Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

Komórki beta trzustki produkują insulinę niezbędną do utrzymania prawidłowej homeostazy glukozy, a ich niepowodzenie powoduje rozwój wszystkich form cukrzycy. Komórki beta zachowują silną zdolność mitochondriów do generowania energii potrzebnej do sprzężenia metabolizmu glukozy z uwalnianiem insuliny. Ostatnio stało się jasne, że utrzymanie funkcjonalnej masy mitochondrialnej ma kluczowe znaczenie dla optymalnego funkcjonowania komórek beta^1,2,3. Aby utrzymać funkcjonalną masę mitochondrialną, komórki beta polegają na mechanizmach kontroli jakości w celu usunięcia dysfunkcyjnych, uszkodzonych lub starzejących się mitochondriów⁴. My i inni wykazaliśmy wcześniej, że komórki beta polegają na wyspecjalizowanej formie obrotu mitochondrialnego, zwanej autofagią mitochondrialną (lub mitofagią), w celu utrzymania kontroli jakości mitochondriów zarówno w wysepkach gryzoni, jak i ludzkich^1,2,5. Niestety, nie było prostej metody wykrywania mitofagii, czyli endogennie wyrażanych składników mitofagii, w ludzkich komórkach beta trzustki.

Ostatnio wykazaliśmy, że regulacja mitofagii w komórkach beta opiera się na tworzeniu kompleksu białkowego składającego się z ligaz E3 CLEC16A i NRDP1 oraz deubikwitynazy USP8¹. Wykazano, że NRDP1 i USP8 niezależnie wpływają na mitofagię poprzez działanie na kluczowy inicjator mitofagii PARKIN^6,7. NRDP1 celuje w PARKIN pod kątem ubikwitynacji i degradacji, aby wyłączyć mitofagię⁶, a USP8 specyficznie deubikwitynuje PARKIN sprzężoną z K6, aby promować jej translokację do mitochondriów⁷. Technologia testu ligacji zbliżeniowej (PLA) jest najnowszym osiągnięciem w dziedzinie biologii interakcji białek⁸, umożliwiając wizualizację endogennych interakcji białkowych in situ w pojedynczych komórkach i nie jest ograniczona przez rzadki materiał próbki. Metodologia ta jest szczególnie kusząca dla biologii ludzkich wysp trzustkowych/komórek beta, ze względu na niewielką dostępność próbek, w połączeniu z potrzebą zrozumienia fizjologicznie istotnych kompleksów białkowych w heterogenicznych typach komórek.

Korzystając z podejścia PLA, jesteśmy w stanie obserwować kluczowe endogenne kompleksy mitofagii w pierwotnych ludzkich komórkach beta trzustki i liniach komórkowych neuronów, a także zademonstrować wpływ środowiska cukrzycowego na szlak mitofagii¹. Podsumowując, nadrzędnym celem tego protokołu jest analiza specyficznych kompleksów białkowych mitofagii w tkankach pozbawionych obfitego materiału lub tam, gdzie konwencjonalne badania interakcji białkowych nie są możliwe.

Użycie zanonimizowanych ludzkich wysp trzustkowych dawcy odbywa się na podstawie zwolnienia od Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) i jest zgodne z polityką IRB Uniwersytetu Michigan. Ludzkie wyspy trzustkowe zostały dostarczone przez sponsorowany przez NIH / NIDDK Zintegrowany Program Dystrybucji Wysp Trzustkowych (IIDP).

