Artykuł metodologiczny

CRISPR/Cas12a: Multipleksowa edycja genomu Saccharomyces cerevisiae i tworzenie drożdżowego pixel artu

17.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59350

⸱

28 maja 2019

 ,  ,  ,  , 
1DSM Biotechnology Center, 2Biochemistry and Molecular Biology, Department of Chemistry, University of Hamburg, 3BrisSynBio, University of Bristol, Life Sciences Building, 4School of Biological Sciences, University of Bristol, Life Sciences Building

W tym artykule

Podsumowanie

System CRISPR/Cas12a w połączeniu z pojedynczą matrycą crRNA umożliwia efektywną multipleksową edycję genomu S. cerevisiae w wielu loci jednocześnie. Wykazano to, konstruując szczepy drożdży wytwarzające karotenoidy, które są następnie wykorzystywane do tworzenia drożdżowej grafiki pikselowej.

Streszczenie

Wysoka wydajność, łatwość użycia i wszechstronność systemu zgrupowanych, regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych/białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) ułatwiły zaawansowaną modyfikację genetyczną Saccharomyces cerevisiae, organizmu modelowego i konia roboczego w biotechnologii przemysłowej. W pracy tej zastosowano białko 12a związane z CRISPR (Cas12a), endonukleazę sterowaną RNA o cechach odróżniających się od Cas9, co jeszcze bardziej rozszerza molekularny zestaw narzędzi do celów edycji genomu. Zaletą systemu CRISPR/Cas12a jest to, że może on być stosowany w multipleksowej edycji genomu z wieloma przewodnikowymi RNA wyrażonymi z jednej jednostki transkrypcyjnej (pojedynczej macierzy CRISPR RNA (crRNA)). Przedstawiamy protokół multipleksowej integracji wielu heterologicznych genów w niezależne loci genomu S. cerevisiae przy użyciu systemu CRISPR/Cas12a z wieloma crRNA ulegającymi ekspresji z jednego konstruktu macierzy crRNA. Proponowana metoda wykorzystuje zdolność S. cerevisiae do przeprowadzania rekombinacji fragmentów DNA in vivo w celu złożenia pojedynczej macierzy crRNA w plazmid, który można wykorzystać do selekcji transformantów, a także do składania sekwencji DNA dawcy, które integrują się z genomem w zamierzonych pozycjach. Cas12a ulega wstępnej ekspresji konstytutywnej, ułatwiając rozszczepienie genomu S. cerevisiae w zamierzonych pozycjach po ekspresji pojedynczej macierzy crRNA. Protokół obejmuje zaprojektowanie i budowę pojedynczej macierzy crRNA i kaset ekspresji DNA dawcy oraz wykorzystuje podejście integracyjne wykorzystujące unikalne sekwencje łączników DNA 50 pz i oddzielne sekwencje DNA z boku integracji, co upraszcza projektowanie eksperymentów poprzez standaryzację i modularyzację oraz rozszerza zakres zastosowań. Na koniec demonstrujemy prostą technikę tworzenia pikselowej grafiki drożdży za pomocą akustycznej obsługi płynów przy użyciu różnokolorowych szczepów drożdży wytwarzających karotenoidy, które zostały skonstruowane.

Wprowadzenie

Enzymy CRISPR/Cas niewątpliwie zrewolucjonizowały biologię molekularną i zostały szeroko przyjęte jako narzędzia do inżynierii genomów z prędkością, która wcześniej była nieosiągalna1. Pierwsza modyfikacja genomu Saccharomyces cerevisiae za pomocą systemu edycji genomu CRISPR/Cas9 została opisana przez DiCarlo i wsp.2, demonstrując udane nokautowanie genów i dokonywanie mutacji punktowych przy użyciu zewnętrznie wprowadzonych oligonukleotydów. Dalsze osiągnięcia w zakresie zestawu narzędzi CRISPR dla drożdży obejmowały: regulację transkrypcji poprzez fuzję katalitycznie nieaktywnego martwego Cas9 (dCas9) z transkrypcyjnymi domenami efektorowymi w celu umożliwienia aktywacji i wyciszenia transkrypcji3, zastosowanie zarówno do edycji genomu, jak i funkcji regulacyjnych do inżynierii szlaków metabolicznych poprzez jednoczesną aktywację, represję i delecję4, delecja dużych fragmentów z genomu S. cerevisiae5, oraz fuzje wielu chromosomów6.

Systemy edycji genomu CRISPR/Cas wywodzą się z adaptacyjnych układów odpornościowych bakterii i archeonów, a systemy te zostały zaadaptowane przez biologów molekularnych do edycji genomu. Ich funkcjonalność opiera się na regionach DNA CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) kodujących RNA odpowiedzialne za rozpoznawanie obcego DNA lub RNA oraz genów związanych z CRISPR (Cas), które kodują endonukleazy sterowane RNA1,7,8,9. Na podstawie niedawnej analizy genomu systemów CRISPR/Cas zaproponowano podzielenie systemów CRISPR/Cas na dwie klasy, pięć typów i 16 podtypów10. Obie klasy rozróżnia się na podstawie organizacji kompleksów efektorowych zaangażowanych w docelowe rozszczepienie. Zazwyczaj systemy CRISPR/Cas z organizacją wielopodjednostkową są klasyfikowane jako klasa 1, podczas gdy kompleksy efektorowe z pojedynczą podjednostką należą do klasy 210,11. W tym artykule przyjrzymy się klasie 2 typu V Cas12a, wcześniej nazywanej Cpf110,12, która jest alternatywą dla klasy 2 typu II Cas9. Chociaż Cas9 jest dobrze scharakteryzowany i szeroko stosowany w badaniach, Cas12a oferuje dodatkowe funkcje12. Po pierwsze, Cas12a tworzy kompleks z CRISPR RNA (crRNA) składający się z 42 do 44 nukleotydów bez konieczności dodatkowego transaktywującego CRISPR RNA (tracrRNA). W związku z tym krótszy przewodnik RNA może być wykorzystany w edycji genomu za pomocą systemów CRISPR/Cas12a w porównaniu z CRISPR/Cas9. Po drugie, unikalna aktywność endonukleazy i endorybonukleazy Cas12a umożliwia dojrzewanie jego pre-crRNA13. Ta aktywność RNazy pozwala na kodowanie wielu crRNA na jednej tablicy crRNA CRISPR, podczas gdy Cas9 wymaga oddzielnej ekspresji każdego tak zwanego jednoprzewodnikowego RNA (sgRNA) lub alternatywnie na przykład ekspresji dodatkowej endonukleazy (np. Csy4) w połączeniu z motywami rozpoznawania dla Csy4 otaczającymi każdy sgRNA14,15. Po trzecie, rozpoznanie miejsca docelowego Cas12a wymaga motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) na końcu 5' od celu i rozszczepia się po pozycji +18/+23 od swojego PAM, co skutkuje rozszczepionym DNA z lepkimi końcami, podczas gdy Cas9 wymaga PAM zlokalizowanego na końcu 3' od celu i rozszczepia się po pozycji -3, tworząc nacięcia na końcu w klasie DNA12. Po czwarte, zgodna sekwencja nukleotydowa PAM różni się między Cas12a ((T)TTV) i Cas9 (NGG), co sprawia, że Cas12a jest obiecującym kandydatem do celowania w bogate w T sekwencje promotora i terminatora16. Wreszcie, niedawne badanie wykazało większą swoistość docelową dla Cas12a niż dla natywnej klasy Cas917.

Przedstawiamy protokół korzystania z systemu CRISPR/Cas12a do edycji genomu S. cerevisiae, ze szczególnym naciskiem na wprowadzenie wielu kaset ekspresji DNA do niezależnych loci genomowych jednocześnie (edycja genomu multipleksowego) przy użyciu pojedynczej macierzy crRNA. Kluczowe kroki protokołu są przedstawione w Rysunek 1. Jako dowód słuszności koncepcji, system CRISPR/Cas12a został zastosowany do wprowadzenia trzech kaset ekspresyjnych do genomu S. cerevisiae, które umożliwiają produkcję β-karotenu18, jak schematycznie pokazano w Rysunek 2. Produkcja β-karotenu wpływa na fenotyp S. cerevisiae: tj. po pomyślnym wprowadzeniu wszystkich trzech heterologicznych genów wymaganych do biosyntezy karotenoidów, białe komórki S. cerevisiae zmieniają kolor na żółty lub pomarańczowy, w zależności od siły ekspresji promotora każdego genu. Ze względu na prosty wizualny odczyt tej ścieżki, została ona wprowadzona w celu opracowania zaawansowanych systemów i metod edycji genomu opartych na CRISPR19,20. W niniejszej pracy kasety ekspresyjne kodujące geny karotenoidowe crtE, crtYB i crtI zostały skonstruowane przy użyciu podejścia klonowania Golden Gate (GGC) 21 z heterologicznymi promotorami i homologicznymi terminatorami używanymi do kierowania ekspresją genów. Kasety ekspresyjne są otoczone unikalnymi sekwencjami 50 par zasad (bp), zwanymi łącznikami, które umożliwiają montaż in vivo z integracyjnymi sekwencjami DNA po bokach (regiony flankujące) z tymi samymi sekwencjami 50 pz, a następnie integrację z genomowym DNA drożdży w pozycji określonej przez regiony flankujące. Dzięki zastosowaniu różnych mocy promotorów uzyskano szczepy o różnym poziomie produkcji karotenoidów, co spowodowało różnice w kolorze komórek. Szczepy te - zainspirowane "Yeast Art Project"22 - zostały użyte w konfiguracji do wykrywania z akustycznym płynem do stworzenia 4-kolorowej "fotografii drożdży" Rosalind Franklin o wysokiej rozdzielczości. Franklin (1920-1958) była angielską chemiczką i krystalografem rentgenowskim, dobrze znaną ze swojego wkładu w odkrycie struktury DNA przez Zdjęcie 5123,24,25.

