Artykuł metodologiczny

Przewodnik po budowie mikroskopu z dużymi nachylonymi płytkami do obrazowania pojedynczych cząsteczek w rozszerzonym polu widzenia

19.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59360

⸱

8 kwietnia 2019

 ,  ,  , 
1CREOL, The College of Optics and Photonics, University of Central Florida, 2Andor Technology, Oxford Instruments

W tym artykule

Podsumowanie

Szczegółowa instrukcja jest opisana, jak zbudować mikroskop HIST (o dużym nachyleniu) i jego zastosowanie do obrazowania pojedynczych molekuł.

Streszczenie

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek znacznie poszerzyło nasze zrozumienie mechanizmów molekularnych w badaniach biologicznych. Jednak uzyskanie obrazów o dużym polu widzenia i wysokim kontraście w grubych komórkach i tkankach było wyzwaniem. W tym miejscu przedstawiamy mikroskopię HIST (Spirit Sweep Til), która pozwala przezwyciężyć ten problem. Para cylindrycznych soczewek została zaimplementowana w celu wygenerowania wydłużonej wiązki wzbudzenia, która została zeskanowana na dużym obszarze obrazowania za pomocą jasnego zwierciadła galvo. Do pozycjonowania elementów optycznych zastosowano konfigurację 4f. Naukowa komplementarna kamera półprzewodnikowa z tlenkiem metalu wykryła sygnał fluorescencyjny i zablokowała nieostre tło za pomocą dynamicznej szczeliny konfokalnej zsynchronizowanej z przemiataniem wiązki. Przedstawiamy instrukcję krok po kroku, jak zbudować mikroskop HIST ze wszystkimi podstawowymi elementami.

Wprowadzenie

Obrazowanie fluorescencji pojedynczej cząsteczki odgrywa ważną rolę w wielu badaniach biologicznych, które ujawniają ultrastruktury, dynamikę i ilość biomolekuł1,2,3. Jednak badanie pojedynczych cząsteczek wewnątrz komórek lub tkanek było wyzwaniem. Podczas gdy mikroskopia konfokalna zapewnia wysoką zdolność do wycinania4, nie nadaje się do obrazowania pojedynczych cząsteczek ze względu na silne fotobielenie spowodowane wysoką intensywnością wzbudzenia lub niską prędkością obrazowania. Mikroskopia szerokokątna wykorzystuje słabsze oświetlenie, ale cierpi z powodu słabego stosunku sygnału do tła (SBR)5. Z drugiej strony, mikroskopia z jasnymi arkuszami może wykazać dobre przekroje i niskie fotowybielanie6; jednak dostępna apertura numeryczna (NA) jest znacznie ograniczona przez wymóg ortogonalnie rozmieszczonych obiektywów7. Alternatywnie wymaga specjalnych iluminatorów i komór na próbki8,9.

Z tych powodów, mikroskopia z wysoce nachylonym i laminowanym arkuszem optycznym (HILO) jest szeroko stosowana do obrazowania 3D pojedynczych cząsteczek10. Kiedy nachylona wiązka napotyka interfejs dwóch mediów (na przykład szkła i wody), wiązka jest załamywana zgodnie z prawem Snella. Co ważne, załamująca się wiązka staje się cieńsza, a jej grubość jest opisana jako dz = R/tan(θ), gdzie R to średnica nachylonej wiązki, a θ to kąt załamania nadawanej wiązki. Ta prosta implementacja zapewnia dobrą zdolność do cięcia. Niemniej jednak zależność ta wskazuje, że cienkie oświetlenie (tj. wysoka zdolność przekroju) wymaga małego R i/lub dużego θ. Na przykład, gdy R = 20 μm i θ = 72 stopnie, można uzyskać dz = 6,5 μm. Ponieważ istnieje praktyczne ograniczenie do zwiększania kąta załamania w celu obrazowania głęboko wewnątrz komórek i uniknięcia całkowitego wewnętrznego odbicia, istnieje silne sprzężenie średnicy oświetlenia i grubości wiązki. Z tego powodu obrazowanie HILO wykazuje stosunkowo małe pole widzenia (FOV), co znacznie ogranicza jego zastosowania w obrazowaniu wielokomórkowym.

