Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Konfokalne obrazowanie na żywo merystemów wierzchołkowych pędów różnych gatunków roślin

12.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59369

⸱

29 marca 2019

 , 
1Department of Botany and Plant Pathology, Purdue University, 2Purdue Center for Plant Biology, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół pokazuje, jak na żywo obrazować i analizować merystemy wierzchołkowe pędów z różnych gatunków roślin za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Merystem wierzchołkowy pędu (SAM) funkcjonuje jako zachowany rezerwuar komórek macierzystych i generuje prawie wszystkie tkanki nadziemne podczas rozwoju postembrionalnego. Aktywność i morfologia SAM determinują ważne cechy agronomiczne, takie jak architektura pędów, wielkość i liczba narządów rozrodczych, a co najważniejsze, plon ziarna. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół analizy zarówno morfologii powierzchni, jak i wewnętrznej struktury komórkowej żywych SAM z różnych gatunków za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Cała procedura, od przygotowania próbki do uzyskania trójwymiarowych obrazów (3D) o wysokiej rozdzielczości, może zostać wykonana w ciągu zaledwie 20 minut. Wykazaliśmy, że protokół ten jest bardzo skuteczny w badaniu nie tylko SAM kwiatostanów gatunków modelowych, ale także merystemów wegetatywnych z różnych upraw, zapewniając proste, ale potężne narzędzie do badania organizacji i rozwoju merystemów u różnych gatunków roślin.

Wprowadzenie

Merystem roślinny zawiera pulę niezróżnicowanych komórek macierzystych i stale podtrzymuje wzrost i rozwój organów roślinnych1. Podczas rozwoju postembrionalnego prawie wszystkie nadziemne tkanki rośliny pochodzą z merystemu wierzchołkowego pędu (SAM). W uprawach aktywność i wielkość SAM i pochodnych merystemów kwiatowych są ściśle związane z wieloma cechami agronomicznymi, takimi jak architektura pędów, produkcja owoców i plon nasion. Na przykład w przypadku pomidorów powiększony SAM powoduje wzrost rozgałęzień pędów i kwiatostanów, a tym samym powoduje generowanie dodatkowych organów kwiatowych i owocowych2. W kukurydzy wzrost wielkości SAM prowadzi do większej liczby nasion i całkowitego plonu3,4. W przypadku soi nieokreśloność merystemu jest również ściśle związana z architekturą pędów i plonem5.

Morfologia i anatomia SAMs mogą być scharakteryzowane za pomocą kilku różnych metod, w tym histologicznego cięcia/barwienia i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)6, które znacznie rozwinęły badania merystemów, dostarczając zarówno przekrojowego, jak i trójwymiarowego (3D) widoku powierzchni SAM. Obie metody są jednak czasochłonne i obejmują kilka etapów eksperymentalnych od przygotowania próbki do uzyskania danych, a metody te zależą głównie od utrwalonych próbek. Ostatnie postępy w technice skaningowej mikroskopii konfokalnej ze skaningiem laserowym przezwyciężyły te ograniczenia i dały nam potężne narzędzie do badania struktury komórkowej i procesu rozwoju tkanek i narządów roślinnych7,8. Mikroskopia konfokalna, dzięki optycznej, a nie fizycznej sekcji tkanek, umożliwia zebranie serii obrazów ze stosu Z, a następnie rekonstrukcję 3D próbki za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Tutaj opisujemy efektywną procedurę badania zarówno wewnętrznych, jak i powierzchniowych struktur żywych SAM z różnych gatunków roślin za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej, która potencjalnie pozwala badaczom na przeprowadzenie całego procesu eksperymentalnego w ciągu zaledwie 20 minut. Różni się od innych opublikowanych metod obrazowania konfokalnego na żywo kwiatostanu rzodkiewnika SAMs9,10,11,12,13,14,15 oraz Arabidopsis flowers12,13, tutaj pokazujemy, że protokół ten jest bardzo skuteczny w badaniu nie tylko merystemów kwiatostanowych gatunków modelowych, ale także merystemów wierzchołkowych pędów wegetatywnych z różnych upraw, takich jak pomidory i soja. Metoda ta nie opiera się na transgenicznych markerach fluorescencyjnych i potencjalnie może być stosowana do badania merystemów pędów wielu różnych gatunków i odmian. Ponadto wprowadzamy również proste kroki przetwarzania obrazu do przeglądania i analizowania różnych SAM w widoku 3D. Podsumowując, ta prosta metoda ułatwi naukowcom lepsze zrozumienie zarówno struktury, jak i procesu rozwoju merystemów zarówno z organizmów modelowych, jak i roślin uprawnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie potraw z mediów i obrazowania

