Artykuł metodologiczny

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

DOI:

10.3791/59398

⸱

2 maja 2019

 , 
1Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, 2VA Ann Arbor Healthcare System

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitofagia jest niezbędnym szlakiem kontroli jakości mitochondriów, który jest kluczowy dla bioenergetyki komórek beta wysp trzustkowych do napędzania stymulowanego glukozą uwalniania insuliny. Ocena mitofagii jest trudna i często wymaga reporterów genetycznych lub wielu uzupełniających technik, które nie są łatwe do wykorzystania w próbkach tkanek, takich jak pierwotne ludzkie wyspy trzustkowe. W tym miejscu demonstrujemy solidne podejście do wizualizacji i ilościowego określania powstawania kluczowych endogennych kompleksów mitofagii w pierwotnych ludzkich wyspach trzustkowych. Wykorzystując czułą technikę ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji regulatorów mitofagii NRDP1 i USP8, jesteśmy w stanie specyficznie określić ilościowo powstawanie niezbędnych kompleksów mitofagii in situ. Łącząc to podejście z przeciwbarwieniem dla czynnika transkrypcyjnego PDX1, możemy określić ilościowo kompleksy mitofagiczne i czynniki, które mogą upośledzać mitofagię, szczególnie w komórkach beta. Metodologia, którą opisujemy, przezwycięża potrzebę dużych ilości ekstraktów komórkowych wymaganych do innych badań interakcji białko-białko, takich jak immunoprecypitacja (IP) lub spektrometria mas, i jest idealna dla cennych próbek ludzkich wysp trzustkowych, które na ogół nie są dostępne w wystarczających ilościach dla tych podejść. Co więcej, metodologia ta eliminuje potrzebę stosowania technik sortowania przepływowego w celu oczyszczenia komórek beta z heterogenicznej populacji wysp trzustkowych do dalszych zastosowań białkowych. W ten sposób opisujemy cenny protokół wizualizacji mitofagii, wysoce kompatybilny do stosowania w heterogenicznych i ograniczonych populacjach komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki beta trzustki produkują insulinę niezbędną do utrzymania prawidłowej homeostazy glukozy, a ich niepowodzenie powoduje rozwój wszystkich form cukrzycy. Komórki beta zachowują silną zdolność mitochondriów do generowania energii potrzebnej do sprzężenia metabolizmu glukozy z uwalnianiem insuliny. Ostatnio stało się jasne, że utrzymanie funkcjonalnej masy mitochondrialnej ma kluczowe znaczenie dla optymalnego funkcjonowania komórek beta1,2,3. Aby utrzymać funkcjonalną masę mitochondrialną, komórki beta polegają na mechanizmach kontroli jakości w celu usunięcia dysfunkcyjnych, uszkodzonych lub starzejących się mitochondriów4. My i inni wykazaliśmy wcześniej, że komórki beta polegają na wyspecjalizowanej formie obrotu mitochondrialnego, zwanej autofagią mitochondrialną (lub mitofagią), w celu utrzymania kontroli jakości mitochondriów zarówno w wysepkach gryzoni, jak i ludzkich1,2,5. Niestety, nie było prostej metody wykrywania mitofagii, czyli endogennie wyrażanych składników mitofagii, w ludzkich komórkach beta trzustki.

Ostatnio wykazaliśmy, że regulacja mitofagii w komórkach beta opiera się na tworzeniu kompleksu białkowego składającego się z ligaz E3 CLEC16A i NRDP1 oraz deubikwitynazy USP81. Wykazano, że NRDP1 i USP8 niezależnie wpływają na mitofagię poprzez działanie na kluczowy inicjator mitofagii PARKIN6,7. NRDP1 celuje w PARKIN pod kątem ubikwitynacji i degradacji, aby wyłączyć mitofagię6, a USP8 specyficznie deubikwitynuje PARKIN sprzężoną z K6, aby promować jej translokację do mitochondriów7. Technologia testu ligacji zbliżeniowej (PLA) jest najnowszym osiągnięciem w dziedzinie biologii interakcji białek8, umożliwiając wizualizację endogennych interakcji białkowych in situ w pojedynczych komórkach i nie jest ograniczona przez rzadki materiał próbki. Metodologia ta jest szczególnie kusząca dla biologii ludzkich wysp trzustkowych/komórek beta, ze względu na niewielką dostępność próbek, w połączeniu z potrzebą zrozumienia fizjologicznie istotnych kompleksów białkowych w heterogenicznych typach komórek.

