Method Article

Badanie poszczególnych autoreaktywnych ośrodków rozrodczych metodą fotoaktywacji w mieszanym chimerycznym modelu autoimmunizacji

DOI:

10.3791/59397

⸱

April 11th, 2019

 ,  , 
1Department of Biomedicine, Aarhus University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje generowanie mieszanych chimer mysiego szpiku kostnego ze spontanicznymi autoimmunologicznymi centrami zarodkowymi, w których autoreaktywne limfocyty zawierają fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP). Daje to możliwość powiązania lokalizacji komórkowej w tkankach z dalszymi analizami molekularnymi i funkcjonalnymi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby autoimmunologiczne stanowią znaczne obciążenie dla zdrowia. Fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i progresji chorób autoimmunologicznych pozostają bez odpowiedzi. Jednym z wymogów postępu w naszym zrozumieniu podstawowych mechanizmów chorobowych i dynamiki komórkowej jest precyzyjne sprzężenie mikroanatomicznej lokalizacji podzbiorów komórek z dalszymi analizami molekularnymi lub funkcjonalnymi; Cel, który tradycyjnie był trudny do osiągnięcia. Opracowanie stabilnych fotoaktywowalnych fluoroforów biologicznych i ich integracja ze szczepami reporterowymi umożliwiło ostatnio precyzyjne znakowanie mikroanatomiczne i śledzenie podzbiorów komórkowych w modelach mysich. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób zdolność do analizy autoreaktywnych limfocytów z pojedynczych centrów rozrodczych może pomóc w dostarczeniu nowych informacji na temat autoimmunizacji, na przykładzie połączenia nowatorskiego chimerycznego modelu autoimmunizacji z fotoaktywowanym reporterem. Demonstrujemy procedurę generowania mieszanych chimer ze spontanicznymi autoreaktywnymi centrami rozrodczymi wypełnionymi limfocytami przenoszącymi fotoaktywowalny reporter białka zielonej fluorescencji. Korzystając ze strategii znakowania in vivo, pojedyncze centra rozrodcze można wizualizować w eksplantowanych tkankach limfatycznych i ich składnikach komórkowych fotoaktywowanych za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Limfocyty aktywowane fotoaktywem z pojedynczych centrów rozrodczych mogą być następnie analizowane lub sortowane metodą cytometrii przepływowej, jako pojedyncze komórki lub luzem, i mogą być poddawane dodatkowym analizom molekularnym i funkcjonalnym. Podejście to może być bezpośrednio zastosowane w celu uzyskania nowych spostrzeżeń w dziedzinie autoimmunizacji, ale procedura generowania chimer szpiku kostnego i procedura fotoaktywacji mogą dodatkowo znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad chorobami zakaźnymi i przerzutami nowotworowymi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częstość występowania chorób autoimmunologicznych gwałtownie wzrosła w ostatnich dziesięcioleciach, szczególnie w społeczeństwach zachodnich. Obecnie choroba autoimmunologiczna zajmuje trzecie miejsce na liście najczęstszych przyczyn zachorowalności i śmiertelności w świecie zachodnim1. Fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i progresji chorób autoimmunologicznych pozostają bez odpowiedzi. Jednym z wymogów postępu w naszym zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw choroby i dynamiki komórkowej jest precyzyjne sprzężenie mikroanatomicznej lokalizacji podzbiorów komórek z dalszymi analizami molekularnymi lub funkcjonalnymi. W ciągu ostatniej dekady opracowanie wielu stabilnych fotokonwertowalnych, fotoaktywowalnych lub fotoprzełączalnych fluoroforów biologicznych oraz ich integracja ze szczepami reporterowymi umożliwiło precyzyjne mikroanatomiczne znakowanie i śledzenie podzbiorów komórkowych w modelach mysich.

Kaede, fotokonwertowalne białko fluorescencyjne pochodzące z kamiennego koralowca, ulega nieodwracalnej fotokonwersji z zielonej fluorescencji na czerwoną fluorescencję po wystawieniu na działanie światła fioletowego lub ultrafioletowego2. Początkowo wykorzystany do śledzenia dynamicznego zachowania poszczególnych komórek podczas tworzenia organotypowych wycinków mózgu3, generacja myszy typu knock-in Kaede umożliwiła następnie monitorowanie ruchu komórkowego in vivo, a system został zastosowany do analiz migracji komórek odpornościowych do i z węzłów chłonnych4. To podejście zostało następnie udoskonalone za pomocą drugiej generacji reporter5. Podobnym raportem jest Dendra6, który był ostatnio używany do śledzenia przerzutów do węzłów chłonnych in vivo7.

Pierwszym opracowanym białkiem fotoaktywowanym było zielone białko fluorescencyjne (GFP) z jednopunktową mutacją (T203H), prowadzącą do bardzo niskiej absorbancji w zakresie długości fali od 450 do 550 nm8. Po fotoaktywacji światłem fioletowym, to fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (PA-GFP) zmienia swoje maksimum absorpcji z ~400 na ~500 nm, dając około 100-krotny wzrost intensywności po wzbudzeniu o długości fali 488 nm. Generacja myszy transgenicznych, u których wszystkie komórki hematopoetyczne wykazują ekspresję PA-GFP, pozwoliła po raz pierwszy na dogłębne analizy selekcji komórek B w anatomicznie zdefiniowanych jasnych i ciemnych strefach centrum rozrodczego9.

Podczas gdy fotoaktywacja to nieodwracalna konwersja ze stanu niefluorescencyjnego na stan fluorescencyjny, a fotokonwersja to jednokierunkowe przejście z jednej długości fali na drugą, fotoprzełączalne białka są w stanie przemieszczać się między obydwoma warunkami10. Ta ostatnia zdolność została niedawno wykorzystana do opracowania optycznej kontroli aktywności białek11.

Korzystając z reportera PA-GFP, niedawno scharakteryzowaliśmy repertuar limfocytów B pojedynczych centrów zarodkowych w nowym modelu spontanicznej autoimmunizacji podobnej do tocznia12. Model ten opiera się na mieszanych chimerach z 1 częścią szpiku kostnego zawierającą autoreaktywny receptor komórek B knock-in ze swoistością dla kompleksów rybonuclear-protein (564Igi13,14) w połączeniu z 2 częściami szpiku kostnego od dowolnego pożądanego dawcy. Po około 6 tygodniach od rozpuszczenia uzyskuje się warunki homeostatyczne, w których spontaniczne autoreaktywne centra rozrodcze są obecne w śledzionie i węzłach chłonnych skóry. Warto zauważyć, że populacja komórek B centrum rozrodczego składa się prawie wyłącznie (~ 95%) z komórek pochodzących z przedziału innego niż 564Igi, a te komórki B pochodzące z typu dzikiego stały się autoreaktywne. W związku z tym model umożliwia podejście typu "plug-and-play" do analiz autoreaktywnych komórek B centrum rozrodczego przy użyciu różnych transgenów, nokautów i reporterów. Tutaj opisujemy procedurę generowania mieszanych chimer ze spontanicznymi autoreaktywnymi centrami rozrodczymi wypełnionymi limfocytami przenoszącymi reporter PA-GFP. Korzystając ze strategii znakowania in vivo, pojedyncze centra rozrodcze można wizualizować w eksplantowanych tkankach limfatycznych i ich składnikach komórkowych fotoaktywowanych za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Limfocyty aktywowane fotoaktywem z pojedynczych centrów rozrodczych mogą być następnie analizowane za pomocą cytometrii przepływowej lub sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorochromem (FACS) i poddawane dodatkowym analizom molekularnym i funkcjonalnym. Możliwość analizy autoreaktywnych limfocytów z pojedynczych ośrodków rozrodczych może być bezpośrednio zastosowana w celu uzyskania nowych spostrzeżeń w dziedzinie autoimmunizacji, ale opisane techniki i podejścia mogą dodatkowo znaleźć odpowiednie zastosowania w badaniach nad chorobami zakaźnymi i przerzutami nowotworowymi.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszelkie wykorzystanie zwierząt było zgodne z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej i zostało zatwierdzone przez Duński Inspektorat Badań nad Zwierzętami (2017-15-0201-01348).