1. Przygotowanie próbki z ludzkich wysepek

1. Dysocjacja pojedynczych komórek
   1. Hodowla próbek ludzkich wysp trzustkowych (4000–6000 ekwiwalentów wysp trzustkowych/10 ml pożywki) przez co najmniej 1 dzień w temperaturze 37 °C w pożywce trzustkowej (PIM(S)) uzupełnionej 1 mM glutaminy (PIM(G)), 100 jednostek/ml antybiotyku przeciwgrzybiczego, 1 mM pirogronianu sodu i 10 % płodowej surowicy bydlęcej (FBS) lub ludzkiej surowicy AB.
   2. Użyj mikroskopu mikroskopu mikroskopowego o 3-krotnym powiększeniu, aby policzyć poszczególne ludzkie wysepki z hodowli. Pobrać 40 wysepek na zabieg/stan zainteresowania (taki jak glukoliotoksyczność) do probówek o pojemności 1,5 ml w pożywce z wysp trzustkowych.
   3. Odwirować wysepki przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C do osadu.
   4. Przepłukać próbki, przez krótkie odwrócenie probówek w temperaturze pokojowej, dwukrotnie 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) zawierającej 50 μM PR619 (inhibitor deubikwitynazy; w celu zachowania oddziaływań białkowych zależnych od ubikwityny), z odwirowaniem między każdym płukaniem przy 400 x g przez 1 minutę w temperaturze 10 °C.
   5. Dysocjuj wyspy trzustkowe na pojedyncze komórki za pomocą 125 μl 0,25% trypsyny zawierającej 50 μM PR619 poprzez inkubację wstępnie podgrzanej trypsyny (37 °C) przez 3 minuty z osadami wysp trzustkowych. W tym czasie delikatnie rozprowadzić wysepki, okresowo delikatnie pipetując za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
   6. Trypsynę ugasić 1 ml podgrzanej (37 °C) pożywki PIM(s) zawierającej 50 μM PR619, a następnie komórki osadu przez odwirowanie przy 400 x g przez 1 min.
   7. Przemyć komórki przez odwirowanie przy 400 x g przez 1 minutę, dwukrotnie, za pomocą PBS + 50 μM PR619.
   8. Na koniec ponownie zawieś komórki w 150 μl PBS zawierającym 50 μM PR619.
2. Przyleganie i utrwalanie pojedynczych komórek
   1. Po ponownym zamieszaniu odwirować roztwór komórek na oszronionych, naładowanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą cytowirówki o sile 28 x g przez 10 minut.
   2. Po cytowirowaniu obrysuj obszar komórkowy za pomocą pisaka hydrofobowego (patrz Tabela materiałów), aby zminimalizować potrzebne objętości roztworu przeciwciała/PLA. Utrwal komórki za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: PFA jest niebezpieczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie.
   3. Aby uzyskać najlepsze rezultaty, należy przeprowadzić barwienie/PLA natychmiast lub w ciągu 24 godzin. W razie potrzeby próbki należy przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do czasu barwienia nie dłużej niż 48 godzin.

2. Immunohistochemia

1. Blokowanie
   1. Umyj komórki dwukrotnie 1x PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Roztwór komórek blokowych, w celu wyeliminowania barwienia tła, z 10% surowicą osła w PBS zawierającą 0,3% detergentu (patrz Tabela Materiałów) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Barwienia
   1. Inkubować komórki z pierwotnymi przeciwciałami mysimi lub króliczymi przeciwko odpowiednio USP8 (1:250) i NRDP1 (1:250) (patrz tabela materiałów) rozcieńczonymi w buforowanym fosforanie soli fizjologicznej z detergentem (PBT, patrz tabela materiałów), w temperaturze 4 °C przez noc, w celu wykrycia sygnalizacji kompleksu mitofagii przez PLA.
   2. Współinkubuj komórki z markerem specyficznym dla identyfikacji komórek beta, który nie był hodowany u myszy lub królika, aby nie zakłócać sygnału PLA. W tym przypadku inkubuj komórki z anty-kozim PDX1 (1:500) w PBT. Inkubować wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe przez noc w temperaturze 4 °C, używając folii z tworzywa sztucznego na wierzchu roztworu, aby zapobiec parowaniu.