Protokół

1. Przygotowanie plazmidów Cas12a

UWAGA: Plazmid zawierający Cas12a bakterii Lachnospiraceae ND2006 (LbCpf1, pCSN067) z optymalizacją kodonów dla ekspresji w S. cerevisiae został przygotowany wcześniej19 i zdeponowany w repozytorium plazmidów (patrz Tabela materiałów). Jest to jednokopiowy episomalny plazmid wahadłowy S. cerevisiae/E. coli zawierający gen markera oporności KanMX, który umożliwia selekcję transformantów S. cerevisiae na geneticynie (G418).

  1. Należy pozyskać plazmid pCSN067 (patrz Tabela materiałów).
  2. Należy namnożyć plazmid pCSN067 w celu uzyskania go w dużej ilości.
    1. 25 µL zakupionych chemicznie kompetentnych komórek E. coli transformuje się plazmidem pCSN067 zgodnie z protokołem producenta. Mieszaninę transformacyjną rozcieńcza się 10- i 50-krotnie w pożywce 2x peptonowo-drożdżowej (PY). Rozcieńczenia 10x i 50x wysiewa się na płytki z agarem 2x PY zawierającym ampicylinę (0,1 g/L) i inkubuje przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Wybiera się od 2 do 3 kolonii i każdą z nich szczepi do 3 mL pożywki 2x PY, a następnie hoduje przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 180 rpm.
    3. Plazmid oczyszcza się za pomocą zestawu do izolacji plazmidów zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Przygotowanie kasety ekspresyjnej pojedynczej macierzy crRNA

  1. Przygotuj pojedynczy macierz crRNA.
    UWAGA: Pojedyncza macierz crRNA składa się z SNR52 promotor polimerazy RNA III z S. cerevisiae2, bezpośrednia powtórka specyficzna dla LbCas12a oraz spacer (genomowa sekwencja docelowa), powtórzone razem dla każdego celu19 i kończy się poprzez a SUP4 terminator z S. cerevisiae2Pojedyncza macierz crRNA jest montowana poprzez in vivo rekombinacja do zlinearyzowanego plazmidu pRN1120 w celu otrzymania plazmidu kolistego, w związku z czym na początku i na końcu pojedynczej macierzy crRNA muszą znajdować się regiony homologiczne do plazmidu pRN1120 (patrz Rycina 2A). Zaleca się wcześniejszą, oddzielną ocenę funkcjonalności kilku zaprojektowanych crRNA19Informacje te są następnie wykorzystywane do wyboru najbardziej funkcjonalnych crRNA, które są łączone w sekwencje powtórzeń bezpośrednich i spacerów w celu stworzenia pojedynczej macierzy crRNA do zastosowań w multipleksowaniu.
    1. Zamów pojedynczą macierz crRNA do eksperymentów z multipleksową edycją genomu w formie syntetycznego DNA (sekwencja DNA pojedynczej macierzy crRNA znajduje się w Tabela uzupełniająca 1).
    2. Namnóż uporządkowaną macierz pojedynczego crRNA (np., przy użyciu starterów KC-101 i KC-102 (Tabela uzupełniająca 2)). Przygotować mieszaninę do amplifikacji PCR zawierającą: 0.5 µL polimerazy DNA, 10 µL buforu 5x wymaganego dla polimerazy DNA, 1 µL 10 mM dNTP, 2.5 µL z 10 µM starter forward, 2.5 µL z 10 µM starter odwrotny, 2 µL matrycy DNA w stężeniu 5 ng/µL or ultrazczystą H2do całkowitej objętości 50 µL.
      1. Reakcję należy przeprowadzić w termocyklerze zgodnie z następującym programem: (i) 98 °C przez 3 min, (ii) 98 °C przez 10 s, (iii) 60 °C przez 20 s, (iv) 72 °C przez 15 s – powtórzyć kroki (ii) do (iv) 30 razy, (v) 72 °C przez 5 min (vi) utrzymać w temperaturze 12 °C do czasu dalszej analizy.
    3. Produkty PCR należy przeanalizować za pomocą elektroforezy, prowadząc próbki w 0,8% żelu agarozowym przy napięciu 5 V/cm przez 40 min, stosując barwnik do ładowania DNA oraz drabinę DNA z fragmentami DNA w zakresie od 100 do 10 000 bp.
    4. Produkty PCR należy oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania produktów PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Przygotuj plazmid biorca dla pojedynczej macierzy crRNA.
    UWAGA: Pojedyncza macierz crRNA jest wyrażana z S. cerevisiae/E. coli plazmid wahadłowy pRN112019 (patrz w Tabela materiałów). Ten wielokopiowy plazmid zawiera gen markera oporności NatMX, który umożliwia selekcję S. cerevisiae transformanty na nourseotrycynie (NTC).
    1. Należy pozyskać plazmid pRN1120.
    2. Namnoż plazmid pRN1120 w celu uzyskania wysokiej ilości materiału.
      1. Przekształć 25 µL zakupionych chemicznie kompetentnych E. coli komórki z plazmidem pRN1120 zgodnie z protokołem producenta. Mieszaninę transformacyjną rozcieńczyć 10- i 50-krotnie w podłożu 2x PY. Rozcieńczenia 10- i 50-krotne wysiać na płytki z agarem 2x PY zawierającym ampicylinę (0,1 g/L) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
      2. Wybrać od 2 do 3 kolonii, zaszczepić każdą z nich w 3 ml pożywki 2x PY i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsarką przy 180 obr./min.
      3. Oczyść plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidów zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Linearyzuj plazmid pRN1120 za pomocą EkologiaRI-HF oraz XhoI. W tym celu należy przygotować mieszaninę do trawienia składającą się z 1 µg pRN1120, 5 µL buforu 10x (bufor 1x zawiera 50 mM octanu potasu, 20 mM octanu Trisu, 10 mM octanu magnezu, 100 µg/mL albumina surowicy bydlęcej [BSA]; pH 7,9), 1 µL z EkologiaRI-HF (20 U), 1 µL z XhoI (20 U) i ultrapure H2O2do uzyskania całkowitej objętości 50 µLInkubować mieszaninę trawienną w temperaturze 37 °C przez 2 h, a następnie inaktywować w temperaturze 65 °C przez 20 min.
    4. Zlinearyzowany plazmid należy poddać analizie za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (0,8%, 40 min, 5 V/cm), stosując barwnik do ładowania DNA oraz drabinę DNA z fragmentami w zakresie od 100 do 10 000 bp. W analizie należy uwzględnić plazmid kolisty jako kontrolę.
    5. Oczyść zlinearyzowany plazmid, korzystając z zestawu do oczyszczania produktów PCR, zgodnie z instrukcją producenta.