Ostatnio rozwiązaliśmy ten problem za pomocą mikroskopii HIST (Inclined Stair), gdzie pole widzenia jest oddzielone od grubości wiązki w bardzo prosty sposób11. Po pierwsze, wiązka wydłużona w jednym kierunku jest generowana przez parę cylindrycznych soczewek. Ta wiązka, określana jako płytka, wytwarza cienkie oświetlenie o dz ~ 4 μm, podczas gdy jej pole widzenia wynosi 130 x 12 μm2. Następnie płytka jest przesuwana po próbce za pomocą obrotowego lustra galvo. Tymczasem obraz fluorescencyjny jest rejestrowany w naukowej kamerze z komplementarnym półprzewodnikiem metalowo-tlenkowym (sCMOS), która skutecznie filtruje nieostre tło, działając w trybie rolling shutter, który służy do przestrajalnego wykrywania szczelin konfokalnych. W ten sposób mikroskopia HIST umożliwia obrazowanie pojedynczych cząsteczek z większym polem widzenia (~130 x 130μm2) i cieńszym oświetleniem niż obrazowanie HILO. Zastosowaliśmy tę nową technikę obrazowania do wykrywania transkryptów RNA za pomocą pojedynczej sondy w komórkach lub kilku sond w tkankach mózgowych myszy, co ma znaczny potencjał w badaniu ekspresji genów i chorób. W przeciwieństwie do innych podejść, HIST wykorzystuje tylko jeden obiektyw o dużej aperturze numerycznej bez dodatkowego oświetlacza lub obiektywów do zdalnego wykrywania i jest w pełni kompatybilny z mikroskopami odwróconymi. Te zalety, wraz z dużym polem widzenia i wysokim kontrastem, sprawią, że mikroskopia HIST stanie się znaczącym narzędziem w biologii i medycynie. Poniżej przedstawiamy szczegółowe instrukcje dotyczące oprzyrządowania mikroskopu HIST oraz sposobu testowania i kalibracji jego działania.

Protokół

1. Ustawianie mikroskopu, laserów i narzędzi do osiowania

  1. Przed zbudowaniem mikroskopu należy przygotować wszystkie niezbędne elementy, w tym optykę, optomechanikę i elektronikę, zgodnie z tabelą materiałów.
  2. Przygotuj korpus mikroskopu składający się głównie z dwóch części: uchwytu obiektywu z portem z gwintem RMS i stolika piezo-stokrotnego zamontowanego na aluminiowym bloku (Rysunek 1A).
    UWAGA: Wykonany na zamówienie korpus mikroskopu został użyty dla wygody i elastyczności oprzyrządowania12. Do mikroskopii HIST można użyć dowolnego dostępnego na rynku korpusu mikroskopu.
  3. Łączenie wielu linii laserowych i sprzęganie ich ze światłowodem jednomodowym
    1. Zainstaluj lasery 405, 561, 638 nm na stole optycznym i połącz wiązki za pomocą rozdzielacza wiązki polaryzacyjnej i długoprzepustowego lustra dichroicznego, jak pokazano na Rysunek 1B. Upewnij się, że wszystkie wiązki laserowe przechodzą przez otwory w narzędziu do wyrównywania. Włóż płytki półfalowe do regulacji mocy.
      UWAGA: Nosić okulary ochronne dla ochrony oczu i używać bloków wiązki do pochłaniania niepożądanych wiązek laserowych.
    2. Zainstaluj soczewkę sprzęgającą światłowód (f = 4,5 mm) i adapter światłowodowy umieszczony w translatorze osi z systemem klatek.
    3. Podłącz światłowód wielomodowy (MMF, Ø 62,5 μm) do adaptera światłowodowego. Wyreguluj każdą parę lusterka kierowniczego i translatora z tak, aż skuteczność sprzężenia każdego lasera będzie wyższa niż 95%. Belka wyjściowa ma profil zbliżony do gaussowskiego z wzorami plamkowymi.
    4. Wyjmij światłowód wielomodowy i podłącz światłowód jednomodowy (SMF). Podobnie jak w przypadku MMF, dostosuj i zmaksymalizuj wydajność sprzężenia trzech laserów.
  4. Zamontuj skolimowane źródło światła, które będzie używane do wyrównania wiązki w ścieżkach wzbudzenia i detekcji. Urządzenie to składa się z czasowo spójnego źródła światła (561 nm) podłączonego do SMF, adaptera światłowodowego, soczewki achromatycznej (f = 60 mm), przysłony i dystansu rurki Ø1" w systemie klatkowym (Rysunek 1C). Dostosuj odległość między adapterem światłowodowym a soczewką za pomocą interferometru ścinającego, aby zapewnić kolimację.
  5. Przygotuj narzędzie do wyrównywania belki (Rysunek 1D). Jest to para aluminiowych słupków z otworami na wysokości 2 cali od powierzchni stołu optycznego, co pozwala na szybkie i precyzyjne ustawienie wiązki.
  6. Zamontuj system z podwójnym otworkiem, który składa się z dwóch tarcz wyrównujących ze szkła szlifowanego Ø1" na każdym końcu i dwóch tubusów soczewek Ø1" (dolna jest szczelinowa), jak pokazano na Rysunek 1E.