Korzystając z podejścia PLA, jesteśmy w stanie obserwować kluczowe endogenne kompleksy mitofagii w pierwotnych ludzkich komórkach beta trzustki i liniach komórkowych neuronów, a także zademonstrować wpływ środowiska cukrzycowego na szlak mitofagii1. Podsumowując, nadrzędnym celem tego protokołu jest analiza specyficznych kompleksów białkowych mitofagii w tkankach pozbawionych obfitego materiału lub tam, gdzie konwencjonalne badania interakcji białkowych nie są możliwe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie zanonimizowanych ludzkich wysp trzustkowych dawcy odbywa się na podstawie zwolnienia od Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) i jest zgodne z polityką IRB Uniwersytetu Michigan. Ludzkie wyspy trzustkowe zostały dostarczone przez sponsorowany przez NIH / NIDDK Zintegrowany Program Dystrybucji Wysp Trzustkowych (IIDP).

1. Przygotowanie próbki z ludzkich wysepek

  1. Dysocjacja pojedynczych komórek
    1. Hodowla próbek ludzkich wysp trzustkowych (4000–6000 ekwiwalentów wysp trzustkowych/10 ml pożywki) przez co najmniej 1 dzień w temperaturze 37 °C w pożywce trzustkowej (PIM(S)) uzupełnionej 1 mM glutaminy (PIM(G)), 100 jednostek/ml antybiotyku przeciwgrzybiczego, 1 mM pirogronianu sodu i 10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS) lub ludzkiej surowicy AB.
    2. Użyj mikroskopu mikroskopu mikroskopowego o 3-krotnym powiększeniu, aby policzyć poszczególne ludzkie wysepki z hodowli. Pobrać 40 wysepek na zabieg/stan zainteresowania (taki jak glukoliotoksyczność) do probówek o pojemności 1,5 ml w pożywce z wysp trzustkowych.
    3. Odwirować wysepki przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C do osadu.
    4. Przepłukać próbki, przez krótkie odwrócenie probówek w temperaturze pokojowej, dwukrotnie 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 50 μM PR619 (inhibitor deubikwitynazy; w celu zachowania oddziaływań białkowych zależnych od ubikwityny), z odwirowaniem między każdym płukaniem przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C.
    5. Dysocjuj wyspy trzustkowe na pojedyncze komórki za pomocą 125 μl 0,25% trypsyny zawierającej 50 μM PR619 poprzez inkubację wstępnie podgrzanej trypsyny (37 °C) przez 3 minuty z osadami wysp trzustkowych. W tym czasie delikatnie rozprowadzić wysepki, okresowo delikatnie pipetując za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
    6. Trypsynę ugasić 1 ml podgrzanej (37 °C) pożywki PIM(s) zawierającej 50 μM PR619, a następnie komórki osadu przez odwirowanie przy 400 x g przez 1 min.
    7. Przemyć komórki przez odwirowanie przy 400 x g przez 1 minutę, dwukrotnie, za pomocą PBS + 50 μM PR619.
    8. Na koniec ponownie zawieś komórki w 150 μl PBS zawierającym 50 μM PR619.
  2. Przyleganie i utrwalanie pojedynczych komórek
    1. Po ponownym zamieszaniu odwirować roztwór komórek na oszronionych, naładowanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą cytowirówki o sile 28 x g przez 10 minut.
    2. Po cytowirowaniu obrysuj obszar komórkowy za pomocą pisaka hydrofobowego (patrz Tabela materiałów), aby zminimalizować potrzebne objętości roztworu przeciwciała/PLA. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: PFA jest niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
    3. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, należy przeprowadzić barwienie/PLA natychmiast lub w ciągu 24 godzin. W razie potrzeby próbki należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do czasu barwienia nie dłużej niż 48 godzin.

