Tutaj prezentujemy protokół hodowli ludzkich monowarstw enteroidowych lub kolonoidowych, które mają nienaruszoną funkcję bariery, do badania interakcji nabłonkowo-mikrobiota gospodarza na poziomie komórkowym i biochemicznym.
Artykuł metodologiczny
Ludzkie monowarstwy okrężnicy do badania interakcji między patogenami, komensalami i nabłonkiem jelitowym gospodarza
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ludzkie 3-wymiarowe (3D) kultury enteroidów lub kolonoidów pochodzące z komórek macierzystych o bazie krypty są obecnie najbardziej zaawansowanym modelem ex vivo nabłonka jelitowego. Ze względu na ich zamknięte struktury i znaczną wspierającą macierz zewnątrzkomórkową, hodowle 3D nie są idealne do badań gospodarz-patogen. Enteroidy lub kolonoidy mogą być hodowane jako monowarstwy nabłonkowe na przepuszczalnych błonach hodowli tkankowych, aby umożliwić manipulację zarówno powierzchniami komórek luminalnych, jak i podstawno-bocznych oraz towarzyszącymi płynami. Ta zwiększona dostępność powierzchni światła ułatwia modelowanie interakcji nabłonkowych bakteria-gospodarz, takich jak zdolność enterokrwotocznej E. coli (EHEC) do rozkładu śluzu na nabłonku okrężnicy. Opisano metodę fragmentacji kultur 3D, wysiewu jednowarstwowego i transepitelialnego oporu elektrycznego (TER) w celu monitorowania postępu w kierunku konfluencji i różnicowania. Różnicowanie monowarstwowe okrężnicy powoduje wydzielanie śluzu, który można badać za pomocą technik immunofluorescencji lub immunoblottingu. Mówiąc bardziej ogólnie, monowarstwy jelitowców lub okrężnicy umożliwiają fizjologicznie istotną platformę do oceny określonych populacji komórek, które mogą być celem mikrobioty patogennej lub komensalnej.
Wprowadzenie
Organoidy jelitowe, enteroidy i kolonoidy doprowadziły do wielu postępów w zrozumieniu zachowania komórek macierzystych, rozwoju jelit, funkcji bariery/transportu i różnicowania komórek. 1 Jednak hodowla 3D ogranicza badanie interakcji nabłonek gospodarza z patogenem, ponieważ światło nie jest bezpośrednio dostępne dla bakterii lub czynników wirulencji, chyba że zamknięte struktury są poddawane mikroiniekcji. 2,3 Dodatkowo, wydzielane materiały, takie jak małe cząsteczki, białka lub śluz, nie mogą być łatwo pobrane z hodowli 3D do dalszej analizy. Wpływ czynników chorobotwórczych na funkcję bariery nabłonkowej4 i transport jonów5 został oceniony w hodowli 3D przy użyciu barwników fluorescencyjnych i mikroskopii poklatkowej, ale monowarstwy wyhodowane na przepuszczalnych nośnikach kultur tkankowych są podatne na dodatkowe techniki, takie jak pomiar TER i rejestracja w komorze Ussing/cęgach napięciowych. 6,7
Liczne publikacje opisywały protokoły dla 2D lub monowarstwowej hodowli enteroidów/kolonoidów. Materiały znalezione w celu promowania przyczepiania się komórek nabłonkowych obejmują hydrożele kolagenowe, 8,9 0,1% żelatyny, 10 cienkowarstwowa macierz błony podstawnej pochodząca z mięsaka mysiego (BMM),11,12,13 i ludzki kolagen IV. 6,7,14,15,16,17 Metody wysiewu obejmują mechaniczne rozdrobnienie przez pipetting6,14,15 i/lub dysocjacja czynników adhezji komórek za pomocą trypsyny,10,11 dispase,13 lub EDTA. 9 Kilka protokołów używa nieporowatych tworzyw sztucznych do hodowli tkankowych, ale ogranicza to dostęp podstawno-boczny, więc większość zastosowań zależy od przepuszczalnych wkładek do hodowli tkankowych. Dokumentacja dotycząca tworzenia i utrzymywania stabilnych zlewających się monowarstw różni się znacznie w poszczególnych publikacjach. Ponadto kompozycje pożywek wzrostu i różnicowania dla kultur ludzkich różnią się w zależności od grupy i nadal ewoluują, ponieważ coraz więcej badaczy przyjmuje i dostosowuje metodologię do swojego zastosowania i dostępnych zasobów.
Aby rozwiązać problemy związane z ograniczeniami 3D hodowli nabłonka jelitowego w badaniach interakcji gospodarz-patogen, przedstawiamy zmodyfikowany protokół przekształcania 3D ludzkich enteroidów lub kolonoidów w monowarstwę. Po osiągnięciu konfluencji w stanie niedojrzałym podobnym do krypty, wycofanie czynników wzrostu WNT3A, RSPO1 oraz inhibitorów A-83-01 i SB 202190 prowadzi do różnicowania reprezentatywnego dla kosmków jelita cienkiego lub powierzchniowego nabłonka okrężnicy. Opisujemy idealną matrycę, ludzki kolagen typu IV, do pokrycia wkładek i uzyskania jednolitych fragmentów enteroidu lub okrężnicy do posiewu. Wykazaliśmy, że ten protokół wytwarza zlewającą się monowarstwę o wysokim TER. Monowarstwy kolonoidu wydzielają grubą wierzchołkową warstwę śluzu, co pozwala na badania ex vivo interakcji patogen-śluz poprzez immunoblotting lub barwienie immunologiczne. Opisano również zmodyfikowaną procedurę utrwalania w celu zachowania warstwy śluzu okrężnicy w celu barwienia immunologicznego. Metoda ta ma na celu zapewnienie wykonalnego modelu do badania najwcześniejszych interakcji między gospodarzem a patogenem w jelitach po zakażeniu.
Protokół
Ten protokół jest oparty na badaniach opublikowanych wcześniej przez autorów. 6,7,14,15,16 Poniższe kroki powinny być wykonywane w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu odpowiednich technik aseptycznych. Wszystkie metody z udziałem próbek ludzkich zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board of Johns Hopkins University School of Medicine (IRB NA_00038329).