1. Ogólna hodowla myszy oraz przygotowanie i narzędzi

  1. Linie myszy domowych w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF), z okresowym monitorowaniem stanu zdrowia zgodnie ze standardowymi wytycznymi.
  2. Opcjonalnie: sprawdź brak spontanicznych centrów rozrodczych u myszy naiwnych z powodu niemonitorowanych infekcji przypadkowych. Można to zrobić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej (obecność struktur centrum rozrodczego) lub cytometrii przepływowej (częstotliwość komórek B centrum rozrodczego), jak opisano wcześniej12.
    UWAGA: Można używać zarówno samic, jak i mężczyzn. Ogólnie rzecz biorąc, idealnie jest dopasować płeć dawców i biorców, ponieważ niezgodność płci może teoretycznie prowadzić do alloreaktywności w stosunku do męskiego antygenu Y przez biorczynie/dawczynie płci żeńskiej15.
  3. Użyj adresatów CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) w wieku około 6-10 tygodni. Użyj 564Igi (B6. Cg-Ightm1(Igh564)TikIgktm1(Igk564)Tik/J) i PA-GFP (B6. Cg-Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J) dawców w wieku 6-12 tygodni.
  4. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne (proste, cienkie nożyczki i kleszcze Dumonta #5 i #7), sterylizując je w autoklawie zgodnie z rutynowymi wytycznymi dotyczącymi sterylizacji.
  5. Przygotować 500 ml buforu szpiku kostnego (BM) zawierającego sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), 2% płodową surowicę bydlęcą (FBS), 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) o pH 7,4. Aby przygotować bufor BM, dodaj 10 ml inaktywowanego termicznie (1 godzina w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C w celu dezaktywacji dopełniacza) FBS i 1,25 ml 400 mM roztworu EDTA (dostosowanego do pH 7,4) do 500 ml PBS o pH 7,4 i dobrze wymieszaj. Przefiltrować bufor za pomocą kolby filtracyjnej 0,2 μm.
  6. Przygotować 10 ml buforu do lizy krwinek czerwonych (RBC) (155 mM NH4Cl, 12 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA), rozcieńczając 1 ml 10-krotnego zapasu do 10 ml całkowitej objętości wodą z odczynnikiem. Przygotować 50 ml PBS z 5 mM EDTA, pH 7,4.

2. Ustanowienie mieszanych chimer szpiku kostnego

  1. Napromienianie biorców (dzień 0)
    1. Umieścić biorców szpiku kostnego CD45.1 w odpowiednim pojemniku do napromieniania i napromieniować 1100 Rad w promienniku gamma.
      UWAGA: Można stosować alternatywne źródła napromieniowania. Niezależnie od źródła, dawka/czas podawania musi być zoptymalizowana, aby uzyskać maksymalny efekt mieloablacyjny przy minimalnym ubocznym uszkodzeniu tkanek u zwierząt.
    2. Umieścić na wodzie z antybiotykiem ad libitum (1 mg sulfadiazyny i 0,2 mg trimetoprimu/ml wody pitnej).
  2. Ekstrakcja kości (dzień 1)
    1. Znieczulenie dawców szpiku kostnego 564Igi poprzez ciągły przepływ 4% izofluranu w powietrzu i eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj dawców etanolem i umieść ich na sterylnych podkładkach chirurgicznych w kapturze przepływowym. Przystąp do pracy utrzymując sterylne warunki, używając sterylnych i sprzętu.
    2. Aby usunąć kość udową i piszczelową, najpierw wykonaj nacięcie wokół kostki i rozciągnij w górę aż do biodra za pomocą prostych, cienkich nożyczek. Za pomocą wytrzymałych kleszczy lub kciuka i palców wskazujących pociągnij skórę do góry i zdejmij nogę w kierunku ciała. Podobnie pociągnij skórę w dół i zdejmij ze stopy.
    3. Wysuń stawy kolanowe i skokowe, chwytając nogę za biodro i mocno ciągnąc stopę. Przystąp do złamania stawu skokowego i przyciągnij stopę do ciała, trzymając się piszczeli, pozbawiając w ten sposób ścięgna i mięśnie kości piszczelowej.
    4. Złam staw kolanowy, aby uwolnić kość piszczelową i podobnie pociągnij go w kierunku ciała, trzymając się za kość udową, pozbawiając w ten sposób ścięgna i mięśnie kości udowej. Wykonaj nacięcie w stawie biodrowym i przetnij ścięgna, a następnie wyciągnij kość udową z panewki biodrowej. Powtórzyć kroki 2.2.2 – 2.2.4 dla strony przeciwnej.
    5. Ostrożnie oczyść kości, pocierając je grubym ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszystkie pozostałe mięśnie i tkankę łączną. Następnie opłucz je w lodowatym buforze BM, zanim ostatecznie przeniesiesz je do świeżego zimnego bufora BM na lodzie za pomocą pary kleszczy Dumont #7. Powtórz krok 2.2 dla dawców PA-GFP.
      UWAGA: Liczba komórek szpiku kostnego od jednego dawcy różni się w zależności od płci i wieku. Skaluj liczbę dawców zgodnie z pożądanymi proporcjami i liczbą szpiku kostnego oraz pożądaną liczbą biorców. Jeśli dawców jest niewielu, kończyny przednie mogą zostać włączone do ekstrakcji szpiku kostnego. Zazwyczaj daje to dodatkowe 1/3 do 1/2 komórek uzyskanych z tylnych kończyn. Zazwyczaj na jednego dawcę można odzyskać od 50 do 200 milionów komórek, w zależności od wieku, płci, pochodzenia i tego, czy obejmuje to tylko kończyny tylne, czy zarówno tylne, jak i przednie.
  3. Ekstrakcja komórek szpiku kostnego
    1. Przygotować zaprawę, spłukując ją w lodowatym buforze BM. Opróżnij bufor do płukania i za pomocą elektrycznego kontrolera pipet z pipetą serologiczną o pojemności 10 ml dodaj 10 ml świeżego, lodowatego buforu BM.
    2. Przenieś kości od dawców 564Igi do moździerza za pomocą pary kleszczy Dumont #7 i użyj tłuczka do zmiażdżenia i zmielenia kości, aby uwolnić szpik kostny. Odessać ekstrakt ze szpiku kostnego za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przepuścić go przez sitko o wielkości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml na lodzie.
    3. Dodaj dodatkowe 10 ml świeżego, lodowatego buforu BM do zaprawy i powtórz czynność, aby zapewnić całkowitą regenerację komórek. Usunąć materiał kostny z zaprawy ręcznikiem papierowym, odpowiednio wyrzucić i dokładnie spłukać zaprawę 70% etanolem, a następnie buforem BM. Powtórz krok 2.3 dla grupy dawców szpiku kostnego PA-GFP.
  4. Liczenie komórek szpiku kostnego
    1. Za pomocą mikropipety umieść kropelkę zawierającą 40 μl buforu do lizy RBC na kawałku plastikowej folii parafinowej. Odwrócić kilkakrotnie probówkę ze szpikiem kostnym 564Igi i pobrać 10 μl porcji za pomocą mikropipety. Wymieszaj go z 40 μl kropli buforu do lizy RBC.
    2. Następnie dodaj 50 μl błękitu trypanowego (0,4% w roztworze wodnym) do kropli. Natychmiast załadować 10 μl powstałej mieszaniny do hemocytometru Burkera-Türka i policzyć pod mikroskopem. Oblicz liczbę komórek na ml, używając 10-krotnego całkowitego współczynnika rozcieńczenia. Potwierdź odpowiednią żywotność komórek >90%. Powtórz krok 2.4 dla grupy dawców szpiku kostnego PA-GFP.
  5. Przygotowanie zawieszeń dla dawców
    1. Na podstawie liczby uzyskanej w kroku 2.4 i pożądanej liczby biorców obliczyć objętość szpiku kostnego dawcy z każdej z dwóch grup dawców, które mają zostać zmieszane w probówce z mieszanką dawcy.
      UWAGA: Na przykład, aby skonfigurować jedną grupę mieszanych chimer 564Igi:PA-GFP w stosunku 1:2 z 6 biorcami CD45.1: każdy biorca wymaga łącznie 20 x 106 komórek dawcy, 1 część 564Igi i 2 części PA-GFP. Wymaga to zatem 6 x 1/3 x 20 x 106 = 40 x 106 komórek donorowych 564Igi i 6 x 2/3 x 20 x 106 = 80 x 106 komórek dawczych PA-GFP.
    2. Wymieszaj odpowiednie ilości PA-GFP i szpiku dawcy 564lgi w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Odwirować mieszaninę szpiku kostnego w temperaturze 200 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego.
    3. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w lodowatym buforze BM o gęstości 1 x 10,8 komórek na ml. Przenieść do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.
  6. Odtwarzanie biorców szpiku kostnego ze szpikiem kostnym dawcy
    1. Znieczulenie biorców należy zastosować za pomocą indukcji z ciągłym przepływem 4% izofluranu w powietrzu, a następnie zabieg podtrzymujący w stężeniu 3,75%. Sprawdź odpowiednią płaszczyznę znieczulenia pod kątem braku odruchu szczypania palców u stóp.
    2. Ostrożnie strzepnąć probówkę zawierającą mieszaninę szpiku kostnego, aby zapewnić odpowiednie zawieszenie komórek szpiku kostnego, a następnie odessać 200 μl mieszanki szpiku kostnego (~20 x 106 komórek) w strzykawce insulinowej o pojemności 0,3 ml i rozmiarze 30.
    3. Ułożyć biorcę na boku, delikatnie rozciągnąć skórę nad i pod okiem, aby lekko "wysunąć oko", a następnie delikatnie włożyć końcówkę strzykawki pod kątem około 30° do przedniej części oczodołu, uważając, aby ominąć oko i otaczające tkanki. Gdy czubek igły dotknie kości podkreślającej oczodół, cofnij się lekko (~0,5 mm) i powoli wstrzyknij szpik kostny dawcy przy stałym nacisku.
      UWAGA: Nie powinno być krwawienia, wycieku płynu ani bardzo niewielkiego lub niewielkiego wybrzuszenia oka po wstrzyknięciu.
    4. Umieść mysz z powrotem w klatce z wodą z antybiotykiem ad libitum i sprawdź, czy natychmiast wyzdrowiejesz po zabiegu. Powtórz krok 2.6 dla każdego adresata.
      UWAGA: Iniekcja do żyły ogonowej może być stosowana zamiast iniekcji zadoczodołowej z podobnymi wynikami, jednak w naszych rękach jest znacznie wolniejsza, co może być problemem w przypadku pracy z dużymi grupami biorców. Należy unikać pobierania znieczulonych zwierząt bezpośrednio na ściółkę o małej średnicy, ponieważ stwarza to ryzyko zachłyśnięcia i uduszenia
  7. Usuwanie wody z antybiotykiem (dzień 14)
    1. Usuń wodę z antybiotykiem z klatki (klatek) i zastąp ją świeżą, zwykłą wodą pitną.

