Method Article

Mikroskopia śledzenia pojedynczych cząsteczek - narzędzie do określania stanów dyfuzyjnych cząsteczek cytozolowych

DOI:

10.3791/59387

⸱

September 5th, 2019

 , 
1Department of Chemistry, University of Virginia, 2Department of Molecular Physiology & Biological Physics, University of Virginia School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek 3D jest wykorzystywana do badania pozycji przestrzennych i trajektorii ruchu fluorescencyjnie znakowanych białek w żywych komórkach bakteryjnych. Opisany w niniejszym dokumencie protokół eksperymentalny i analizy danych określa dominujące zachowania dyfuzyjne białek cytozolowych w oparciu o zbiorcze trajektorie pojedynczych cząsteczek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek bada położenie i ruchy pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach z kilkudziesięcionanometrową rozdzielczością przestrzenną i milisekundową czasową. Możliwości te sprawiają, że mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek idealnie nadaje się do badania funkcji biologicznych na poziomie molekularnym w fizjologicznie istotnych środowiskach. W tym miejscu demonstrujemy zintegrowany protokół zarówno do pozyskiwania, jak i przetwarzania/analizy danych śledzenia pojedynczych cząsteczek w celu wyodrębnienia różnych stanów dyfuzyjnych, jakie może wykazywać białko będące przedmiotem zainteresowania. Informacje te można wykorzystać do ilościowego określenia tworzenia się kompleksów molekularnych w żywych komórkach. Przedstawiamy szczegółowy opis eksperymentu lokalizacji pojedynczej cząsteczki 3D opartego na kamerze, a także kolejnych etapów przetwarzania danych, które pozwalają uzyskać trajektorie poszczególnych cząsteczek. Trajektorie te są następnie analizowane przy użyciu ramy analizy numerycznej w celu wyodrębnienia dominujących stanów dyfuzyjnych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek i względnej obfitości tych stanów. Ramy analizy opierają się na stochastycznych symulacjach wewnątrzkomórkowych trajektorii dyfuzji Browna, które są przestrzennie ograniczone przez dowolną geometrię komórki. Na podstawie symulowanych trajektorii generowane i analizowane są surowe obrazy pojedynczych cząsteczek w taki sam sposób, jak obrazy eksperymentalne. W ten sposób eksperymentalne ograniczenia precyzji i dokładności, które są trudne do skalibrowania eksperymentalnie, są wyraźnie uwzględniane w przepływie pracy analizy. Współczynnik dyfuzji i względne frakcje populacji dominujących stanów dyfuzyjnych są wyznaczane przez dopasowanie rozkładów wartości eksperymentalnych za pomocą liniowych kombinacji symulowanych rozkładów. Pokazujemy użyteczność naszego protokołu, rozwiązując stany dyfuzyjne białka, które wykazuje różne stany dyfuzyjne po utworzeniu kompleksów homo- i heterooligomerycznych w cytozolu patogenu bakteryjnego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie dyfuzyjnego zachowania biomolekuł dostarcza wglądu w ich biologiczne funkcje. Techniki oparte na mikroskopii fluorescencyjnej stały się cennymi narzędziami do obserwacji biomolekuł w ich natywnym środowisku komórkowym. Odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP) i spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS)1 zapewniają uśrednione zachowania dyfuzyjne. I odwrotnie, mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek umożliwia obserwację pojedynczych fluorescencyjnie oznaczonych cząsteczek z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową2,3,4. Obser....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kalibracja funkcji rozrzutu punktu podwójnej helisy