  1. Płytki MS: Dodaj 0,5x pożywkę Murashige & Skoog MS, 1% agaru do wody dejonizowanej, a następnie dostosuj pH do 5,8 za pomocą roztworu wodorotlenku potasu (opcjonalnie: Dodaj 1% sacharozy do długotrwałej uprawy roślin). Autoklaw i płytki do nalewania.
  2. Naczynia do obrazowania: Plastikowe szalki Petriego (6 cm szerokości, 1,5 cm głębokości) napełnić 0,5-0,8 cm 1,5% stopionej agarozy.

2. Wzrost roślin

  1. Wzrost rzodkiewnika
    1. Wysterylizowane nasiona wysiewać na płytkach MS i umieszczać je w temperaturze poniżej 4 °C na dwa dni. Następnie przenieś płytki MS na krótki dzień (8 godzin światła / 16 godzin ciemności), w temperaturze 22 °C na dwa tygodnie.
    2. Sadzonki należy przesadzić do gleby i wyhodować w ciągu krótkiego dnia (8 godzin światła / 16 godzin ciemności) w temperaturze 22 °C przez cztery tygodnie.
    3. Przenieść rośliny do światła ciągłego, w temperaturze 22 °C, w celu wywołania przejścia z fazy wegetatywnej do fazy rozrodczej oraz w celu zobrazowania SAM-ów kwiatostanu.
  2. Wzrost pomidorów i soi
    1. Nasiona należy inkubować przykryte mokrą bibułą filtracyjną w temperaturze poniżej 28 °C, aż wykiełkują.
    2. Przesadzić sadzonki do gleby i hodować je w ciągu długiego dnia (16 godzin światła / 8 godzin ciemności) w temperaturze 25 °C przez tydzień lub dłużej w celu zobrazowania wegetatywnych SAM.

3. Analiza wierzchołka pędu

  1. Rozcięcie wierzchołka pędu kwiatostanu
    1. Odetnij wierzchołek pędu kwiatostanu wraz z 1-2 cm główną łodygą z przykręconych roślin Arabidopsis za pomocą żyletki. Przytrzymaj podstawową część głównej łodygi i usuń jak najwięcej starszych organów kwiatowych z głównej łodygi, wycinając szypułki kleszczami jubilerskimi.
      UWAGA: Unikaj obcinania palców podczas używania żyletki. Zużyte żyletki należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na ostre przedmioty.
    2. Przytrzymaj przymocowaną łodygę wierzchołka pędu za pomocą kleszczyków jubilerskich lub palców w polu mikroskopu stereoskopowego, kontynuuj usuwanie reszty kwiatów, aż prawie cały SAM będzie można zobaczyć z okularów. Usuń szypułki wyraźnie na skrzyżowaniu głównej łodygi.
  2. Rozwarstwienie wierzchołka pędu wegetatywnego
    1. Aby wyświetlić wegetatywne SAM z pomidora lub soi, wypreparuj liścienie, liście i korzenie roślin.
    2. Trzymaj hipokotyle roślin pod mikroskopem stereoskopowym i dalej wycinaj zawiązki liści pokrywające wegetatywne SAM za pomocą kleszczy jubilerskich.