3. Test ligacji zbliżeniowej

1. Sonda PLA i przeciwbarwienie
   1. Przygotować roztwór sondy PLA zgodnie z instrukcjami producenta, tj. przygotować 20 μl roztworu sondy na próbkę, przygotowując końcowe stężenie roztworu sondy 1:5 zarówno anty-myszy, jak i anty-królika w PBT i inkubując przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Po całonocnej inkubacji umyj komórki dwukrotnie 1x PBS przez 5 minut każda, na kołysce.
   3. Tuż przed inkubacją z roztworem sondy dodać wtórny anty-kozi Cy5 o końcowym stężeniu 1:600 do roztworu sondy (w celu wykrycia endogennego PDX1). Dodać 20 μl roztworu sondy do każdej komórki, delikatnie przykryć folią z tworzywa sztucznego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
2. Ligacji
   1. Umyj komórki dwukrotnie, w temperaturze pokojowej, buforem A (przepis znajduje się w Tabeli Materiałów) przez 5 minut każda, na kołysce.
   2. Przygotować roztwór do ligacji (część odczynników wykrywających, patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. W tym celu rozcieńczyć podwiązanie (5x) w stosunku 1:5 w wodzie uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). Bezpośrednio przed inkubacją dodać 0,025 U/ml ligazy. Dodać 20 μl roztworu do ligacji do komórek. Przykryć folią z tworzywa sztucznego i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
3. wzmocnienie
   1. Umyj komórki dwukrotnie w temperaturze pokojowej z buforem A przez 2 minuty każda.
   2. Przygotować roztwór do amplifikacji (część odczynników do wykrywania, patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć bufor wzmacniający (5x) 1:5 w wodzie uzdatnionej DEPC i przechowywać w ciemności do momentu użycia. Dodać rozcieńczenie polimerazy w stosunku 1:80 (część odczynników wykrywających, patrz tabela materiałów) do roztworu bezpośrednio przed dodaniem roztworu do komórek.
   3. Dodać 20 μl roztworu amplifikacyjnego do komórek. Przykryj folią z tworzywa sztucznego i umieść w ciemności w temperaturze 37 °C na okres od 1 godziny, 40 minut do 2 godzin, aby uzyskać maksymalny sygnał.
4. Przygotowanie do obrazowania
   1. Umyć komórki dwukrotnie buforem B (przepis znajduje się w Tabeli Materiałów) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, na kołysce.
   2. Na koniec umyj komórki raz w 0,01x buforze B, przez 2 minuty w temperaturze pokojowej na bujaku.
   3. Mocować próbki, dodając kroplę podłoża montażowego zawierającego 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) i ostrożnie umieszczając szkiełko nakrywkowe na próbkach za pomocą ostrza skalpela w celu wyciśnięcia wszelkich powstałych pęcherzyków. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci na krawędziach.
   4. Próbki obrazu na mikroskopie zdolnym do uchwycenia wielu płaszczyzn ogniskowych, takim jak laserowy skaningowy mikroskop konfokalny lub odwrócony mikroskop fluorescencyjny z możliwością dekonwolucji, wykonujący co najmniej 9 różnych obrazów płaszczyzny ogniskowej.
      1. Rejestruj obrazy w 100-krotnym powiększeniu, z wysokością stosu z około 0,45 μm. Wychwytywanie PLA przy wzbudzeniu 550 nm, emisja 570 nm; przeciwbarwienie przy wzbudzeniu 650 nm, emisja 670 nm; i DAPI przy wzbudzeniu 405 nm, emisji 450 nm.
   5. Aby zapewnić zminimalizowanie sygnałów tła obrazu fluorescencyjnego i światła rozproszonego na potrzeby dalszej analizy zdarzeń PLA (zwłaszcza w mikroskopach szerokokątnych), należy przetwarzać obrazy przy użyciu dwuwymiarowego algorytmu dekonwolucji (najbliższego sąsiada) za pomocą standardowego oprogramowania do przetwarzania obrazu.
      UWAGA: W przypadku Olympusa użyj CellSens, Nikon użyj NIS-Elements, Leica użyj LAS X, Zeiss - ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, a także kilku wtyczek dostępnych za pośrednictwem Image-J. W celu analizy, całkowita liczba interakcji we wszystkich stosach z powinna być analizowana za pomocą oprogramowania Image-J, upewniając się, że analizowane są tylko komórki Pdx-1 dodatnie (sekcja 3.5).
5. Kwantyfikacja oddziaływań PLA
   1. Otwórz darmową aplikację Image-J i otwórz obraz PLA. Zacznij od pierwszego, ostro ostrego obrazu PLA.
   2. Kliknij kartę obrazu i wybierz dostosuj, a następnie próg (Rysunek 1A). Dostosuj próg, aby usunąć cały niespecyficzny sygnał PLA, zanotuj korektę progu i staraj się zachować spójność przez cały czas analizy.
   3. Kliknij kartę procesu i wybierz binarny, a następnie utwórz binarny (Rysunek 1B). Użyj obrazu binarnego do pomiaru cząstek, klikając zakładkę "analizuj" i naciskając analizuj cząstki (Rysunek 1C).
   4. Na potrzeby analizy upewnij się, że ustawienia są następujące: Rozmiar = 0–Nieskończoność, Okrągłość = 0–1,0, Pokaż = Kontury, pola wyboru Wyświetl wyniki i Wyczyść wyniki (Rysunek 1D). Kliknij przycisk OK. Zwróć uwagę na liczbę analizowanych cząstek w arkuszu kalkulacyjnym oznaczającą próbkę i pozycję stosu z.
   5. Powtarzaj kroki 3.5.2–3.5.4, aż wszystkie ostre stosy z dla próbki zostaną przeanalizowane. Zsumuj całkowitą liczbę cząstek w próbce w arkuszu kalkulacyjnym, aby określić ilościowo całkowitą liczbę interakcji.

