Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezpośredni pomiar zaangażowania celu KDM1A za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59390

⸱

13 czerwca 2019

 ,  , 
1Oryzon Genomics

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru docelowego zaangażowania KDM1A w próbkach ludzkich lub zwierzęcych komórek, tkanek lub krwi leczonych inhibitorami KDM1A. Protokół wykorzystuje znakowanie chemoprobem wolnego enzymu KDM1A i bezpośrednią kwantyfikację docelowego zajęcia za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe i może być stosowany w badaniach przedklinicznych i klinicznych.

Streszczenie

Ocena docelowego zaangażowania, zdefiniowana jako interakcja leku z białkiem, do którego został zaprojektowany, jest podstawowym wymogiem dla interpretacji biologicznej aktywności dowolnego związku w rozwoju leku lub w podstawowych projektach badawczych. W epigenetyce zaangażowanie celu jest najczęściej oceniane na podstawie analizy markerów zastępczych, a nie pomiaru związku związku z celem. Dalsze odczyty biologiczne, które zostały przeanalizowane, obejmują modulację znacznika histonowego lub zmiany ekspresji genów. KDM1A to demetylaza lizynowa, która usuwa grupy metylowe z mono- i dimetylowanego H3K4, modyfikacja związana z wyciszeniem ekspresji genów. Modulacja markerów zastępczych zależy od typu komórki i funkcji składu genetycznego badanych komórek, co może znacznie utrudnić interpretację i porównanie różnych przypadków. Aby obejść te problemy, przedstawiono wszechstronny protokół oceny wpływu dawki i dynamiki bezpośredniego zaangażowania celu KDM1A. Opisany test wykorzystuje chemosondę KDM1A do wychwytywania i ilościowego oznaczania niehamowanego enzymu, może być szeroko stosowany do próbek komórek lub tkanek bez konieczności modyfikacji genetycznej, ma doskonałe okno wykrywania i może być stosowany zarówno do badań podstawowych, jak i analizy próbek klinicznych.

Wprowadzenie

Demetylaza 1 specyficzna dla lizyny (KDM1A)1 jest demetylazą zaangażowaną w kontrolę transkrypcji genów. Białko to stało się potencjalnym celem farmakologicznym2 w onkologii; w tym w ostrej białaczce szpikowej3 (AML), zespole mielodysplastycznym (MDS)4, mielofibrozie (MF)5,6, drobnokomórkowym raku płuc (SCLC)7; w anemii sierpowatej (SCD)8,9, a także w chorobach ośrodkowego układu nerwowego, w tym w chorobie Alzheimera (AD), stwardnieniu rozsianym (MS) oraz w zaburzeniach związanych z agresją10.

Większość związków hamujących KDM1A znajdujących się w fazie rozwoju klinicznego to pochodne cyklopropylaminy, które hamują białko poprzez wiązanie kowalencyjne z jego kofaktorem flawinoadeninonukleotydowym (FAD)11. Hamowanie KDM1A indukuje zmiany w ekspresji genów, jednak zmiany te różnią się znacząco w zależności od tkanki, typu komórek lub przypadku choroby. Inhibicja KDM1A zmienia również modyfikacje histonów12, lecz zmiany te występują zazwyczaj lokalnie w konkretnym miejscu w genomie i są ponownie wysoce specyficzne dla danej tkanki i komórki.

Protokół został opracowany w celu bezpośredniego pomiaru stopnia związania (target engagement) KDM1A w próbkach biologicznych i został zoptymalizowany do stosowania z inhibitorami pochodzącymi od cyklopropylaminy. Test opiera się na technologii ELISA i analizuje równolegle całkowitą oraz wolną (tj. niezwiązaną przez inhibitor) ilość KDM1A w natywnym ekstrakcie białkowym z próbki biologicznej w badaniu w fazie stałej. W pierwszym kroku próbkę biologiczną lizuje się w obecności biotynylowanej selektywnej chemosondy KDM1A OG-88113,14, pochodnej selektywnego inhibitora KDM1A ORY-1001 (iadademstat), silnego inhibitora KDM1A znajdującego się w fazie rozwoju klinicznego do leczenia chorób onkologicznych. Chemosonda posiada wartość IC50 dla KDM1A wynoszącą 120 nM i zawiera motyw wiążący FAD połączony z biotynylowanym ogonem z glikolu polietylenowego (PEG). Chemosonda wiąże się wyłącznie z wolnym KDM1A, a nie z KDM1A związanym z inhibitorem w próbce. Po związaniu chemosondy kompleksy zawierające KDM1A w próbce są wychwytywane na płytkach mikrotitracyjnych z powierzchnią pokrytą streptawidyną w celu oznaczenia wolnego KDM1A lub na płytkach pokrytych monoklonalnym przeciwciałem wychwytującym anty-KDM1A w celu oznaczenia całkowitego KDM1A. Po przemyciu obie płytki inkubuje się z przeciwciałem detekcyjnym anty-KDM1A, ponownie przemywa i inkubuje z wtórnym przeciwciałem osiołkowym anty-króliczym IgG sprzężonym z HRP w celu detekcji przy użyciu substratu luminescencyjnego i kwantyfikacji poprzez pomiar względnych jednostek światła (RLU) w luminometrze (Rycina 1).

