Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

Summary

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Abstract

Informacje o toksyczności chemikaliów są niezbędne w ich stosowaniu i gospodarce odpadami. W przypadku chemikaliów o niskich stężeniach długoterminowe skutki są bardzo ważne dla oceny ich konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Demonstrując długoterminowe wpływy, wpływ chemikaliów na przestrzeni pokoleń w ostatnich badaniach dostarcza nowego wglądu. W tym miejscu opisujemy protokoły badania wpływu substancji chemicznych na wiele pokoleń przy użyciu wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans. Przedstawiono dwa aspekty: (1) badania skutków międzypokoleniowych (TG) i (2) badań efektów wielopokoleniowych, z których te ostatnie są podzielone na badania narażenia wielopokoleniowego (MGE) i wielopokoleniowego efektu resztkowego (MGR). Badanie efektu TG jest solidne i ma prosty cel, jakim jest ustalenie, czy narażenie rodziców na chemikalia może skutkować jakimikolwiek szczątkowymi konsekwencjami dla potomstwa. Po zmierzeniu wpływu na rodziców, roztwory podchlorynu sodu są używane do zabicia rodziców i zatrzymania potomstwa, aby ułatwić pomiar wpływu na potomstwo. Badanie efektu TG służy do określenia, czy potomstwo jest dotknięte, gdy jego rodzic jest narażony na zanieczyszczenia. Badanie efektu MGE i MGR jest systematycznie stosowane w celu określenia, czy ciągła ekspozycja pokoleniowa może skutkować reakcjami adaptacyjnymi u potomstwa na przestrzeni pokoleń. Staranne pobieranie i przenoszenie służy do rozróżniania generacji, aby ułatwić pomiar wpływu na każde pokolenie. Połączyliśmy również protokoły, aby zmierzyć zachowanie lokomocji, reprodukcję, długość życia, zmiany biochemiczne i ekspresję genów. Przedstawiono również kilka przykładowych eksperymentów ilustrujących badania efektów trans- i wielopokoleniowych.

Introduction

Stosowanie i zarządzanie odpadami chemikaliów jest w dużym stopniu zależne od informacji o ich skutkach przy określonych stężeniach. Warto zauważyć, że czas jest kolejnym istotnym elementem między efektami a stężeniami. Oznacza to, że substancje chemiczne, zwłaszcza te w niskich stężeniach w rzeczywistym środowisku, potrzebują czasu, aby wywołać mierzalne efekty¹. Dlatego naukowcy ustalają różne długości czasu ekspozycji w eksperymentach na zwierzętach, a nawet obejmują cały cykl życia. Na przykład myszy były narażone na nikotynę przez 30, 90 lub 180 dni, aby zbadać jej toksyczne działanie ². Jednak takie czasy narażenia nadal nie są wystarczające, aby wyjaśnić długoterminowe skutki zanieczyszczeń (np. trwałych zanieczyszczeń organicznych [TZO]), które mogą utrzymywać się przez pokolenia organizmów w środowisku. Dlatego badania nad skutkami na przestrzeni pokoleń zyskują coraz większe zainteresowanie.

Istnieją dwa główne aspekty badań nad efektem pokoleniowym. Pierwszym z nich jest badanie efektu międzypokoleniowego (TG), które może solidnie sprawdzić, czy narażenie rodziców na chemikalia może mieć jakiekolwiek konsekwencje dla potomstwa³. Drugie badanie to wielopokoleniowe badanie efektów, które jest bardziej systematyczne i uwzględnia zarówno narażenie, jak i skutki rezydualne. Z jednej strony, efekty ekspozycji wielopokoleniowej (MGE) są wykorzystywane do zilustrowania reakcji adaptacyjnych zwierząt na długotrwałe trudne środowisko. Z drugiej strony, wielopokoleniowe efekty resztkowe (MGR) są wykorzystywane do wykazania długoterminowych konsekwencji resztkowych po narażeniu, ponieważ narażeniu matki towarzyszy narażenie zarodka na pierwsze potomstwo i narażenie linii zarodkowej na drugie potomstwo, co sprawia, że trzecie potomstwo jako pierwsze pokolenie całkowicie nie jest narażone⁴.

