji zarodka jest lepsze niż używanie kleszczy, które są zbyt duże i wypierają zbyt dużo pożywki OCT. Drugi krytyczny etap ma miejsce podczas cięcia zamrożonych bloków, ponieważ uzyskanie wysokiej jakości skrawków zawierających pożądaną tkankę (tkanki) może być trudne bez odpowiedniego przeszkolenia i doświadczenia. Dlatego zalecamy korzystanie z próbek testowych do czasu opanowania techniki. Trzecim krytycznym krokiem jest usunięcie szkiełka nakrywkowego, które może zakłócić lub usunąć próbki tkanek. Odkryliśmy, że połączenie delikatnego mieszania w celu poluzowania szkiełka nakrywkowego i powolnego wyjmowania szkiełka z pojemnika PBS jest najskuteczniejszym podejściem do usuwania szkiełek nakrywkowych. Najlepsza jest delikatna i pewna ręka; Naukowcy mogą uznać, że konieczne jest trochę prób i błędów, aby nauczyć się, jak skutecznie usuwać szkiełka nakrywkowe.
Dodatkowe ważne kroki w protokole obejmują optymalizację przeciwciał (przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe zarówno dla testów IF, jak i IHC) oraz ekspozycję szkiełek na substrat chromogenny i przeciwbarwienie. Niezbędne są dokładne badania dotyczące swoistości przeciwciał pierwszorzędowych i stężenia docelowego; ogólnie rzecz biorąc, najlepiej jest zebrać wystarczającą ilość próbek nieszlachetnych do co najmniej dwóch oddzielnych eksperymentów dla IF i IHC, które zostaną przeprowadzone w celu optymalizacji stężeń przeciwciał pierwszorzędowych przed rozpoczęciem kombinacji IF/IHC. Włączenie znanej kontroli dodatniej i ujemnej dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego jest niezbędne w każdym doświadczeniu, aby zapewnić, że zarówno testy IF, jak i IHC działają prawidłowo. Konieczne może być również dostosowanie stężenia przeciwciał wtórnych. Konieczna jest optymalizacja ekspozycji skrawków tkanek na substrat chromogenny i przeciwbarwienie dla testu IHC, ponieważ wytyczne producenta często opisują szeroki zakres możliwych czasów ekspozycji. Nie wszystkie chromogeny mogą być kompatybilne z barwnikami przeciwstawnymi i endogenną pigmentacją tkanek, co wymaga starannego planowania w odniesieniu do doboru chromogenów.
Istnieje wiele potencjalnych modyfikacji, które można zastosować do opisanego protokołu, a my z powodzeniem przeprowadziliśmy ten protokół z innymi kombinacjami przeciwciał, które nie mogły być jednocześnie stosowane do IF. Jak wspomniano powyżej, substancje chromogenne mają wyraźną kompatybilność z określonymi przeciwbarwieniami. Odkryliśmy, że te komponenty można łatwo modyfikować w protokole. Dodatkowo parametry inkubacji przeciwciał są dość elastyczne i mogą być zwiększane lub zmniejszane w zależności od pożądanej intensywności barwienia. Proces osadzania można również modyfikować. Chociaż skupiliśmy się na przekrojach poprzecznych, zarodki można łatwo ustawić w dowolnym kierunku, aby dotrzeć do konkretnych tkanek będących przedmiotem zainteresowania. Wreszcie, w tym protokole istnieje wiele możliwych punktów pauzy. Odwodnione zarodki mogą być przechowywane w 100% MeOH w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy; zamrożone bloki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do trzech miesięcy; a przygotowane preparaty można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do dziewięciu miesięcy w pudełku na szkiełka.
Ze względu na względną złożoność tego połączonego protokołu IF/IHC istnieje wiele możliwych źródeł zmienności lub błędów, które mogą wymagać rozwiązania problemu, począwszy od jakości tkanki, przez doświadczenie badaczy, aż po obsługę próbek. Większość krytycznych kroków opisanych powyżej jest uważana za krytyczną, ponieważ albo wymagają optymalizacji na poziomie indywidualnego użytkownika, albo wymagają szczególnej zręczności, umiejętności i doświadczenia. Odkryliśmy jednak, że niespecyficzne barwienie tła i niska intensywność sygnału są najważniejszymi problemami wymagającymi optymalizacji. Podobnie jak w przypadku każdego protokołu IF lub IHC, rozwiązanie tych problemów może być czasochłonne i pracochłonne, a ta metoda może być spotęgowana, ponieważ te dwie techniki są połączone. Z tego powodu zdecydowanie zalecamy osobną optymalizację IF i IHC przed przystąpieniem do połączonego protokołu.
