Tutaj prezentujemy protokół pomiaru docelowego zaangażowania KDM1A w próbkach ludzkich lub zwierzęcych komórek, tkanek lub krwi leczonych inhibitorami KDM1A. Protokół wykorzystuje znakowanie chemoprobem wolnego enzymu KDM1A i bezpośrednią kwantyfikację docelowego zajęcia za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe i może być stosowany w badaniach przedklinicznych i klinicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Bezpośredni pomiar zaangażowania celu KDM1A za pomocą testów immunologicznych opartych na chemoprobe
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ocena docelowego zaangażowania, zdefiniowana jako interakcja leku z białkiem, do którego został zaprojektowany, jest podstawowym wymogiem dla interpretacji biologicznej aktywności dowolnego związku w rozwoju leku lub w podstawowych projektach badawczych. W epigenetyce zaangażowanie celu jest najczęściej oceniane na podstawie analizy markerów zastępczych, a nie pomiaru związku związku z celem. Dalsze odczyty biologiczne, które zostały przeanalizowane, obejmują modulację znacznika histonowego lub zmiany ekspresji genów. KDM1A to demetylaza lizynowa, która usuwa grupy metylowe z mono- i dimetylowanego H3K4, modyfikacja związana z wyciszeniem ekspresji genów. Modulacja markerów zastępczych zależy od typu komórki i funkcji składu genetycznego badanych komórek, co może znacznie utrudnić interpretację i porównanie różnych przypadków. Aby obejść te problemy, przedstawiono wszechstronny protokół oceny wpływu dawki i dynamiki bezpośredniego zaangażowania celu KDM1A. Opisany test wykorzystuje chemosondę KDM1A do wychwytywania i ilościowego oznaczania niehamowanego enzymu, może być szeroko stosowany do próbek komórek lub tkanek bez konieczności modyfikacji genetycznej, ma doskonałe okno wykrywania i może być stosowany zarówno do badań podstawowych, jak i analizy próbek klinicznych.
Wprowadzenie
Demetylaza 1 specyficzna dla lizyny (KDM1A)1 jest demetylazą zaangażowaną w kontrolę transkrypcji genów. Białko to stało się potencjalnym celem farmakologicznym2 w onkologii; w tym w ostrej białaczce szpikowej3 (AML), zespole mielodysplastycznym (MDS)4, mielofibrozie (MF)5,6, drobnokomórkowym raku płuc (SCLC)7; w anemii sierpowatej (SCD)8,9, a także w chorobach ośrodkowego układu nerwowego, w tym w chorobie Alzheimera (AD), stwardnien....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Próbki krwi pobrano z Biobanku Instituto de Investigación Biomédica Sant Pau zgodnie z hiszpańskim ustawodawstwem (Real Decreto de Biobancos 1716/2011) oraz za zgodą lokalnych komisji etycznych. Badania z wykorzystaniem tkanek zwierzęcych przeprowadzono zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (dyrektywa Rady Wspólnot Europejskich 86/609/EWG) ustanowionymi przez Komisję Etyczną ds. Eksperymentów na Zwierzętach w PRAAL-PCB.
1. Przygotowanie próbek biologicznych do analizy.
UWAGA: Niniejszy protokół obejmuje manipulację próbkami biologicznymi, które m....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Liniowość oznaczania całkowitego i wolnego KDM1A.
Serię standardową przygotowano zgodnie z opisem w kroku 5.3.2., wykorzystując od 0 do 2500 pg pełnowymiarowego ludzkiego rekombinowanego enzymu KDM1A. Wartości RLU dla całkowitego i wolnego rKDM1A oceniono w celu weryfikacji liniowości (Rysunek 2A oraz 2B). Dane przedstawiono jako średnią z 3 eksperymentów z 3 powtór.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu bezpośredniego pomiaru zaangażowania celu KDM1A przy użyciu nowatorskiego testu ELISA opartego na chemoprobe KDM1A. Metoda została zwalidowana na hodowanych ludzkich liniach komórkowych i próbkach ex vivo od ludzi, szczurów, myszy i pawianów (w tym PBMC, płuc, mózgu, skóry, guzów), ale może być łatwo stosowana do innych gatunków, u których zachowane są docelowe epitopy przeciwciała KDM1A i centrum katalityczne. Ponieważ OG-881 jest chemosondą opartą na aktywności, jak.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorka Tamara Maes jest dyrektorem wykonawczym i udziałowcem, a autorzy Cristina Mascaró i Raquel Ruiz Rodriguez są pracownikami Oryzon Genomics S.A. Oryzon Genomics S.A. opracowuje inhibitory KDM1A i posiada patenty obejmujące związki i metody stosowane w tym artykule.