3. Sprawdzanie udanej rekonstytucji i weryfikacja odpowiedniego stopnia chimeryzmu (Tydzień 6)

  1. Krwawienie zadoczodołowe chimer i kontroli
    1. Przygotować probówki do pobierania krwi, znakując 1,5 ml probówek do mikrowirówek zgodnie z numerami kolczyków biorcy i dodając 50 μl PBS zawierającego 5 mM EDTA.
      UWAGA: Dołącz odpowiednie kontrolki dla PA-GFP, CD45.1 i CD45.2 oraz 9D11 (idiotyp). Można to zrobić, dołączając 1 mysz PA-GFP+, 1 mysz CD45.1, 1 mysz B6 i 1 mysz 564Igi.
    2. Znieczulić myszy i sprawdzić odpowiednią płaszczyznę znieczulenia, jak w kroku 2.6.1. Ułóż chimerę na boku, delikatnie rozciągnij skórę nad i pod okiem, aby lekko "wysunąć oko".
    3. Delikatnie włożyć owinięta w BoPET heparynizowaną rurkę kapilarną (objętość wewnętrzna 60 μl) pod kątem około 40° do przedniej części oczodołu, uważając, aby nie uszkodzić oka i otaczających tkanek. Delikatnie przekręć/obrócić rurkę, aż zacznie wypełniać się krwią.
    4. Pozwól, aby krew pasywnie wypełniła probówkę poprzez działanie kapilarne, aż do prawie całkowitego napełnienia, a następnie wycofaj probówkę i umieść ją w odpowiedniej, wstępnie oznaczonej probówce zbiorczej, jednocześnie natychmiast rozluźniając uchwyt wokół oka, aby oko mogło ustabilizować się z powrotem na swoim miejscu. Krwawienie powinno natychmiast ustać.
    5. Upewnij się, że rurka kapilarna została opróżniona do probówki zbiorczej i wyrzuć ją do pojemnika na ostre przedmioty. Zamknij probówkę i odwróć trzy razy, aby zapewnić całkowite wymieszanie z PBS/EDTA.
    6. Umieść mysz z powrotem w klatce i sprawdź, czy natychmiast wróciła do zdrowia po zabiegu. Powtórz krok 3.1 dla każdej myszy eksperymentalnej i odpowiednich kontrolników.
      UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas wykonywania nakłucia żyły podżuchwowej, ponieważ ta metoda może stwarzać większe ryzyko przypadkowego zakażenia u biorców napromieniowanych, zanim zostaną one w pełni odtworzone. Co więcej, z naszego doświadczenia wynika, że objętość pobranej krwi i ilość krwi utraconej z powodu nadmiernego krwawienia jest bardziej zmienna. Oba te względy są ważne, ponieważ chimery szpiku kostnego są wrażliwe w fazie rekonstytucji, zanim nowy szpik kostny zostanie w pełni wszczepiony, a hematopoeza powróci do normalnego poziomu.
  2. Oczyszczanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)
    1. Po zakończeniu pobierania krwi na krótko (10 s) odwirować probówki na niskich obrotach (<200 x g), aby zebrać rozcieńczoną, ustabilizowaną krew na dnie probówek.
    2. Napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml pożywką do separacji limfocytów i przymocować igłę 18 G. Wprowadzić igłę do dna pierwszej probówki i umieścić ją pod próbką krwi z 1 ml pożywki do separacji limfocytów. Ostrożnie wyjąć igłę i wytrzeć ją ręcznikiem papierowym, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu następnej próbki.
    3. Przeprowadzić przez wszystkie próbki, a następnie odwirować przez 25 minut przy 800 x g, w temperaturze pokojowej, w wirówce z odchylanym wiadrem, z hamulcami ustawionymi na niski/wyłączony.
    4. Przygotuj zestaw odpowiednio oznakowanych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawierających po 1 ml lodowatego buforu BM każda.
    5. Po odwirowaniu, dla każdej próbki, należy wprowadzić do górnej warstwy (osocza) za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl i zassać warstwę komórek jednojądrzastych (MNC) tuż nad granicą faz. Przenieść komórki do odpowiednio oznakowanej probówki zawierającej 1 ml buforu BM. Zamknij pokrywkę i odwróć, aby wymieszać. Wyrzucić probówkę zawierającą pożywkę do separacji limfocytów.
    6. Przejść przez wszystkie próbki, a następnie odwirować przy 200 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym. Odessać i wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu BM. Próbki są teraz gotowe do barwienia przeciwciałami i analizy metodą cytometrii przepływowej.
  3. Barwienie do oceny metodą cytometrii przepływowej
    UWAGA: Sugerowany panel: CD45.1-FITC, B220-PerCP-Cy5.5, 9D11-A568, CD45.2-APC. Nieaktywowany PA-GFP jest wykrywany w kanale Pacific Orange (lub równoważnym). Nie jest wymagany barwnik żywotności, ponieważ separacja limfocytów pozwala pozbyć się martwych komórek.
    1. Za pomocą mikropipety dodać 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę dla każdej chimery i próbki kontrolnej do płytki 96-dołkowej.
    2. W przypadku 3 próbek kontrolnych innych niż PA-GFP należy zebrać pozostałe 100 μl każdej próbki (łącznie 300 μl). Dodać 50 μl tego materiału do niebarwionych studzienek kontrolnych i pojedynczo barwionych studzienek kontrolnych. W przypadku kontroli PA-GFP pojedynczo barwionej dodatkowo dodać 50 μl niebarwionej próbki PA-GFP.
    3. Do każdej studzienki dodać 100 μl buforu (niebarwione), pojedynczego przeciwciała (kontrole kompensacji pojedynczo barwione, z wyjątkiem kontroli kompensacji PA-GFP) lub mieszaniny przeciwciał (próbki). Inkubować na lodzie przez 20 minut.
    4. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Wytrzepać bufor. Dodać 200 μl buforu BM do każdej studzienki i ponownie odwirować do przemycia. Wytrzeć bufor i ponownie zawiesić komórki w każdym dołku w 200 μl buforu BM. Próbki są teraz gotowe do analizy na cytometrze przepływowym (Rysunek 1).
      UWAGA: Odpowiedzi ośrodków zarodkowych w chimerach można analizować w dowolnym momencie od 6 tygodnia.