2. Ustawianie ścieżki wykrywania

  1. Wyjmij obiektyw i zainstaluj skolimowane źródło światła. Wyreguluj pokrętła lustra (M1) pod uchwytem obiektywu tak, aby wiązka wyjściowa z mikroskopu była mniej więcej równoległa do wysokości stołu optycznego i wyrównana z gwintowanymi otworami na stole. Patrz Rysunek 2, aby uzyskać szczegółowe pozycje każdego komponentu optycznego.
  2. Włóż wielopasmowe zwierciadło dichroiczne (DM) i odbij wiązkę o 90 stopni. Użyj maksymalnego rozmiaru tęczówki i upewnij się, że wiązka przechodzi przez środek lustra dichroicznego bez przycinania.
  3. Użyj nieszczelnej wiązki przechodzącej przez zwierciadło dichroiczne, aby pokierować wyrównaniem ścieżki wykrywania. Umieść kamerę sCMOS w wiązce i upewnij się, że wiązka uderza w środek układu kamery za pomocą dwóch luster (M2 i M3).
  4. Włóż soczewkę tubusu (TL; f = 300 mm) w odległości około 300 mm od aparatu.
  5. Usuń skolimowane źródło światła i dostosuj względną odległość między obiektywem tubusu a kamerą, aż wzór na suficie zostanie wyraźnie rozwiązany przez kamerę.
  6. Umieść wielopasmowy filtr przepustowy (BF) przed soczewką tubusu, aby uzyskać wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne.