1. Pokryj wkładki do hodowli komórkowych macierzą zewnątrzkomórkową
- Przygotuj 5 ml podstawowego roztworu kolagenu dożylnego (1 mg/ml) w 100 mM kwasu octowego. Odstawić w temperaturze 4 °C na około 4 godziny do całkowitego uwodnienia/rozpuszczenia.
- Podatkować roztwór podstawowy kolagenu dożylnie i przechowywać w temperaturze 4 °C (≤ 1 miesiąc) lub -20 °C (> 1 miesiąc).
- Bezpośrednio przed powlekaniem należy rozcieńczyć roztwór podstawowy kolagenu dożylnie w sterylnej wodzie klasy kultur tkankowych do końcowego stężenia 34 μg/ml. W przypadku wkładek do hodowli komórkowych na płytkach 24-dołkowych należy pokryć każdą wkładkę 100 μl roztworu, co odpowiada 10 μg/cm2.
- Inkubować płytkę w standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych CO2 w temperaturze 37 °C przez ≥ 2 godziny lub dla wygody uszczelnić krawędzie płytki folią parafinową i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc lub do 1 tygodnia.
2. Izolowanie enteroidów/kolonoidów z hodowli 3D
UWAGA: Enteroidy lub kolonoidy są ustalane na podstawie biopsji dawcy i utrzymywane w hodowli 3D zgodnie ze standardowymi protokołami opisanymi wcześniej. 14,18 Krótko mówiąc, krypty są pobierane z biopsji jelit lub resekcji za pomocą chelatacji i mechanicznego mieszania. Krypty są myte, zbierane i platerowane w BMM. Pożywka ekspandująca (opisana w kroku 4.2) jest dodawana do kultury i wymieniana co 2 dni. Tworzenie się kultur 3D jest widoczne w ciągu kilku godzin po posiewaniu.
- Odessać pożywkę hodowlaną z 24-dołkowej płytki i zastąpić 1 ml lodowatego roztworu do zbioru (patrz tabela materiałów) na studzienkę.
- Użyj mini skrobaka do komórek, aby usunąć i rozbić granulat matrycy membrany podstawnej, zwracając szczególną uwagę na każdy materiał w pobliżu krawędzi studni.
- Mieszać płytkę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością około 200 obr./min, 4 °C przez 30-45 min.
3. Dysocjacja enteroidów/kolonoidów 3D
- Użyj pipety jednokanałowej P200 lub pipety wielokanałowej wyposażonej w sterylne końcówki filtrujące, aby rozprowadzić zawiesinę komórek.
- Zawiesinę (zawiesiny) komórkową należy umieścić w stożkowej fiolce o pojemności 15 ml. Należy użyć wielu fiolek, jeśli całkowita objętość zawiesiny wynosi > 6 ml.
- Dodać równą objętość pożywki Advanced DMEM/F12 zawierającej 10 mM HEPES, dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy (1x) i penicylinę-streptomycynę (1x) (pożywka do mycia). Odwróć probówkę 3-4 razy, aby wymieszać. Odwirować przy 300 x g, 10 min, 4 °C.
- Opcjonalnie odessać pożywkę płuczącą i zastąpić ją 0,5 ml/studzienkę trypsyny (patrz Tabela materiałów). Zawiesić kolonoidy za pomocą pipety P200, zakryć probówkę i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na około 2 minuty. Natychmiast wyjąć probówkę, dodać pożywkę myjącą do końcowej objętości 10 ml i powtórzyć wirowanie jak w kroku 3.3.
UWAGA: Ten krok może być preferowany, jeśli roztarcie nie prowadzi do powstania fragmentów o jednakowej wielkości.
- Opcjonalnie odessać pożywkę płuczącą i zastąpić ją 0,5 ml/studzienkę trypsyny (patrz Tabela materiałów). Zawiesić kolonoidy za pomocą pipety P200, zakryć probówkę i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na około 2 minuty. Natychmiast wyjąć probówkę, dodać pożywkę myjącą do końcowej objętości 10 ml i powtórzyć wirowanie jak w kroku 3.3.
4. Powlekanie zawiesiny enteroidu/kolonoidu
- Jeżeli powlekane wkładki były przechowywane w temperaturze 4 °C, należy je zrównoważyć w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C/5% CO2 przez co najmniej 30 minut przed posiewem komórek.
- Dla każdej wkładki, która ma być powlekana, przygotuj 1 ml ciepłego (w temperaturze 25-37 °C) podłoża rozprężnego (EM) i dodaj 10 μM Y-27632 i 10 μM CHIR 99021.
UWAGA: EM składa się z Advanced DMEM/F12 zawierającego B27 (1x), 50% pożywki kondycjonowanej WNT3A, 15% pożywki kondycjonowanej RSPO1, 10% pożywki kondycjonowanej Noggin, 50 ng/ml ludzkiego EGF, 500 nM A-83-01, 10 μM SB 202190, koktajlu antybiotykowego/przeciwgrzybiczego (1x), 10 mM HEPES, dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy (1x) i penicyliny-streptomycyny (1x) (patrz Tabela materiałów). - Odessać pożywkę płuczącą z probówki zawierającej osad komórek i ponownie zawiesić w objętości EM wystarczającej do uzyskania co najmniej 100 μl/wkładkę.
- Odessać roztwór kolagenu dożylnie z każdej wkładki i przemyć dwukrotnie 150 μl pożywki myjącej na wkładkę.
- Odmierzyć pipetę 600 μl EM do przestrzeni pod każdą wkładką.
- Odpipetować 100 μl zawiesiny komórek do każdej wkładki.
- Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych i pozostawić w spokoju przez co najmniej 12 godzin
UWAGA: Unikaj potrząsania lub ostrego przechylania płytki, aby zapobiec nierównomiernemu rozmieszczeniu fragmentów kolonoidu na membranie wkładki. - Monitoruj przyczepianie się i rozprzestrzenianie komórek, aby utworzyć zlewającą się monowarstwę, umieszczając płytkę na mikroskopie światła z kontrastem fazowym pod soczewką obiektywu 2,5x-10x.