4. Znakowanie in vivo strefy brzeżnej/zatoki podtorebkowej w celu ułatwienia identyfikacji pojedynczych centrów rozrodczych

UWAGA: Obecny protokół jest demonstrowany dla zastrzyków na nogę/staw skokowy (węzeł chłonny podkolanowy) i dożylnie (dożylnie, śledziona), ale może być różny w zależności od miejsca docelowego.

  1. Obustronne wstrzyknięcie opuszki stopy w celu znakowania węzłów chłonnych podkolanowych
    1. Znieczulij myszy jak w kroku 2.6.1.
    2. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć 2 μl znakowanego PE szczurzego przeciwciała anty-mysiego CD169 w 18 μl PBS o pH 7,4. Umieść dwie kropelki po 10 μl każdej mieszanki na kawałku plastikowej folii parafinowej. Odessać każdą kroplę za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 ml z igłą o rozmiarze 30.
    3. Wstrzyknąć 10 μl mieszanki do etykietowania w opuszkę stopy (wprowadzić igłą pod kątem 5-10° w środkową część opuszki stopy, proksymalnie od początku palców u nóg i wprowadzić igłę mniej więcej do połowy w kierunku pięty) lub stawu skokowego (wprowadzić igłę pod kątem 5-10° tuż nad piętą i włożyć mniej więcej w połowie jej długości wzdłuż osi ścięgna Achillesa w w kierunku kolana). Umieść myszy z powrotem w klatkach i odczekaj około 15 minut przed przejściem do kroku 5.
  2. Wstrzyknięcie dożylne w celu znakowania śledziony
    1. Znieczulić myszy jak w ppkt 2.6.1.
    2. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml rozcieńczyć 10 μl znakowanego PE szczurzego przeciwciała anty-mysiego CD169 w 90 μl PBS. Odessać mieszaninę za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 ml.
    3. Wykonać zadoczodołowe wstrzyknięcie dożylne zgodnie z krokiem 2.6. Umieść myszy z powrotem w klatkach i odczekaj około 15 minut przed przejściem do kroku 5.
      UWAGA: Jako alternatywę dla izofluranu można zastosować środek znieczulający do iniekcji, taki jak mieszanina ketaminy i ksylazyny; Jednak zwykle prowadzi to do wolniejszego czasu odzyskiwania. Ponieważ na drenaż limfatyczny ma na ogół wpływ ruchy mięśni szkieletowych, oczekuje się, że doprowadzi to do spowolnienia czasu drenażu.