figure-introduction-1
Rysunek 1. Schemat testu immunoabsorpcyjnego ELISA z użyciem enzymatycznej chemosondy w celu oceny zaangażowania celu KDM1A: A) Oznaczanie całkowitej ilości KDM1A przy użyciu kanapkowego testu ELISA oraz B) Oznaczanie wolnej ilości KDM1A przy użyciu testu ELISA z chemosondą. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Na obu płytkach ELISA umieszcza się krzywą wzorcową w celu weryfikacji liniowości każdego testu. Określenie stopnia zaangażowania celu KDM1A w każdej próbce jest następnie obliczane jako wartość względna w stosunku do próbki przed podaniem dawki lub próbki traktowanej nośnikiem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki krwi pobrano z Biobanku Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau zgodnie z hiszpańskim ustawodawstwem (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) oraz za zgodą lokalnych komisji etycznych. Badania z wykorzystaniem tkanek zwierzęcych przeprowadzono zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (dyrektywa Rady Wspólnot Europejskich 86/609/EWG) ustanowionymi przez Komisję Etyczną ds. Eksperymentów na Zwierzętach w PRAAL-PCB.

1. Przygotowanie próbek biologicznych do analizy.

UWAGA: Niniejszy protokół obejmuje manipulację próbkami biologicznymi, które mogą podlegać standardowi OSHA (Occupational Safety and Health Administration) dotyczącemu patogenów przenoszonych przez krew (29 CFR 1910.1030), Dyrektywie 2000/54/WE Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 18 września 2000 r. lub równoważnym przepisom. Ponadto próbki biologiczne mogą zawierać ślady biologicznie aktywnych badanych związków chemicznych, a protokół może obejmować dalszą manipulację takimi związkami. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy zapoznać się z kartą charakterystyki (SDS) użytych związków i ściśle przestrzegać wszystkich obowiązujących środków bezpieczeństwa ustanowionych w ośrodku badawczym, w tym stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (PPE). Podczas prowadzenia eksperymentu należy nosić właściwą odzież ochronną i stosować odpowiednie osłony. Odpady należy utylizować w odpowiednich pojemnikach na odpady (odpady biologiczne/cytotoksyczne).

UWAGA: Niniejszy protokół rozpoczyna się od komórek lub próbek od obiektów traktowanych inhibitorem KDM1A oraz ich kontroli nietraktowanych lub traktowanych placebo/nośnikiem3.

  1. Komórki traktowane nośnikiem lub inhibitorem KDM1A in vitro
    1. W przypadku komórek hodowanych w zawiesinie, jako kultury 10 mL, należy przenieść zawiesiny do czystych probówek stożkowych 15 mL i przejść do punktu 1.1.3.
    2. W przypadku komórek adherentnych (hodowanych w kolbach 75 cm2 ), należy usunąć medium z kolby i krótko przemyć przy użyciu 4 mL PBS. Odłączyć komórki od naczyń, stosując 1,5 mL 0,5% Trypsyny-EDTA przez 2 - 5 min (warunki trypsynizacji mogą się różnić, należy stosować się do zaleceń dostawcy dla danej linii komórkowej), dodać 4 mL PBS i przenieść komórki do czystych probówek stożkowych 15 mL.
    3. Umieścić probówki w wirówce laboratoryjnej i zebrać komórki poprzez wirowanie przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz, resuspendować osad w 1 mL PBS odmierzonego za pomocą mikropipety i przenieść zawiesinę do probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL.
    4. Umieścić próbki w mikrocentryfudze i wirować przez 5 min przy 400 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć PBS poprzez aspirację mikropipetą, a następnie pozostawić osady w lodzie i przejść do Kroku 2 albo zamrozić osady w lodzie suchym i przechowywać w temperaturze -80 °C do Kroku 3.
  2. Próbki od pacjentów lub zwierząt traktowanych nośnikiem/placebo lub inhibitorem KDM1A
    1. Tkanki: Pokroić tkankę na małe kawałki o rozmiarach ≈1 cm3 za pomocą skalpela. Zamrozić kawałki tkanek w ciekłym N2 w naczyniu Dewara i przechowywać w temperaturze -80 °C do Kroku 3.
    2. Polimorficzne komórki mononuklearne krwi obwodowej (PBMC): Rozcieńczyć 10 mL świeżej krwi (obrobić maksymalnie 2 h po pobraniu krwi) zebranej do probówek z K2-EDTA dwiema objętościami PBS w probówce stożkowej 50 mL. Wyizolować PBMC z krwi, używając komercyjnie dostępnych probówek do separacji PBMC zgodnie z instrukcją producenta. Pozostawić osady w lodzie i przejść do Kroku 3.2 albo zamrozić osady w lodzie suchym i przechowywać w temperaturze -80 °C do Kroku 3.
      UWAGA: Mokry osad komórkowy o objętości od 20 do 50 μL zawiera ≈ 1 x 107 komórek, w zależności od ich wielkości. Mokry osad PBMC uzyskany z 10 mL zdrowej ludzkiej krwi ma objętość ≈ 20 μL i zawiera ≈ 1 x 107 PBMC. Tkanki lub osady komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 ºC do 6 miesięcy.

2. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotowanie 2 μM roztworu roboczego OG-881: Wyjąć jednorazową alikwot 10 μL roztworu zapasu biotynilowanej sondy OG-881 o stężeniu 20 mM z lodówki (4 °C) i pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na 10 min. Przygotować 2 μM roztwór roboczy poprzez rozcieńczenie seryjne roztworu zapasu OG-881 w PBS, używając mikropipety z końcówkami z filtrem i zmieniając końcówkę pomiędzy poszczególnymi etapami rozcieńczania.
  2. Przygotowanie 10x inhibitora proteaz: rozpuścić 1 tabletkę w 1 mL PBS w probówce do mikrowirówki.
  3. Przygotowanie pożądanej objętości 1x buforu do lizy komórek z chemosondą OG-881 w stężeniu 25 nM. Na każdy 1 mL zmieszać 100 μL komercyjnie zakupionego 10x buforu do lizy komórek, 150 μL 10x inhibitora proteaz, 12,5 μL 2 μM OG-881 oraz 737,5 μL dwukrotnie destylowanej wody typu 1.
  4. Opcjonalnie przygotować pożądaną objętość 1x buforu do lizy komórek, ale z 25 nM ORY-1001 zamiast OG-881, analogicznie do kroku 2.3. Można zastosować mniej silne inhibitory, jednak mogą one wymagać wyższych stężeń do wykorzystania w kontroli pozytywnej ze 100% inhibicją (patrz krok 3.5).
    UWAGA: Należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, aby uniknąć niezamierzonego zanieczyszczenia roztworów lub próbek roztworami zapasowymi OG-881 lub inhibitora KDM1A. Aby obliczyć pożądaną objętość 1x buforu do lizy komórek z 25 nM OG-881, przyjąć, że wymagane jest 400 µL na 40 mg sproszkowanej tkanki lub 200 µL na mokry osad 107 komórek.

3. Ekstrakcja białek natywnych

  1. Z tkanek:
    1. Rozetrzeć i homogenizować sześcian zamrożonej tkanki o objętości ≈ 1 cm3 za pomocą moździerza i tłuczka schłodzonych na suchym lodzie. Przenieść próbki do jednorazowych probówek w ilościach zawierających ≈ 40 mg proszku tkankowego, unikając w każdym momencie rozmrażania. Przejść do kroku 3.1.2. w celu natychmiastowego przetworzenia lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Resuspendować 40 mg sproszkowanej tkanki w 400 µL 1x buforu do lizy komórek (Cell Lysis buffer) z dodatkiem 25 nM OG-881, wymieszać na wortexie przez 10 s i przecisnąć próbkę co najmniej pięć razy przez tępą igłę strzykawki o rozmiarze 18G, aż do uzyskania lizy tkanki i mętnej zawiesiny o barwie od jasnożółtej do pomarańczowej. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza.
    3. Kontynuować zgodnie z krokiem 3.3
  2. Z osadów komórkowych (PBMC i linie komórkowe):
    1. Resuspendować osad ≈ 1 x 107 komórek w 200 µL 1x buforu do lizy komórek zawierającego 25 nM OG-881. Krótko wymieszać próbki na wortexie i trzymać na lodzie przez 5 min.
    2. Poddać próbki sonikacji w sonikatorze, stosując 3 impulsy po 20 s każdy przy częstotliwości 45 kHz; między impulsami umieszczać próbki na lodzie przez 20 s.
      UWAGA: Od momentu resuspendowania próbek biologicznych w 1x buforze do lizy komórek, należy trzymać je na lodzie przez resztę procesu.
  3. Próbki trzymać na lodzie przez dodatkowe 5 min, krótko wymieszać na wortexie, a następnie wirować przez 10 min przy 14 000 x g w schłodzonej wirówce w temperaturze 4 °C.
  4. Za pomocą mikropipety 1 mL przenieść nadsączniki do nowych probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i pozostawić na lodzie przez 2 h. Kontynuować zgodnie z krokiem 4.
  5. Opcjonalnie, kontrolę pozytywną w celu symulacji 100% zajęcia celu można przygotować w następujący sposób:
    1. Resuspendować osad komórkowy lub sproszkowaną tkankę z próbki kontrolnej (vehicle) lub nieleczonej (przed dawką) w wymaganej objętości 1x buforu do lizy komórek z dodatkiem 25 nM ORY-1001 i przetworzyć zgodnie z opisem w krokach od 3.1 do 3.3.
    2. Przenieść nadsączniki kontroli pozytywnej do nowych probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i pozostawić na lodzie przez 1 h. ORY-1001 celowo zahamuje KDM1A i zablokuje wiązanie chemoproby.
    3. Do nadsącznika kontroli pozytywnej dodać 5 μL roztworu roboczego 2 μM OG-881 (objętość dla kontroli pozytywnej z próbki 40 mg tkanki) lub 2,5 μL roztworu roboczego 2 μM OG-881 (objętość dla kontroli pozytywnej z próbki 107 komórek), aby uzyskać takie samo stężenie OG-881 jak w pozostałych próbkach, i pozostawić na lodzie przez 2 h. Kontynuować zgodnie z krokiem 4.