- Po 1-2 dniach większość fragmentów powinna przylegać do macierzy kolagenowej. Odświeżyć pożywkę hodowlaną i przerwać leczenie preparatami Y-27632 i CHIR 99021. Kontynuuj odświeżanie pożywki co 2-3 dni, aż do zlewania się. Konfluencja jest zwykle osiągana w ciągu 7-10 dni.
5. Zmierz transepiteliczny opór elektryczny
- Podłącz przewody elektrod i włącz woltomierz nabłonkowy (EVOM). Sprawdź, czy funkcja pomiaru jest ustawiona na omy.
- Zanurz na krótko końcówki elektrod w 70% etanolu i wytrzyj do sucha chusteczką laboratoryjną. Równowaga elektrody w 5 ml medium myjącego przez około 5 minut.
- Zanurz krótszą końcówkę elektrody w medium wkładkowym i skieruj dłuższą końcówkę elektrody w dolnej płytce studzienki. Utrzymuj elektrodę w pełnej orientacji pionowej, aż odczyt EVOM będzie względnie stabilny lub nie dłużej niż 60 s.
UWAGA: Jeśli zespół elektrody jest przechylony daleko od pionu lub wysokość końcówki jest nieprawidłowo wyregulowana, krótsza końcówka może zetknąć się z monowarstwą ogniwa i ją przerwać. - Porównaj pomiary EVOM z wartością uzyskaną z bezkomórkowej wkładki zanurzonej w pożywce hodowlanej, aby ocenić postęp w kierunku konfluencji lub różnicowania.
6. Różnicowanie zlewających się monowarstw enteroidu/kolonoidu
- Wymień EM na podłoże różnicujące (DM) i kontynuuj odświeżanie nośnika co dwa dni, aż do 5 dnia. DM to EM, w którym brakuje WNT3A, RSPO1, A-83-01 i SB 202190.
- Kontynuuj monitorowanie TER, aby sprawdzić, czy różnicowanie przebiega zgodnie z oczekiwaniami. TER będzie nadal wzrastać w dniach 1-5 różnicowania. Monowarstwy mogą nadal zwiększać TER i zachowywać żywotność po 5-6 dniu, ale wykazują maksymalne i najbardziej powtarzalne wyniki, gdy są stosowane w 5-6 dniu.
7. Zakażenie bakteryjne komensalnymi lub chorobotwórczymi bakteriami E. coli
- Na dzień przed przeprowadzeniem infekcji umyj i nakarm monowarstwy EM lub DM bez antybiotyków.
- Użyj sterylnej pętli mikrobiologicznej, aby delikatnie zeskrobać powierzchnię zamrożonego bakteryjnego bulionu glicerolowego i zaszczepić 2 ml bulionu LB. Przenieść probówkę do standardowego inkubatora z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C na 12-16 godzin.
- Rozcieńczyć 50 μl kultury starterowej w 5 ml świeżego bulionu LB (1:100) i kontynuować inkubację z wytrząsaniem przez 90 min. W ten sposób uzyska się kulturę w fazie logarytmicznej o gęstości 105-10 6 jednostek tworzących kolonie (jtk)/ml.
- Opcjonalnie potwierdzić stężenie bakterii poprzez pomiar gęstości optycznej przy 600 nm (OD600) w spektrofotometrze.
- Odwirować kulturę bakteryjną przy 12 000 x g przez 10 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić bakterie w bezantybiotykowym EM lub DM do końcowego stężenia 107 jtk/ml.
- Do wkładki dodać 10 μl zawiesiny bakteryjnej (stężenie końcowe10-6 jtk/ml). Pipetować powoli, aby wymieszać i uniknąć naruszenia zewnątrzkomórkowej warstwy śluzu.
- Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli tkankowych na żądany okres infekcji.
8. Utrwalenie w celu zachowania i immunostainu śluzu
- Wyjmij wkładki do hodowli komórkowych z płytki 24-dołkowej, ostrożnie odwróć na bibułce laboratoryjnej, aby usunąć podłoże wierzchołkowe i zetrzyj zewnętrzny płyn przylegający do wkładki.
- W nowej 24-dołkowej płytce zanurzyć wkładkę w roztworze lodowatego kwasu octowego w stosunku 1:3 w absolutnym etanolu (roztwór Clarke'a) na 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Odwróć wkładkę, aby usunąć utrwalacz i ponownie nawodnić komórki w 1x PBS przez 10 minut. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami barwienia immunologicznego.
- Użyj żyletki, aby przeciąć na obwodzie wkładki membranowej. Przenieś membranę na szklane szkiełko mikroskopowe za pomocą kleszczyków i przymocuj szkło nakrywkowe za pomocą środka montażowego.
9. Przygotowanie lizatów komórkowych do immunoblottingu
UWAGA: Wykonaj następujące kroki na lodzie lub w zimnym pomieszczeniu.
- Odessać podłoże i raz przemyć wkład za pomocą PBS.
- Dodać 150 μl buforu do lizy zawierającego inhibitory proteazy (patrz tabela materiałów) do wkładu i odstawić na 5-10 minut. Bufor do lizy zawiera 50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% SDS, koktajl inhibitorów proteazy 1:100.
- Użyj mini skrobaka do komórek, aby usunąć komórki z wkładki, a następnie użyj pipety P200, aby krótko rozcierać zawiesinę i przenieść do probówki mikrowirówkowej.
- Sonikuj zawiesinę impulsami 5 x 1 s o amplitudzie 20% za pomocą sondy mikrokońcówkowej (patrz Tabela materiałów).
- Dodać bufor ładujący SDS-PAGE w przypadku natychmiastowego wykonywania elektroforezy lub porcji i przechowywać lizaty w temperaturze -20 °C.