5. Eksplantacja śledziony i węzłów chłonnych oraz przygotowanie do fotoaktywacji

  1. Przygotowanie dwustronnej komory obrazowania i fotoaktywacji
    1. Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 20 ml i ponownie napełnić go smarem próżniowym, wkładając do niego dyszę rurki ze smarem próżniowym. Następnie wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 5 ml i za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml ponownie napełnić ją smarem próżniowym.
    2. Użyj strzykawki o pojemności 5 ml wypełnionej smarem próżniowym, aby przygotować komorę obrazowania i fotoaktywacji, umieszczając kwadratowe szkiełko nakrywkowe na płaskiej powierzchni i śledząc wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego smarem próżniowym (około 1-2 mm od krawędzi).
      UWAGA: Należy uważać, aby uniknąć zanieczyszczenia tłuszczem próżniowym wszelkich powierzchni, które następnie wejdą w kontakt z soczewką mikroskopu, ponieważ mikrokropelki tłuszczu próżniowego zemulgowane w wodzie zanurzeniowej mogą zanieczyścić soczewkę.
    3. Napełnij komorę smaru próżniowego typu cover-slip lodowatym buforem BM i umieść na zimnej, płaskiej powierzchni.
  2. Pobieranie węzłów chłonnych i śledziony
    1. Poddaj eutanazji chimeryczną mysz znakowaną in vivo, która ma być analizowana zgodnie z krokiem 2.2.1. Spryskaj tuszę 70% etanolem.
    2. Aby uzyskać dostęp do węzła chłonnego podkolanowego, użyj prostych cienkich nożyczek, aby wykonać nacięcie w skórze tuż pod kolanem i przedłuż nacięcie w górę wzdłuż linii ścięgna podkolanowego prawie aż do stawu biodrowego. Używając kleszczyków Dumont #5 lub #7, pociągnij każdy z odsłoniętych płatów skóry na zewnątrz, aby odsłonić tkankę w dole podkolanowym (Ryc. 2A).
    3. Za pomocą pary kleszczy Dumont #5 ostrożnie wejdź do dołu podkolanowego tuż przyśrodkowo do żyły podkolanowej i rozetnij tłuszcz, wkładając, otwierając i zamykając kleszcze wzdłuż osi nogi, w celu odsłonięcia leżącego poniżej węzła chłonnego podkolanowego.
    4. Wysuń węzeł chłonny z dołu, ściskając mięsień czworogłowy uda od przedniej strony proksymalnie do kolana za pomocą kciuka i palca wskazującego (Rysunek 2B). Chwyć węzeł chłonny od dołu za pomocą kleszczy, aby uwolnić go od otaczającej tkanki (Rysunek 2C), a następnie umieść go w komorze na tłuszcz próżniowy przygotowany w kroku 5.1.
    5. Powtórzyć kroki 5.2.2 – 5.2.4 dla strony przeciwnej. W razie potrzeby w jednej komorze można umieścić wiele węzłów chłonnych.
    6. Na koniec zamknij komorę, umieszczając drugie szkiełko nakrywkowe na wierzchu obręczy smaru próżniowego i delikatnie dociskając, uważając, aby wycisnąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
      UWAGA: Część bufora może również zostać wypchnięta, ale smar próżniowy powinien tworzyć szczelne uszczelnienie, zapobiegając wyciekom płynu (Rysunek 2D). Węzły chłonne znajdują się teraz w dwustronnej komorze obrazowania.
    7. Aby uzyskać dostęp do śledziony, za pomocą prostych cienkich nożyczek wykonaj nacięcie przez ścianę brzucha po lewej stronie myszy, proksymalnie do przedniej linii przyśrodkowej, tuż poniżej klatki piersiowej i przedłuż ją wokół ciała do tylnej linii pachowej. Wierzchołek śledziony powinien być widoczny (Rysunek 3A).
    8. Wyciągnij śledzionę za pomocą kleszczy Dumont #7 i odetnij zrosty na spodzie, aby ją uwolnić. Użyj pary prostych, cienkich nożyczek, aby pokroić plastry o przekroju poprzecznym o grubości ~2 mm.
    9. Umieść plasterek w próżniowej komorze na tłuszcz przygotowanej w kroku 5.1. W razie potrzeby w jednej komorze można umieścić wiele plastrów śledziony.
    10. Na koniec zamknij komorę, umieszczając drugie szkiełko nakrywkowe na obrzeżu smaru próżniowego i delikatnie dociskając, uważając, aby wycisnąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Wszystkie komory obrazowania należy utrzymywać na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem czasu obrazowania i fotoaktywacji.
      UWAGA: Część bufora może również zostać wypchnięta, ale smar próżniowy powinien tworzyć szczelne uszczelnienie, zapobiegając wyciekom płynu. Wycinki śledziony znajdują się teraz w dwustronnej komorze obrazowania (Ryc. 3B).

6. Fotoaktywacja

  1. Identyfikacja pojedynczych centrów rozrodczych
    UWAGA: Ten protokół jest opisany dla śledziony, ale jest całkowicie analogiczny dla węzłów chłonnych.
    1. Umieść komorę obrazowania na stoliku mikroskopu. Za pomocą plastikowej pipety transferowej o pojemności 3,5 ml umieść kroplę wody destylowanej na górnym szkiełku nakrywkowym i opuść obiektyw do punktu kontaktu. Skoncentruj się na górnej części tkanki za pomocą przechodzącego światła.
    2. Przełącz się na tryb ciemny i wzbudzenie dwufotonowe, a następnie dostrój laser do 940 nm.
      UWAGA: Dzięki odpowiednim zestawom filtrów, ta długość fali pozwala na wzbudzenie i wykrycie generowania drugich harmonicznych w strukturach zawierających kolagen związanych z głównymi naczyniami i elementami strukturalnymi, a także CD169-PE wstrzykniętym w kroku 4.2, który identyfikuje strefę brzeżną. Jednak wzbudzenie 940 nm nie powoduje fotoaktywacji PA-GFP.
    3. Zlokalizuj poszczególne obszary białej miazgi (ograniczone barwieniem CD169-PE) w pobliżu powierzchni tkanki i zidentyfikuj osłonkę limfoidalną okołotętnikową (PALS, strefa komórek T) przez drugą generację harmonicznych związaną z tętniczką centralną. W strefie między PALS a strefą brzeżną poszukaj obecności wysoce autofluorescencyjnych, aktywowanych makrofagów o ciele barwiącym (silny sygnał autofluorescencyjny we wszystkich kanałach, wygląd podobny do kropli z ciemnymi wakuolami) (Rysunek 4A).
      UWAGA: W razie potrzeby, ze względu na niepożądane ułożenie tkanki, komorę obrazowania można obrócić i obrazować można wykonać z drugiego kierunku.
    4. Na podstawie cech rozpoznawczych zidentyfikowanych w kroku 6.1.3 narysuj obszar zainteresowania identyfikujący pojedynczy obszar centrum rozrodczego. Ustaw stos Z o głębokości około 100-150 μm, zaczynając od powierzchni tkanki i używając kroku o rozmiarze ~3 μm.
    5. Przełącz na długość fali wzbudzenia 830 nm. Wyłącz lub przyciemnij wszystkie kanały, aby zapobiec fotouszkodzeniom detektorów (ponieważ moc lasera i fluorescencja wyjściowa są zwykle znacznie wyższe przy tej długości fali), a następnie "zobrazuj" stos.
      UWAGA: Konkretne ustawienia, takie jak moc lasera i czas przebywania pikseli, zależą od głębokości tkanki, konkretnej użytej tkanki i systemu obrazowania. Każda aplikacja musi być zoptymalizowana pod kątem konkretnego używanego systemu obrazowania. Chociaż ważne jest, aby uzyskać skuteczną fotoaktywację w całym stosie, należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić komórek.
    6. Przełącz z powrotem na długość fali wzbudzenia 940 nm i ponownie otwórz kanały. Przeskanuj stos, aby potwierdzić wydajną fotoaktywację w całym (Rysunek 4B) i brak fotouszkodzeń (rozproszony, nieograniczony komórkami sygnał PA-GFP, ciemne plamy lub autofluorescencja wysokiego stopnia w obszarze fotoaktywowanym).
    7. Przystąp do fotoaktywacji wszystkich istotnych tkanek w komorze obrazowania, a następnie natychmiast zwróć ją do lodu do czasu dalszego przetwarzania. Kontynuuj fotoaktywację dodatkowych komór obrazowania.
      UWAGA: Eksplantacja tkanek, montowanie, a zwłaszcza fotoaktywacja są procesami czasochłonnymi, ale całkowity czas realizacji powinien być ograniczony do 4-6 godzin, aby zapobiec dramatycznemu spadkowi żywotności komórek.