Przeprowadziliśmy wstępne eksperymenty na linii komórkowej beta trzustki MIN6 i linii komórkowej nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y, aby zoptymalizować i potwierdzić zarówno specyficzność przeciwciał, jak i wizualizowane interakcje białek. Komórki MIN6 posiewano na szkiełkach nakrywkowych w ilości 30 000 komórek/ml i pozostawiano do przylegania przez 48 godzin, komórki SH-SY5Y posiewano na szkiełkach nakrywkowych w ilości 15 000 komórek/ml i pozostawiono do przylegania na 24 godziny. Następnie zastosowano protokół PLA, jak powyżej, zaczynając od kroku 1.2.3. Aby zapewnić specyficzność sygnałów PLA, najpierw przeprowadziliśmy to podejście w obecności (i) braku przeciwciała pierwszorzędowego (Figura 2A, Figura 3A), (ii) samo przeciwciało NRDP1 (Figura 2B, Figura 3B), (iii) samo przeciwciało USP8 ( Figura 2C, Figura 3C) oraz (iv) zarówno przeciwciała NRDP1, jak i USP8 ( Rysunek 2D, Rysunek 3D). Dla ułatwienia konfiguracji próby, Tabela 1 opisuje, jak prawidłowo rozmieścić kontrole eksperymentalne. Warto zauważyć, że nie obserwujemy punktowego sygnału PLA w pojedynczym przeciwciałie pierwszorzędowym ani żadnych warunków kontroli przeciwciał pierwszorzędowych, potwierdzając w ten sposób, że interakcje in situ są specyficznie obserwowane między NRDP1 i USP8 w obecności obu przeciwciał pierwszorzędowych, zarówno w komórkach MIN6, jak i SH-SY5Y.

Następnie dostosowaliśmy to podejście do stosowania z ludzkimi wyspami trzustkowymi, aby analizować interakcje kompleksu mitofagii, szczególnie w pierwotnych ludzkich komórkach beta. Ludzkie wysepki składają się z niejednorodnej populacji funkcjonalnie odrębnych komórek, w tym komórek alfa, beta, delta i komórek PP9. W przeciwieństwie do mysich wysp trzustkowych, w których komórki beta stanowią ~80% masy wysp trzustkowych, komórki beta obejmują proporcjonalnie mniejszy zakres w ludzkich wyspach trzustkowych (między 28-75%)10,11,12. W związku z tym staraliśmy się wykorzystać technologię PLA, aby umożliwić nam obserwację obecności kompleksów mitofagii NRDP1-USP8 szczególnie w komórkach beta i upewnić się, że nie zaobserwujemy mylących obserwacji z innych typów komórek wysp trzustkowych (które mogą wystąpić w badaniach koimmunoprecypitacji lizatów wysp trzustkowych). Dlatego ważne jest, aby zapewnić odpowiednie i równomierne rozproszenie wysp trzustkowych do takiego poziomu, aby pojedyncze komórki można było łatwo rozróżnić i poddać dalszej analizie. Jak widać na Rysunek 4, protokół dyspersji (sekcja 1) jest bardzo skuteczny w zapewnianiu pojedynczych komórek w polu widzenia mikroskopu do dalszej analizy. Aby zidentyfikować komórki beta, przeprowadziliśmy barwienie za pomocą surowic odpornościowych specyficznych dla PDX1 podczas procesu PLA. PDX1 jest istotnym czynnikiem transkrypcyjnym specyficznym dla komórek beta, który znajduje się w dojrzałych komórkach beta produkujących insulinę, głównie w jądrze13. Barwienie PDX1 zostało zachowane po NRDP1: USP8 PLA w pierwotnych ludzkich wysepkach (Ryc. 4). Co ważne, użyliśmy surowic anty-PDX1 kozy, aby uniknąć reaktywności krzyżowej z pierwszorzędowymi przeciwciałami stosowanymi do PLA (odpowiednio królicze anty-NRDP1 i mysie anty-USP8). Tak więc dodanie barwienia przeciwstawnego PDX1 pozwala na specyficzną ocenę endogennych kompleksów mitofagii w pierwotnych ludzkich komórkach beta.