Wyniki
Ludzkie hodowle enteroidów i kolonoidów są hodowane jako struktury 3D, a następnie dysocjowane i fragmentowane w celu wysiania na wkładki do hodowli komórkowych powlekane ludzkim kolagenem IV. Postęp formowania monowarstwy jest łatwo monitorowany codziennie za pomocą mikroskopii w polu jasnym, barwienia immunofluorescencyjnego (Rysunek 1) oraz poprzez stały wzrost transepitelialnej oporności elektrycznej (TER) (Rysunek 2), która odzwierciedla przepuszczalność połączeń ścisłych dla jonów i koreluje z konfluencją monowarstwy. TER pustej wkładki 24-dołkowej wynosi około 50-100 Ω·cm2, a po osiągnięciu konfluencji wzrasta do około 400-500 Ω·cm2. Wszystkie komórki nabłonkowe w konfluencyjnych monowarstwach są połączone kompleksami złącza, wykrywanymi za pomocą pierścienia F-aktyny na obwodzie komórki (Rysunek 1). Monowarstwy w pełnym medium z czynnikami wzrostu reprezentują proliferacyjny nabłonek przypominający krypty, składający się głównie z aktywnie dzielących się komórek, które włączają analog nukleozydowy EdU (Rysunek 2). Usunięcie czynników wzrostu WNT3A i RSPO1 promuje różnicowanie, prowadząc do powstania hodowli przypominających kosmki, w których brakuje komórek proliferujących. Zróżnicowane monowarstwy zawierają enterocyty (enteroidy) lub kolonocyty (kolonoidy) i rozwijają wyspecjalizowane komórki nabłonka jelitowego, co wykazano w hodowlach 3D,18 w tym komórki kubkowe i enteroendokrynne.15 Zróżnicowane monowarstwy wykazują również znaczący wzrost TER (> 1000 Ω·cm2) (Rysunek 2), co wskazuje na dojrzałe połączenia ścisłe.
W prawidłowej fizjologii człowieka warstwa nabłonka jelitowego oddziela składniki odżywcze i bogatą w drobnoustroje przestrzeń światła jelita od sterylnego środowiska surowczego. Nabłonek ściśle reguluje komunikację między tymi dwoma przedziałami. Monowarstwy enteroidów i kolonoidów zachowują tę istotną właściwość kompartymentacji, co wykazano w analizie proteomicznej przedstawionej w Tabeli 1. Istnieją znaczące różnice w składzie białek w pożywkach warunkujących pobranych z powierzchni apikalnej i basolateralnej zróżnicowanych monowarstw enteroidów. Dostęp do obu stron, apikalnej i basolateralnej, umożliwia gromadzenie obu nadpłynów w sposób zależny od czasu w celu pomiaru różnicowej sekrecji innych cząsteczek, takich jak cytokiny i chemokiny.15,17
Monowarstwy są wygodnymi i wysoce powtarzalnymi modelami do wykrywania zmian w ekspresji białek z wykorzystaniem zarówno immunoblottingu, jak i immunostainingu. W związku z tym zmiany w ekspresji mucyny 2 (MUC2) wywołane wyciszeniem za pomocą shRNA (KD) mogą być wykrywane obiema tymi technikami (Rysunek 3). Transdukcja shRNA została przeprowadzona na kolonoidach 3D, które utrzymywano w pożywce selekcyjnej z antybiotykami. Po weryfikacji KD kolonoidy mogą być nadal utrzymywane jako kultury 3D i/lub wysiewane jako monowarstwy do celów eksperymentalnych. Co więcej, KD MUC2 nie wpływa na efektywność tworzenia monowarstw w porównaniu z rodzimą linią kolonoid dzikiego typu. Pobieranie monowarstw do immunoblottingu jest proste i podobne do protokołów opisanych dla linii komórkowych pochodzących z ludzkiego gruczolakoraka nabłonka. Zazwyczaj z pojedynczej monowarstwy wyhodowanej na wkładce o powierzchni 0,33 cm2 można wyekstrahować około 50 µg lub więcej białka całkowitego. Jak pokazano na Rysunku 3, MUC2 jest ledwo wykrywalny w niezróżnicowanych (UD) monowarstwach kolonoid WT, ale wykazuje wysoką ekspresję w zróżnicowanych (DF) monowarstwach WT. MUC2 znajduje się poniżej poziomu detekcji w obu rodzajach monowarstw kolonoid (UD i DF) transdukowanych shRNA przeciwko MUC2.
Co istotne, monowarstwy stanowią odpowiedni model do badania oddziaływań między gospodarzem a mikroorganizmami na powierzchni apikalnej nabłonka. Zróżnicowane monowarstwy kolonoidów tworzą grubą, przylegającą warstwę śluzu dodatnią pod kątem MUC2, która nie jest łatwo przenikana przez komensalne bakterie E. coli HS (Rycina 4), co jest analogiczne do obserwacji sugerowanych w przypadku prawidłowego ludzkiego jelita grubego.19 Wykazano jednak, że enterohemoragiczna E. coli (EHEC), patogen ludzkiego jelita grubego, posiada zdolność do niszczenia wzbogaconej w MUC2 przylegającej warstwy śluzu w celu dotarcia do powierzchni apikalnej nabłonka (Rycina 4).14,20 Pozostałe MUC2 występuje jedynie wewnątrz komórek kubkowych.