2. Immunohistochemia

  1. Blokowanie
    1. Umyj komórki dwukrotnie 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Roztwór komórek blokowych, w celu wyeliminowania barwienia tła, z 10% surowicą osła w PBS zawierającą 0,3% detergentu (patrz Tabela Materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Barwienia
    1. Inkubować komórki z pierwotnymi przeciwciałami mysimi lub króliczymi przeciwko odpowiednio USP8 (1:250) i NRDP1 (1:250) (patrz tabela materiałów) rozcieńczonymi w buforowanym fosforanie soli fizjologicznej z detergentem (PBT, patrz tabela materiałów), w temperaturze 4 °C przez noc, w celu wykrycia sygnalizacji kompleksu mitofagii przez PLA.
    2. Współinkubuj komórki z markerem specyficznym dla identyfikacji komórek beta, który nie był hodowany u myszy lub królika, aby nie zakłócać sygnału PLA. W tym przypadku inkubuj komórki z anty-kozim PDX1 (1:500) w PBT. Inkubować wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe przez noc w temperaturze 4 °C, używając folii z tworzywa sztucznego na wierzchu roztworu, aby zapobiec parowaniu.

3. Test ligacji zbliżeniowej

  1. Sonda PLA i przeciwbarwienie
    1. Przygotować roztwór sondy PLA zgodnie z instrukcjami producenta, tj. przygotować 20 μl roztworu sondy na próbkę, przygotowując końcowe stężenie roztworu sondy 1:5 zarówno anty-myszy, jak i anty-królika w PBT i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Po całonocnej inkubacji umyj komórki dwukrotnie 1x PBS przez 5 minut każda, na kołysce.
    3. Tuż przed inkubacją z roztworem sondy dodać wtórny anty-kozi Cy5 o końcowym stężeniu 1:600 do roztworu sondy (w celu wykrycia endogennego PDX1). Dodać 20 μl roztworu sondy do każdej komórki, delikatnie przykryć folią z tworzywa sztucznego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  2. Ligacji
    1. Umyj komórki dwukrotnie, w temperaturze pokojowej, buforem A (przepis znajduje się w Tabeli Materiałów) przez 5 minut każda, na kołysce.
    2. Przygotować roztwór do ligacji (część odczynników wykrywających, patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. W tym celu rozcieńczyć podwiązanie (5x) w stosunku 1:5 w wodzie uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). Bezpośrednio przed inkubacją dodać 0,025 U/ml ligazy. Dodać 20 μl roztworu do ligacji do komórek. Przykryć folią z tworzywa sztucznego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  3. wzmocnienie
    1. Umyj komórki dwukrotnie w temperaturze pokojowej z buforem A przez 2 minuty każda.
    2. Przygotować roztwór do amplifikacji (część odczynników do wykrywania, patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć bufor wzmacniający (5x) 1:5 w wodzie uzdatnionej DEPC i przechowywać w ciemności do momentu użycia. Dodać rozcieńczenie polimerazy w stosunku 1:80 (część odczynników wykrywających, patrz tabela materiałów) do roztworu bezpośrednio przed dodaniem roztworu do komórek.
    3. Dodać 20 μl roztworu amplifikacyjnego do komórek. Przykryj folią z tworzywa sztucznego i umieść w ciemności w temperaturze 37 °C na okres od 1 godziny, 40 minut do 2 godzin, aby uzyskać maksymalny sygnał.
  4. Przygotowanie do obrazowania
    1. Umyć komórki dwukrotnie buforem B (przepis znajduje się w Tabeli Materiałów) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, na kołysce.
    2. Na koniec umyj komórki raz w 0,01x buforze B, przez 2 minuty w temperaturze pokojowej na bujaku.
    3. Mocować próbki, dodając kroplę podłoża montażowego zawierającego 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) i ostrożnie umieszczając szkiełko nakrywkowe na próbkach za pomocą ostrza skalpela w celu wyciśnięcia wszelkich powstałych pęcherzyków. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci na krawędziach.
    4. Próbki obrazu na mikroskopie zdolnym do uchwycenia wielu płaszczyzn ogniskowych, takim jak laserowy skaningowy mikroskop konfokalny lub odwrócony mikroskop fluorescencyjny z możliwością dekonwolucji, wykonujący co najmniej 9 różnych obrazów płaszczyzny ogniskowej.