3. Ustawianie ścieżki wzbudzenia

  1. Zamontuj ponownie skolimowane źródło światła na uchwycie obiektywu. Umieść składane lustro (M4), aby przekierować wiązkę wyjściową z mikroskopu o 90 stopni. Dostosuj pokrętła lustra dichroicznego i lustra składanego iteracyjnie, aż wiązka przejdzie przez otwory w narzędziu do wyrównywania wiązki.
  2. Odłącz skolimowane źródło światła i zainstaluj je na stole, w którym wiązka skierowana jest w stronę korpusu mikroskopu. Wyrównaj belkę za pomocą narzędzia do wyrównywania belki i systemu podwójnych otworków.
  3. Włóż soczewkę L4 (f = 400 mm; Ø = 2") do ścieżki optycznej w odległości około 400 mm od uchwytu obiektywu. Zamontuj soczewkę obiektywu i wyreguluj położenie L4 wzdłuż osi optycznej, aż na suficie utworzy się idealny wzór dysku Airy.
    UWAGA: Podczas wkładania soczewki pozycja wiązki przechodzącej przez soczewkę powinna pozostać niezmieniona. Obiektyw L4 ma gwint SM2, który umożliwia łatwe mocowanie/odłączanie go od płytki klatkowej z gwintem SM2 60 mm.
  4. Odkręć obiektyw i ponownie zainstaluj skolimowane źródło światła z otwartą przysłoną. Prześledź wiązkę wyjściową z mikroskopu za pomocą wizytówki. Zamontuj lustro M5 w miejscu, w którym wielkość wiązki jest najmniejsza i w odległości około 400 mm od L4, które jest sprzężoną płaszczyzną obrazu ().
  5. Zamontuj lustro M6 i odbij wiązkę o 90 stopni. Dostosuj M5 i M6 iteracyjnie za pomocą narzędzia do wyrównywania belki.
  6. Włóż obiektyw L3 (f = 150 mm) w odległości około 150 mm od M5. Użyj interferometru ścinającego, aby zapewnić kolimację wiązki wyjściowej.
  7. Tymczasowo odejmij L4 i prześledź wiązkę w dół, aby znaleźć ogniskową L3. Umieść w tym miejscu jednoosiowe lustro galvo, które jest sprzężoną tylną płaszczyzną ogniskową (cBFP). Podłącz 0 woltów do lustra galvo i obróć uchwyt lustra galvo tak, aby odbijał wiązkę o 90 stopni.
  8. Umieść lusterko składane M7. Prawidłowo umieść L2 (f = 100 mm) w taki sam sposób, jak w kroku 3.6.
  9. Wyjmij skolimowane źródło światła z uchwytu na przedmioty. Zainstaluj soczewkę kolimacyjną L1 (f = 100 mm), adapter światłowodowy i przysłonę. Podłącz światłowód jednomodowy do adaptera i wyślij wiązkę przez system obrazowania.
  10. Włóż ponownie L4 i dostrój system, aż na suficie pojawi się idealny wzór dysku Airy.

4. Ustawianie soczewek cylindrycznych

  1. Włóż soczewkę cylindryczną (CL1, f = 400 mm) za L1 i upewnij się, że soczewka cylindryczna skupia wiązkę wzdłuż osi x.
  2. Włóż kolejną soczewkę cylindryczną (CL2, f = 50 mm) do ścieżki wiązki. Użyj interferometru ścinającego, aby upewnić się, że wiązka wyjściowa jest skolimowana.
    UWAGA: Odległość między dwiema soczewkami cylindrycznymi wynosi 450 mm. Belka wyjściowa ma stopień kompresji 8, a na suficie tworzy się wydłużony, owalny wzór dysku Airy.

5. Testowanie obrazowania kafelków

  1. Przygotuj próbkę hydrożelu 3D. Wymieszaj kulki Crimson 20 nm z roztworem hydrożelu, który składa się z 12% akrylamidu: bisakryloamidu (29:1), 0,2% (v/v) TEMED i 0,2% (w/v) nadsiarczanu amonu w 0,75x buforze TAE. Wstrzyknąć 50 μl zmieszanego roztworu do komory przepływowej, jak opisano w innym miejscu11. Po 10 minutach próbka hydrożelu 3D jest gotowa do obrazowania.
  2. Umieścić próbkę na uchwycie na próbkę. Włącz laser 638 nm i ustaw moc na <1 mW w celu wzbudzenia próbki.
  3. Uruchom oprogramowanie sterujące kamerą. W panelu ustawień akwizycji kamery wybierz opcję Wewnętrzna w trybie wyzwalania, a następnie kliknij opcję Nagraj wideo w trybie swobodnego uruchamiania.
  4. Nieznacznie dostosuj położenie kamery tak, aby obraz znajdował się na środku kamery, gdy do lustra galvo zostanie przyłożone 0 woltów.
  5. Obróć poziome pokrętło lustra M5, aby uzyskać bardzo nachylone oświetlenie.
    UWAGA: Wraz ze wzrostem kąta oświetlenia obraz hydrożelowy staje się wyraźniejszy niż obraz Epi, ponieważ wiązka staje się cieńsza. Jednak obraz zachowuje prawie tę samą pozycję.
  6. Nagraj obraz kafelka. Oblicz efektywną szerokość oświetlenia11. Na przykład Rysunek 3 pokazuje efektywną szerokość oświetlenia wynoszącą 12 μm.