4. Oznaczanie ilości natywnego białka za pomocą metody Bradforda

  1. Rozcieńczyć komercyjny odczynnik do oznaczania białka metodą Bradforda 5-krotnie wodą podwójnie destylowaną H2O typu 1. Obliczyć objętość odczynnika wymaganą dla całkowitej liczby próbek i wzorców (1 mL na próbkę lub wzorzec + 5 mL objętości nadmiarowej).
  2. W celu sporządzenia krzywej wzorcowej dla albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przygotować jedną probówkę do mikrocentryfugi z 1 mL rozcieńczonego roztworu do oznaczania białka metodą Bradforda (próba ślepa) oraz siedem probówek do mikrocentryfugi z 995 μL rozcieńczonego roztworu do oznaczania białka metodą Bradforda. Do każdej z 7 probówek dodać 5 μL każdego ze wzorców BSA (stężenia w zakresie od 125 do 2 000 µg/mL) i wymieszać, delikatnie odwracając probówki kilka razy. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  3. Przenieść rozcieńczone wzorce do kuwet i odczytać OD próby ślepej oraz próbek wzorców albuminy surowicy bydlęcej w spektrofotometrze przy 280 nm.
  4. W przypadku próbek biologicznych przygotować jedną probówkę do mikrocentryfugi z 1 mL rozcieńczonego roztworu do oznaczania białka metodą Bradforda (próba ślepa) oraz tyle probówek do mikrocentryfugi z 999 μL rozcieńczonego odczynnika do oznaczania białka metodą Bradforda, ile próbek wymaga ilościowego oznaczenia. Za pomocą automatycznej mikropipety P2 dodać 1 μL natywnego ekstraktu białkowego przygotowanego w kroku 3 do każdej probówki i wymieszać, delikatnie odwracając probówki kilka razy. Inkubować próbki przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść objętości do kuwet i odczytać OD próbek w spektrofotometrze przy 280 nm.
  6. Zaleca się niezwłoczne przejście do kroku 5. Alternatywnie natywne ekstrakty białkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu wykonania kroku 5. Należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania.

5. Luminescencyjne testy ELISA do oznaczania całkowitego i wolnego KDM1A

UWAGA: Należy utrzymywać stałą temperaturę w laboratorium na poziomie 23-24 °C (RT).

  1. Powlekanie płytek mikrotitracyjnych przeciwciałem wychwytującym KDM1A lub streptawidyną
    1. ELISA dla całkowitego poziomu KDM1A: dla każdej płytki przygotować 10 mL przeciwciała wychwytującego KDM1A o stężeniu końcowym 2 μg/mL w PBS. Przenieść 100 µL do każdego dołka płytki.
    2. ELISA dla wolnego KDM1A: dla każdej płytki przygotować 10 mL streptawidyny w stężeniu 10 µg/mL w PBS. Przenieść 100 µL do każdego dołka płytki.
    3. Płytki do ELISA dla całkowitego i wolnego KDM1A szczelnie zamknąć folią przylepną i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w lodówce.
  2. Mycie i blokowanie płytek
    1. Wyjąć płytki z lodówki i pozostawić je do wyrównania temperatury przez około 45 min w temperaturze pokojowej (RT) przed użyciem.
    2. Przygotować 1 000 mL buforu do mycia (0,1% Tween w PBS) oraz 50 mL buforu blokującego (1% BSA w PBS) na każdą płytkę.
    3. Umyć płytki 3 razy buforem do mycia. W tym i w kolejnych krokach, po każdym etapie mycia, delikatnie uderzyć płytką o ręczniki papierowe, aby usunąć resztki roztworu.
    4. Do każdego dołka obu płytek dodać 200 µL buforu blokującego, obie płytki szczelnie zamknąć folią przylepną i inkubować przez 2 h w RT.
  3. Przygotowanie próbek biologicznych
    1. Rozcieńczyć natywne ekstrakty białkowe otrzymane na koniec Kroku 3 do odpowiedniego stężenia, używając PBS. Zalecane stężenie będzie zależało od poziomu ekspresji KDM1A w próbce biologicznej. Przykładowe odpowiednie zakresy to (1) osady komórkowe: 0,5 – 10 μg na dołek; (2) PBMC: 5 – 30 μg na dołek; (3) utarta tkanka (mózg, płuca, skóra): 20 – 100 µg na dołek. Próbki podczas przygotowania przechowywać na lodzie. Jeśli to możliwe, przeprowadzić analizy techniczne w trzech powtórzeniach.
    2. Przygotować krzywą wzorcową z użyciem ludzkiego rKDM1A:
      1. Aby przygotować roztwór roboczy standardu KDM1A, odpipetować odpowiednią objętość rKDM1A do uzyskania stężenia końcowego 25 pg/µL, dodać 75 μL 2 μM OG-881 i uzupełnić 1 x PBS do całkowitej objętości 6 mL w probówce typu Falcon 15 mL. Roztwór roboczy standardu KDM1A przechowywać na lodzie przez 1 h i delikatnie mieszać, odwracając probówkę Falcon 15 mL kilka razy co 20 min.
      2. Przygotować serię rozcieńczeń standardu KDM1A w probówkach do mikrowirówki 1,5 mL zgodnie z Tabelą 1 (Przygotowanie standardu), w objętości wystarczającej do analizy w trzech powtórzeniach dla dwóch płytek mikrotitracyjnych 96-dołkowych.
SERIA STANDARDÓWRoboczy roztwór standardu KDM1A (µL)
(pg KDM1A/dołek)PBS (µL) 
2500 dla C-*800-
2500800-
1750560240
1250400400
750240560
25080720
258792
00800
UWAGA:
(1) Przygotowana objętość każdego rozcieńczenia jest wystarczająca do wykonania testu w trzech powtórzeniach na 2 płytkach.
(2) Zalecany zakres wynosi od 2,5 do 5 000 pg / dołek
* Dla kontroli negatywnej C-, bez przeciwciała detekcyjnego KDM1A