Chociaż przewidujemy, że ta metoda będzie przydatna w szerokim zakresie eksperymentów, istnieją potencjalne ograniczenia. Pomyślne przeprowadzenie tej procedury zależy od utrzymania nienaruszonych próbek tkanek poprzez dwa sekwencyjne eksperymenty, które obejmują wiele etapów mycia. Z tego powodu wszelkie problemy, które pojawiają się podczas cięcia lub obchodzenia się z tkankami, w tym użycie starszych preparatów, które mogły pogorszyć jakość, znacznie ograniczą zdolność badaczy do skutecznego wykonania tego protokołu. Chociaż szkiełka podstawowe mogą być potencjalnie przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do dziewięciu miesięcy, przyleganie tkanek do szkiełek zmniejsza się z czasem, a największy sukces odnieśliśmy w przypadku szkiełek, które są używane w ciągu miesiąca od przygotowania lub najlepiej następnego dnia. Drugim ograniczeniem jest niewielka powierzchnia zarodków danio pręgowanego. Chociaż odkryliśmy, że ten eksperyment jest przydatny w wizualizacji białek, które są stosunkowo obficie eksprymowane we wczesnych stadiach zarodków, białka, które są wyrażane niekonsekwentnie lub na niskich poziomach, mogą być bardzo trudne do uchwycenia w sekcji. Wreszcie, ponieważ protokół wykorzystuje kriosekcje 10\u201212 μm, najlepiej nadaje się do oceny ekspresji białek w większych strukturach, takich jak jądra, a nie w mniejszych składnikach subkomórkowych.
Podsumowując, nasz połączony protokół IF/IHC będzie korzystny dla szerokiej gamy badań na zarodkach danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju i stanowi ważną innowację w precyzyjnej analizie ekspresji białek w takich próbkach. Nasza metoda, pokazana z powodzeniem na rycinie 5, pozwoli naukowcom zachować delikatną morfologię zarodków danio pręgowanego we wczesnym stadium w kriosekcjach, jednocześnie pracując z nieco ograniczonym zakresem obecnie dostępnych przeciwciał pierwotnych, które są zatwierdzone do stosowania w IF lub IHC u tego gatunku. Protokół ten będzie prawdopodobnie przydatny w badaniach na innych gatunkach ryb i (np. Medaka i Xenopus spp.), które są utrudnione przez podobne ograniczenia dostępności przeciwciał i może mieć zastosowanie również w tradycyjnych modelach ssaków.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant NIH 5K01OD021419-02 oraz NC State University College of Veterinary Medicine.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 15/25 | N/A | N/A | 15% żelatyna rybna/25% sacharoza w/v, wykonane z dH2O |
| Przeciwciało drugorzędowe Alexa 555 | Invitrogen | A21429 | stosowane w rozcieńczeniu 1:2,000 w buforze blokowym dla przeciwciała IF |
| Diluent | Dako | S3022 | |
| Tło Buster Buster | NB306 | ||
| bufor blokowy (IF) | N/A | N/A | 5% normalna surowica kozia, 0,1% Triton X-100 w 1x PBS |
| cellOprogramowanie do obrazowania Sens Oprogramowanie | Olympus | cellSens | używane z mikroskopem światła złożonego |
| chimeryczne zarodki danio pręgowanego | N/A | N/A | AB chimery typu dzikiego analizowane przy 48 hpf |
| Mikroskop światła złożonego | Olympus | BX51 | używany z aparatem cyfrowym i oprogramowaniem do obrazowania cellSens do przechwytywania obrazu po |
| konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym | Leica | DM 2500 | używany z aparatem cyfrowym i pakietem Leica Application Suite Zaawansowane oprogramowanie do obrazowania fluorescencji po IF |
| Jednorazowe formy plastikowe, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Aparat cyfrowy, mikroskop świetlny | Olympus | DP27 | |
| Aparat cyfrowy, mikroskop fluorescencyjny | Leica | TCS SPE | |
| Etanol | Koptec | V1001 | |
| Żelatyna rybna | Sigma | G7041 | |
| Szkiełka | podstawowe Fisher | 12-550-15 | |
| Nadtlenek wodoru, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS Zestaw do wykrywania polimerów HRP | Vector | MP-7401 | wtórne przeciw królikowi, polimer HRP |
| Pakiet aplikacji Leica Zaawansowane oprogramowanie do obrazowania fluorescencyjnego | Leica | LAS AF 2.3.6 | używane z konfokalnym mikroskopem fluorescencyjnym |
| Metanol | Fisher | A452-4 | |
| Zmodyfikowana Hematoksylina Meyera | Thermo | 72804 | |
| Normalna surowica kozia | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT | medium Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anty-Oregon Green | przeciwciało Sondy molekularne/Life Technologies | A889 | stosowane w rozcieńczeniu 1:7500 dla IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | stosowany w stężeniu 2,5% w 0,2 M KCl |
| Paraformaldehyd, 4% | Acros Organics | 416780030 | wyprodukowane w laboratorium w 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami | wyprodukowana w laboratorium | N/A | 50 ml 10x PBS, objętość do 500 ml z dH2O |