6. Obrazowanie HIST

  1. Przygotuj płytkę akwizycji danych połączoną z listwą zaciskową. Podłącz złącze BNC USER 1 z P0.0 za pomocą przewodu elektrycznego. Użyj USER 1 jako wyjścia cyfrowego do zewnętrznego wyzwalania kamery sCMOS. Podłącz wyjście analogowe AO0 do sterownika lustra galvo.
  2. Wygeneruj ciągi impulsów TTL z P0.0 za pomocą specjalnie przygotowanego programu (Rysunek 4A) i ustaw czas okresu = 400 ms i t_ON = 2 ms. Sprawdź wygenerowane impulsy z terminala BNC USER 1 za pomocą oscyloskopu cyfrowego, a następnie podłącz BNC do zewnętrznego portu wyzwalania kamery.
    UWAGA: Oprogramowanie sterujące użyte w tym artykule jest dostępne na żądanie. W przypadku obrazowania z różną liczbą klatek na sekundę kamery czas okresu należy odpowiednio dostosować.
  3. Rozpocznij zamiatanie lustra galvo za pomocą niestandardowego programu. Dostosuj Vmin do -500 mV i Vmax do 500 mV, aby uzyskać pełne obrazowanie FOV. Należy zauważyć, że w tej operacji próbki hydrożelu 3D nadal wykazują wysokie tło podobne do oświetlenia Epi.
  4. Zmiana ustawień akwizycji kamery.
    1. Wybierz Zewnętrzny w trybie wyzwalania i W dół (sekwencyjny) w menu rozwijanym LightScan Plus, jak pokazano w Rysunek 4B.
      UWAGA: Przy tym ustawieniu aparat nie robi zdjęć, chyba że włączony jest sygnał wyzwalający.
    2. Kliknij opcję Scan Speed Control (Kontrola prędkości skanowania), aby wyświetlić kontrolę wysokości okna i czasu ekspozycji linii, a następnie ustaw wartości odpowiednio na 180 wierszy i 28 ms.
      UWAGA: Gdy szerokość płytki (Weff) wynosi 180 wierszy (12 μm), a czas całkowania na linię (Tint) wynosi 28 ms, czas opóźnienia między liniami (TD) jest określany jako TD = Tint/Weff = 0,156 ms. W przypadku obrazowania 2,048 x 2,048 pikseli całkowity czas akwizycji wynosi 2,048 x TD + Tint = 346 ms, co odpowiada ~2,9 kl./s.
  5. Nieznacznie dostosuj Vmax i Vmin, aby uzyskać wyraźniejsze obrazy.
  6. Uzyskaj obrazy stosu 3D za pomocą niestandardowego programu, włączając stos 3D i określając liczbę stosów oraz rozmiar kroku.

Wyniki

Jako przykład, jednoniciowe DNA znakowane Atto647N obrazowano z długością fali wzbudzenia 638 nm w hydrożelu 3D. DNA zostało zakotwiczone w sieci hydrożelu za pomocą grupy acrydite podczas polimeryzacji żelu. Obrazy wykonano w odległości 5 µm nad powierzchnią, jak pokazano na Rysunku 5a. Obraz HIST wykazał znacznie mniejsze tło w porównaniu z obrazem Epi, dla którego obliczono stosunek sygnału do tła wynoszący 1,9 ± 0,7 dla obrazu HIST, podczas gdy większość plamek pojedynczych cząsteczek była ledwo wykrywalna w technice Epi.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ pojedynczych cząsteczek RNA (smFISH) przeprowadzono z użyciem 4 sond FISH. Rysunek 5b przedstawia obrazy smFISH EEF2 (eukariotyczny czynnik elongacji translacji 2) znakowanego AlexaFluor 647 w komórkach A549 w buforze obrazowym (przygotowanie próbek opisano w naszej poprzedniej pracy11). Wykonano projekcję maksymalnej intensywności z 20 stosów z-stack odpowiadających grubości 5 µm. Obraz HIST wykazał nie tylko znacznie lepszy stosunek sygnału do tła (SBR), ale także bardziej jednorodne oświetlenie w porównaniu z obrazem Epi. W obrazowaniu Epi czas ekspozycji wynosił 400 ms, natomiast w obrazowaniu HIST czas integracji na linię wynosił 32 ms; w obu przypadkach moc oświetlenia mierzona przed obiektywem wynosiła 7,5 mW. Prędkość obrazowania dla Epi i HIST wynosiła 2,5 fps.