Tabela 1: Przygotowanie standardów. Aby przygotować serię standardów białka KDM1A, pipetuj wskazane objętości roboczego roztworu standardu KDM1A oraz PBS do ośmiu odpowiednio oznakowanych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.

figure-protocol-1
Tabela 2: Projekt płytki głębokoołkowej.Standardy (niebieskie) i próbki (żółte) z kroku 5.4.2. zostały pipetowane do odpowiadających im pozycji na płytce głębokoołkowej, aby ułatwić ich przeniesienie na płytki ELISA zgodnie z kierunkiem niebieskich (standardy) i żółtych (próbki) strzałek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

figure-protocol-2
Tabela 3: Projekt płytki ELISA. Płytka do analizy obejmuje krzywą wzorcową z malejącymi ilościami rekombinowanego celu KDM1A (na niebiesko); próbki biologiczne (S) na żółto oraz odpowiadające im kontrole negatywne (zawierają próbki, ale nie zawierają pierwszego przeciwciała detekcyjnego) na biało, które należy przenieść na płytki ELISA z płytki głębokich dołków. Próbka blank (0 w krzywej wzorcowej) zawiera wszystkie odczynniki wychwytujące i detekcyjne, ale nie zawiera próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

  1. ELISA
    1. (Kontynuacja kroku 5.2.4.) Po 2 h inkubacji odlać bufor blokujący i przemyć płytki buforem do mycia.
    2. Przenieść odpowiednio rozcieńczone próbki (natywne ekstrakty białkowe i krzywą standardową z kroku 5.3.) do chłodzonego bloku magazynującego z 96 głębokimi dołkami zgodnie z rozmieszczeniem na płytce przedstawionym w tabeli 2 (Projekt płytki z głębokimi dołkami).
    3. Przechowywać blok na lodzie do momentu pipetowania 100 μL próbki na dołek na płytki ELISA do oznaczania białka całkowitego i wolnego, zgodnie z rozmieszczeniem na płytce przedstawionym w tabeli 3 (Projekt płytki ELISA).
    4. Inkubować przez 1 h w RT, odlać próbki i przemyć płytki 5 razy buforem do mycia.
    5. Przygotować 20 mL przeciwciała detekcyjnego króliczego anty-KDM1A w stężeniu 0.125 µg/mL w buforze blokującym, dodać 100 µL na dołek do każdej płytki testowej, z wyjątkiem dołków odpowiadających kontrolom negatywnym C-. Uszczelnić górną część płytki i inkubować przez 1 h w RT.
    6. Odlać roztwór przeciwciała detekcyjnego i przemyć płytki 6 razy buforem do mycia.
    7. Przygotować 25 mL wtórnego przeciwciała koziego anty-króliczego HRP w rozcieńczeniu 1:5,000 w buforze blokującym, dodać 100 µL na dołek do płytek mikrotitracyjnych i inkubować przez 1 h w RT.
  2. Detekcja chemiluminescencyjna
    1. Na 30 min przed zakończeniem kroku 5.4.7., w warunkach przy słabym oświetleniu, zmieszać równe części Luminol-Enhancer i roztworu nadtlenku (10.5 mL: 10.5 mL dla 2 płytek) w bursztynowej butelce i pozostawić w RT.
      UWAGA: Pracujący roztwór luminolu należy przechowywać w bursztynowej butelce i unikać długotrwałej ekspozycji na intensywne światło. Krótkotrwała ekspozycja na typowe oświetlenie laboratoryjne nie zaszkodzi roztworowi pracującemu.
    2. Przynajmniej 20 min przed pomiarem luminescencji włączyć czytnik mikropłytek w temperaturze 25 °C i ustawić czas integracji na 1,000 ms oraz czas stabilizacji (settle time) na 150 ms. Ustawienia parametrów mogą wymagać optymalizacji w zależności od urządzenia.
    3. Po 1 h inkubacji w kroku 5.4.7. odlać roztwór przeciwciała wtórnego i przemyć płytki 6 razy buforem do mycia.
    4. Pipetować 100 µL na dołek pracującego roztworu luminolu (substratu chemiluminescencyjnego) przygotowanego w kroku 5.5.1. Pipetować bardzo powoli, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Używać stopera, aby kontrolować czas między dodaniem roztworu a pomiarem luminescencji płytek i utrzymywać ten czas na stałym poziomie w celu zapewnienia dobrej powtarzalności między testami.
    5. Uszczelnić górną część płytek i wirować z prędkością 500 x g w RT przez 45 s w wirówce do płytek, aby usunąć wszelkie pozostałe pęcherzyki. Inkubować płytki przez 1 min na wytrząsarce do płytek przy 100 rpm.
    6. Włożyć płytkę do czytnika i pozostawić na 3 min w celu stabilizacji temperatury do 25 °C (bez folii przylepnej). Zawsze zaczynać od płytki ELISA do białka wolnego.