7. Odzyskiwanie i analiza komórek aktywowanych fotoaktywem

  1. Ekstrakcja limfocytów z węzłów chłonnych i śledziony
    1. Dla każdej próbki aktywowanej fotoaktywem należy przygotować odpowiednio oznakowaną probówkę mikrowirówkową o pojemności 1,5 ml zawierającą 500 μl buforu BM na lodzie. Uwzględnij próbki z kontroli innej niż PA-GFP i nieaktywowanej myszy PA-GFP. Można to osiągnąć, dołączając jedną mysz sterującą B6 i jedną mysz sterującą PA-GFP.
    2. Ostrożnie wyjąć górną szkiełko przykrywkowe z komory obrazowania, zwracając uwagę na utrzymanie pozycji próbek (jeśli w jednej komorze znajduje się wiele próbek) i umieścić każdą próbkę w odpowiedniej probówce na próbkę.
    3. Za pomocą homogenizatora tłuczkowego ściśnij tkankę i przekręć tłuczek w probówce, aby uwolnić limfocyty. Za pomocą mikropipety odessać lizat i przefiltrować przez sitko o wielkości 70 μm do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. W przypadku próbek z węzłów chłonnych przejdź do kroku 7.1.5.
    4. W przypadku próbek śledziony odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl buforu do lizy RBC. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, następnie dodać 800 μl lodowatego buforu BM i przejść do kroku 7.1.5.
    5. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl lodowatego buforu BM. Próbki są teraz gotowe do barwienia w celu oceny cytometrii przepływowej i sortowania, jeśli jest to pożądane.
  2. Barwienie do oceny metodą cytometrii przepływowej
    UWAGA: Sugerowany panel: CD169-PE, B220-PerCP-Cy5.5, 9D11-A647, CD38-PE-Cy7, Fixable Viability Dye Efluor-780, GL7-Pacific Blue. Nieaktywowany PA-GFP jest wykrywany w kanale Pacific Orange (lub równoważnym). Fotoaktywowany PA-GFP jest wykrywany w kanale GFP. Wszelkie współoczyszczone makrofagi (które mogły, ale nie musiały być in vivo znakowane CD169-PE) można wykluczyć poprzez barwienie CD169-PE i użycie go jako bramki zrzutowej.
    1. Za pomocą mikropipety dodać 100 μl zawiesiny komórek na studzienkę dla każdej chimery i próbki kontrolnej na płytce 96-dołkowej.
    2. W przypadku próbek kontrolnych B6 dodać 50 μl tego materiału do niebarwionych studzienek kontrolnych i pojedynczo barwionych studzienek kontrolnych. W przypadku nieaktywowanego PA-GFP pojedynczo barwiona kontrola dodać dodatkowo 50 μl niebarwionej nieaktywowanej próbki PA-GFP. W przypadku aktywowanej kontroli pojedynczo barwionej PA-GFP należy zebrać pozostały materiał dla wszystkich próbek aktywowanych fotoaktywowanymi.
    3. Do każdej studzienki dodać 100 μl buforu (niebarwione i kontrole kompensacyjne PA-GFP), pojedynczego przeciwciała (kontrole kompensacyjne pojedynczo) lub mieszaniny przeciwciał (próbki aktywowane fotoaktywowane). Inkubować na lodzie przez 20 minut.
    4. Wirować przy 200 x g 5 minut w temperaturze 4 °C. Wytrzepać bufor. Dodać 200 μl buforu BM do każdej studzienki i ponownie odwirować do przemycia. Wytrzeć bufor i ponownie zawiesić komórki w każdym dołku w 200 μl buforu BM. Próbki są teraz gotowe do analizy na cytometrze przepływowym lub sorterze (reprezentatywne wyniki w Rysunek 5).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Generacja mieszanych chimer szpiku kostnego

Obecny protokół zdecydowanie osiąga mieszane chimery szpiku kostnego z prawie całkowitym chimeryzmem w przedziale komórek B, jak pokazano w reprezentatywnym wyniku w Rysunek 1 (dla istotności statystycznej proszę odnieść się do 12). Serotypowanie ujawnia znormalizowaną liczbę komórek B po 6 tygodniach od rekonstytucji (Figura 1A), z niską częstotliwością 9D11 (idiotyp) dodatnich krążących komórek B pochodzących z przedziału 564Igi (Figura 1B). W obrębie całkowitej bramki limfocytów występuje niska częstość szczątkowych komórek pochodzących od biorcy, ~6% CD45.1 (Q1), co wskazuje na ogólny stopień chimeryzmu ~94% (Figura 1C). W przedziale dawczym (CD45.1-, Q4+Q3) stosunek 564Igi (Q4) do PA-GFP (Q3) wynosi około 23% do 77%. Ten nieco niższy niż wejściowy stosunek 33% do 66% tłumaczy się ciężką negatywną selekcją komórek B pochodzących z przedziału 564Igi 12. Jak widać na Rysunek 1D, w przedziale komórek B występuje praktycznie całkowity chimeryzm (99,9% CD45.1-) i dominacja komórek B pochodzących ze szpiku kostnego PA-GFP (Q3), co jest konsekwencją ciężkiej negatywnej selekcji komórek B pochodzących z 564Igi.

Pobieranie tkanek, przetwarzanie i ocena metodą cytometrii przepływowej

Rysunek 2 i Rysunek 3 pokazują procedury i wyniki eksplantacji świeżo wyizolowanych węzłów chłonnych i plastrów śledziony. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywny wynik dla znakowania in vivo i fotoaktywacji pojedynczego obszaru centrum zarodkowego w eksplantowanym wycinku śledziony. Jak widać (Rysunek 4A), znakowanie in vivo za pomocą CD169-PE solidnie oznaczyło strefę brzeżną (czerwoną, oznaczoną przez "MZ"). Sygnał drugiej harmonicznej jest widoczny w elementach strukturalnych zawierających kolagen i głównych naczyniach krwionośnych (kolor niebieski), w tym w tętniczce centralnej osłonki limfatycznej okołotętniczkowej (PALS). Wysoce autofluorescencyjne, aktywowane makrofagi o zabarwionym ciele są związane z aktywnością centrum zarodkowego (groty strzałek). Podsumowując, identyfikacja strefy brzeżnej, PALS i makrofagów o ciele barwnym, pozwala na identyfikację obszaru zainteresowania, który prawdopodobnie zawiera pojedyncze centrum rozrodcze. Obszar zainteresowania jest aktywowany fotoaktywem, jak pokazano na rysunku Rysunek 4B. Jak wykazano, fotoaktywacja jest mikroanatomicznie precyzyjna9, co daje określony obszar aktywacji. Przedstawione wyniki stanowią dodatkowo potwierdzenie dużego zagęszczenia limfocytów PA-GFP+ w odtworzonych chimerach oraz obecności spontanicznych centrów rozrodczych. Ocena cytometryczna przepływu w dół dodatkowo potwierdza znormalizowaną liczbę kompartmentów komórek B (Figura 5D), spontaniczną populację centrum zarodkowego (Figura 5E) oraz obecność podzbioru komórek B centrum rozrodczego, które zostały fotoaktywowane (Figura 5F).

Tak więc, obecny protokół przedstawia solidną metodę generowania mieszanych chimer szpiku kostnego z spontanicznymi autoreaktywnymi centrami zarodkowymi, które składają się głównie z komórek B pochodzących z dzikiego typu z fotoaktywowanym reporterem. To z kolei pozwala na dalsze analizy poszczególnych centrów rozrodczych (przegląd graficzny w Rysunek 6).

