Method Article

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

DOI:

10.3791/59398

⸱

May 2nd, 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2VA Ann Arbor Healthcare System

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitofagia jest niezbędnym szlakiem kontroli jakości mitochondriów, który jest kluczowy dla bioenergetyki komórek beta wysp trzustkowych do napędzania stymulowanego glukozą uwalniania insuliny. Ocena mitofagii jest trudna i często wymaga reporterów genetycznych lub wielu uzupełniających technik, które nie są łatwe do wykorzystania w próbkach tkanek, takich jak pierwotne ludzkie wyspy trzustkowe. W tym miejscu demonstrujemy solidne podejście do wizualizacji i ilościowego określania powstawania kluczowych endogennych kompleksów mitofagii w pierwotnych ludzkich wyspach trzustkowych. Wykorzystując czułą technikę ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji regulatorów mitofagii NRDP1 i USP8, jesteśmy w stanie specyficznie określić ilościowo powstawanie niezbędnych kompleksów mitofagii in situ. Łącząc to podejście z przeciwbarwieniem dla czynnika transkrypcyjnego PDX1, możemy określić ilościowo kompleksy mitofagiczne i czynniki, które mogą upośledzać mitofagię, szczególnie w komórkach beta. Metodologia, którą opisujemy, przezwycięża potrzebę dużych ilości ekstraktów komórkowych wymaganych do innych badań interakcji białko-białko, takich jak immunoprecypitacja (IP) lub spektrometria mas, i jest idealna dla cennych próbek ludzkich wysp trzustkowych, które na ogół nie są dostępne w wystarczających ilościach dla tych podejść. Co więcej, metodologia ta eliminuje potrzebę stosowania technik sortowania przepływowego w celu oczyszczenia komórek beta z heterogenicznej populacji wysp trzustkowych do dalszych zastosowań białkowych. W ten sposób opisujemy cenny protokół wizualizacji mitofagii, wysoce kompatybilny do stosowania w heterogenicznych i ograniczonych populacjach komórek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki beta trzustki produkują insulinę niezbędną do utrzymania prawidłowej homeostazy glukozy, a ich niepowodzenie powoduje rozwój wszystkich form cukrzycy. Komórki beta zachowują silną zdolność mitochondriów do generowania energii potrzebnej do sprzężenia metabolizmu glukozy z uwalnianiem insuliny. Ostatnio stało się jasne, że utrzymanie funkcjonalnej masy mitochondrialnej ma kluczowe znaczenie dla optymalnego funkcjonowania komórek beta1,2,3. Aby utrzymać funkcjonalną masę mitochondrialną, komórki beta polegają na mechanizmach kontroli jakości w celu usunięcia dysfunkcyjn....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie zanonimizowanych ludzkich wysp trzustkowych dawcy odbywa się na podstawie zwolnienia od Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) i jest zgodne z polityką IRB Uniwersytetu Michigan. Ludzkie wyspy trzustkowe zostały dostarczone przez sponsorowany przez NIH / NIDDK Zintegrowany Program Dystrybucji Wysp Trzustkowych (IIDP).