3. Przygotowanie konstruktów donora DNA Promotor-ORF-Terminator (POT)

  1. Zamów zestaw sekwencji promotora (P) o różnej sile, otwartej ramki odczytu (O) oraz terminatora (T) w formie syntetycznego DNA, tak aby każdy element zawierał zestandaryzowane 4-bp sekwencje rozpoznawcze flankowane przez miejsca cięcia BsaI, co umożliwi montaż metodą Golden Gate Cloning (GGC)26 (szczegółowe projekty znajdują się w Supplementary Table 3, a sekwencje w Supplementary Table 4).
  2. Zmontuj kasety ekspresyjne POT składające się z promotora, otwartej ramki odczytu, terminatora i sekwencji łączników poprzez montaż 4-częściowy z wykorzystaniem reakcji GGC21, do wektora docelowego, który zawiera już określone 50-bp sekwencje łączników (patrz Supplementary Table 4 oraz referencje26,27).
    1. Zmierz stężenie części DNA za pomocą spektrofotometru. Rozcieńcz każdą część DNA w ultrazczystej H2O do stężenia końcowego 15 fmol/µL.
    2. Przygotuj mieszaninę reakcyjną składającą się z fragmentów DNA: 2 µL promotora, 2 µL otwartej ramki odczytu, 2 µL terminatora i 2 µL szkieletu (wektory docelowe poziomu 1 opisane w 26), 4 µL buforu 5x T4 DNA ligase, 2,5 µL T4 DNA ligazy (1 U/µL), 1,5 µL BsaI-HF (20 U/µL) oraz ultrazczystej H2O do całkowitej objętości 20 µL.
    3. Przeprowadź reakcję GGC w termocyklerze według następującego programu: (i) 37 °C przez 2 min, (ii) 16 °C przez 5 min – powtórz kroki (i) i (ii) 50 razy, (iii) 50 °C przez 60 min, (iv) 80 °C przez 45 min, (v) utrzymuj w 12 °C do czasu dalszej analizy.
  3. Przeprowadź transformację 25 µL zakupionych chemicznie kompetentnych komórek E. coli28 za pomocą 3 µL mieszaniny reakcyjnej GGC zgodnie z protokołem producenta. Rozcieńcz mieszaninę transformacyjną 10- i 50-krotnie w podłożu 2x PY. Wysiej rozcieńczenia 10x i 50x na płytki z agarem 2x PY zawierającym ampicylinę (0,1 g/L) i inkubuj przez noc w 37 °C.
  4. Wybierz od 2 do 3 kolonii i zaszczep każdą kolonię w 3 mL podłoża 2x PY, a następnie hoduj przez noc w 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przy 180 rpm.
  5. Oczyść plazmidy za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidów zgodnie z instrukcjami producenta.
  6. Sprawdź za pomocą PCR, czy kasety ekspresyjne POT zostały prawidłowo zmontowane w reakcji GGC.
    1. Zaprojektuj startery komplementarne do sekwencji łącznika znajdującej się na początku i na końcu każdej kasety ekspresyjnej (patrz Figure 2B). Dla łączników wybranych w tym protokole użyj starterów od KC-103 do KC-108 (patrz Supplementary Table 2).
    2. Przygotuj mieszaniny do amplifikacji PCR dla każdego plazmidu zawierające: 0,5 µL polimerazy DNA z aktywnością korekcyjną, 10 µL buforu 5x wymaganego dla polimerazy DNA, 1 µL dNTPs (10 mM), 2,5 µL startera forward (10 µM), 2,5 µL startera reverse (10 µM), 2 µL matrycy DNA o stężeniu 5 ng/µL oraz ultrazczystej H2O do całkowitej objętości 50 µL.
    3. Przeprowadź reakcję PCR w termocyklerze według następującego programu: (i) 98 °C 3 min, (ii) 98 °C przez 10 s, (iii) 60 °C przez 20 s, (iv) 72 °C przez 2 min 30 s – powtórz kroki (ii) do (iv) 30 razy, (v) 72 °C przez 5 min, (vi) utrzymuj w 12 °C do czasu dalszej analizy.
      UWAGA: Powstałe produkty PCR składają się z 50-bp łącznika 5’, promotora, otwartej ramki odczytu, terminatora i 50-bp łącznika 3’.
  7. Przeanalizuj produkty PCR metodą elektroforezy, prowadząc próbki na żelu agarozowym 0,8% przy 5 V/cm przez 40 min, używając barwnika do ładowania DNA i drabinki DNA z fragmentami w zakresie od 100 do 10 000 bp.

4. Przygotowanie sekwencji DNA flankujących integrację zawierających sekwencje łącznikowe

  1. Wyizoluj genomowe DNA z dzikiego typu S. cerevisiae CEN.PK113-7D29.
    1. Hodowlę szczepu prowadź w kolbie z wytrząsaniem o pojemności 500 mL wypełnionej 100 mL pożywki ekstraktu drożdżowego, peptonu i dekstrozy (YEPD, 2% glukozy) w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu 250 rpm przez 48 godzin.
    2. Zbiór komórek przeprowadź poprzez wirowanie 2 mL hodowli z prędkością 16,000 x g przez 1 min, a następnie odlej nadsącz.
    3. Resuspenduj komórki w soli fizjologicznej (200 µL; 0.85% NaCl) z dodatkiem RNazy (10 µL, 10 mg/mL) i enzymu litycznego dla drożdży (4 µL). Inkubuj zawiesinę komórkową w temperaturze 37 °C przez 15 min.
    4. Dodaj 300 µL roztworu do lizy komórek (patrz Tabela materiałów) i krótko wymieszaj w wortexie.
    5. Dodaj 168 µL roztworu do wytrącania białek (patrz Tabela materiałów) i intensywnie mieszaj w wortexie przez 20 s.
    6. Oddziel frakcję białkową poprzez wirowanie przy 16,000 x g i 4 °C przez 10 min. Przenieś 600 µL nadsączu do nowej probówki, wymieszaj z 600 µL izopropanolu i krótko wymieszaj w wortexie.
    7. Odzyskaj DNA poprzez wirowanie przy 16,000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min. Odlej nadsącz i zachowaj osad.
    8. Przemyj osad 200 µL etanolu (70%). Wiruj przy 16,000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min i usuń nadsącz. Odparuj etanol, inkubując probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 min z otwartą zakrętką.
      UWAGA: Jeśli w probówce nadal widoczny jest płyn, powtórz krok 4.1.8. Nie susz osadu dłużej niż przez 10 min, aby zapobiec zmniejszeniu rozpuszczalności DNA.
    9. Rozpuść DNA w 50 µL buforu TE. Przechowuj oczyszczone DNA w temperaturze 4 °C.
  2. Dla każdego miejsca integracji zaprojektuj sekwencje DNA flankujące integrację (ok. 500 bp) w taki sposób, aby po wprowadzeniu DNA donora usunięte zostało około 1000 bp genomowego DNA (patrz schemat projektowania na Ryc. 2B oraz sekwencje w Tabeli uzupełniającej 4).
  3. Zaprojektuj startery do wygenerowania regionów flankujących metodą PCR.
    1. Dla lewego regionu flankującego zaprojektuj startery forward i reverse do amplifikacji około 500 bp regionu genomowego DNA położonego 5’ (po lewej stronie) od miejsca integracji.
      UWAGA: Starter forward zawiera 20 bp homologicznych do zamierzonego regionu flankującego. Starter reverse zawiera 20 bp homologicznych do zamierzonego regionu flankującego oraz pożądaną 50-bp sekwencję łącznikową, aby umożliwić późniejszy montaż in vivo podczas edycji genomu za pomocą Cas12a.
    2. Dla prawego regionu flankującego zaprojektuj startery forward i reverse do amplifikacji około 500 bp regionu genomowego DNA położonego 3’ (po prawej stronie) od miejsca integracji.
      UWAGA: Starter forward zawiera 20 bp homologicznych do zamierzonego regionu flankującego oraz pożądaną 50-bp sekwencję łącznikową, aby umożliwić późniejszy montaż in vivo podczas edycji genomu za pomocą Cas12a. Starter reverse zawiera 20 bp homologicznych do zamierzonego regionu flankującego.
  4. Amplifikuj regiony flankujące za pomocą zaprojektowanych starterów (np. startery od KC-109 do KC-120 zamieszczone w Tabeli uzupełniającej 2).
    1. Zmierz stężenie oczyszczonego genomowego DNA, który posłuży jako matryca w reakcji PCR. Doprowadź stężenie DNA do 50 ng/µL.
    2. Przygotuj mieszaniny do amplifikacji PCR składające się z genomowego DNA (1–4 µL rozcieńczenia genomowego DNA o stężeniu 50 ng/µL) oczyszczonego w kroku 4.1, starterów forward i reverse (po 10 µM każdego), 1 µL dNTPs 10 mM, 10 µL 5x buforu wymaganego dla polimerazy DNA, 0.5 µL polimerazy DNA (1.0 U) oraz ultra czystej H2O do całkowitej objętości 50 µL.
    3. Przeprowadź reakcje PCR w termocyklerze zgodnie z następującym programem: (i) 98 °C przez 3 min, (ii) 98 °C przez 20 s, (iii) 60 °C przez 20 s, (iv) 72 °C przez 15 s; powtórz kroki (ii) do (iv) 30 razy, (v) 72 °C przez 5 min, (vi) utrzymuj w 12 °C do czasu dalszej analizy.
  5. Przeanalizuj produkty PCR metodą elektroforezy na żelu agarozowym 0.8% przy 5 V/cm przez 40 min, używając barwnika do ładowania DNA oraz drabiny DNA z fragmentami w zakresie od 100 do 10,000 bp.
  6. Oczyść prawidłowe produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcją producenta.

5. Transformacja do S. cerevisiae

UWAGA: Transformację należy przeprowadzić zgodnie z protokołem opartym na metodach opracowanych przez Gietz et al. (1995)30 oraz Hill et al.31, które można stosować dla różnych szczepów S. cerevisiae. Poniższy protokół jest wystarczający dla 1 transformacji.