Konfiguracja laboratorium optycznego z pryzmatem, źródłami laserowymi oraz soczewkami do badań absorpcji i emisji fotonów.
Rysunek 1Korpus mikroskopu, lasery i narzędzia do pozycjonowania. (A) Obiektyw i uchwyt na próbkę. (B) Zdjęcie systemów laserowych. LP, dichroiczne lustro długoprzepuszczalne; λ/2, płytki półfalowe; PBS, polaryzacyjny dzielnik wiązki. (C) Kolimowane źródło światła. (D) Narzędzie do centrowania wiązki z dwoma wymiennymi otworami zwężającymi. (E) System z podwójnym otworem zwężającym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ optyczny do mikroskopii, lustra, soczewki, kamery; schemat z opisanymi komponentami.
Rycina 2. Szczegółowy układ mikroskopii z silnie nachylonym skanowaniem kafelkowym (HIST). Zdjęcie (A) i schemat (B) systemu mikroskopu HIST. BF, filtr przepustowy wielopasmowy; CL1-2, soczewki cylindryczne; DM, lustro dichroiczne; GM, lustro galwanometryczne; BF, filtr przepustowy; M1-7, lustra; L1-4, soczewki; SMF, światłowód jednomodowy; TL, soczewka tubusowa; cIP, sprzężona płaszczyzna obrazu; cBFP, sprzężona tylna płaszczyzna ogniskowa. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Obraz mikroskopowy i wykres przedstawiający odchylenie standardowe na osi x, powiązane z analizą optyczną.
Rycina 3Oświetlenie pól z zastosowaniem współczynnika kompresji wynoszącego 8. (A) Obraz fluorescencyjny kulek o średnicy 20 nm w hydrożelu 3D. Pasek skali, 20 µm. (B) Projekcja odchylenia standardowego A wzdłuż kierunku y, wygładzona za pomocą 10 punktów danych. Czerwona strzałka wskazuje efektywną szerokość oświetlenia wynoszącą 12 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat sterowania lustrem galwanometrycznym dla obrazowania stosu 3D z układem piezoelektrycznym i ustawieniami skanowania sekwencyjnego.
Rycina 4. Panele sterowania oprogramowaniem do obrazowania i kontroli. (A) Autorski program LabView synchronizuje sterowanie skanowaniem lustra galwanometrycznego, rozpoczęcie akwizycji kamery sCMOS oraz ruch stolika piezoelektrycznego. (B) Panel sterowania ustawieniami akwizycji kamery. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Porównanie obrazowania komórek w mikroskopii epi-fluorescencyjnej i HIST, prezentujące wizualizację jąder.
Rysunek 5. (A) Obrazy DNA znakowanego Atto647N w hydrożelu 3D przy oświetleniu Epi oraz HIST. (B) Obrazy smFISH dla EEF2 przy użyciu 4 sond FISH w komórkach A549 wykonane za pomocą mikroskopii Epi i HIST. Barwienie DAPI przedstawiono w kolorze niebieskim. Paski skali, 20 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki. Pierwszym z nich jest prawidłowe umieszczenie L4 w kroku 3.3, upewniając się, że padająca wiązka przechodzi przez środek soczewki, a na suficie tworzy się idealny wzór dysku Airy. Położenie L4 określa rozmieszczenie wszystkich pozostałych elementów optycznych, w tym M5, L3, GM i L2. Drugim krytycznym krokiem jest proces synchronizacji. Aby odrzucić nieostre tło, aktywne piksele, których efektywna szerokość wykrywania jest równa szerokości kafelka, powinny być zsynchronizowane z przemiataniem wiązki. Dlatego konieczne jest zmierzenie efektywnej szerokości oświetlenia wiązki kafelków (krok 5.6) i odpowiednie ustawienie parametrów kamery w kroku 6.4.