UWAGA: Obrazy opisane w tej i następnych sekcjach są uzyskiwane przy użyciu specjalnie zbudowanego mikroskopu fluorescencji odwróconej, jak opisano w Rocha et al.23. Ta sama procedura ma zastosowanie do różnych implementacji mikroskopów przeznaczonych do lokalizacji pojedynczych cząsteczek i mikroskopii śledzącej2,3,4. Dostępne jest całe oprogramowanie do pozyskiwania obrazów i przetwarzania danych opisane w tym artykule (https://github.com/GahlmannLab2014/Single-Molecule-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W opisanych tutaj warunkach eksperymentalnych (20 000 klatek, długość trajektorii minimum 4 lokalizacje) i w zależności od poziomów ekspresji znakowanych fluorescencyjnie białek fuzyjnych, można wygenerować około 200-3 000 lokalizacji dających 10-150 trajektorii na komórkę (Rysunek 2a,b). Duża liczba trajektorii jest niezbędna do uzyskania dobrze próbkowanego rozkładu pozornych współczynników dyfuzji. Rozmiar zebranego tutaj pola widzenia wynosi ~55 x .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynnikiem krytycznym dla pomyślnego zastosowania przedstawionego protokołu jest zapewnienie, że sygnały jednocząsteczkowe są dobrze oddzielone od siebie (tj. muszą być rzadkie w przestrzeni i czasie (Ruch uzupełniający 1)). Jeśli w komórce znajduje się więcej niż jedna cząsteczka fluoryzująca w tym samym czasie, lokalizacja może być nieprawidłowo przypisana do trajektorii innej cząsteczki. Nazywa się to problemem z linkowaniem30. Warunki eksperymentalne, takie jak poziomy ekspres.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Alecii Achimovich i Ting Yan za krytyczną lekturę rękopisu. Dziękujemy Edowi Hallowi, starszemu pracownikowi naukowemu w grupie Advanced Research Computing Services na Uniwersytecie Wirginii, za pomoc w skonfigurowaniu procedur optymalizacyjnych wykorzystywanych w tej pracy. Fundusze na te prace zostały zapewnione przez Uniwersytet Wirginii.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kwas 2,6-diaminomelicznyChem Impex International5411Niezbędny do wzrostu komórek Y. enterocolitica zastosowanych.
Soczewki 4fThorlabsAC508-080-Af=80mm, laser 2"
514 nmCoherentGenesis MX514 MTMSłuży do wzbudzania fluorescencji
agarozaInivtrogen16520100Służy do wytwarzania podkładek żelowych do montażu płynnej próbki bakteryjnej na mikroskopie.
Chlorek amonuSigma AldrichA9434Składnik M2G.
filtr pasmowo-przepustowyChromaET510/bpŚcieżka wzbudzenia.
Brain Heart InfusionSigma Aldrich53286Pożywka wzrostowa dla Y. enterocolitica.
chlorek wapniaSigma Aldrich223506składnik M2G.
kameraŹródło obrazowaniaDMK 23UP031Kamera do obrazowania kontrastu fazowego.
dielektryczna maska fazowaDouble Helix, LLCN/AWytwarza sygnał DHPSF.
Fosforan disodowySigma Aldrich795410Składnik M2G.
kwas etylenodiaminotetraoctowyFisher ScientificS311-100Chelaty Ca2+. Indukuje wydzielanie w T3SS.
lustro uchylneNewport8892-KUmożliwia przełączanie między ścieżkami fluorescencji i kontrastu fazowego.
fluosferyInvitrogenF8792Koraliki fluorescencyjne. 540/560 długości fal ekscytacji i emisji. Średnica 40 nm.
szkiełko nakrywkoweVWR16004-302#1.5, 22mmx22mm
glukozaChem Impex International811M2G składnik.
olejek immersyjnyOlympusZ-81025Umieszczony na soczewce obiektywu.
siarczan żelaza(II)Sigma AldrichF0518M2G.
filtr długoprzepustowySemrockLP02-514RU-25Ścieżka emisji.
siarczan magnezuFisher ScientificS25414Askładnik M2G.
platforma mikroskopowaMad City Labsniestandardowaplatforma do mikroskopu odwróconego.
Zastosowane komórki kwasu nalidyksowegoSigma AldrichN4382Y. enterocolitica są odporne na kwas nalidyksowy.
soczewka obiektywuOlympus1-U2B99160X, 1.4 NA
Środek do czyszczenia ozonuNovascanPSD-UV4Służy do eliminowania fluorescencji tła na szkiełkach nakrywkowych.
fosforan potasuSigma Aldrich795488składnik M2G.
Czerwona dioda LEDThorlabsM625L3Oświetla próbkę do obrazowania kontrastu fazowego. 625nm.
Kamera sCMOSHamamatsuORCA-Flash 4.0 V2Kamera do obrazowania fluorescencyjnego.
filtr krótkoprzepustowyChromaET700SP-2P8Ścieżka emisji.
Soczewka tubusuThorlabsAC508-180-Af=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasdN/A N/ASzczep AD4442, eYFP-YscQ
ćwierćfalowa zerowego rzęduThorlabsWPQ05M-514Ścieżka wzbudzenia.
płytka

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., Uphoff, S., Stracy, M. Understanding Protein Mobility in Bacteria by Tracking Single Molecules. Journal of Molecular Biology. , (2018).
  2. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule Tracking3D Localization MicroscopyDiffusive States AnalysisFluorescent Bead FiducialDouble Helix Point Spread FunctionMATLAB Data ProcessingApparent Diffusion CoefficientStochastic Simulation FrameworkCytosolic Protein ComplexesBacterial Pathogen Imaging

Related Articles