  1. Przygotuj roztwory niezbędne do transformacji.
    1. Przygotuj następujące roztwory stokowe i wysterylizuj je przez filtrację: bufor 10x TE zawierający 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, objętość całkowita 50 mL; 1 M LiAc o pH 7,5, objętość całkowita 50 mL; 50% PEG 4000, objętość całkowita 100 mL.
      UWAGA: Zawsze sprawdzaj, czy roztwór stokowy PEG 4000 ma pH 5. Roztworu stokowego tego nie należy przechowywać dłużej niż miesiąc.
    2. Przygotuj następujące roztwory z roztworów stokowych: przygotuj roztwór LiAc-TE zawierający 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, objętość całkowita 0,5 mL. Przygotuj roztwór PEG-LiAc-TE zawierający 40% PEG 4000, 0,1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, objętość całkowita 1 mL.
      UWAGA: Dla powodzenia transformacji kluczowe jest, aby roztwory PEG-LiAc-TE i LiAc-TE były świeżo przygotowane.
  2. Pierwsza runda transformacji (przygotowanie szczepu z uprzednią ekspresją Cas12a).
    UWAGA: We wszystkich etapach transformacji należy używać wody o pH wyższym niż 5. Zaleca się stosowanie wody demineralizowanej na wszystkich etapach transformacji.
    1. Przygotuj przedkulturę, hodując szczep CEN.PK113-7D w kolbie wytrząsowej o pojemności 100 mL zawierającej 20 mL pożywki YEPD (2% glukozy) i inkubuj przez noc w 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm.
    2. Zmierz OD600 przedkultury (ODpc). Oblicz współczynnik rozcieńczenia (df) między objętością przedkultury a objętością świeżej pożywki wymaganej do przygotowania komórek z uprzednią ekspresją Cas12a, które zostaną użyte w transformacji (kultura transformacyjna). W obliczeniach przyjmij gęstość optyczną kultury transformacyjnej (ODtc) równą 1,0 po etapie inkubacji opisanym w 5.2.3 (ti).
      Równanie równowagi statycznej \(df=\frac{OD_{pc}}{OD_{tc}}\cdot2^{\frac{ti}{\tau}}\), użyte w analizie danych.
      gdzie ti i τ to odpowiednio czas inkubacji i czas podwojenia.
      1. Oblicz objętość przedkultury (Vi) wymaganą do zaszczepienia kultury transformacyjnej (Vtc) na podstawie współczynnika rozcieńczenia.
        Równanie obliczania objętości Vi=Vtc/df; formuła edukacyjna, zwięzła koncepcja analizy.
    3. Przygotuj kulturę transformacyjną poprzez zaszczepienie 20 mL YEPD (2% glukozy) (Vtc) objętością przedkultury ustaloną w poprzednim kroku (Vi). Inkubuj w 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm.
    4. Mierz OD600 kultury transformacyjnej, aż zostanie osiągnięta wartość OD600 równa 1,0.
    5. Zbierz komórki poprzez wirowanie 20 mL hodowli przy 2 500 x g przez 5 min. Odlej nadsącz i przemyj komórki w 20 mL wody demineralizowanej w temperaturze pokojowej. Powtórz etap wirowania i zachowaj osad komórkowy.
    6. Resuspenduj komórki w 100 µL roztworu LiAc-TE i przenieś do probówki do mikrocentryfugi.
    7. Dodaj 5 µL jednoniciowego nośnikowego DNA (10 mg/mL DNA z plemni łososia) i wymieszaj poprzez pipetowanie.
    8. Pipetuj 1 µg plazmidu pCSN067 do probówki do mikrocentryfugi.
      UWAGA: Całkowita objętość mieszaniny DNA nie powinna przekraczać 100 µL, aby uniknąć obniżenia wydajności transformacji.
    9. Dodaj 600 µL roztworu PEG-LiAc-TE i wymieszaj poprzez pipetowanie. Inkubuj przez 30 min w 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 450 rpm w nasโตłowym bloku grzejnym.
    10. Dodaj 70 µL DMSO (100%) do mieszaniny transformacyjnej i wymieszaj poprzez pipetowanie. Przeprowadź szok termiczny, inkubując mieszaninę transformacyjną w 42 °C przez 15 minut w łaźni wodnej.
    11. Zregeneruj komórki, przenosząc mieszaninę do probówki o dnie okrągłym o pojemności 15 mL i dodając do niej 10 mL YEPD (2% glukozy). Inkubuj przez noc w 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm.
    12. Wirowuj mieszaninę transformacyjną przy 2 500 x g przez 5 min. Odlej nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w około 200 µL pozostałego roztworu.
    13. Wysiej 150 µL mieszaniny transformacyjnej oraz 20-krotne rozcieńczenie mieszaniny transformacyjnej w YEPD (2% glukozy) na płytki z agarem YEPD (2% glukozy) uzupełnione o 0,2 g/L G418. Inkubuj płytki w 30 °C przez 48–72 godziny.
    14. Wybierz pojedynczego transformanta i ponownie wysiej go na płytkę z agarem YEPD (2% glukozy) uzupełnioną o 0,2 g/L G418, aby uzyskać pojedyncze kolonie.
  3. Druga runda transformacji (przeprowadzenie multipleksowej edycji genomu za pomocą CRISPR/Cas12a).
    1. Przygotuj przedkulturę, hodując szczep z uprzednią ekspresją Cas12a, stworzony w pierwszej rundzie transformacji (krok 5.2), w kolbie wytrząsowej o pojemności 100 mL zawierającej 20 mL pożywki YEPD (2% glukozy) uzupełnionej o 0,2 g/L G418. Inkubuj przez noc w 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm.
      UWAGA: W przypadku wielu transformacji dostosuj objętość przedkultury.
    2. Postępuj zgodnie z krokami od 5.2.2 do 5.2.7 dla pierwszej rundy transformacji.
      UWAGA: W przypadku wielu transformacji dostosuj objętości wymaganych roztworów i kultur szczepu z uprzednią ekspresją Cas12a.
    3. Pipetuj 1 µg pojedynczej macierzy crRNA, 1 µg zlinearyzowanego plazmidu biorcy dla macierzy crRNA, 1 µg DNA donorowego oraz 1 µg każdego regionu flankującego (krok 4.3) do probówki do mikrocentryfugi.
      UWAGA: Całkowita objętość mieszaniny DNA nie powinna przekraczać 100 µL, aby uniknąć obniżenia wydajności transformacji.
    4. Przygotuj następujące kontrole transformacji: kontrolę negatywną (ultraczysta H2O); kontrolę pozytywną do wyznaczenia wydajności transformacji (1 µg kolistego pRN1120); kontrolę weryfikującą, czy wprowadzenie DNA donorowego odbywa się poprzez edycję CRISPR (1 µg kolistego pRN1120, 1 µg wszystkich kaset ekspresyjnych DNA donorowego i 1 µg regionów flankujących, ale bez pojedynczej macierzy crRNA); kontrolę weryfikującą, czy DNA donorowe może zostać zintegrowane poza celem (1 µg zlinearyzowanego pRN1120, 1 µg kaset ekspresyjnych DNA donorowego i 1 µg pojedynczej macierzy crRNA, ale bez regionów flankujących); kontrolę weryfikującą pełną linearyzację pRN1120 (1 µg zlinearyzowanego pRN1120).
    5. Postępuj zgodnie z krokami od 5.2.9 do 5.2.12 dla pierwszej rundy transformacji.
    6. Wysiej 150 µL mieszaniny transformacyjnej oraz 20-krotne rozcieńczenie mieszaniny transformacyjnej w YEPD (2% glukozy) na agar YEPD (2% glukozy) uzupełniony o 0,2 g/L G418 i 0,2 g/L NTC. Wysiej kontrole na agar YEPD (2% glukozy) uzupełniony odpowiednim selektorem (G418 i/lub NTC lub bez selekcji). Inkubuj płytki w 30 °C przez 48–72 godziny.
    7. Wybierz pojedynczego zabarwionego transformanta i ponownie wysiej go na płytkę z agarem YEPD (2% glukozy), aby uzyskać pojedyncze zabarwione kolonie.

6. Ocena wydajności edycji genomu

  1. Policz liczbę kolonii barwnych oraz kolonii białych na płytkach po transformacji.
  2. Oblicz wydajność edycji genomu, dzieląc liczbę kolonii barwnych przez całkowitą liczbę kolonii (zarówno białych, jak i barwnych), zgodnie z Tabelą 1.