4. Barwienie

  1. Aby bezpośrednio uwidocznić komórki w SAM, użyj świeżo przygotowanego roztworu jodku propidyny (PI) do barwienia ścian komórkowych. Rozpuść proszek PI w sterylnej, dejonizowanej wodzie, przygotuj 1 ml roztworu barwiącego PI o stężeniu 1 mg / ml i przechowuj roztwór PI w probówce mikrowirówkowej pokrytej folią aluminiową.
  2. Odpipetować 50 μl roztworu PI na czystą i pustą szalkę Petriego i zanurzyć cały wypreparowany wierzchołek pędu w barwniku na 2 minuty. Wypłukać poplamiony wierzchołek pędu dwukrotnie w sterylnej, dejonizowanej wodzie. Podczas procesu barwienia zanurz cały kwiatostan SAM lub wegetatywny SAM w roztworze PI, aby uzyskać jednolite zabarwienie.

5. Kolekcja obrazów

UWAGA: W przypadku tej metody, wszystkie SAM-y są obrazowane za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego i z 20-krotnym soczewką zanurzającą w wodzie. Zgodnie z opisem w innych protokołach9,12,13,15, możliwe jest również obrazowanie SAM za pomocą odwróconego mikroskopu. Ponadto obrazowanie na żywo można uzyskać przy użyciu mikroskopów konfokalnych różnych marek, z tymi samymi etapami przygotowania próbki. W tym badaniu etapy obrazowania są szczegółowo opisane jako przykład.

  1. Przebij otwór w środku naczynia do obrazowania za pomocą kleszczy i przyklej poplamiony wierzchołek pędu pionowo w podłożu.
  2. Napełnij naczynie obrazowania sterylną, dejonizowaną wodą, aby całkowicie zanurzyć próbkę. Patrząc z mikroskopu stereoskopowego, pipetuj w górę iw dół, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione wokół merystemu. Następnie wyreguluj kąt łodygi w agarze tak, aby upewnić się, że SAM jest w pełni widoczny bezpośrednio z góry.
  3. Umieść miskę obrazowania na stoliku na próbkę mikroskopu konfokalnego. Opuść soczewkę zanurzającą się w wodzie i podnieś stolik próbki mikroskopu, aby końcówka soczewki zanurzyła się w wodzie.
  4. Otwórz oprogramowanie mikroskopu konfokalnego i zlokalizuj SAM w jasnym polu okularów. Przesuń próbkę SAM tuż pod soczewkę obiektywu, regulując kontroler XY, a następnie skup się na SAM z okularów, ostrożnie regulując kontroler Z.
  5. Uruchom funkcję akwizycji w oprogramowaniu mikroskopu konfokalnego (patrz tabela materiałów), uruchom tryb Na żywo, aby wyświetlić próbkę z ekranu komputera i ustaw wszystkie parametry eksperymentu skanowania laserowego.
    1. Podczas regulacji parametrów użyj funkcji wskaźnika zasięgu, aby określić, czy sygnał jest nasycony, czy nie.
    2. Opcjonalnie zastosuj funkcję Użyj ponownie, aby ponownie wczytać wszystkie ustawienia parametrów z wybranego pliku konfokalnego.
      UWAGA: Sugerowane parametry obrazowania: Linia lasera (wzbudzenie): 515 nm lub 561 nm; Emisja 570-650 nm; otworek: 1 jednostka przewiewna (AU); Wzmocnienie: 600-750, tryb skanowania: Frame; Rozmiar ramy: 512 X 512 lub 1024 X 1024; prędkość skanowania: od 7 do Max; Kierunek skanowania: dwukierunkowy; Liczba uśredniająca: 2-4; Metoda uśredniania: średnia; Głębia bitowa: 16 bitów; Interwał skanowania: 0,5-1 μM. Ponadto zoptymalizuj wszystkie te parametry w oparciu o charakter różnych próbek roślin i specyficzne potrzeby w zakresie obrazowania.