figure-results-1
Rycina 1: Cytometryczna ocena stopnia chimeryzmu we krwi mieszanych chimer 564Igi (CD45.1-, PA-GFP-):P A-GFP (CD45.1-, PA-GFP+) u śmiertelnie napromieniowanych biorców CD45.1 (CD45.1+, PA-GFP-), 6 tygodni po rekonstytucji. A) Wykres przedstawiający bramkowanie komórek B B220 +, wstępnie bramkowanych na limfocytach singletowych. B) Subgate z wykresu A, wykazujący częstość 9D11+ (idiotyp) w populacji komórek B. C) Wykres PA-GFP w porównaniu z CD45.1, wstępnie bramkowany na limfocytach singletowych. D) Wykres PA-GFP w porównaniu z CD45.1 w podbramce komórki B z wykresu A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Procedura pobierania i montażu węzłów chłonnych podkolanowych w celu obrazowania i fotoaktywacji. A) Poniżej kolana wykonuje się nacięcie i rozciąga się do stawu biodrowego, a krawędzie są cofnięte na boki, w celu odsłonięcia dołu podkolanowego (grot strzałki). B) Znajdująca się na nim poduszeczka tłuszczowa jest otwierana, a węzeł chłonny podkolanowy jest odsłonięty (grot strzałki). C) Węzeł chłonny podkolanowy jest pobierany z dołu. D) Procedurę powtarza się dla strony przeciwległej i oba węzły są zamontowane w dwustronnej komorze nakrywkowej/próżniowo-smarowej wypełnionej buforem BM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Procedura pobierania i montowania śledziony w celu obrazowania i fotoaktywacji. A) Nacięcie wykonuje się na przedniej linii przyśrodkowej tuż pod klatką piersiową i rozciąga się wokół ciała do tylnej linii pachowej, a krawędzie są cofane, aby odsłonić czubek śledziony (grot strzały). B) Śledziona jest cofana i wycinana, a następnie krojona na cienkie (1-2 mm) plastry, które są umieszczane w dwustronnej komorze nakrywkowej/próżniowo-smarowej wypełnionej buforem BM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Fotoaktywacja. A) Dwufotonowa mikrofotografia centrum rozrodczego w śledzionie przed fotoaktywacją. Znakowanie in vivo anty-CD169-PE przeprowadzono przed pobraniem śledziony w celu oznakowania strefy brzeżnej (kolor czerwony, oznaczony przez "MZ"). Sygnał drugiej harmonicznej jest widoczny w strukturach zawierających kolagen związanych z powłoką i głównymi naczyniami krwionośnymi (niebieski). Groty strzałek identyfikują wysoce autofluorescencyjne, aktywowane makrofagi barwiące ciało związane z aktywnością centrum zarodkowego. Obrazowanie wykonano przy wzbudzeniu 940 nm. Podziałka w lewym górnym rogu wskazuje 200 μm. B) Jak dla A, ale po fotoaktywacji przy 830 nm. Komórki aktywowane fotoaktywem są teraz widoczne (na zielono) w zdefiniowanym obszarze zainteresowania ograniczonym strefą brzeżną i obejmującym wcześniej zidentyfikowane makrofagi o ciele barwnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Analiza cytometryczna przepływowa fotoaktywowanych komórek B centrum rozrodczego. A) Wykres rozproszenia do przodu i bocznego oraz bramki limfocytów. B) Wykres obszaru rozproszenia do przodu w funkcji wysokości rozproszenia do przodu w bramce limfocytów i wynikowej bramki singletowej. C) Wykres wykluczenia barwnika żywotności w obrębie bramki singletowej i wynikająca z niej bramka żywej komórki. D) Bramkowanie komórek B B220 +. E) Bramkowanie komórek B centrum rozrodczego, zidentyfikowanych jako komórki CD38lo GL7hi w bramie B220 +. F) Bramkowanie komórek aktywowanych fotoaktywem w populacji komórek GC B, zidentyfikowanych jako podzbiór komórek współwyrażających nieaktywowany i fotoaktywowany PA-GFP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Graficzny przegląd protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępnych jest wiele mysich modeli autoimmunizacji, z których wiele ma spontaniczne centra rozrodcze16. Jednak wiele z dostępnych modeli zawiera złożone tło genetyczne lub mutacje w centralnych regulatorach proliferacji lub aktywacji limfocytów, co sprawia, że nie nadają się one odpowiednio do krzyżowania z liniami reporterowymi i badań nad normalnym zachowaniem limfocytów w autoimmunizacji. Obecny model, przeciwnie, pozwala na podejście "plug-and-play" do dogłębnych analiz autoreaktywnych komórek B centrum rozrodczego pochodzących z dzikiego typu przy użyciu dowolnej pożądanej kombinacji transgenów, nokautów i reporterów, w tym przypadku reprezentowanych przez fotoaktywowaną GFP. Korzystając ze strategii znakowania in vivo, pojedyncze centra rozrodcze można wizualizować w eksplantowanych tkankach limfatycznych i ich składnikach komórkowych fotoaktywowanych za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Limfocyty aktywowane fotoaktywem z pojedynczych centrów rozrodczych mogą być następnie analizowane lub sortowane metodą cytometrii przepływowej, jako pojedyncze komórki lub luzem. Komórki te mogą być następnie poddane dodatkowym analizom molekularnym i funkcjonalnym, aby zapewnić nowe informacje w dziedzinie autoimmunizacji.

Istnieje kilka krytycznych kroków do pomyślnego wykonania tej procedury. Jak wykazano w reprezentatywnych wynikach, napromienianie (1100 Rad) i rekonstytucja szpiku kostnego dawcy z powodzeniem zastępują przedział szpiku kostnego biorcy, powodując prawie całkowity chimeryzm w przedziale komórek B. Jest to ważny punkt, ponieważ resztkowe limfocyty B pochodzące od biorcy sprawiłyby, że podzbiór populacji centrum rozrodczego byłby "ciemny". Niezależnie od źródła użytego do napromieniowania, dawka/czas napromieniania musi być zoptymalizowany, aby uzyskać maksymalny efekt mieloablacyjny przy minimalnym ubocznym uszkodzeniu tkanek zwierząt. Stwierdzono, że w przypadku rekonstytucji protokół zgniatania kości i rekonstytucji z 20 milionami komórek dawcy zapewnia wysoki stopień rekonstytucji. Praca w sterylnej i zimnej / na lodzie do ekstrakcji szpiku kostnego zapewnia wysoką żywotność szpiku dawcy. Aby osiągnąć pożądane proporcje szpiku kostnego od dawcy, należy zachować szczególną ostrożność podczas liczenia porcji komórek, zarówno przy samym liczeniu, jak i przy pobieraniu podpróbki szpiku kostnego do liczenia. Mieszanie i kogranulowanie szpiku dawcy, zamiast odwirowywania i ponownego zawieszania oddzielnie, a następnie mieszania, służy zapobieganiu wszelkim odchyleniom w proporcjach dawców po zliczaniu komórek.

Generacja mieszanych chimer szpiku kostnego w protokole może działać samodzielnie i umożliwia generowanie chimer z autoreaktywnymi centrami rozrodczymi z dowolnym pożądanym reporterem, transgenem lub nokautem. Jednak jednym z ograniczeń w tym zakresie jest konieczność korzystania z dawców zgodnych z tkankami histologicznymi. Szczep 564Igi znajduje się na tle kongenicznym C57Bl/6J, w związku z czym pozostali dawcy (dawcy) i biorcy powinni mieć tło kongeniczne H-2b (lub alternatywnie, szczep 564Igi powinien zostać skrzyżowany wstecznie z pożądanym szczepem, a fenotyp autoimmunologiczny zweryfikowany na nowym tle). Procedura napromieniania ma tendencję do faworyzowania środowiska tolerogennego17, a niezgodności niektórych drobnych antygenów zgodności tkankowej mogą być tolerowane. Jednak ten aspekt powinien być dokładnie rozważony, szczególnie w przypadku mieszania dawców i/lub biorców płci męskiej i żeńskiej, ze względu na możliwość reaktywności samic z antygenami Y ograniczonymi dla mężczyzn.

Podobnie, aspekt fotoaktywacji protokołu może występować samodzielnie i może być stosowany w wielu różnych kontekstach. Jednak reporter PA-GFP jest obecnie dostępny tylko z promotorem UBC, który jest aktywny we wszystkich komórkach linii krwiotwórczej, ale nie w komórkach zrębowych. Jak wspomniano we Wprowadzeniu, dostępne są inne fotoaktywowane, fotoprzełączalne lub fotokonwertowalne szczepy reporterowe, które mogą być zastąpione PA-GFP, po odpowiednim dostosowaniu warunków doświadczalnych.