      1. Rejestruj obrazy w 100-krotnym powiększeniu, z wysokością stosu z około 0,45 μm. Wychwytywanie PLA przy wzbudzeniu 550 nm, emisja 570 nm; przeciwbarwienie przy wzbudzeniu 650 nm, emisja 670 nm; i DAPI przy wzbudzeniu 405 nm, emisji 450 nm.
    5. Aby zapewnić zminimalizowanie sygnałów tła obrazu fluorescencyjnego i światła rozproszonego na potrzeby dalszej analizy zdarzeń PLA (zwłaszcza w mikroskopach szerokokątnych), należy przetwarzać obrazy przy użyciu dwuwymiarowego algorytmu dekonwolucji (najbliższego sąsiada) za pomocą standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazu.
      UWAGA: W przypadku Olympusa użyj CellSens, Nikon użyj NIS-Elements, Leica użyj LAS X, Zeiss - ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, a także kilku wtyczek dostępnych za pośrednictwem Image-J. W celu analizy, całkowita liczba interakcji we wszystkich stosach z powinna być analizowana za pomocą oprogramowania Image-J, upewniając się, że analizowane są tylko komórki Pdx-1 dodatnie (sekcja 3.5).
  5. Kwantyfikacja oddziaływań PLA
    1. Otwórz darmową aplikację Image-J i otwórz obraz PLA. Zacznij od pierwszego, ostro ostrego obrazu PLA.
    2. Kliknij kartę obrazu i wybierz dostosuj, a następnie próg (Rysunek 1A). Dostosuj próg, aby usunąć cały niespecyficzny sygnał PLA, zanotuj korektę progu i staraj się zachować spójność przez cały czas analizy.
    3. Kliknij kartę procesu i wybierz binarny, a następnie utwórz binarny (Rysunek 1B). Użyj obrazu binarnego do pomiaru cząstek, klikając zakładkę "analizuj" i naciskając analizuj cząstki (Rysunek 1C).
    4. Na potrzeby analizy upewnij się, że ustawienia są następujące: Rozmiar = 0–Nieskończoność, Okrągłość = 0–1,0, Pokaż = Kontury, pola wyboru Wyświetl wyniki i Wyczyść wyniki (Rysunek 1D). Kliknij przycisk OK. Zwróć uwagę na liczbę analizowanych cząstek w arkuszu kalkulacyjnym oznaczającą próbkę i pozycję stosu z.
    5. Powtarzaj kroki 3.5.2–3.5.4, aż wszystkie ostre stosy z dla próbki zostaną przeanalizowane. Zsumuj całkowitą liczbę cząstek w próbce w arkuszu kalkulacyjnym, aby określić ilościowo całkowitą liczbę interakcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy wstępne eksperymenty na linii komórkowej beta trzustki MIN6 i linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y, aby zoptymalizować i potwierdzić zarówno specyficzność przeciwciał, jak i wizualizowane interakcje białek. Komórki MIN6 posiewano na szkiełkach nakrywkowych w ilości 30 000 komórek/ml i pozostawiano do przylegania przez 48 godzin, komórki SH-SY5Y posiewano na szkiełkach nakrywkowych w ilości 15 000 komórek/ml i pozostawiono do przylegania na 24 godziny. Następnie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy proste i skuteczne podejście do wykorzystania NRDP1:USP8 PLA w tkankach/komórkach będących przedmiotem zainteresowania w celu ilościowego określenia tworzenia kompleksów mitofagii w górę. Wcześniej potwierdziliśmy tworzenie kompleksu mitofagii CLEC16A-NRDP1-USP8 w komórkach beta trzustki za pomocą kilku metodologii, w tym eksperymentów z koimmunoprecypitacją, badań interakcji bezkomórkowych oraz testów ubikwitynacji in vitro i komórkowych, i wykazaliśmy, w jaki sposób ten kompleks napędza regulowany strum...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od JDRF (CDA-2016-189 i-2018-539), National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health (R01-DK-108921), rodziny Brehm i rodziny Anthony. Nagroda JDRF Career Development Award dla S.A.S. jest częściowo wspierana przez Duńską Akademię Diabetologiczną, która jest wspierana przez Fundację Novo Nordisk.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTA 1XLife Technologies25200-056
Antybiotyk-Antybiotyk AntybiotykowyLife Technologies15240-062
Roztwór blokowyDomowezastosowanie 1X PBS, dodaj 10% surowicy osła i 0,3% detergentu Triton X-100.