Korzystając z tych metod, możemy skompilować migawkę retencji kompleksu mitofagii NRDP1:USP8, aby wywnioskować kompetencję szlaku mitofagii w komórkach beta. Aby rozszerzyć to podejście do stosowania w warunkach środowiskowych naśladujących cukrzycę typu 214, potraktowaliśmy linie komórek beta i pierwotne ludzkie wyspy trzustkowe palmitynianem i wysokim poziomem glukozy w celu wywołania glukoliotoksyczności. Rzeczywiście, stwierdziliśmy, że interakcja NRDP1 i USP8 została zmniejszona po 48-godzinnej ekspozycji na palmitynian i wysoki poziom glukozy w obu liniach komórek beta, a także w pierwotnych ludzkich komórkach beta przez PLA (Rysunek 5 i odniesienie1). Wynik ten podkreśla wykonalność tego testu do oceny kluczowych endogennych czynników mitofagii po bodźcach cukrzycowych.

Rysunek 1: Proces analizy obrazu J w celu ilościowego określenia oddziaływań PLA. W tym miejscu przedstawiono ważne etapy analizy. (A) Regulacja progu obrazu w celu zapewnienia specyficznej analizy sygnału PLA. (B) Konwersja obrazu na dane binarne w celu umożliwienia łatwej kwantyfikacji. (C-D) Jak sfinalizować analizę, analizując cząstki rozpoznawane przez oprogramowanie ImageJ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2: NRDP1 i USP8 specyficznie oddziałują w komórkach beta trzustki. Pokazano obrazy w dużym powiększeniu (100x) linii komórkowej trzustki myszy, MIN6. (A-D) Sygnał PLA dla oddziaływania NRDP1:USP8 jest pokazany na czerwono, a jądra są oznaczone przez DAPI na niebiesko. (A-C) Nie obserwuje się specyficznego sygnału punktowego dla interakcji NRDP1: USP8, jeśli zarówno (A), jak i jedno (B, C) z pierwotnych przeciwciał białkowych zostanie pominięte podczas procesu PLA. Jednak interakcja obu białek jest widoczna przez PLA w komórkach beta trzustki (D), gdy oba przeciwciała są włączone. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: NRDP1 i USP8 specyficznie oddziałują w komórkach nerwiaka zarodkowego. Pokazano obrazy w dużym powiększeniu (100x) ludzkiej linii komórkowej nerwiaka zarodkowego, SH-SY5Y. (A-D) Sygnał PLA dla oddziaływania NRDP1:USP8 jest pokazany na czerwono, a jądra są oznaczone przez DAPI na niebiesko. (A-C) Nie obserwuje się specyficznego sygnału punktowego dla interakcji NRDP1: USP8, jeśli zarówno (A), jak i jedno (B, C) z pierwotnych przeciwciał białkowych zostanie pominięte podczas procesu PLA. Jednak oddziaływanie obu białek jest widoczne przez PLA (D), gdy oba przeciwciała są włączone. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Kompleksy mitofagii komórek beta można zidentyfikować w pierwotnych ludzkich wyspach trzustkowych in situ za pomocą PLA. Wyświetlane są obrazy rozproszonych ludzkich wysepek w dużym powiększeniu (100x). Pojedyncze komórki są wyznaczane przez barwienie jądrowe za pomocą DAPI (niebieski), komórki beta obserwuje się za pomocą barwienia PDX1 (magenta), a kompleksy mitofagiczne można zobaczyć zarówno w komórkach beta, jak i komórkach niebeta (czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Kompleks mitofagii NRDP1: USP8 jest destabilizowany w komórkach beta przez glukoliotoksyczność.
Pokazane są obrazy o dużym powiększeniu (100x) komórek MIN6 traktowanych przez 48 godzin kontrolą (25 mM glukozy + 0,82% BSA) lub wysoką glukozą + palmitynianem (25 mM glukozy + 0,4 mM palmitynianu/0,82% BSA). Punkty A-B) Sygnał PLA (NRDP1:USP8) jest obserwowany w obu grupach leczenia. Sygnał PLA zmniejsza się w komórkach beta MIN6 po glukoliotoksyczności (B) w porównaniu z kontrolami (A). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przykładowy projekt eksperymentalny.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.