6. Przetwarzanie obrazu

  1. Do wizualizacji optycznych widoków przekrojów ortogonalnych i poprzecznych należy użyć tego samego komercyjnego oprogramowania do pozyskiwania obrazu. Otwórz oryginalny plik konfokalny, kliknij menu orto, wybierz orto. Następnie wybierz pozycję x, pozycję y i pozycję z obrazu i zapisz obrazy jako pliki tiff.
    1. Opcjonalnie wybierz funkcję odległości 3D, aby zdefiniować fizyczną odległość między dwoma punktami, które zostały wybrane ze stosu obrazów konfokalnych.
    2. Alternatywnie można użyć Fiji/Image J, pakietu do przetwarzania obrazów z otwartymi zasobami, aby zwizualizować widoki przekroju ortogonalnego i poprzecznego.
    3. Otwórz oryginalny plik konfokalny z Fidżi, kliknij menu obrazu, wybierz Stosy, a następnie wybierz Widoki ortogonalne.
    4. Wybierz płaszczyzny XY, YZ i XZ w środkowej pozycji i zapisz je jako obrazy w formacie TIFF.
  2. Do wizualizacji przezroczystego rzutu 3D należy użyć tego samego oprogramowania.
    1. Otwórz oryginalny plik konfokalny, kliknij menu 3D i wybierz opcję Przezroczysty, aby wygenerować widok rzutowania 3D.
    2. Opcjonalnie kliknij menu 3D, wybierz opcję Wygląd, a następnie wybierz opcję Przezroczystość, aby dostosować trzy parametry rzutowania, w tym Próg, Rampę i Maksimum, dla przezroczystości obrazu 3D.
    3. Kliknij menu 3D, wybierz Wygląd, a następnie wybierz Światło, aby dostosować jasność obrazu 3D.
    4. Wyeksportuj wyświetlane obrazy i zapisz je jako pliki Tiff.
  3. Aby zobrazować projekcję maksymalnej intensywności 3D, otwórz pliki konfokalne za pomocą tego samego oprogramowania i kliknij menu 3D.
    1. Wybierz menu 3D i wybierz Maksimum.
    2. Alternatywnie, użyj Fiji/Image J, aby zwizualizować projekcję maksymalnej intensywności 3D.
    3. Otwórz oryginalny plik konfokalny z Fidżi, kliknij menu Obraz i wybierz stosy.
    4. Wybierz projekt 3D i zapisz jako obrazy w formacie Tiff.
  4. Do wizualizacji widoku kodowania głębi obrazów 3D należy użyć tego samego oprogramowania.
    1. Kliknij menu 3D i wybierz Wygląd.
    2. Wybierz opcję Specjalne i wybierz opcję Kodowanie głębokości.
    3. Alternatywnie użyj Fiji/Image J, aby zwizualizować widok kodowania głębi.
    4. Otwórz pliki konfokalne, kliknij menu obrazu, wybierz Hyperstack.
    5. Wybierz kod Temporal-Color i zapisz jako obrazy w formacie Tiff.
      UWAGA: Kodowanie głębokości z-stack można również osiągnąć za pomocą wtyczki Z Code Stack dla Fidżi.
  5. Aby zobrazować widok obrotu 3D, jak pokazano (Film 1 i Film 2), należy użyć tego samego oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
    1. Otwórz pliki konfokalne, kliknij menu 3D i wybierz Serie.
    2. Wybierz opcję Renderuj serię, a następnie wybierz jedną z czterech opcji, w tym Odwróć x, Odwróć y, Początek i koniec oraz Lista pozycji.
    3. Zapisz serię renderowania jako pliki AVI.
    4. Alternatywnie można użyć Fidżi/Obrazu J, aby zwizualizować widok obrotu 3D.
    5. Otwórz oryginalny plik konfokalny z Fidżi, kliknij menu Obraz i wybierz Stosy.
    6. Wybierz projekt 3D i zapisz jako filmy w formacie AVI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby ocenić wydajność naszego protokołu oraz zbadać morfologię merystemów różnych gatunków, przeprowadziliśmy eksperymenty z obrazowaniem konfokalnym na żywo merystemu kwiatostanowego Arabidopsis oraz merystemów wegetatywnych pomidora i soi. W niniejszym badaniu jako przykłady wykorzystano ekotyp Arabidopsis Landsberg erecta, odmianę pomidora Micro-Tom oraz odmianę soi Williams 82.