Przy obrazowaniu z bardzo dużym polem widzenia, prezentowana metoda wykazuje zwiększone tło z jednej strony w porównaniu z drugą stroną. Przypisuje się to nieznacznie zmienionym kątom oświetlenia w różnych pozycjach obrazowania. Wdrożenie drugiego lustra galvo zamiast M5 łagodzi ten problem, jak pokazano wcześniej, poprzez synchroniczną regulację pozycji i kąta skanowania11. Zamiast gotowych dubletów achromatycznych pomocny będzie również telecentryczny obiektyw skanujący. Jednak do zobrazowania obszaru o powierzchni <8 080μm2 wystarczające było pojedyncze zamiatanie zwierciadła galvo. Mikroskopia HIST ma ograniczenie głębokości obrazowania, jednak jest w stanie uzyskać dobry SBR podczas obrazowania do ~15 μm za pomocą wiązki płytek 12 μm i soczewki obiektywowej zanurzeniowej NA 1,4511.

W tym protokole użyliśmy współczynnika kompresji belki wynoszącego 8, aby wykonać belkę z płytek. W mikroskopii HIST można zastosować cieńsze oświetlenie w celu uzyskania wyższego SBR, co może być skuteczne w obrazowaniu tkanek jednocząsteczkowych11. Jednak w tym przypadku efekt fotowybielania należy rozpatrywać poprzez zwiększoną intensywność wzbudzenia, podczas gdy obecny współczynnik kompresji wiązki wykazał zmniejszone fotowybielanie w obrazowaniu 3D w porównaniu z Epi11. W porównaniu z mikroskopami z arkuszami świetlnymi z dwoma ortogonalnie ustawionymi obiektywami, mikroskopia HIST jest prosta do wdrożenia i kompatybilna z konwencjonalnymi preparatami próbek. Ulepszony SBR i duże pole widzenia mikroskopii HIST są odpowiednie do badania interakcji i dynamiki pojedynczych biomolekuł w wielu komórkach i mogą być dalej wykorzystywane w obrazowaniu w superrozdzielczości i śledzeniu pojedynczych cząsteczek.