7. Potwierdzenie integracji donorowego DNA w docelowych loci

  1. Ponownie wysiać kolorową pojedynczą kolonię z płytki po transformacji na płytkę z agarem YEPD (2% glukozy) bez G418 i selekcji NTC, a następnie inkubować przez 48 godzin w temperaturze 30 °C.
  2. Wybrać pojedynczą kolonię i zaszczepić ją do kolby inkubacyjnej o pojemności 500 mL wypełnionej 100 mL pożywki YEPD (2% glukozy). Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm.
  3. Wyizolować genomowe DNA zgodnie z opisem w sekcji 4.1.
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować protokół przygotowania drożdży do kolonialnej reakcji PCR zaproponowany wcześniej przez Looke et al.32. W takim przypadku można pominąć etap wzrostu w pożywce płynnej (sekcja 7.2).
  4. Zweryfikować poprawność integracji poprzez amplifikację dwóch fragmentów na każdą zintegrowaną kasetę ekspresyjną.
    1. Zaprojektować primery, które przyłączają się do genomowego DNA poza transformowanymi regionami flankującymi oraz poza genem zainteresowania (patrz przykłady w Tabeli uzupełniającej 2, KC-121 do KC-132). Podczas stosowania primerów KC-121 do KC-132 ustawić temperaturę przyłączania w programie PCR na 62 °C.
    2. Amplifikować interesujący region zgodnie z opisem w sekcji 4.4.2. Dostosować program PCR, a w szczególności skorygować czas etapu elongacji w reakcji PCR zgodnie z długością matrycy i zaleceniami producenta polimerazy DNA.
  5. Sprawdzić wielkość produktów PCR za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym (0.8%, 40 min, 5 V/cm), używając barwnika do ładowania DNA oraz markera wielkości DNA z fragmentami w zakresie od 100 do 10 000 bp.

8. Tworzenie drożdżowej sztuki pikselowej przy użyciu akustycznego dozownika cieczy

  1. Przygotuj szablon obrazu dla drożdżowego pixel artu.
    1. Zmień rozmiar oryginalnego obrazu RGB (220 × 280 pikseli, patrz wyniki reprezentatywne), np. za pomocą programu ImageJ, aby utworzyć końcowy obraz w skali szarości o wymiarach 64 × 96 pikseli (szerokość × wysokość), wizualizowany w zamierzonych kolorach (Wyniki Reprezentatywne).
    2. Konwertuj obraz RGB na skalę szarości, stosując następujący wzór:
      Wzór intensywności skali szarości, \(I_{gr} = (I_r + I_g + I_b) / 3\), równanie, przetwarzanie kolorów.
      gdzie Igr, Ir, Ig, Ib to odpowiednio intensywności koloru szarego, czerwonego, zielonego i niebieskiego.
    3. W celu kategoryzacji pikseli opracuj wtyczkę do programu ImageJ stosującą następujące reguły: (a) Jeśli Igr wynosi ≤ 64, dla tego piksela użyj ciemnopomarańczowych drożdży (szczep 1, Tabela uzupełniająca 3). (b) Jeśli 64 < Igr ≤ 128, dla tego piksela użyj pomarańczowych drożdży (szczep 2, Tabela uzupełniająca 3). (c) Jeśli 128 < Igr ≤ 192, dla tego piksela użyj żółtych drożdży (szczep 3, Tabela uzupełniająca 3). (d) Jeśli Igr > 192, dla tego piksela użyj białych drożdży (CEN.PK113-7D).
  2. Nanieś komórki drożdży, aby utworzyć drożdżowy pixel art.
    1. Zaszczep kolby shake-flask o pojemności 500 mL zawierające 100 mL podłoża YEPD (2% glukozy) trzema szczepami S. cerevisiae produkującymi karotenoidy o różnych kolorach oraz szczepem typu dzikiego CEN.PK113-7D. Inkubuj kultury przez noc w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 rpm.
    2. Przenieś 0,5 mL kultury nocnej do probówki wypełnionej 0,5 mL sterylnego niejonowego podłoża gradientu gęstości (patrz Tabela materiałów). Wymieszaj krótko za pomocą wortexa.
    3. Przenieś zawiesinę komórek do odpowiedniego zbiornika (reservoir), 2 × 3 dołki. Wykonaj nanoszenie kroplowe (spotting) przy użyciu akustycznego dozownika cieczy z płytki źródłowej zbiornika do mikropłytki (patrz Tabela materiałów) zawierającej 50 mL agaru YEPD (2% glukozy). Aby uprościć wysiew, zdefiniuj dołki na płytce, np. traktując mikropłytkę jako płytkę 6144-dołkową (64 × 96).
    4. Nanieś 25 nL każdego szczepu S. cerevisiae z płytki źródłowej zbiornika 2 × 3 dołki, korzystając z pliku .csv z ustawieniem kalibracji cieczy 6RES_AQ_GPSA2 na docelową mikropłytkę. Zdefiniuj każdą z tych kropel 25 nL jako piksel w siatce 64 × 96, która jest przekładana na pozycje dołków (A01, B01, C01 itd.).
    5. Inkubuj mikropłytkę w temperaturze 30 °C przez 48 godzin. Aby zintensyfikować kolory szczepów, przechowuj płytkę agarową w temperaturze 4 °C przez co najmniej 72 godziny.

Wyniki

Protokół multipleksowej edycji genomu z wykorzystaniem CRISPR/Cas12a został zademonstrowany poprzez konstrukcję trzech szczepów S. cerevisiae produkujących karotenoidy, wykazujących ekspresję genów crtE, crtYB oraz crtI pod kontrolą heterologicznych promotorów o wysokiej, średniej i niskiej sile: odpowiednio szczep 1, 2 i 3 (Supplementary Table 3). Konstrukcja tych szczepów wymagała stworzenia trzech kaset ekspresyjnych donorowego DNA oraz sześciu regionów flankujących na szczep w celu celowania w trzy różne loci w DNA genomicznym (pokazane na Figure 2B). Jak opisano w niniejszym protokole, promotor, otwarta ramka odczytu, terminator oraz dwie przyległe 50-bp sekwencje łącznikowe zostały zmontowane w kasetę ekspresyjną za pomocą reakcji klonowania Golden Gate, a poprawność montażu zweryfikowano za pomocą PCR (Figure 3A). Pojedyncza macierz crRNA została zamówiona jako syntetyczny fragment DNA i namnożona metodą PCR (Figure 3B). Plazmid biorca dla pojedynczej macierzy crRNA (plazmid pRN1120) został zlinearyzowany enzymami EcoRI-HF oraz XhoI, a linearyzację potwierdzono metodą elektroforezy (Figure 3C). Projekt i sekwencje nukleotydowe wprowadzonych kaset ekspresyjnych donorowego DNA oraz regionów flankujących przedstawiono w Supplementary Table 3 and Supplementary Table 4. Sekwencja kaset ekspresyjnych pojedynczej macierzy crRNA znajduje się w Supplementary Table 1. Funkcjonalność spacerów zawartych w pojedynczej macierzy crRNA została wcześniej przetestowana poprzez pojedynczą edycję genomu z użyciem poszczególnych crRNA19.

Wydajność edycji genomu z wykorzystaniem Cas12a oceniono w pierwszej kolejności na podstawie liczby barwnych kolonii uzyskanych po transformacji (Tabela 1, Rysunek 4). Wydajność edycji w trzech skonstruowanych szczepach wynosiła od 50% do 94%. Warto zauważyć, że wprowadzenie kaset ekspresyjnych użytych do wytworzenia szczepu 1 wykazało najniższą wydajność edycji, co mogło być spowodowane naturą donorowego DNA (i.e., kasety ekspresyjne te kodują crtE, crtYB i crtI pod kontrolą trzech silnych promotorów). Następnie za pomocą PCR potwierdzono prawidłową integrację trzech kaset ekspresyjnych donorowego DNA w zamierzonych loci w DNA genomowym (Rysunek 5). Primery zaprojektowano w taki sposób, aby produkty PCR powstawały tylko w przypadku prawidłowej integracji donorowego DNA w zamierzonym locus. Dla każdego eksperymentu transformacyjnego z płytki transformacyjnej wybrano i przebadano osiem kolonii (należy zauważyć, że na Rysunku 5 przedstawiono tylko trzy). Generalnie, spośród 8 badanych kolonii na każdy fragment donorowego DNA, prawidłowa integracja donorowego DNA crtE w locus INT1, crtYB w locus INT2 oraz crtI w locus INT3 została potwierdzona w >90% transformantów. Wyniki te demonstrują, że system CRISPR/Cas12a w połączeniu z pojedynczą macierzą crRNA umożliwia wydajną edycję multipleksową genomu S. cerevisiae w wielu loci jednocześnie.

Dodatkowo demonstrujemy tworzenie „pikselowej sztuki drożdżowej” przy użyciu trzech skonstruowanych szczepów produkujących karotenoidy wraz z niebarwiącym szczepem typu dzikiego. Wyjściowo, na podstawie czarno-białego zdjęcia Rosalind Franklin (Rysunek 6A), stworzono obraz 4-kolorowy (Rysunek 6B) oraz listę rozmieszczenia, która posłużyła następnie do naniesienia czterech różnych szczepów drożdży na mikropłytkę agarową za pomocą akustycznego dozownika cieczy, co zaowocowało uzyskaniem wysokorozdzielczego „obrazu drożdżowego” Rosalind Franklin (Rysunek 6C,D,E).