Ważne jest, aby unikać niezamierzonej fotoaktywacji niepożądanych obszarów, utrzymując laser znacznie powyżej 900 nm podczas obrazowania, ponieważ ta długość fali nie spowoduje fotoaktywacji PA-GFP. W przypadku samej fotoaktywacji określone ustawienia, takie jak moc lasera i czas przebywania pikseli, będą zależeć od głębokości tkanki, konkretnej użytej tkanki i systemu obrazowania, a każda aplikacja musi być zoptymalizowana pod kątem konkretnego używanego systemu obrazowania. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić komórek w wyniku fotouszkodzenia, ale jednocześnie konieczne jest uzyskanie skutecznej fotoaktywacji w całym stosie, aby uzyskać wystarczającą reprezentację aktywowanych komórek do dalszych analiz. Komórki B centrum rozrodczego na ogół stanowią od 0,5% do ~ 2% komórek B śledziony lub skórnych węzłów chłonnych, a jak widać z reprezentatywnych wyników (Figura 5), fotoaktywowane pojedyncze komórki B centrum rozrodczego mogą stanowić ~ 1% całkowitej populacji obecnej w pojedynczym wycinku śledziony. W związku z tym pomyślna analiza lub sortowanie znacznej liczby komórek wymaga przetworzenia dużej liczby zdarzeń.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SE Degn jest stypendystą Lundbeckfonden i wyróżnionym członkiem Fundacji Carlsberg. Prace te były częściowo dodatkowo wspierane przez grant biomedyczny NNF (SE Degn).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciało, 9D11-A568generowana we własnym zakresie, uprzejmie dostarczona przez MC Carroll, oznaczona zestawem: Przeciwciało Biotium 92255
Przeciwciało, anty-mysie / ludzki antygen GL7 Pacific Blue (marker aktywacji limfocytów T i B)144613Biolegend
przeciwciało anty-mysie CD169 PE (Siglec-1)142403Biolegend
przeciwciało PE / Cy7 przeciwko myszom CD38Biolegend102717
PerCP / Cy5.5 anty-mysie / ludzkie CD45R/B220Biolegend103235
rurka kapilarna, Owinięty mylarem, heparynizowanyFisher Scientific211766
Cell, 70 i mikro; mFalcon352350
Probówki stożkowe, 50 mlFalcon352235
Szkiełko nakrywkowe, kwadratowe, 22x22 mm, 0,13-0,17 mmThermo Fisher Scientific22X22-1
EDTAMerck1,084,180,250
Etanol, 70%VWR8301.360
Płodowa surowica bydlęcaLife Technologies10270106
Cytometr przepływowy, FACS Canto IIBD Biosciences338962
Cytometr przepływowy, LSRFortessa SORPBD Biosciences-Produktna specjalne zamówienie z 4 laserami (405 nm, 488 nm, 561 nm i 640 nm)
Smar, wysoka próżnia, Dow CorningVWR DOWC1597418
Hemocytometr, Burker-Tü rkVWR630-1544
Izofluran, weterynarz IsoFlo.Orion Pharma9658
Pożywka do separacji limfocytów (Lympholyte-M Cell Separation Media)CedarlaneCL5035
Probówka do mikrowirówek, 1,5 ml (Eppendorf)Mikroskop Sarstedt72.690.550
, Two-photonPrairie Technologies (obecnie Bruker)-Specjalne zamówienie Ultima In Vivo Two Photon Microscope
Moździerz z wargą, nieszkliwiony, 75 mlVWR410-0110
NaHCO3Merck1063290500
Igła, 18 gaugeBD Medical304622
NH4ClVWR87,769,290
PBSSigmad8537
Homogenizator tłuczkaVWR47747-358
Tłuczek, nieszkliwiony, 175 mmVWR410-0122
Pipeta, serologiczna, 10 mlVWR612-3700
Pipeta transferowa, plastikowaSarstedt861,172,001
Plastikowa folia parafinowa (Parafilm M)BemisPM996
Płytka, 96-dołkowaFalcon353910
Kleszcze chirurgiczne, Student Dumont #5 KleszczeFST - Fine Science Tools91150-20
Kleszcze chirurgiczne, Kleszcze Student Dumont #7FST - Narzędzia do nauki o sztuce91197-00
Nożyczki chirurgiczne, Cienkie nożyczki studenckie, prosteFST - Narzędzia do nauki o nauce91460-11
Strzykawka, 10 mlTerumoSS-10ES1
, 20 mlTerumoSS-20ES1
Strzykawka, 5 mlTerumoSS-05S1
Strzykawka, insulina, 0,3 mlBD Medical324827
Tribrissen weterynarz 24% inj., zawierająca 200 mg sulfadiazyny i 40 mg trimetoprimu/mlMSD 431577
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%VWRK940-100ML
Barwnik żywotności, eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fisher Scientific65-0865-14
Hybrydoma 9D11 , 9D11-A647 Hybrydoma 9D11 generowana we własnym zakresie, uprzejmie dostarczona przez MC Carroll, oznaczona zestawem: Przeciwciało Nordic Biosite ABD-1031, FITC anty-mysie CD45.1 Biolegend 110705 Przeciwciało , Przeciwciało , , sitko Strzykawka zdrowia zwierząt

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lerner, A., Jeremias, P., Matthias, T. The World Incidence and Prevalence of Autoimmune Diseases is Increasing. International Journal of Celiac Disease. 3 (4), 151-155 (2015).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  3. Mutoh, T., Miyata, T., Kashiwagi, S., Miyawaki, A., Ogawa, M. Dynamic behavior of individual cells in developing organotypic brain slices revealed by the photoconvertable protein Kaede. Experimental neurology. 200 (2), 430-437 (2006).
  4. Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein “Kaede” transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10871-10876 (2008).
  5. Tomura, M., et al. Tracking and quantification of dendritic cell migration and antigen trafficking between the skin and lymph nodes. Scientific Reports. 4, 6030(2014).
  6. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  7. Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science (New York, NY). 359 (6382), 1403-1407 (2018).
  8. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, NY). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  9. Victora, G. D., et al. Germinal center dynamics revealed by multiphoton microscopy with a photoactivatable fluorescent reporter. Cell. 143 (4), 592-605 (2010).
  10. Habuchi, S., et al. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9511-9516 (2005).
  11. Zhou, X. X., Chung, H. K., Lam, A. J., Lin, M. Z. Optical control of protein activity by fluorescent protein domains. Science (New York, NY). 338 (6108), 810-814 (2012).
  12. Degn, S. E., et al. Clonal Evolution of Autoreactive Germinal Centers. Cell. 170 (5), 913-926 (2017).
  13. Berland, R., et al. Toll-like receptor 7-dependent loss of B cell tolerance in pathogenic autoantibody knockin mice. Immunity. 25 (3), 429-440 (2006).
  14. Chatterjee, P., et al. Complement C4 maintains peripheral B-cell tolerance in a myeloid cell dependent manner. European journal of immunology. 43 (9), 2441-2450 (2013).
  15. Toubai, T., et al. Induction of acute GVHD by sex-mismatched H-Y antigens in the absence of functional radiosensitive host hematopoietic-derived antigen-presenting cells. Blood. 119 (16), 3844-3853 (2012).
  16. Luzina, I. G., et al. Spontaneous formation of germinal centers in autoimmune mice. Journal of leukocyte biology. 70 (4), 578-584 (2001).
  17. Sachs, D. H., Kawai, T., Sykes, M. Induction of tolerance through mixed chimerism. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 4 (1), a015529(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Germinal Center AnalysisPhotoactivation TechniqueMixed Chimeric ModelAutoreactive LymphocytesTwo Photon MicroscopyFlow Cytometric AnalysisBone Marrow ChimeraLymph Node LabelingSingle Cell SortingB Cell Receptor

Related Articles