Bufor ADomowej robotyAby zrobić 1L: Wymieszaj 8,8 g NaCl, 1,2 g bazy Tris, 500ul Tween-20 z 750 ml ddH20. pH do 7,5 z HCl i napełnij do 1 l. Filtruj roztwór i przechowuj w temperaturze 4C. Przynieś do RT przed użyciem eksperymentalnym
Bufor BDomowej robotyAby zrobić 1L: Wymieszaj 5,84 g NaCl, 4,24 g bazy Tris, 26 g Tris-HCl z 500 ml ddH20. pH do 7,5, i napełnić do 1L. Przefiltruj roztwór i przechowuj 4C. Przynieś do RT przed użyciem eksperymentalnym
AffiniPure sprzężony z Cy5 osłem anty-kozyJackson Labs705-175-147
Odczynniki do wykrywania RedSigma- AldrichDU092008-100RXNZestaw zawierający: roztwór do ligacji (5X), ligazę, roztwór do amplifikacji (5X) i polimerazę.
Sonda DuoLink PLA anty-mysia MINUSSigma- AldrichDU092004-100RXN
Sonda DuoLink PLA anty-królik PLUSSigma- AldrichDU092002-100RXN
Płodowa surowica
Kozia poliklonalna anty-PDX1 (klon A17)Santa CruzSC-14664RRID: AB_2162373
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
Linia komórkowa trzustki MIN6Prezent od D. StoffersLinia komórkowa insulinoma myszy, wykorzystywana do testów komórkowych.
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-USP8 (klon US872)Sigma- AldrichSAB200527
Pap-penResearch Products International195505
ParafilmSłuży do uszczelniania przeciwciał i sondowania roztworów na komórkach, aby zapobiec parowaniu przy użyciu małych objętości roztworu.
PBT (sól fizjologiczna buforowana fosforanami z trytonem)Domowej robotyAby zrobić 50 ml: 43,5 ml DDH2O, 5 ml 10 razy PBS, 0,5 ml 10 razy BSA (100 mg / ml roztwór), 1 ml 10% roztwór trytona X-100 w ddH20)
Penicylina-Streptomycyna (100X)Life Technologies15140-122
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 10XFisher ScientificBP399-20
PIM(ABS) Ludzka surowica ABProdo LabsPIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamina)Prodo LabsPIM-G001GMP
PIM(S) mediaProdo LabsPIM-S001GMP
PR619Apex BioA812
Prolong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPILife Technologies (sondy molekularne)P36935
Królik poliklonalny anty-FLRF / RNF41 (Nrdp1)Bethyl LaboratoriesA300-049ARRID: AB_2181251
Komórki SH-SY5YPrezent od L. SatinLudzka linia komórkowa nerwiaka zarodkowego, wykorzystywana do testów komórkowych.
Pirogronian sodu (100X)Life Technologies11360-070
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Woda do pracy z RNA (woda DEPC)Fisher ScientificBP361-1L
bydlęca

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
  2. Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
  3. Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
  4. Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
  5. Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
  6. Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
  7. Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
  8. Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701(2015).
  9. Silva Xavier, D. a, G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54(2018).
  10. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  11. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334(2006).
  12. Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
  13. Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
  14. Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
  15. Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
  16. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  17. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
  18. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756(2016).
  20. Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
  21. Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
  22. Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
  23. Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  24. Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oddzia ywanie NRDP1 i USP8przeciwbarwienie PDX1izolacja kom rek wysepekfiksacja metod cytospinanaliza cz stek w programie ImageJkwantyfikacja mitofagiibadania nad cukrzyc

Powiązane artykuły