Schemat przygotowania pojedynczej macierzy crRNA do edycji Cas12a; metody PCR i wyniki sztuki pikselowej drożdży.
Rysunek 1: Schemat procedury dla multipleksowej edycji genomu CRISPR/Cas12a w S. cerevisiae. Schemat obejmuje kluczowe etapy przedstawionej metody. Szczegóły znajdują się w sekcji Protokół. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat edycji genów CRISPR-Cas12a; zlinearyzowany wektor z crRNA, ilustrujący miejsca cięcia.
Rysunek 2: Schemat multipleksowej edycji genomu CRISPR/Cas12a z wykorzystaniem pojedynczej macierzy crRNA. (A) Pojedyncza macierz crRNA składa się z trzech jednostek crRNA w ich dojrzałej formie, 20-bp powtórzenia bezpośredniego specyficznego dla LbCas12a (szare kwadraty) z 23-bp sekwencją naprowadzającą (kolorowe romby). Ekspresja macierzy crRNA jest umożliwiona przez promotor SNR52 i terminator SUP4. Transformacja S. cerevisiae zlinearyzowanym pRN1120 oraz kasetą ekspresyjną pojedynczej macierzy crRNA zawierającą sekwencje homologiczne do pRN1120 (ukośne pasy) pozwala na rekombinację in vivo do kolistego plazmidu w komórkach uprzednio eksprimujących LbCas12a. Pojedyncza macierz crRNA jest następnie przetwarzana przez Cas12a. (B) Cas12a jest kierowany do zamierzonych genomowych miejsc docelowych INT1, INT2 i INT3 i tworzy pęknięcia obu nici DNA. W mieszaninie transformacyjnej uwzględniono donorowe DNA składające się z regionów flankujących i kasety ekspresyjnej genu karotenoidów. Zespoły donorowego DNA zostały skierowane do jednego odcinka DNA w genomowym DNA wokół loci INT1 (crtE), INT2 (crtYB) i INT3 (crtI) poprzez rekombinację in vivo dzięki obecności 50-bp homologicznych sekwencji łączących, oznaczonych jako 5, A, B, C, D lub E. P1–P3, różne promotory; T1–T3, różne terminatory. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Verwaal et al. 201819. Konstrukcje genetyczne przedstawiono za pomocą symboli wizualnych Synthetic Biology Open Language (SBOL)40. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza elektroforezą w żelu; separacja DNA; drabina; markery bp; wyniki; eksperyment z biologii molekularnej.
Rycina 3: PCR weryfikująca eksperymenty edycji genomu. (A) Weryfikacja reakcji klonowania Golden Gate zmontowanych kaset donora DNA. Uzyskane wyniki są zgodne z oczekiwaną długością. (B) PCR pojedynczej macierzy crRNA. (C) Linearyzacja plazmidu pRN1120. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wzrost kolonii bakteryjnych na płytkach agarowych, schemat porównawczy, wyniki eksperymentu, analiza mikrobiologiczna.
Rycina 4: Płytki z transformacjami S. cerevisiae z zastosowaniem podejścia multipleksowej edycji genomu. (A) Szczep 1 wykazujący ekspresję crtE, crtYB i crtI pod kontrolą trzech silnych promotorów (ciemnopomarańczowe kolonie). (B) Szczep 2 wykazujący ekspresję crtE, crtYB i crtI pod kontrolą trzech promotorów o średniej sile (pomarańczowe kolonie). (C) Szczep 3 wykazujący ekspresję crtE, crtYB i crtI pod kontrolą trzech słabych promotorów (żółte kolonie). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki elektroforezy żelowej wykazujące separację fragmentów DNA i identyfikację kolonii dla edycji genów.
Rycina 5: PCR weryfikująca integrację kaset ekspresyjnych DNA donora w docelowych loci w obrębie DNA genomowego. (A) Weryfikacja trzech kolonii szczepu 1. (B) Weryfikacja trzech kolonii szczepu 2. (C) Weryfikacja trzech kolonii szczepu 3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przekształcenie zdjęcia Rosalind Franklin w obraz 3D; układ spektrofotometryczny w laboratorium; pikselizacja kolorystyczna.
Rycina 6: Drożżowy pixel art przedstawiający Rosalind Franklin. (A) Czarno-białe zdjęcie RGB Rosalind Franklin o wymiarach 220 × 280 pikseli, które posłużyło jako szablon. (B) Komputerowa konwersja czarno-białego zdjęcia Rosalind Franklin na 4-kolorową listę pikseli o wymiarach 64 × 96. (C) Zdjęcie drożżowego pixel artu zawierającego 64 × 96 kolonii drożdży wraz z powiększonym fragmentem. (D) Zdjęcie akustycznego dozownika cieczy z dwiema w pełni wyrosłymi płytkami. (E) Zdjęcie w pełni wyrosłej mikropłytki z 64 × 96 koloniami drożdży. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Szczep 1Szczep 2Szczep 3
Kolorowe kolonie16279220
Białe kolonie161818
Łączna liczba kolonii32297238
Wydajność50%94%92%

Tabela 1: Efektywność edycji w podejściu do multipleksowej edycji genomu.

sekwencja macierzy crRNAa,b,c,d,e,f
CATGTTTGACAGCTTATCATCGATAATCCGGAGCTAGCATGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGTCTTTGAAAA
GATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGG
TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA
TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC
ATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCAATTTCTACTAAGTGTAGAT
CTGGTGGGAGAGAAAGCTTATGAAATTTCTACTAAGTGTAGATGTGCCGTAC
GCCGGAGCCGACGGAATTTCTACTAAGTGTAGATTGCCCCTCTTATACGATTATATTTT
TTTTTGTTTTTTATGTCTGGGGGGCCCGGTACCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG
GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG
a. Homologia do pRN1120 (pogrubiono).
b. promotor SNR52 (kursywa).
c. Genomowe sekwencje docelowe (podkreślone).
d. Bezpośrednie powtórzenia naprowadzające specyficzne dla LbCas12a (kursywa, pogrubienie).
e. terminator SUP4 (kursywa).
f. Homologia do pRN1120 (pogrubiono).

Tabela uzupełniająca 1: Pojedyncza macierz crRNA dla LbCas12a zawierająca homologię z plazmidem pRN1120.

NazwaSekwencjaaOpisbPunkt zastosowania
KC-101CATGTTTGACAGCTTATCATCStarter FW do amplifikacji pojedynczej macierzy crRNA2.1.4
KC-102CACACAGGAAACAGCTATGACStarter RV do amplifikacji pojedynczej macierzy crRNA2.1.4
KC-103AAGCGACTTCCAATCGCTTTGCStarter FW do amplifikacji DNA donorowego z konektorem 53.6.1
KC-104AAAGCAAAGGAAGGAGAGAACStarter RV do amplifikacji DNA donorowego z konektorem A3.6.1
KC-105CGGATCGATGTACACAACCGStarter FW do amplifikacji DNA donorowego z konektorem B3.6.1
KC-106CAACAGGAGGCGGATGGATATACStarter RV do amplifikacji DNA donorowego z konektorem C3.6.1
KC-107AACGTTGTCCAGGTTTGTATCCStarter FW do amplifikacji DNA donorowego z konektorem D3.6.1
KC-108AGGTACAACAAGCACGACCGStarter RV do amplifikacji DNA donorowego z konektorem E3.6.1
KC-109CACTATAGCAATCTGGCTATATGStarter FW do amplifikacji INT1 5' z konektorem 54.4
KC-110AAACGCCTGTGGGTGTGGTAC
TGGATATGCAAAGCGATTGGAA
GTCGCTTGACTCCTCTGCCGTC
ATTCC		Starter RV do amplifikacji INT1 5' z konektorem 54.4
KC-111TTGCCCATCGAACGTACAAG
TACTCCTCTGTTCTCTCCTTCCTT
TGCTTTAAGCGTTGAAGTTTCCTC
TTTG		Starter FW do amplifikacji INT1 3' z konektorem A4.4
KC-112TGTCAACTGGAGAGCTATCGStarter RV do amplifikacji INT1 3' z konektorem A4.4
KC-113AGAAGATTTCTCTTCAATCTCStarter FW do amplifikacji INT2 5' z konektorem B4.4
KC-114TGCTAAGATTTGTGTTCGTT
TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT
CGATCCGCCCTTATCAAGGATACC
TGGTTG		Starter RV do amplifikacji INT2 5' z konektorem B4.4
KC-115ACGCTTTCCGGCATCTTCCA
GACCACAGTATATCCATCCGCCT
CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG
GTGG		Starter FW do amplifikacji INT2 3' z konektorem C4.4
KC-116TCTCCTCTTCGATGACCGGGStarter RV do amplifikacji INT2 3' z konektorem C4.4
KC-117GGTCGTTTTTGTGCAGCATATTGStarter FW do amplifikacji INT3 5' z konektorem D4.4
KC-118GCGGAATATTGGCGGAACGG
ACACACGTGGATACAAACCTG
GACAACGTTTTCCAAGGAGGTG
AAGAACG		Starter RV do amplifikacji INT3 5' z konektorem D4.4
KC-119AAATAACCACAAACATCCTT
CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT
GTACCTGATGGGACGTCAGCACT
GTAC		Starter FW do amplifikacji INT3 3' z konektorem E4.4
KC-120GAGCTTACTCTATATATTCATTCStarter RV do amplifikacji INT3 3' z konektorem E4.4
KC-121GTTACTAAACTGGAACTGTCCGStarter FW do weryfikacji integracji con5-crtE-conA z INT1 5'7.4.1
KC-122CACTGCTAACTACGTTTACTTCStarter FW do weryfikacji integracji con5-crtE-conA z INT1 3'7.4.1
KC-123CACTGGAACTTGAGCTTGAGStarter FW do weryfikacji integracji conB-crtYB-conC z INT2 5'7.4.1
KC-124GTCTCCAGCTGAATTGGTCCStarter FW do weryfikacji integracji conB-crtYB-conC z INT2 3'7.4.1
KC-125CTCTCATGAAGCAGTCAAGTCStarter FW do weryfikacji integracji conD-crtI-conE z INT3 5'7.4.1
KC-126GATCGGTCAATTAGGTGAAGStarter FW do weryfikacji integracji conD-crtI-conE z INT3 3'7.4.1
KC-127CCTTGTCCAAGTAGGTGTCCStarter RV do weryfikacji integracji con5-crtE-conA z INT1 5'7.4.1
KC-128GCTGTCATGATCTGTGATAACStarter RV do weryfikacji integracji con5-crtE-conA z INT1 3'7.4.1
KC-129CTGGCAATGTTGACCAATTGCStarter RV do weryfikacji integracji conB-crtYB-conC z INT2 5'7.4.1
KC-130CCAACGTGCCTTAAAGTCTGStarter RV do weryfikacji integracji conB-crtYB-conC z INT2 3'7.4.1
KC-131CCTTACCTTCTGGAGCAGCAGStarter RV do weryfikacji integracji conD-crtI-conE z INT3 5'7.4.1
KC-132CTGGTTACTTCCCTAAGACTGStarter RV do weryfikacji integracji conD-crtI-conE z INT3 3'7.4.1
a. Pogrubione sekwencje oznaczają sekwencje konektorów.
b. Startery Forward i Reverse oznaczono odpowiednio jako FW i RV.