Oświadczenia

University of Central Florida złożył wniosek patentowy obejmujący pracę opisaną w tym artykule.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Agencję Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obronności (DARPA) (HR00111720066) i Narodową Fundację Nauki (NSF) (1805200). Dziękujemy Michaelowi Serge'owi z firmy Andor Technology za hojne wypożyczenie kamery sCMOS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dublet achromatyczny 1"KolimatorAC254-060-A-ML 
1" Achromatyczny dubletThorlabsAC254-100-A-MLL1,L2
1" Achromatyczny dubletThorlabsAC254-300-A-MLTL
1" Szerokopasmowe lustra dielektryczneThorlabsBB1-E02-10M1~M7
1" Soczewki cylindryczneThorlabsLJ1363RM-ACL1
1" Soczewki cylindryczneThorlabsLJ1695RM-ACL2
1" kwadratowy montaż kinematycznyEdmund Optics58-857Do montażu zwierciadła dichroicznego
1" Gwintowana płyta klatkowaThorlabsCP02Do mocowania innych soczewek
2" Achromatyczny dubletThorlabsAC508-150-A-MLL3
2" Achromatyczny dubletThorlabsAC508-400-A-MLL4
2" Gwintowany Płyta klatkowaThorlabsLCP01Do trzymania L4
2 "Gwintowana płyta klatkowaThorlabsLCP01TDo przechowywania L3
2% Bis SolutionBio Rad64085292składnik hydrożelowy
20 nm kulki fluorescencyjneThermo FisherF8782Do testowania obrazowania
30 mm Klatka kątowa Kinematyczne lusterko do montażuThorlabsKCB1Dla obiektywnych i Mocowanie kamery
30mm Cage System IrisThorlabsCP20S
3-osiowy stolik NanoMaxThorlabsMAX311D
40% roztwór akrylamiduBio Rad64148001składnik hydrożelowy
405 nm laserCoboltCobolt 06-MLD
50x bufor TAEBio-Rad161-0743składnik hydrożelowy
561 nm laserCoboltCobolt 06-DPL
638 nm laserCoboltCobolt 06-MLD
Nadsiarczan amonuSigmaA3678-25Gskładnik hydrożelowy
Narzędzie do wyrównywania wiązkiwykonane na
Listwy zaciskowe BNCNatural InstrumentsBNC-2110
Płyta klatkowa z gwintem wewnętrznym M9 x 0,5ThorlabsCP1TM09Do mocowania soczewek asferycznych
Pręty systemu klatkowegoSeriaThorlabs
Hodowle komórkowe i smFISHZobacz referencje [11]
Taśma dwustronna Scotch515182Komora przepływowa
Epoksyd Devcon14250Lustro
przepływowe GalvoThorlabsGVS211GM
Galvo System Zasilacz liniowyThorlabsGPS011
Płyta półfalowaThorlabsWPH10M-405/561/633Regulacja mocy
zwierciadło dichroiczne dalekiego przepustuChromaT550lpxrDo łączenia laserów
Szkiełka mikroskopoweFisherbrand12549-3Komora przepływowa
Mikroskopische DeckglaserHecht Assistent990/5024Komora przepływowa
Montowana tarcza wyrównująca z matowego szkłaThorlabsDG10-1500-H1-MDDo systemu z podwójnym otworkiem
Zamontowana soczewka asferyczna RochesterThorlabsA230TM-A Wielopasmowe
lustro dichroiczneSemrockDi03-R405/488/561/635- t3DM; Grubość 3 mm
Filtr wielopasmowySemrockFF01-446/523/600/677-25BF
Włókno wielomodoweThorlabsM31L02MMF
N,N,N',N'-tetrametylo etylenodiaminaSigmaT7024-25MLskładnik hydrożelowy
płyta NI-DAQNatural InstrumentsPCI-6733
Ø 1" Kinematic Mirror MountThorlabsKM100Do trzymania luster
Soczewka obiektywuOlympusPLANAPO N 60X60X 1.45NA
olej Podstawa cokołu Widelce mocująceNewport9916
Słupki filaroweThorlabsRS1P8E
Kontroler piezoelektrycznyThorlabsBPC303
Spolaryzowany rozdzielacz wiązkiThorlabsPBS251Do łączenia laserów
Adapter RMS-SM1ThorlabsSM1A3TSDo obiektywu
Uchwyt prętawykonany
Mocowanie klatki obrotowej ThorlabsRSP1 / CRM1 / CRM1PDo HWP i cylindrycznego montażu obiektywu
Kamera sCMOSAndorZyla-4.2P-CL10
Interferometr ścinającyThorlabsSI100Test kolimacji wiązki
Światłowód jednomodowyThorlabsP5-405BPM-FC-2SMF
SM1 Tubusy obiektywuThorlabsSM1S25Do systemu
SM1 Szczelinowy tubusobiektywu ThorlabsSM1L30CDo systemu z podwójnym otworkiem
Montaż na sceniewykonany na zamówienie
gwintowany adapter światłowodowyThorlabsSM1FC
Oś Z Montaż translacyjnyThorlabsSM1ZZłącze światłowodowe
zamówienie SRna zamówieniez podwójnym otworkiem

Bibliografia

  1. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361, 880-887 (2018).
  2. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer. Science. 359, (2018).
  3. Raj, A., van Oudenaarden, A. Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression. Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).
  4. Wilson, T. Resolution and optical sectioning in the confocal microscope. Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).
  5. Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope. Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).
  6. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  7. Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nature Methods. 8, 1047(2011).
  8. Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12, 641(2015).
  9. Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. 3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet. Nature Communications. 9, 123(2018).
  10. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5, 159-161 (2008).
  11. Tang, J., Han, K. Y. Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination. Optica. 5, 1063-1069 (2018).
  12. Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution. Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).
  13. Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. Ray tracing analysis of inclined illumination techniques. Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia z silnie nachylonym przesuwanym kafelkiemobrazowanie z rozszerzonym polem widzeniawzbudzanie soczewk cylindrycznskanowanie lustrem galwanometrycznymkonfiguracja optyczna 4fkamera sCMOSdynamiczna szczelina konfokalnaprzygotowanie pr bki hydro elowejsterowanie wzbudzaniem laserowym

Powiązane artykuły