| 10x sól fizjologiczna buforowana fosforyzem | wyprodukowana w laboratorium | N/A | przy użyciu protokołu Cold Spring Harbor |
| 1x PBSt | wyprodukowano w laboratorium | N/A | 50 ml 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, objętość do 500 ml z dH2O |
| fosforylowane przeciwciało histonowe H3 | Cruz | sc-8656-R | stosowane w rozcieńczeniu 1:500 do IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | z powodzeniem stosowały inne marki oprócz EMS |
| Sacharoza | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | stosowany w stosunku 1:1,000 w 1x PBS do IF |
| 1x sól fizjologiczna buforowana Tris | wyprodukowana w laboratorium | N/A | 50 mL 10x TBS, do 500 mL objętości z dH2O |
| 10x sól fizjologiczna buforowana Tris | wyprodukowana w laboratorium | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, do 1 L objętości z dH2O |
| 1x TBSt | wyprodukowany w laboratorium | N/ A | 50 ml 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, objętość do 500 ml z dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | nieutwardzalny nośnik montażowy |
| Vector NovaRed Podłoże | Vector SK-4800 | HRP | |
| Ksylen | Fisher | X3P-1GAL |
Bibliografia
- Whole-mount IHC protocol for zebrafish embryos [Internet]. GeneTex. , Irvine. Available from: http://www.genetex.com/uploaddata/Protocol/Document/IHC-WM.pdf (2013).
- Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Kogata, N., Howard, B. A. A whole-mount immunofluorescence protocol for three-dimensional imaging of the embryonic mammary primordium. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 18 (2), 227-231 (2013).
- Santos, D., Monteiro, S., Luzio, A. General Whole-Mount Immunohistochemistry of Zebrafish (Danio rerio) Embryos and Larvae Protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Sexton, J. M., Hickstein, D. D. Expression of KRASG12V in Zebrafish Gills Induces Hyperplasia and CXCL8-Associated Inflammation. Zebrafish. 12 (3), 221-229 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
- Macdonald, R. Zebrafish Immunohistochemistry. Molecular Methods in Developmental Biology. Guille, M. , 127th ed, Humana Press. New York. 77-88 (1999).
- Santos, C., Pinto, M. L. Immunohistochemical Assessment as a Tool for Investigating Developmental Toxicity in Zebrafish (Danio rerio). Methods in Molecular Biology. 1797, 461-476 (2018).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Azuma, M., Sood, R., Liu, P., et al. brca2 in zebrafish ovarian development, spermatogenesis, and tumorigenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19350-19355 (2010).
- Shive, H. R., West, R. R., Embree, L. J., Golden, C. D., Hickstein, D. D. BRCA2 and TP53 collaborate in tumorigenesis in zebrafish. PLoS One. 9 (1), (2014).
- van der Loos, C. M. Multiple Immunoenzyme Staining: Methods and Visualizations for the Observation With Spectral Imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
- van der Loos, C. M. Immunoenzyme Multiple Staining Methods. , Bios Scientific Publishers. New York. (1999).
- OCT Embedding For Cryostat Sectioning Of Embryos or Larvae [Internet]. The Zebrafish Book, 5th edition. , University of Oregon Press. Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/OCT+Embedding+For+Cryostat+Sectioning+Of+Embryos+Or+Larvae (2007).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of Cells and Tissues for Fluorescence Microscopy. Basic Methods in Microscopy. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Spector and Goldman, editors (2006).
- Torres, E. The Lack of Commercial Antibodies for Model Organisms (and How You Can Deal with It) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018).
- Carmany-Rampey, A., Moens, C. B. Modern mosaic analysis in the zebrafish. Methods. 39, 228-238 (2006).
- Da’as, S. I., Balci, T. B., Berman, J. N. Mast cell development and function in the zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1220, 29-57 (2015).
- Quan, F. B., et al. Comparative distribution and in vitro activities of the urotensin II-related peptides URP1 and URP2 in zebrafish: evidence for their colocalization in spinal cerebrospinal fluid-contacting neurons. PLoS One. 10 (3), (2015).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Sullivan-Brown, J., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Embedding, serial sectioning and staining of zebrafish embryos using JB-4 resin. Nature Protocols. 6 (1), 46-55 (2011).
- JB-4 Embedding Kit. [Internet]. Polysciences, Inc. , Available from: http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/plastic-embedding-media-kits/jb-4-sup-r-sup-embedding-kits-reagents/jb-4supsup-embedding-kit/ (2018).
Przedruki i uprawnienia