Widząc ortogonalny pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy prostą metodę obrazowania, którą można zastosować do badania merystemów wierzchołkowych pędów z różnych roślin z niewielkimi modyfikacjami, otwierając nową drogę do badania regulacji merystemów zarówno na etapie wegetatywnym, jak i reprodukcyjnym w modelowych roślinach i uprawach. W przeciwieństwie do metod SEM i barwienia histologicznego, protokół ten może pomóc w ujawnieniu zarówno widoku powierzchniowego, jak i wewnętrznych struktur komórkowych SAM, bez konieczności pracochłonnego utrwalania pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Purdue Bindley Bioscience Center Imaging Facility za dostęp do laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego i za wsparcie techniczne, a autorzy doceniają pomoc od Andy'ego Schabera z Purdue Bindley Imaging Facility. Działanie to zostało sfinansowane przez Uniwersytet Purdue w ramach finansowania AgSEED Crossroads w celu wsparcia rolnictwa i rozwoju obszarów wiejskich stanu Indiana.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar PhytoDot Scientific Inc.DSA20300-1000
AgarozaDot Scientific Inc.Kleszcze AGLE-500
ROBOZRS-4955Dumont #5SF Super cienkie kleszcze Inox Rozmiar końcówki .025 X .005mm, do preparowania wierzchołków pędów.
Pionowy mikroskop konfokalny LSM 880 Zeiss
Murashige & Skoog MS mediumDot Scientific Inc.DSM10200-50
Plan APO 20x/1.1 soczewka do zanurzania w wodzieZeiss
Plastikowe szalki Petriego 100 mm X 15 mmCELLTREAT Produkty naukowe229694Zastosowanie do produkcji płytek
MS Plastikowe szalki Petriego60 mm X 15CELLTREAT Produkty naukowe229665Do użytku jako naczynia do obrazowania
Mieszanka propagacyjnaSungro Ogrodnictwo
Jodek propidynyAcros Organics4403002501 mg/ml roztwór w wodzie, do barwienia ścian komórkowych
ŻyletkaPERSONNA62-0179Do wycinania wierzchołków pędów z roślin
Mikroskop stereoskopowyNikonSMZ1000
TissueVWR82003-820
ZenZeissOprogramowanie do akwizycji obrazu

Bibliografia

  1. Meyerowitz, E. M. Genetic control of cell division patterns in developing plants. Cell. 88 (3), 299-308 (1997).
  2. Xu, C., et al. A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato. Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).
  3. Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus. Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).
  4. Je, B. I., et al. Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits. Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).
  5. Ping, J., et al. Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean. Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).
  6. Vaughan, J. G., Jones, F. R. Structure of the angiosperm inflorescence apex. Nature. 171, 751(1953).
  7. Sijacic, P., Liu, Z. Novel insights from live-imaging in shoot meristem development. Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).
  8. Tax, F. E., Durbak, A. Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems. Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).
  9. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  10. Heisler, M. G., Ohno, C. Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).
  11. Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem. Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).
  12. Prunet, N. Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers. Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).
  13. Prunet, N., et al. Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds. Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).
  14. Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana. Development. 131, 4225-4237 (2004).
  15. Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment. Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).
  16. Zhou, Y., et al. HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers. Science. 361 (6401), 502-506 (2018).
  17. Zhou, Y., et al. Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators. Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).
  18. Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases. Development. 142 (6), 1043(2015).
  19. Li, W., et al. LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation. Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).
  20. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wierzchołkowy merystem pędumikroskopia konfokalnabarwienie jodkiem propidiumobrazowanie żywych komórektrójwymiarowy widok projekcyjnyprzygotowanie próbekporównanie gatunków roślinanaliza merystemu wegetatywnegobadanie merystemu kwiatowegoskanowanie laserowe
Konfokalne obrazowanie na żywo merystemów wierzchołkowych pędów różnych gatunków roślin
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.