Rycina 1: Tworzenie monowarstw ludzkich enteroidów/kolonoidów. (A) Przykład fragmentów kolonoidów po rozpuszczeniu BMM i tryturacji. (B) Przykład insertu bezpośrednio po wysianiu fragmentów kolonoidów. Pasek skali (A-B) = 200 μm. Reprezentatywna (C) projekcja maksymalnej intensywności oraz (D) konfokalny optyczny przekrój Z z odpowiadającymi projekcjami ortogonalnymi pokazują, że fragmenty kolonoidów wysiane na filtry pokryte ludzkim kolagenem IV tworzą liczne wyspy monowarstw 2-4 dni po wysianiu. Obszary wolne od komórek (gwiazdka) są identyfikowalne poprzez brak barwienia zarówno jąder (Hoechst 33342, niebieski), jak i apikalnej F-aktyny (falloidyna, zielony) zarówno w C, jak i D. Reprezentatywna (E) projekcja maksymalnej intensywności oraz (F) konfokalny przekrój optyczny z odpowiadającymi projekcjami ortogonalnymi pokazują konfluentną monowarstwę kolonoidów z ciągłą powierzchnią apikalną wykrytą za pomocą immunobarwienia F-aktyny około 1 tydzień po wysianiu. (G) Powiększenie reprezentatywnej projekcji maksymalnej intensywności oraz (H) konfokalny przekrój optyczny z odpowiadającymi projekcjami ortogonalnymi pokazują, że komórki w konfluentnych monowarstwach kolonoidów tworzą perijunkcyjne pierścienie F-aktyny (biała grot strzałki) oraz niedojrzałe apikalne rąbki szczoteczkowe (żółte groty strzałek). Pasek skali (C-H) = 20 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Ocena różnicowania monowarstw enteroidów/kolonoidów. (A) Inkorporacja EdU (czerwony) wykazuje stopniowy spadek proliferacji podczas różnicowania monowarstw jelita czczego. (B) Średnie pomiary TER w konfluentnych monowarstwach jelita czczego w pożywce ekspansyjnej lub różnicującej. Słupki błędów reprezentują SEM. UD, nieróżnicowane; DF, różnicowane. Liczby odpowiadają dniom w określonych warunkach; UD1 był pierwszym dniem konfluencji, około 1 tygodnia po wysiewie. (C) Nieróżnicowane (UD) monowarstwy jelita czczego mają szerokie, krótsze komórki i mniej dojrzałe apikalne rąbki szczoteczkowe oparte na aktynie niż różnicowane (DF) monowarstwy jelita czczego w 5. dniu. Pasek skali (A, C) = 50 μm. Wszystkie monowarstwy przedstawiono co najmniej 1 tydzień po wysiewie i były one konfluentne przed rozpoczęciem różnicowania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: Kolonoidy typu dzikiego oraz kolonoidy z wyciszeniem genu (KD) transdukowane shRNA tworzą zgodne monowarstwy. (A) Reprezentatywne obrazy ludzkiej konfluentnej monowarstwy kolonoidów typu dzikiego (WT) różnicowanych przez 5 dni oraz (B) monowarstw hodowanych w podobny sposób, pochodzących z kultur kolonoidów z wyciszeniem MUC2. Pasek skali (A-B) = 50 μm (C) Reprezentatywny immunoblot kultur kolonoidów transdukowanych shRNA typu scrambled lub shRNA przeciwko MUC2 wykazuje, że zmiany w ekspresji białka wynikające z KD mogą być ilościowo określone za pomocą immunoblottingu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Monowarstwy enteroidów/kolonoidów są odpowiednimi modelami do badania oddziaływań między mikrobami światła jelita a gospodarzem. (A) Reprezentatywna projekcja maksymalnej intensywności oraz ortogonalny przekrój optyczny monowarstwy kolonoidów pokazują grubą apikalną warstwę śluzu MUC2-dodatnią, która nie jest przepuszczalna dla E. coli HS (czarne groty strzałek) znajdujących się na apikalnej powierzchni śluzu. Monowarstwy były zakażone przez 6 godzin dawką 106 cfu/mL HS. (B) Reprezentatywna projekcja maksymalnej intensywności ludzkiej monowarstwy kolonoidów zakażonej apikalnie EHEC (106 cfu/mL, 6 godzin). Pasek skali (A-B) = 50 μm. (C) Pomiary intensywności immunofluorescencji MUC2 wykazują znaczący spadek poziomu MUC2 w monowarstwach kolonoidów zakażonych EHEC w porównaniu z niezakazżonymi kontrolami. Słupki błędów reprezentują SEM. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
| Białko | Numer akcesyjny | Obfitość peptydów |
| Medium podstawnoboczne | ||
| białko wiążące kwasy tłuszczowe, wątrobowe [Homo sapiens] | NP_001434.1 | 1299 |
| profilina-1 [Homo sapiens] | NP_005013.1 | 797 |
| prekursor apolipoproteiny A-IV [Homo sapiens] | NP_000473.2 | 744 |
| prekursor ekto-ADP-rybozylotransferazy 4 [Homo sapiens] | NP_066549.2 | 633 |
| izoforma 1 dehydrogenazy glikolowej 3-fosforanu [Homo sapiens] | NP_002037.2 (+1) | 616 |
| prekursor serotransferyny [Homo sapiens] | NP_001054.1 (+1) | 572 |
| prekursor izoformy 3 białka wiążącego witaminę D [Homo sapiens] | NP_001191236.1 (+2) | 567 |
| katalaza [Homo sapiens] | NP_001743.1 | 427 |
| prekursor izoformy 1 agryny [Homo sapiens] | NP_940978.2 (+1) | 377 |
| prekursor izoformy 1 laktoferyny [Homo sapiens] | NP_002334.2 (+1) | 262 |
| Medium wierzchołkowe | ||
| prekursor czynnika trefoil 3 [Homo sapiens] | NP_003217.3 | 326 |
| prekursor czynnika trefoil 1 [Homo sapiens] | NP_003216.1 | 304 |
| prekursor izoformy a białka rdzeniowego proteoglikanu siarczanu heparanu specyficznego dla błony podstawnej [Homo sapiens] | NP_001278789.1 (+3) | 303 |
| izoforma 1 filaminy-B [Homo sapiens] | NP_001157789.1 (+2) | 240 |
| prekursor czynnika trefoil 2 [Homo sapiens] | NP_005414.1 | 182 |
| prekursor izoformy b białka DMBT1 (deleted in malignant brain tumors 1) [Homo sapiens] | NP_015568.2 (+3) | 169 |
| keratyna cytoszkieletowa typu II 1 [Homo sapiens] | NP_006112.3 | 157 |
| miozyna-9 [Homo sapiens] | NP_002464.1 | 150 |
| prekursor aminopeptydazy N [Homo sapiens] | NP_001141.2 (+1) | 145 |
| prekursor agryny [Homo sapiens] | NP_940978.2 (+1) | 112 |
Tabela 1. Częściowa lista peptydów zidentyfikowanych za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas w płynach apikalnych i basolateralnych pobranych z zróżnicowanych monowarstw jelita czczego.