    7. Odczytać względne jednostki luminescencji (RLU) dla każdego testu na płytce ELISA (wolne i całkowite KDM1A).
    8. Zapisać i skopiować surowe wartości RLU z plików excel z surowymi danymi (Raw Data) do dalszej analizy wyników.

6. Obliczenie zaangażowania celu

  1. W programie do arkuszy kalkulacyjnych oblicz wartości RLU Free oraz RLU Total dla próbek SX i próbek referencyjnych REF (nieleczonych, z nośnikiem lub przed podaniem dawki) na podstawie surowych danych z powtórzeń technicznych, zgodnie z poniższymi instrukcjami:
    1. Wprowadź poszczególne surowe dane Raw RLUi Total i Raw RLUi Free z tła (blank), krzywej wzorcowej, kontroli negatywnych C- oraz próbek biologicznych (SX i REF) do arkusza analizy (np. Excel). Wprowadź również do arkusza ilości (w pg) KDM1A z krzywej wzorcowej.
    2. Oblicz średnią surową wartość RLU (Raw mean RLU), odchylenia standardowe σRLU oraz współczynnik zmienności CVRLU z poszczególnych surowych danych Raw Total i Raw Free RLUi dla każdego punktu danych z powtórzeń technicznych.
    3. Zastosuj eliminację wartości odstających (przykład dla powtórzeń trzykrotnych): dla każdego pojedynczego punktu danych Raw RLU Total i Raw RLU Free (RLUi) z technicznego powtórzenia trzykrotnego, zastosuj kryteria Grubbsa, gdy CV dla powtórzenia > 0,15, i odrzuć pojedynczą podejrzaną wartość Raw RLU, gdy
      figure-protocol-3
      gdzie Z = 1,148 dla n = 3 i 90% przedziału ufności (CI).
    4. Jeśli zastosowano eliminację wartości odstających, ponownie oblicz Raw mean RLU, odchylenie standardowe σRLU oraz CVRLU z nieodrzuconych (nr) wartości Raw RLUi Total i Raw RLUi Free dla każdego punktu danych.
    5. Zastosuj korekcję tła: Oblicz średnie wartości RLU Free i RLU Total dla każdej próbki wzorcowej, każdej próbki SX oraz próbki referencyjnej REF jako:
      figure-protocol-4
      figure-protocol-5
  2. Przedstaw dane graficznie w następujący sposób:
    1. Wykreśl wartości RLUFree i RLUTotal (oś Y) w stosunku do identyfikacji próbki (oś X) na wykresie słupkowym.
    2. Wykreśl również wartości RLU (oś Y) wzorców na wykresie punktowym w stosunku do ilości białka rKDM1A w pg (oś X) dla pomiarów Free i Total, a także odpowiednie linie trendu liniowego i oblicz wartości r2 (kwadrat współczynnika korelacji liniowej).
  3. Oblicz stopień zaangażowania celu (target engagement, TE), tj. procent KDM1A związanego przez inhibitor KDM1A w każdej próbce SX w stosunku do próbki referencyjnej REF (nieleczonej, z nośnikiem lub przed podaniem dawki) w następujący sposób:
    1. Oblicz stosunek R średnich wartości RLU Free do Total dla próbek SX i REF jako:
      figure-protocol-6
      figure-protocol-7
    2. Następnie oblicz stopień zaangażowania celu (TE) próbki SX jako:
      figure-protocol-8
      Opcjonalnie: (1) Jeśli przeprowadzono N eksperymentów z powtórzeniami biologicznymi, z których każdy zawierał n powtórzeń technicznych; najpierw oblicz TESX dla zestawów powtórzeń technicznych. Następnie oblicz średnią wartość TE, SD i wartości CV dla zestawu powtórzeń biologicznych.
  4. Sprawdź, czy spełnione są kryteria akceptacji testu: Zweryfikuj, czy (1) tło testu jest dopuszczalne i średnia wartość Blank < 0,05 x 107 RLU; (2) autoluminescencja próbki nie występuje, a wartości RLU kontroli negatywnych C- znajdują się poniżej dolnej granicy oznaczalności (LLOQ = średnia wartość Blank + 10x SD); (3) krzywa wzorcowa rKDM1A jest liniowa i r2 ≥ 0,98; (4) próbki biologiczne mają wartości RLU mieszczące się w zakresie dynamicznym i liniowym testu, tj. między LLOQ a 2 500 pg/well.
    UWAGA: Kroki od 6.1. do 6.4. można łatwo zautomatyzować w arkuszu kalkulacyjnym.
  5. Wyeksportuj dane TE do wybranego oprogramowania statystycznego (otwartego lub komercyjnego) w celu graficznego przedstawienia wartości TE i przeprowadzenia dodatkowych analiz statystycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Liniowość oznaczania całkowitego i wolnego KDM1A.