Chociaż ssaki (np. myszy) są organizmami modelowymi w badaniach toksyczności, szczególnie w odniesieniu do ludzi, ich zastosowanie w badaniu efektów pokoleniowych jest dość czasochłonne, kosztowne i etycznie problematyczne ⁵. W związku z tym organizmy, w tym skorupiak Daphnia magna⁶, owad Drosophila melanogaster⁷ i danio pręgowany Danio rerio⁸, zapewniają alternatywne opcje. Jednak organizmy te albo nie są podobne do ludzi, albo wymagają specjalnego sprzętu w badaniach.

Caenorhabditis elegans to mały, wolno żyjący nicień (około 1 mm długości) o krótkim cyklu życia (około 84 h w temperaturze 20 °C)⁹. Nicienie te mają wiele wspólnych szlaków biologicznych konserwatywnych dla ludzi, dlatego są szeroko stosowane do ilustrowania skutków różnych stresów lub substancji toksycznych¹⁰. Warto zauważyć, że 99,5% nicieni to hermafrodyty, co czyni te organizmy niezwykle przydatnymi w badaniu efektów pokoleniowych, np. Efekty TG metali ciężkich i sulfonamidów^3,11, MGE effects of gold nanoparticles and heavy metals¹² and temperature¹³, MGR effects of sulfonamide¹⁴, oraz zarówno MGE, jak i MGR wpływu promieniowania gamma¹⁵ oraz lindane⁴. Ponadto uzyskano porównywalne wyniki między wpływem substancji chemicznych (np. zearalenonu) na rozwój i rozmnażanie myszy a C. elegans^16,17, co dałoby przewagę w ekstrapolacji efektów z tego małego zwierzęcia na ludzi.

Zarówno badania efektu TG, jak i MG są czasochłonne i wymagają starannego projektowania i wydajności. Warto zauważyć, że w wyżej wymienionych badaniach istniały różnice w wyborach dotyczących etapów życia, warunków narażenia i metod separacji pokoleń. Różnice te utrudniały bezpośrednie porównanie wyników i utrudniały ich dalszą interpretację. W związku z tym konieczne jest ustanowienie jednolitych protokołów, które będą kierować badaniami skutków TG i MG, a także zapewnić szerszy obraz, aby ujawnić podobne wzorce różnych substancji toksycznych lub zanieczyszczeń w długoterminowych konsekwencjach. Nadrzędny cel obecnych protokołów zademonstruje jasne procesy operacyjne w badaniu między- i wielopokoleniowych efektów z C. elegans. Protokoły przyniosą korzyści naukowcom, którzy są zainteresowani badaniem długoterminowych skutków substancji toksycznych lub zanieczyszczeń.

Protocol

1. Culture E. coli OP50

1. Prepare 1 M sodium hydroxide solution by dissolving 4 g of sodium hydroxide in 100 mL water.
2. Prepare lysogeny broth (LB) medium by dissolving 10 g of tryptone, 5 g of yeast extract and 10 g of sodium chloride with 1 L of ultrapure water in a 1 L conical flask. Adjust the pH to 7.0 with 1 M sodium hydroxide solution.
3. Aliquot the LB liquid medium from step1.2 into 20 conical flasks (maximum allowable volume: 100 mL) with 50 mL medium in each. Cover the conical flasks with kraft paper.
4. Sterilize the LB liquid medium at 121 °C and 0.105 MPa for 20 min. Cool the LB medium down to room temperature.
5. Pipette 200 µL from the bacterial suspensions (see step 1.8) or pick a small colony from agars (in step 2.14) using an inoculating loop, place it in LB medium.
6. Incubate the LB medium with shaking at 150 rpm at 37 °C for 24-48 h. The LB medium will change from a brown transparent liquid to turbid khaki-colored suspension.
7. Use the bacterial suspensions from 80% of total flasks to provide E. coli OP50 as nematode food to be used in step 2.11.
8. Store the rest of the flasks containing the bacterial suspensions in a refrigerator at 4 °C. Pipette 200 µL of the LB suspensions on to the upper side of fresh LB medium (step 1.4) and repeat step1.6 for subsequent incubation.