Dyskusja
Parametry krytyczne dla pomyślnego tworzenia monowarstw enteroidu / okrężnicy obejmują: 1) zdrowe, proliferujące kultury 3D jako materiał wyjściowy; 2) pokrycie powierzchni wkładki do hodowli komórkowej ludzkim kolagenem IV przed wysiewem jednowarstwowym; 3) fragmentacja kultur 3D mechanicznie lub enzymatycznie, ale nie do poziomu pojedynczej komórki.
Podczas izolacji enteroidów/kolonoidów 3D optymalna prędkość wytrząsania może się różnić w zależności od średnicy obrotowej danego modelu wytrząsarki. Celem jest nie tylko poruszenie płytki w celu wydajnego wymieszania, ale także uniknięcie rozpryskiwania zawiesiny komórek na pokrywie płytki lub do sąsiednich studzienek. Okresy inkubacji trwające < 30 minut mogą powodować przyleganie resztkowego BMM do komórek, co może utrudniać przyczepianie się i tworzenie jednolitych monowarstw komórek po posiewie na wkładkach. Intensywna inkubacja (≥ 1 godzina) spowoduje znaczne zmniejszenie żywotności komórek.
Zakres tarcia wymagany do dysocjacji enteroidów/kolonoidów 3D może się różnić w zależności od sztywności tłoka i zręczności użytkownika. Zaleca się okresowe badanie zawartości studzienki pod mikroskopem świetlnym z kontrastem fazowym w celu określenia jednorodności fragmentu podczas rozcierania, z celem około 30 komórek na fragment. Zamiast lub oprócz rozcierania, zawiesina może być krótko trawiona trypsyną w celu uzyskania mniejszych, jednolitych fragmentów. Trawienie trypsyny może być pożądane, jeśli monowarstwy zawierają dużą ilość struktur podobnych do 3D wśród pojedynczej warstwy nabłonka. Jednak dysocjacja na pojedyncze komórki nie jest pożądana, ponieważ znacznie zmniejsza żywotność komórek. Jedna studzienka enteroidów/kolonoidów hodowanych w kropelce BMM o objętości 35 μl na ogół wystarcza do wypełnienia 2-3 insertów, ale czynnik ten może się różnić w zależności od liczby i średniej wielkości enteroidów/colonoidów.
Monowarstwy okrężnicy mogą wchłonąć znaczną objętość ośrodka wierzchołkowego w miarę różnicowania. Można to obejść, nakładając dodatkową masę do górnej komory wkładki (150-200 μl), chociaż częściowe suszenie górnej komory nie wydaje się niekorzystnie wpływać na żywotność lub funkcję monowarstwy w dalszych testach. Po około 4-5 dniach różnicowania, monowarstwy okrężnicy rozwijają śluz zewnątrzkomórkowy, który może być widoczny jako gęsty/galaretowaty materiał na powierzchni komórki po starannym zaaspiracji DM.
W przypadku interakcji EHEC z zewnętrzną warstwą śluzu rutynowo stosujemy miano bakterii i okres inkubacji określone w protokole. Jednak unikalne szczepy bakteryjne powinny być początkowo oznaczane w wielu stężeniach i okresach inkubacji, aby określić odpowiednie parametry dla pożądanego efektu.
Podczas wiązania śluzu aspiracja pożywki wierzchołkowej prawdopodobnie usunie większość zewnątrzkomórkowej nieprzyłączonej warstwy śluzu. Dlatego ważne jest, aby ostrożnie wylać pożywkę. Jeśli podłoże jest zatrzymywane we wkładce przez napięcie powierzchniowe, użyj rogu złożonej tkanki laboratoryjnej, aby przełamać napięcie powierzchniowe i odprowadzić większość pożywki. Po utrwaleniu i zabarwieniu warstwa śluzu może zostać przypadkowo przemieszczona lub spłaszczona podczas montażu szkła nakrywkowego nad filtrem wkładowym. Aby zachować wysokość śluzu, umieść filtr na kropli materiału montażowego i ostrożnie umieść szkło nakrywkowe na filtrze. Nie stukaj ani nie naciskaj na szkło nakrywkowe, ponieważ może to znacznie spłaszczyć warstwę śluzu.
Aby utworzyć spolaryzowaną monowarstwę z komórek w hodowli 3D, konieczne jest odtworzenie interakcji między podstawno-bocznymi integrynami błonowymi komórek nabłonka jelitowego a białkami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Laminina, kolagen IV, fibronektyna i szereg proteoglikanów tworzą ECM nabłonka jelitowego. 21,22 Porównaliśmy lamininę pochodzącą z ludzkich komórek, fibronektynę, kolagen IV i BMM pochodzącą z myszy jako powłoki wkładki. Tylko kolagen dożylny wspierał tworzenie stabilnych, długotrwałych (do 4 tygodni) zlewających się monowarstw enteroid/colonoid (ryc. 1-2). Na każdej z pozostałych badanych matryc uzyskano małe plamy jednowarstwowego wzrostu, ale regiony te nie przeszły do konfluencji. Stosowanie ludzkiego kolagenu IV jako substytutu ECM ma wiele zalet. BMM pochodzący z komórek mięsaka mysiego Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) nie jest pochodzenia ludzkiego, podczas gdy ludzki kolagen IV jest dostępny na rynku i ogólnie bardziej opłacalny. Ponadto BMM jest złożoną mieszaniną białek o wrodzonej zmienności i może zawierać czynniki wzrostu wydzielane przez mięsaka, które wpływają na ekspresję genów. 23
Interakcje między komórkami nabłonka jelitowego a ECM leżącym u podstaw restytucji nabłonka jelitowego są nadal nie w pełni poznane. Znaczenie kolagenu dożylnego, ale nie lamininy, jako liganda adhezyjnego dla ludzkich kolonocytów24 i wzmacniacza restytucji komórek nabłonka krypty jelitowej25 zostało zasugerowane przy użyciu przeciwciał przeciwko kolagenowi IV, które zapobiegały przyczepianiu się. Ekspresja nabłonkowa β1-integryny wydaje się być ważna dla interakcji ECM, ponieważ przeciwciało specyficzne dla β1-integryny znacząco blokowało adhezję kolonocytów do kolagenu typu IV. 24 Podczas gdy kolagen IV zapewnia niezawodny ECM do tworzenia monowarstwy enteroidu/kolonoidu na wkładkach, nabłonkowa przebudowa ECM w czasie nie została jeszcze oceniona w tym modelu, podobnie jak wpływ bardziej złożonych i zdefiniowanych mieszanin ECM kolagenu IV, lamininy i fibronektyny.