1. Przygotowanie próbki z ludzkich wysepek

  1. Dysocjacja pojedynczych komórek
    1. Hodowla próbek ludzkich wysp trzustkowych (4000–6000 ekwiwalentów wysp trzustkowych/10 ml pożywki) przez co najmniej 1 dzień w temperaturze 37 °C w pożywce trzustkowej (PIM(S)) uzupełnionej 1 mM glutami....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy wstępne eksperymenty na linii komórkowej beta trzustki MIN6 i linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y, aby zoptymalizować i potwierdzić zarówno specyficzność przeciwciał, jak i wizualizowane interakcje białek. Komórki MIN6 posiewano na szkiełkach nakrywkowych w ilości 30 000 komórek/ml i pozostawiano do przylegania przez 48 godzin, komórki SH-SY5Y posiewano na szkiełkach nakrywkowych w ilości 15 000 komórek/ml i pozostawiono do przylegania na 24 godziny. Następnie .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy proste i skuteczne podejście do wykorzystania NRDP1:USP8 PLA w tkankach/komórkach będących przedmiotem zainteresowania w celu ilościowego określenia tworzenia kompleksów mitofagii w górę. Wcześniej potwierdziliśmy tworzenie kompleksu mitofagii CLEC16A-NRDP1-USP8 w komórkach beta trzustki za pomocą kilku metodologii, w tym eksperymentów z koimmunoprecypitacją, badań interakcji bezkomórkowych oraz testów ubikwitynacji in vitro i komórkowych, i wykazaliśmy, w jaki sposób ten kompleks napędza regulowany strum.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od JDRF (CDA-2016-189 i-2018-539), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health (R01-DK-108921), rodziny Brehm i rodziny Anthony. Nagroda JDRF Career Development Award dla S.A.S. jest częściowo wspierana przez Duńską Akademię Diabetologiczną, która jest wspierana przez Fundację Novo Nordisk.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% trypsyna-EDTA 1XLife Technologies25200-056
Antybiotyk-Antybiotyk AntybiotykowyLife Technologies15240-062
Roztwór blokowyDomowezastosowanie 1X PBS, dodaj 10% surowicy osła i 0,3% detergentu Triton X-100.
Bufor ADomowej robotyAby zrobić 1L: Wymieszaj 8,8 g NaCl, 1,2 g bazy Tris, 500ul Tween-20 z 750 ml ddH20. pH do 7,5 z HCl i napełnij do 1 l. Filtruj roztwór i przechowuj w temperaturze 4C. Przynieś do RT przed użyciem eksperymentalnym
Bufor BDomowej robotyAby zrobić 1L: Wymieszaj 5,84 g NaCl, 4,24 g bazy Tris, 26 g Tris-HCl z 500 ml ddH20. pH do 7,5, i napełnić do 1L. Przefiltruj roztwór i przechowuj 4C. Przynieś do RT przed użyciem eksperymentalnym
AffiniPure sprzężony z Cy5 osłem anty-kozyJackson Labs705-175-147
Odczynniki do wykrywania RedSigma- AldrichDU092008-100RXNZestaw zawierający: roztwór do ligacji (5X), ligazę, roztwór do amplifikacji (5X) i polimerazę.
Sonda DuoLink PLA anty-mysia MINUSSigma- AldrichDU092004-100RXN
Sonda DuoLink PLA anty-królik PLUSSigma- AldrichDU092002-100RXN
Płodowa surowica
Kozia poliklonalna anty-PDX1 (klon A17)Santa CruzSC-14664RRID: AB_2162373
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
Linia komórkowa trzustki MIN6Prezent od D. StoffersLinia komórkowa insulinoma myszy, wykorzystywana do testów komórkowych.
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-USP8 (klon US872)Sigma- AldrichSAB200527
Pap-penResearch Products International195505
ParafilmSłuży do uszczelniania przeciwciał i sondowania roztworów na komórkach, aby zapobiec parowaniu przy użyciu małych objętości roztworu.
PBT (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z trytonem)Domowej robotyAby zrobić 50 ml: 43,5 ml DDH2O, 5 ml 10 razy PBS, 0,5 ml 10 razy BSA (100 mg / ml roztwór), 1 ml 10% roztwór trytona X-100 w ddH20)
Penicylina-Streptomycyna (100X)Life Technologies15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10XFisher ScientificBP399-20
PIM(ABS) Ludzka surowica ABProdo LabsPIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamina)Prodo LabsPIM-G001GMP
PIM(S) mediaProdo LabsPIM-S001GMP
PR619Apex BioA812
Prolong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPILife Technologies (sondy molekularne)P36935
Królik poliklonalny anty-FLRF / RNF41 (Nrdp1)Bethyl LaboratoriesA300-049ARRID: AB_2181251
Komórki SH-SY5YPrezent od L. SatinLudzka linia komórkowa nerwiaka zarodkowego, wykorzystywana do testów komórkowych.
Pirogronian sodu (100X)Life Technologies11360-070
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Woda do pracy z RNA (woda DEPC)Fisher ScientificBP361-1L
bydlęca

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitophagy ComplexesProximity Ligation AssayHuman Pancreatic Beta CellsNRDP1 USP8 InteractionPDX1 CounterstainingIslet Cell IsolationCytospin FixationImageJ Particle AnalysisMitophagy QuantificationDiabetes Research

Related Articles