Serię standardową przygotowano zgodnie z opisem w kroku 5.3.2., wykorzystując od 0 do 2500 pg pełnowymiarowego ludzkiego rekombinowanego enzymu KDM1A. Wartości RLU dla całkowitego i wolnego rKDM1A oceniono w celu weryfikacji liniowości (Rysunek 2A oraz 2B). Dane przedstawiono jako średnią z 3 eksperymentów z 3 powtór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu bezpośredniego pomiaru zaangażowania celu KDM1A przy użyciu nowatorskiego testu ELISA opartego na chemoprobe KDM1A. Metoda została zwalidowana na hodowanych ludzkich liniach komórkowych i próbkach ex vivo od ludzi, szczurów, myszy i pawianów (w tym PBMC, płuc, mózgu, skóry, guzów), ale może być łatwo stosowana do innych gatunków, u których zachowane są docelowe epitopy przeciwciała KDM1A i centrum katalityczne. Ponieważ OG-881 jest chemosondą opartą na aktywności, jak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorka Tamara Maes jest dyrektorem wykonawczym i udziałowcem, a autorzy Cristina Mascaró i Raquel Ruiz Rodriguez są pracownikami Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. opracowuje inhibitory KDM1A i posiada patenty obejmujące związki i metody stosowane w tym artykule.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane przez Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche oraz częściowo wspierane przez program współpracy CIIP-20152001 i RETOS RTC-2015-3332-1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna-EDTA (1X)Thermo Scientific#25300-062
10 x tabletki inhibitora proteazyRoche#11836153001
96 blok do przechowywania studni głębinowychVWR#734-1679
96-dołkowe płytki ELISANunc#436110
Klej FilmPerkin Elmer#6050173
Klej folia przezroczystaVWR#60941-062
Biotynylowana sonda KDM1A OG-881Oryzon Genomics S.A.NA
Albumina surowicy bydlęcejSigma# 3117057001
Albumina surowicy bydlęcej StandardThermo Scientific#23208)
Test białka BradfordBioRad#500-0001
Bufor do lizy komórek 10XSygnalizacja komórkowa#9803
Wirówka do płytek 96-dołkowychHettichRotina 420R
KolbaThermo Scientific#156499
Pełnowymiarowy, enzymatycznie aktywny ludzki rekombinowany motyw LSD1 / KDM1A#31426
Graphpad Prism 5 ProjectGraphPad SoftwareNA
Luminol-Enhacer i roztwór nadtlenku (podłoże chemiluminescencyjne)Thermo Scientific#37074
MikrowirówkaEppendorf5415 R
Czytnik mikropłytek Infinite 200-TecanTecanInfinite 200
Mysie przeciwciało monoklonalne wychwytujące Anti-KDM1A (epitop N-końcowy)Abcam#ab53269
Igła głowa głowa,BD#303129
ORY-1001 (iadademstat)Oryzon Genomics S.A.Probówki separacyjne NA
PBMC 10 mlGreiner bio-one#163288
Probówki separacyjne PBMC 50 mlGreiner bio-one#227288
PBS 1xSigma#D8537
Wytrząsarka do płytekHeidolph InstrumentsRotamax 120
Polysorbate 20Sigma#P7949
Przeciwciało monoklonalne do wykrywania królika Anty-KDM1A (epitop C-końcowy)Sygnalizacja komórkowa#672184BF-100
Przeciwciało drugorzędowe Osioł sprzężony z peroksydazą Anty-królicze IgG ThermoScientific#31458
Spektrofotometr kuweta 1.5Deltalab#302100
Spektrofotometr do kuwetyGE HealthcareGeneQuant 1300
StreptawidynaPromega#Z704A
StrzykawkaBD#303172
Typ 1 ultraczysta wodaMilliporeMilli-Q Advantage A10
Myjka ultradźwiękowaVWRUSC200T
,