Ludzkie enteroidy/kolonoidy w formacie jednowarstwowym (ryc. 1-4) umożliwiają manipulacje i pobieranie próbek, które byłyby kłopotliwe lub niemożliwe do osiągnięcia przy użyciu kultur osadzonych w matrycy 3D. Enteroidy/kolonoidy 3D różnią się wielkością, złożonością strukturalną i objętością światła, a zatem mikroiniekcja drobnoustrojów lub małych cząsteczek jest trudna do dokładnego określenia ilościowego. Dodatkowo, w przeciwieństwie do monowarstw (Tabela 1), kultury 3D uniemożliwiają bezpośredni dostęp zarówno do powierzchni luminalnej, jak i podstawno-bocznej w celu pomiaru jonów, składników odżywczych, cytokin lub wydzielanych czynników związanych z procesami fizjologicznymi lub patofizjologicznymi. Konfluencja (ryc. 1-2) jest jedną z głównych właściwości monowarstwy enteroid/okrężnicy, niezbędną nie tylko do ustalenia fizjologicznych gradientów składników odżywczych, jonów i innych makrocząsteczek, ale także do stworzenia właściwej bariery między mikrobiotą świetlną a sterylnymi środowiskami surowiczymi wypełnionymi mezenchymalnymi/komórkami odpornościowymi. Te aspekty są ważne do rozważenia w przyszłych badaniach, które obejmują monowarstwy enteroidu / kolonoidu z typami komórek mezenchymalnych, immunologicznych lub neuronalnych w celu zbudowania bardziej złożonych modeli fizjologicznych.
Zauważone ograniczenia opisanego tutaj modelu wkładu do hodowli komórkowej obejmują brak sił fizycznych, takich jak naprężenie ścinające płynu i mechaniczne rozciąganie/ściskanie (perystaltyka), a także brak beztlenowego środowiska wierzchołkowego, zwykle doświadczanego przez nabłonek jelitowy in vivo. Elementy te mogą zostać rozwiązane za pomocą bardziej zaawansowanych platform mikrofizjologicznych,26 ale ich wdrożenie wymaga również dodatkowych kosztów, sprzętu i wiedzy specjalistycznej. Zarówno hodowle 3D, jak i jednowarstwowe są również pozbawione interakcji lub wkładu mikrobiomu jelitowego, populacji komórek zrębu i układu odpornościowego, chyba że te składniki są celowo dodawane.
Przyszłe zastosowania monowarstwy enteroidu / okrężnicy na wkładkach do hodowli komórkowych pokrytych kolagenem dożylnym mogą obejmować inne badania patogennych lub komensalnych interakcji mikrobiologicznych, wychwytu leków lub składników odżywczych, toksyczności, metabolizmu, funkcji bariery i poprawy funkcjonalnej katalizowanej przez kohodowlę z dodatkowymi typami komórek jelitowych. Oceny można dokonywać nie tylko w obrębie nabłonka zdrowych dawców, ale także u osób z mutacjami genetycznymi lub zaburzeniami jelitowymi, pod warunkiem, że fenotypy in vivo zostaną ustalone jako zachowane w hodowli enteroidów/kolonoidów ex vivo.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty NIH P01 AI125181, K01 DK106323 (JGI) i K01 DK113043 (JFA). Dziękujemy Jamesowi Kaperowi (University of Maryland, Baltimore, MD, USA) za dostarczenie szczepu E. coli HS i EHEC. Uznajemy również Zintegrowane Rdzenie Fizjologii i Obrazowania Hopkins Conte Digestive Disease Basic and Translational Research Core Center (P30 DK089502) oraz Johns Hopkins Mass Spectrometry and Proteomics Core.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 2-Amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiol | Sigma | T4661 | Baza Tris, Składnik buforu do lizy |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | Inhibitor ALK4/5/7 |
| Kwas octowy, lodowaty | Fisher Scientific | A38 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | Składnik pożywki |
| wzrostowej Alexa Fluor 488 falloidyna | Life Technologies | A12379 | Sonda fluorescencyjna do F-aktyny |
| Koktajl antybiotykowo-grzybiczy | Invivogen | ant-pm-2 | Primocin (100x) |
| B27, 50x | Life Technologies | 17504-044 | Składnik pożywki Wkładki do |
| hodowli komórkowych | Corning | 3470 | Transwell, membrana PET, 0,4 μ m porów, płytka 24-dołkowa |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Inhibitor GSK3 i beta |
| Zestaw do obrazowania Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 Life Technologies | C10639 | ||
| Kolagen IV, z ludzkiego łożyska | Sigma | C5533 | |
| Cultrex Roztwór do zbierania organoidów | Trevigen | 3700-100-01 | Depolimeryzuje matrycę |
| błony podstawnejEnterokrwotoczny Escherichia coli (EHEC) | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Woltoomomierz nabłonkowy | World Precision Instruments | EVOM2 | |
| Elektroda woltoomomierza nabłonkowego | World Precision Instruments | STX3 | |
| Escherichia coli szczep HS | Kaper lab, University of Maryland | ||
| Etanol, absolutny | Pharmco | 111000200 | |
| FluorSave Podłoże montażowe | Millipore | 345789 | Do montażu wkładki membranowej na szkiełku mikroskopowym |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | Dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy, 200 mM |
| linia komórkowa HEK293T/Noggin-Fc | van den Brink lab, Tytgat Instytut Badań | Do produkcji Pożywka kondycjonowana Noggin | |
| HEK293T/RSPO1-Fc-HA linia komórkowa | Trevigen | 3710-001-K | Do produkcji pożywki kondycjonowanej Rspondin-1 |
| HEPES, 1 M | Life Technologies | 15630-080 | Składnik pożywki wzrostowej |
| Wirówka Heraeus Multifuge X1R | Thermo Fisher Scientific | 75004250 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Fluorescencyjny barwnik jądrowy |
| Ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) | R& D Systems | 236-EG-01M | Składnik pożywki wzrostowej |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | Składnik buforu do lizy |
| Mikroskop świetlny z odwróconymi hodowlami komórkowymi | Olympus | CKX51 | |