2. Culture C. elegans

NOTE: Culture C. elegans using as per steps 2.1 to 2.11 based upon standard methods¹⁸.

1. Dissolve 22.8 g of K₂HPO₄•3H₂O in 100 mL of sterile distilled water.
2. Dissolve 6.8 g of KH₂PO₄ in 50 mL of sterile distilled water.
3. Mix solutions from steps 2.1 and 2.2, to prepare 1 M K₂HPO₄-KH₂PO₄ buffer (pH 6.0, 150 mL in total).
4. Prepare 1.0 M MgSO₄ by dissolving 1.232 g of MgSO₄•7H₂O in 5 mL of sterile distilled water, and sterilize it by filtering the solution through a 0.22 µm sterile disposable membrane filter into a sterile container.
5. Prepare 1 M CaCl₂ by dissolving 0.554 g of CaCl₂ in 5 mL of sterile distilled water, and sterilize it by filtering the solutions through a 0.22 µm sterile disposable membrane filter into a sterile container.
6. Prepare 1 M cholesterol solution by dissolving 0.025 g of cholesterol in 5 mL of absolute ethanol, and sterilize it by filtering the solution through a 0.22 µm sterile disposable membrane filter into a sterile container.
7. Prepare the nematode growth medium (NGM) agar by adding 17 g of agar powder, 2.5 g of peptone and 3 g of sodium chloride to a 1 L conical flask containing 1 L of ultrapure water. Add 25 mL of K₂HPO₄-KH₂PO₄ solution from step 2.3.
8. Sterilize the NGM agar from step 2.7 at 121 °C with 0.105 MPa for 20 min.
9. Cool the NGM agar to about 50 °C, add 1 mL of 1 M MgSO₄, 1 M CaCl₂, and 5 mg/mL cholesterol-ethanol solution from steps 2.4 to 2.6 into the medium and mix them thoroughly.
10. Pour ~10 mL NGM agar medium per dish into 100 sterile Petri dishes (6.0 cm diameter). Cool the medium in the Petri dishes to room temperature to form solid agar.
11. Pipette 170 µL of the bacterial suspensions from step 1.7 onto the aforementioned NGM agar using a sterile tip. Shake the NGM agar slightly to distribute the LB medium evenly over the NGM agar surface.
12. Inoculate the NGM agar with the top-side up at 37 °C for 8-12 h to form a bacterial lawn.
13. Use most of the agar with bacterial lawns from step 2.12 to culture nematodes in step 2.15 or 2.19.
14. Store 1 or 2 agars up-side down to avoid water evaporation and contamination in refrigerators at 4 °C so as to sustain the bacteria in of contamination.
15. When there are less than 2,000 nematodes on the stocking NGM agars (from earlier experiments or gifted from other labs), cut one sixth of the NGM agar that contains C. elegans with a sterile tip and transfer it onto newly prepared NGM agars with bacterial lawn (from step 2.13). Keep the NGM agars up-side down in a 22 °C incubator for the subsequent culture.
16. When there are more than 2,000 nematodes on the stocking NGM agar, flush the nematodes of the NGM agar with 2 mL of sterile water into centrifuge tubes. The input of 2 mL of water will result in an approximately 1.5 mL output.
17. Allow the nematodes to settle in the centrifuge tubes from for 30 min. Discard 1 mL of the supernatants by pipetting and add 1 mL of sterile water into each tube to wash the pellets (i.e., the nematodes).
18. Settle down the nematodes in the centrifuge tubes for 30 min. Discard 1 mL of the supernatants by pipetting. Add 1 mL of sterile water into each tube to resuspend the nematodes.
19. Distribute the nematode suspensions (approximately 1.5 mL in total) by pipetting 150 µL onto each new NGM agar with bacterial lawn (from step 2.13), making 8-10 new NGM agars in total.
20. Keep the NGM agars from step 2.19 up-side up in a 20 °C incubator overnight and then up-side down for the subsequent culture.
21. Repeat step 2.15 or step 2.16-2.20 every three days.