Bibliografia

  1. Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
  2. Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
  3. Maes, T. ORY-1001, a Potent and Selective Covalent KDM1A Inhibitor, for the Treatment of Acute Leukemia. Cancer Cell. 33 (3), 495-511 (2018).
  4. Sugino, N. A novel LSD1 inhibitor NCD38 ameliorates MDS-related leukemia with complex karyotype by attenuating leukemia programs via activating super-enhancers. Leukemia. 31 (11), 2303-2314 (2017).
  5. Kleppe, M., Shank, K., Efthymia, P., Riehnhoff, H., Levine, R. L. Lysine-Specific Histone Demethylase, LSD1, (KDM1A) As a Novel Therapeutic Target in Myeloproliferative Neoplasms. Blood. 126, 601(2015).
  6. Jutzi, J. S., et al. LSD1 Inhibition Prolongs Survival in Mouse Models of MPN by Selectively Targeting the Disease Clone. HemaSphere. 2 (3), 54(2018).
  7. Mohammad, H. P. DNA Hypomethylation Signature Predicts Antitumor Activity of LSD1 Inhibitors in SCLC. Cancer Cell. 28 (1), 57-69 (2015).
  8. Rivers, A., et al. RN-1, a potent and selective lysine-specific demethylase 1 inhibitor, increases γ-globin expression, F reticulocytes, and F cells in a sickle cell disease mouse model. Experimental Hematology. 43 (7), 546-553 (2015).
  9. Rivers, A. Oral administration of the LSD1 inhibitor ORY-3001 increases fetal hemoglobin in sickle cell mice and baboons. Experimental Hematology. 67, 60-64 (2018).
  10. Buesa, C., et al. The dual LSD1/MAO-B inhibitor ORY-2001 prevents the development of the memory deficit in samp8 mice through induction of neuronal plasticity and reduction of neuroinflammation. Alzheimer’s & Dementia. 11 (7), P905(2015).
  11. Schmidt, D. M., McCafferty, D. G. Trans-2-Phenylcyclopropylamine is a mechanism-based inactivator of the histone demethylase LSD1. Biochemistry. 46 (14), 4408-4416 (2007).
  12. Forneris, F., Binda, C., Vanoni, M. A., Battaglioli, E., Mattevi, A. Human histone demethylase LSD1 reads the histone code. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41360-41365 (2005).
  13. Oryzon Genomics, Methods to determine kdm1a target engagement and chemoprobes useful therefor. , WO2017158136 (2016).
  14. Mascaró, C., Ortega, A., Carceller, E., Rruiz Rodriguez, R., Cicero, F., Lunardi, S., Yu, L., Hilbert, M., Maes, T. Chemoprobe-based assays of histone lysine demethylase 1A target occupation enable in vivo pharmacokinetics and -dynamics studies of KDM1A inhibitors. Journal of Biological Chemistry. , In Press (2019).
  15. Rodriguez-Suarez, R. Development of Homogeneous Nonradioactive Methyltransferase and Demethylase Assays Targeting Histone H3 Lysine 4. Journal of Biomolecular Screening. 17 (1), 49-58 (2011).
  16. Lynch, J. T., Cockerill, M. J., Hitchin, J. R., Wiseman, D. H., Somervaille, T. C. CD86 expression as a surrogate cellular biomarker for pharmacological inhibition of the histone demethylase lysine-specific demethylase 1. Analytical Biochemistry. 442 (1), 104-106 (2013).
  17. Schulz-Fincke, J. Structure-activity studies on N-Substituted tranylcypromine derivatives lead to selective inhibitors of lysine specific demethylase 1 (LSD1) and potent inducers of leukemic cell differentiation. European Journal of Medicinal Chemistry. 144, 52-67 (2018).
  18. Ishii, T., et al. CETSA quantitatively verifies in vivo target engagement of novel RIPK1 inhibitors in various biospecimens. Scientific Report. 7, 13000(2017).
  19. Maes, T. ORY-2001: An Epigenetic drug for the treatment of cognition defects in Alzheimer’s disease and other neurodegenerative disorders. Alzheimer’s & Dementia. 12 (7), P1192(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Immunoassay oparty na sondach chemicznychsonda chemiczna KDM1Aprotok ELISAekstrakcja bia ekbufor do lizy kom rekpowlekanie streptawidynprzeciwcia o anty KDM1Adetekcja luminescencyjna
Bezpośredni pomiar zaangażowania celu KDM1A za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.