Tabela uzupełniająca 2: Sekwencje starterów.

Tabela integracji genetycznej, przedstawiająca szczegóły dotyczące promotora, ORF i terminatora w różnych szczepach do edycji genów.
Tabela uzupełniająca 3: Projekt skonstruowanych szczepów.

Wykres sekwencjonowania DNA, macierz multipleksowa, pokazująca sekwencje DNA flankujące miejsce integracji do analizy badawczej.
Tabela uzupełniająca 4: Sekwencje kaset ekspresyjnych DNA donora oraz regionów flankujących. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Dostarczony protokół opisuje multipleksową edycję genomu S. cerevisiae przy użyciu Cas12a z bakterii Lachnospiraceae ND2006 w połączeniu z pojedynczą macierzą crRNA i DNA dawcy. Szczegółowo wyjaśniono budowę pojedynczej macierzy crRNA i DNA dawcy. W przeciwieństwie do dobrze znanego systemu CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12a ma unikalną dodatkową zdolność przetwarzania wielu crRNA wyrażonych z jednej macierzy crRNA13,33. Dzięki tej funkcji jednoczesna edycja wielu celów jest łatwiejsza do skonfigurowania i może być osiągnięta w jednej transformacji. To podejście z pojedynczą macierzą crRNA zostało już wcześniej zademonstrowane przez Zetsche i wsp. 34 którzy jednocześnie edytowali do czterech genów w komórkach ssaków za pomocą AsCas12a oraz przez Swiat i wsp. 35 osób, które wprowadziły cztery fragmenty DNA do genomu drożdży za pomocą FnCas12a. O ile nam wiadomo, nie zgłoszono większej liczby jednoczesnych modyfikacji genomu przy użyciu systemu Cas12a, a maksymalny limit celów dla pojedynczej macierzy dla Cas12a nie został jeszcze określony. Dalsze badania z wykorzystaniem pojedynczych macierzy crRNA w połączeniu z Cas12a obejmują multipleksową regulację transkrypcji w szerokim zakresie organizmów 33,36,37.

W przedstawionym protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Starannie zaprojektuj wszystkie sekwencje DNA, które są zaangażowane w eksperyment edycji genomu Cas12a, zwłaszcza w przypadku wprowadzania nowych sekwencji DNA. Określ funkcjonalność nowych sekwencji dystansowych będących częścią crRNA, na przykład za pomocą eksperymentu z edycją genomu singleplex, jak opisano przez Verwaal i wsp. 19 przed połączeniem ich w pojedynczą macierz crRNA. Postępuj zgodnie z zaleceniami dotyczącymi przygotowania roztworów transformacyjnych stosowanych w eksperymencie edycyjnym Cas12a, aby osiągnąć dobrą wydajność przemiany drożdży.

Istnieje kilka opcjonalnych modyfikacji techniki. Zaleca się użycie 1 μg każdego DNA dawcy, zlinearyzowanej kasety ekspresyjnej pRN1120 lub pojedynczej kasety ekspresji macierzy crRNA w transformacji, chociaż oczekuje się, że użycie mniejszej ilości DNA również spowoduje zadowalającą wydajność transformacji. Wykonaj transformację testową, aby określić, czy można użyć niższych ilości DNA. Transformacja S. cerevisiae może być przeprowadzona przy użyciu innej metody niż opisana w tym protokole, na przykład protokołu opisanego przez Gietza i in. (2007)38. Plazmid pRN1120 biorcy przewodnika RNA jest odpowiedni do ekspresji pojedynczego crRNA i pojedynczej macierzy crRNA różnych wariantów Cas12a (np. z Acidaminococcus spp. BV3L6 lub Francisella novicida U112), a także do ekspresji sgRNA w połączeniu z Cas919. DNA dawcy nie musi być ograniczone do kaset ekspresji genów karotenoidów i regionów flankujących, które kierują DNA dawcy do opisanych miejsc INT1, INT2 i INT3 w genomowym DNA. Dowolne DNA będące przedmiotem zainteresowania może zostać wprowadzone, w sposób multipleksowy, do genomowego DNA gospodarza zgodnie z zasadami projektowania opisanymi w niniejszym protokole, lub alternatywnie DNA dawcy może być użyte do usunięcia DNA z genomu gospodarza. Modułowa budowa pojedynczej macierzy crRNA ułatwia łatwą regulację sekwencji dystansowych i bezpośrednich powtórzeń. Modyfikacja sekwencji dystansowych pozwala na zmianę zamierzonego locus integracji, który może być zaprojektowany przez jedno z narzędzi do identyfikacji genomowego miejsca docelowego, np. oprogramowanie GuideScan 1.039. Zamiast używać dużych sekwencji flankujących, które zawierają sekwencje łączników, 50-bp regionu flankującego można włączyć do sekwencji DNA dawcy poprzez włączenie tych 50-pz sekwencji regionu flankującego do starterów stosowanych w PCR. W tym przypadku do udanego eksperymentu z multipleksową edycją genomu potrzebne są tylko trzy zamiast dziewięciu fragmentów DNA dawcy.

Podsumowując, protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku, jak przeprowadzić multipleksową edycję genomu u S. cerevisiae przy użyciu Cas12a w połączeniu z podejściem z pojedynczą macierzą crRNA. Protokół zademonstrowano poprzez multipleksową edycję genomu przy użyciu 9 fragmentów DNA dawcy i pojedynczej macierzy crRNA kodującej trzy gRNA. Wykazujemy wysoką ogólną częstotliwość edycji od 50% do 94% dla trzech opisanych tutaj projektów szczepów. Podsumowując, unikalną cechą Cas12a jest zdolność do przetwarzania pojedynczej macierzy crRNA na pojedyncze crRNA w komórce, co sprawia, że Cas12a jest doskonałym narzędziem umożliwiającym multipleksową edycję genomu i opracowywanie modułów regulacji transkrypcji ukierunkowanych na wiele kaset ekspresyjnych za jednym razem. Ostatecznie uzyskano trzy szczepy produkujące karotenoidy na różnym poziomie i barwach w odcieniach od żółtego do pomarańczowego. Dzięki tym szczepom i szczepowi typu dzikiego pokazaliśmy, w jaki sposób można w prosty sposób wykorzystać płyn akustyczny do tworzenia pikselowej sztuki drożdży – na cześć Rosalind Franklin, która przyczyniła się do odkrycia struktury DNA 65 lat temu za pomocą swojego słynnego zdjęcia 5123.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że istnieje konflikt interesów. Autorzy złożyli wniosek o własność intelektualną związaną z prezentowanymi metodami.