3. Prepare synchronized eggs and L3 larvae of C. elegans

1. Flush off the gravid nematodes and newly produced eggs from the NGM agars into sterile centrifuge tubes, with 2 mL of sterile water on each NGM agar resulting in approximately 1.5 mL of output.
2. Settle down the nematodes in the centrifuge tubes for 30 min, and then discard 85% of the supernatants by pipetting.
3. Prepare sodium hypochlorite solutions by dissolving 0.6 g of NaOH and

Results

Tutaj opisujemy protokoły badania wpływu substancji chemicznych na przestrzeni pokoleń przy użyciu C. elegans w badaniach międzypokoleniowych (TG), wielopokoleniowych (MGE) i wielopokoleniowych (MGR). Jako przykłady przedstawiono wyniki naszych własnych badań. Jedno z badań przedstawia wpływ TG metali ciężkich na zachowanie lokomocji³. Pozostałe dwa badania przedstawiają wpływ MGE i MGR sulfometoksazolu i lindanu na rozrodczość oraz pomiary wskaźników bioc...

Discussion

Aby skutecznie przeprowadzić opisany protokół, należy wziąć pod uwagę następujące sugestie. Wykonaj ogólne operacje eksperymentalne w sterylnym środowisku. Niewłaściwa eksploatacja może spowodować zanieczyszczenie szczepów E. coli , np. grzyby i roztocza mogą utrudniać prawidłowy wzrost C. elegans, a tym samym wpływać na wyniki eksperymentów. W części opisującej hodowlę C. elegans obserwuj skalę wzrostu C. elegans na agarach NGM gołym okiem lub pod mikroskopem. Gdy skala C. elegans...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
agar w proszku	OXOID, Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania	9002-18-0
79nnHT Szybki system PCR w czasie rzeczywistym	Biosystemy stosowane
96-dołkowa sterylna mikropłytka	Costar? Corning? Ameryka
Sterylizator autoklawu	Tomy, Tomy Digital Biology, Japonia
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	LongYue, Shanghai longyue instrument equipment co. Ltd, Chiny
chlorek wapnia	Sinopharm odczynnik chemiczny firma Ltd, Chiny	10043-52-4
wirówka  5417R	Eppendorf, Ai Bende (Shanghai) International Trade Co., Ltd, Niemcy
Probówki wirówkowe	Axygen, Aixjin biotechnology (Hangzhou) co. Ltd, Ameryka
cholesterol	Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny	57-88-5
Dimetylosulfotlenek	VETEC, Sigmar aldrich (Shanghai) trading co. Ltd, Ameryka	67-68-5
wodorofosforan disodowy	Odczynnik chemiczny Sinopharm Ltd, Chiny	7558-79-4
etanol	Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny	64-17-5
Filter	Thermo, Thermo Fisher Scientific, amerykański
inkubator	YiHeng17, Shanghai yiheng scientific instrument co. Ltd, chińska
pętla
inokulacyjnaK2HPO4• 3H2O	Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny	16788-57-1
papier
Mcroplate Reader	Boitek, Boten apparatus co. Ltd, America
MgSO4• 7H2O	Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny	10034-99-8
Mikroskopy XTL-BM-9TD	BM, Shanghai BM optical instruments manufacturing co. Ltd, Chiny
Szalki
Pipeta	Eppendorf, Ai Bende (Szanghaj) International Trade Co., Ltd, Niemcy
Chlorek potasu	Sinopharm odczynnik chemiczny firma Ltd, Chiny	7447-40-7
diwodorofosforan potasu	Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny	7778-77-0
Zestawy Qiagen RNeasy	Qiagen Inc., Walencja, Kalifornia, Stany Zjednoczone
Zestawy QuantiTect SYBR Green RT-PCR	Qiagen Inc., Walencja, Kalifornia, Stany Zjednoczone
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA	RevertAid Thermo Scientific, Wilmington, DE, Stany
Chlorek sodu	Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny	7647-14-5
wodorotlenek sodu	Sinopharm chemical reagent company Ltd, Chiny	1310-73-2
roztwór podchlorynu sodu	Aladdin, Shanghai Aladdin biochemical technology co., Ltd, Chiny	7681-52-9
trypton	OXOID, Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania	73049-73-7
ekstrakt drożdżowy	OXOID, Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania	119-44-8