| LB bulion | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Linia komórkowa L-WNT3A | ATCC | CRL-2647 | Do produkcji pożywki kondycjonowanej Wnt3a |
| Matrigel, zmniejszony współczynnik wzrostu | Corning | 356231 | Macierz błony podstawnej do hodowli 3D |
| Mini skrobak do komórek | United BioSystems | MCS-200 | |
| Przeciwciało MUC2, mysz monoklonalna | Abcam | ab11197 | Stosowanie w stosunku 1:100 do barwienia immunologicznego, 1:500 do immunoblottingu |
| Cząstki lentiwirusowe MUC2 shRNA | GE Dharmacon | RHS4531 | GIPZ lentiwirusowe shRNA, ID: 4583 |
| Wytrząsarka orbitalna | Grant Instruments | PSU-10i | |
| Penicylina-streptomycyna, 100x | Life Technologies | 15140-122 | Składnik pożywki wzrostowej |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Corning | 21-031 | |
| z mikrokońcówką | Branson Ultrasonics | 450 | |
| Koktajl inhibitorów proteazy dla komórek ssaków | Sigma | P8340 | Składnik buforu do lizy |
| SB 202190 | Tocris | 1264 | p38 Inhibitor MAPK |
| Chlorek sodu | Sigma | S3014 | Składnik buforu do lizy |
| Deksoycholan sodu | Sigma | D6750 | Składnik buforu do lizy |
| Dodecylosiarczan sodu | Sigma | L3771 | Składnik buforu do lizy |
| TrypLE Express, 1x | Life Technologies | 12605-010 | Trypsyna, do trawienia fragmentów enteroidu/kolonoidu |
| Przeciwciało winkulinowe, monoklonalne królika | Abcam | ab129002 | Stosować w stosunku 1:1000 do immunoblottingu |
| Woda, klasa hodowli tkankowej, sterylna filtrowana | Corning | 25-055 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | Inhibitor RhoA/ROCK |
Bibliografia
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13, 633-642 (2016).
- Hill, D. R., et al. Bacterial colonization stimulates a complex physiological response in the immature human intestinal epithelium. eLife. 6, e29132(2017).
- Williamson, I. A., et al. A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6, 301-319 (2018).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and Toxin Production by Clostridium difficile within Human Intestinal Organoids Result in Disruption of Epithelial Paracellular Barrier Function. Infection and Immunity. 83, 138(2015).
- Foulke-Abel, J., et al. Human Enteroids as a Model of Upper Small Intestinal Ion Transport Physiology and Pathophysiology. Gastroenterology. 150, 638-649.e638 (2016).
- Yin, J., et al. Molecular Basis and Differentiation-Associated Alterations of Anion Secretion in Human Duodenal Enteroid Monolayers. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 591-609 (2018).
- Tse, C., et al. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC)—Secreted Serine Protease EspP Stimulates Electrogenic Ion Transport in Human Colonoid Monolayers. Toxins. 10, 351(2018).
- Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue engineering. Part C, Methods. 19, 961-969 (2013).
- Wang, Y., et al. Self-renewing Monolayer of Primary Colonic or Rectal Epithelial Cells. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4, 165-182 (2017).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7, 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64, 911(2015).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell–derived human enteroids. Science. 353, 1387(2016).
- Kozuka, K., et al. Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform. Stem Cell Reports. 9, 1976-1990 (2017).
- In, J., et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli Reduces Mucus and Intermicrovillar Bridges in Human Stem Cell-Derived Colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2, 48-62 (2016).
- Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Scientific Reports. 7, 45270(2017).
- Vernetti, L., et al. Functional Coupling of Human Microphysiology Systems: Intestine, Liver, Kidney Proximal Tubule, Blood-Brain Barrier and Skeletal Muscle. Scientific Reports. 7, 42296(2017).
- Noel, G., et al. Enterotoxigenic Escherichia coli is phagocytosed by macrophages underlying villus-like intestinal epithelial cells: modeling ex vivo innate immune defenses of the human gut. Gut Microbes. 9, 382-389 (2018).
- Sato, T., et al. Long-term Expansion of Epithelial Organoids From Human Colon, Adenoma, Adenocarcinoma, and Barrett's Epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
- Johansson, M. E. V., Sjövall, H., Hansson, G. C. The gastrointestinal mucus system in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10, 352-361 (2013).
- Hews, C. L., et al. The StcE metalloprotease of enterohaemorrhagic Escherichia coli reduces the inner mucus layer and promotes adherence to human colonic epithelium ex vivo. Cellular Microbiology. 19, e12717(2017).
- Laurie, G. W., Leblond, C. P., Martin, G. R. Localization of type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, and fibronectin to the basal lamina of basement membranes. The Journal of Cell Biology. 95, 340(1982).
- Timpl, R. Macromolecular organization of basement membranes. Current Opinion in Cell Biology. 8, 618-624 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10, 1886-1890 (2010).
- Ishii, S., et al. Normal colonic epithelium adheres to carcinoembryonic antigen and type IV collagen. Gastroenterology. 106, 1242-1250 (1994).
- Moore, R., Madri, J., Carlson, S., Madara, J. L. Collagens facilitate epithelial migration in restitution of native guinea pig intestinal epithelium. Gastroenterology. 102, 119-130 (1992).
- Bein, A., et al. Microfluidic Organ-on-a-Chip Models of Human Intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5, 659-668 (2018).
Przedruki i uprawnienia