Podziękowania

Ten projekt otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 686070 (DD-DeCaf) i 764591 (SynCrop) oraz z programu badawczego Building Blocks of Life o numerze projektu 737.016.005 przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO). T.E.G. był wspierany przez Royal Society (grant UF160357) i BrisSynBio, Centrum Badawcze Biologii Syntetycznej BBSRC/EPSRC (grant BB/L01386X/1). Dziękujemy Zi Di i Jeffreyowi van Wijkowi za ich wkład w eksperymenty z plamkami drożdży w celu stworzenia drożdżowej grafiki pikselowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals specyficzne dla protokołu
1 Kb Plus DNA LadderThermo Fisher Scientific10787018Elektroforeza
Sól sodowa ampicylinySigmaAldrich A9518Wybór transformantów E. coli
BsaI-HF (20 U/µ l)New England BioLabsR353LGolden Gate Roztwór
do lizy komórek klonujących (z zestawu Puregene Yeast/Bact. Kit B)QIAGEN854016Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae
CutSmart BufferNew England BioLabsB7204SLinearyzacja soli
sodowej kwasu dezoksyrybonukleinowego pRN1120 z jąder łososiaSigma AldrichD1626Transfromacja
S. cerevisiae (nośnik DNA)
dNTPsInvitrogen10297018PCR
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101SLinearyzacja pRN1120
Absolut etanolu do analizyMerck100983Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae
Kwas etylenodiamino-tetraoctowySigma AldrichEDTransformacja< br/> S. cerevisiae
G418 sól dwusiarczanowaSigma AldrichA1720Wybór transformantów S. cerevisiae
HistodenzSigma AldrichD2158 Drożdżowa sztuka pikselowa
IzopropanolMerck100993Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae
Octan litu dwuwodnySigma AldrichL6883Transformacja
S. cerevisiae
Nancy-520 Barwnik żelowy DNASigma Aldrich1494Elektroforeza
NEB10 kompetentne komórki E. coliNew England BioLabsC3019HTransformacja E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
NourseothricinJena BioscienceAB102Wybór transformantów S. cerevisiae
Bufor PhusionNew England BioLabsM0530LPCR
Phusion High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BioLabsM0530LPCR
Glikol polietylenowy 4000Merck7490Transformacja
S. cerevisiae
Roztwór do wytrącania białek (10 M NH4AC) (z zestawu Puregene Drożdże/Bact. Zestaw B)QIAGEN854016Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae
Fioletowy barwnik ładującyNew England BioLabsB7024SElektroforeza
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27106Oczyszczanie plazmidów
Mieszanka enzymów koktajlowych RNazyThermo Fisher ScientificAM2286Izolacja genomowego DNA z
bufora ligazy DNA SInvitrogen46300-018Golden Gate Klonowanie
Ligazy DNA T4 (1 U/&mikro; l)Invitrogen1705218Golden Gate Klonowanie
UltraPure AgarozaInvitrogen16500500Kreator elektroforezy
SV Żel i zestaw systemu czyszczenia PCRPromegaA9282Oczyszczanie produktów PCR i linearyzowanych pRN1120
XholNew England BioLabsR0146SpRN1120
50 mg / ml (5 jednostek/&mikro; L)Zymo ResearchE1006Izolacja genomowego DNA z S. cerevisiae (enzym lizy drożdży)
Bufor do przechowywania zymoliazyZymo ResearchE1004-BIzolacja genomowego DNA z S. cerevisiae (niezbędna do przygotowania enzymu do lizy drożdży)
Chemikalia ogólnego zastosowania
2*Ekstrakt peptonowo-drożdżowy (PY) Płyta agarowa wzrost pożywki
2*PYUprawa E. coli
WodaPrzemiana
buforu
ELFOElektroforeza
MQWiele etapów
Fizjologiczny roztwórPrzemiana
S. cerevisiae
TE Przechowywanie DNA, transformacja S. cerevisiae
Ekstrakt drożdżowy-pepton-dekstroza (YEPD; 2% glukozy) podłożeUprawa agaru
YEPD (2% glukozy)Wzrost płytki
S. cerevisiae
Materiały eksploatacyjne
Probówki Eppendorfa
Probówki Sokoła (50 ml)
Mikropłytka 96 dołków szalki
Petriego
Końcówki do pipet 0,5 - 10 i mikro; L
Końcówki do pipet 10 - 200 i mikro; L
Końcówki do pipet 100 - 1000 i mikro; L
Kolby wstrząsające (500 ml)
Sterylne filtry
Sprzęt
Wirówka (probówki Falcon)
Inkubator
Zestaw NanoDrop
do elektroforezy
Spektrofotometr
Wirówka stołowa (probówki Eppendorfa)
Termocykler
Plazmidy
pCSN067AddgeneID 101748https://www.addgene.org/
pRN1120AddgeneID 101750https://www.addgene.org/
szczepy
S. cerevisiae szczep
CEN. Kolekcja PK113-7D		EUROSCARFhttp://www.euroscarf.de
. cerevisiae T4 Linearyzacja zymoliazy E. coli demineralizowana S. cerevisiae soli bufor S. cerevisiae akustyczny Echo 525 do obsługi cieczy

Bibliografia

  1. Knott, G. J., Doudna, J. A. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science. 361 (6405), 866-869 (2018).
  2. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  3. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  4. Lian, J., HamediRad, M., Hu, S., Zhao, H. Combinatorial metabolic engineering using an orthogonal tri-functional CRISPR system. Nature Communications. 8 (1), 1688(2017).
  5. Li, Z. -H., Liu, M., Lyu, X. -M., Wang, F. -Q., Wei, D. -Z. CRISPR/Cpf1 facilitated large fragment deletion in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Basic Microbiology. 58 (12), 1100-1104 (2018).
  6. Shao, Y., Lu, N., Qin, Z., Xue, X. CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2706-2708 (2018).
  7. Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321 (5891), 960-964 (2008).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).
  10. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 13 (11), 722-736 (2015).
  11. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), (2016).
  12. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  13. Fonfara, I., Richter, H., Bratovič, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  14. Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601(2018).
  15. Ferreira, R., et al. Multiplexed CRISPR/Cas9 genome editing and gene regulation using Csy4 in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 10-15 (2018).
  16. Swarts, D. C., Martin, J. Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure–function comparisons and implications for genome editing. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481(2018).
  17. Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a. Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).
  18. Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
  19. Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).
  20. Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories. Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).
  21. Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS One. 3 (11), 3647(2008).
  22. Yeast Art project. , Available from: http://www.yeastart.org (2018).
  23. Franklin, R. E., Gosling, R. G. Molecular configuration in sodium thymonucleate. Nature. 171, 740-741 (1953).
  24. Watson, J. D., Crick, F. H. A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 171, 737-738 (1953).
  25. Wilkins, M. H. F., Stokes, A. R., Wilson, H. R. Molecular structure of deoxypentose nucleic acids. Nature. 171, 738-740 (1953).
  26. Young, E. M., et al. Iterative algorithm-guided design of massive strain libraries, applied to itaconic acid production in yeast. Metabolic Engineering. 48, 33-43 (2018).
  27. Roubos, J. A., Pel, H. J., Meijrink, B. Cloning Method. , WO2013144257 (2013).
  28. Mandel, M., Higa, A. Calcium-dependent bacteriophage DNA infection. Journal of Molecular Biology. 53 (1), 159-162 (1970).
  29. Van Dijken, J. P., et al. An interlaboratory comparison of physiological and genetic properties of four Saccharomyces cerevisiae strains. Enzyme and Microbial Technology. 26 (9-10), 706-714 (2000).
  30. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11 (4), 355-360 (1995).
  31. Hill, J., Donald, K. A., Griffiths, D. E., Donald, G. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Acids Research. 19 (20), 5791(1991).
  32. Looke, M., Kristjuhan, K., Kristjuhan, A. Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques. 50 (5), 325-328 (2011).
  33. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  34. Zetsche, B., et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).
  35. Swiat, M. A., et al. FnCpf1: a novel and efficient genome editing tool for Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12585-12598 (2017).
  36. Li, L., et al. CRISPR-Cpf1-Assisted Multiplex Genome Editing and Transcriptional Repression in Streptomyces. Applied Environmental Microbiology. 84 (18), 00827-00918 (2018).
  37. Zhang, X., et al. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell Discovery. 3, 17018(2017).
  38. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).
  39. Perez, A. R., et al. GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design. Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).
  40. Cox, R. S., et al. Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0. Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pojedyncza macierz crRNAakustyczny dozownik cieczyklonowanie Golden Gateszczepy produkuj ce karotenoidywydajno integracji genomowejmonta donorowego DNA
CRISPR/Cas12a: Multipleksowa edycja genomu Saccharomyces cerevisiae i tworzenie drożdżowego pixel artu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.