Podziękowania
To badanie zostało sfinansowane przez Oryzon Genomics. S.A., Hoffman-La Roche oraz częściowo wspierane przez program współpracy CIIP-20152001 i RETOS RTC-2015-3332-1.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,05% Trypsyna-EDTA (1X) | Thermo Scientific | #25300-062 | |
| 10 x tabletki inhibitora proteazy | Roche | #11836153001 | |
| 96 blok do przechowywania studni głębinowych | VWR# | 734-1679 | |
| 96-dołkowe płytki ELISA | Nunc | #436110 | |
| Klej Film | Perkin Elmer | #6050173 | |
| Klej folia przezroczysta | VWR | #60941-062 | |
| Biotynylowana sonda KDM1A OG-881 | Oryzon Genomics S.A. | NA | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma | # 3117057001 | |
| Albumina surowicy bydlęcej Standard | Thermo Scientific | #23208) | |
| Test białka Bradford | BioRad | #500-0001 | |
| Bufor do lizy komórek 10X | Sygnalizacja komórkowa | #9803 | |
| Wirówka do płytek 96-dołkowych | Hettich | Rotina 420R | |
| Kolba | Thermo Scientific | #156499 | |
| Pełnowymiarowy, enzymatycznie aktywny ludzki rekombinowany motyw LSD1 / KDM1A | #31426 | ||
| Graphpad Prism 5 Project | GraphPad Software | NA | |
| Luminol-Enhacer i roztwór nadtlenku (podłoże chemiluminescencyjne) | Thermo Scientific | #37074 | |
| Mikrowirówka | Eppendorf | 5415 R | |
| Czytnik mikropłytek Infinite 200-Tecan | Tecan | Infinite 200 | |
| Mysie przeciwciało monoklonalne wychwytujące Anti-KDM1A (epitop N-końcowy) | Abcam | #ab53269 | |
| Igła głowa głowa, | BD | #303129 | |
| ORY-1001 (iadademstat) | Oryzon Genomics S.A. | Probówki separacyjne NA | |
| PBMC 10 ml | Greiner bio-one | #163288 | |
| Probówki separacyjne PBMC 50 ml | Greiner bio-one | #227288 | |
| PBS 1x | Sigma | #D8537 | |
| Wytrząsarka do płytek | Heidolph Instruments | Rotamax 120 | |
| Polysorbate 20 | Sigma | #P7949 | |
| Przeciwciało monoklonalne do wykrywania królika Anty-KDM1A (epitop C-końcowy) | Sygnalizacja komórkowa | #672184BF-100 | |
| Przeciwciało drugorzędowe Osioł sprzężony z peroksydazą Anty-królicze IgG Thermo | Scientific | #31458 | |
| Spektrofotometr kuweta 1.5 | Deltalab | #302100 | |
| Spektrofotometr do kuwety | GE Healthcare | GeneQuant 1300 | |
| Streptawidyna | Promega | #Z704A | |
| Strzykawka | BD | #303172 | |
| Typ 1 ultraczysta woda | Millipore | Milli-Q Advantage A10 | |
| Myjka ultradźwiękowa | VWR | USC200T |
Bibliografia
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119 (7), 941-953 (2004).
- Maiques-Diaz, A., Somervaille, T. C. LSD1: biologic roles and therapeutic targeting. Epigenomics. 8 (8), 1103-1116 (2016).
- Maes, T.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
