Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59400

⸱

5 kwietnia 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Molecular Medicine and Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

Ten test zabijania opsonofagocytarnego służy do porównywania zdolności komórek odpornościowych fagocytarnych do reagowania i zabijania bakterii w oparciu o różne metody leczenia i/lub warunki. Klasycznie test ten służy jako złoty standard do oceny funkcji efektorowych przeciwciał podniesionych przeciwko bakterii jako opsonina.

Streszczenie

Kluczowym aspektem odpowiedzi immunologicznej na bakteryjną kolonizację gospodarza jest fagocytoza. Test zabijania opsonofagocytarnego (OPKA) to procedura eksperymentalna, w której komórki fagocytarne są hodowane wspólnie z jednostkami bakteryjnymi. Komórki odpornościowe będą fagocytozę i zabijać kultury bakteryjne w sposób zależny od dopełniacza. Skuteczność zabijania komórek za pośrednictwem układu odpornościowego zależy od wielu czynników i może być wykorzystana do określenia, jak różne kultury bakteryjne wypadają w porównaniu z odpornością na śmierć komórki. W ten sposób można ocenić skuteczność potencjalnych terapii opartych na odporności w stosunku do określonych szczepów bakterii i/lub serotypy. W tym protokole opisujemy uproszczony OPKA, który wykorzystuje podstawowe warunki hodowli i zliczania komórek w celu określenia żywotności komórek bakteryjnych po jednoczesnej hodowli z warunkami leczenia i komórkami odpornościowymi HL-60. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w przypadku wielu różnych serotypów pneumokoków, szczepów otoczkowych i torebkowych oraz innych gatunków bakterii. Zaletami tego protokołu OPKA są jego prostota, wszechstronność (ponieważ test ten nie ogranicza się do leczenia przeciwciałami jako opsoninami) oraz minimalizacja czasu i odczynników do oceny podstawowych grup eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Test zabijania opsonofagocytarnego (OPKA) jest kluczowym narzędziem do łączenia zmian w strukturze lub funkcji bakterii z późniejszymi zmianami w odpowiedzi immunologicznej i funkcji. W związku z tym jest często stosowany jako test uzupełniający w celu określenia odpornościowej skuteczności leczenia przeciwciałami, kandydatów na szczepionki, optymalizacji enzymów itp. Podczas gdy testy in vivo są niezbędne do określenia skutecznego klirensu lub ochrony w modelu infekcji bakteryjnej, OPKA może być używany do oceny wkładu immunologicznego w śmierć komórek bakteryjnych w najbardziej podstawowych składnikach: bakteriach, komórkach odpornościowych i eksperymentalnych terapiach. Wcześniejsze badania wykazały, że OPKA mogą być modyfikowane i stosowane w przypadku różnych bakterii i serotypów, w tym Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3. Co więcej, te zoptymalizowane testy mogą być wykorzystane do oceny różnych eksperymentalnych metod leczenia, w tym zdolności enzymu do uczynienia bakterii bardziej dostępnym dla komórek odpornościowych za pośrednictwem dopełniacza4 oraz leczenia przeciwciałami w celu poprawy opsonizacji5. Klasycznie test OPKA jest z powodzeniem stosowany w badaniach podstawowych i klinicznych jako potężny wskaźnik ochrony indukowanej przez przeciwciała specyficzne dla patogenu6,7,8,9.

Różne typy komórek odpornościowych mogą być używane do oceny zabijania opsonofagocytarnego. Jedną z powszechnie stosowanych populacji fagocytarnych jest ludzka linia komórkowa białaczki HL-60. Ta linia komórkowa może być utrzymywana w hodowli jako inaktywowane promielocyty; Mogą one jednak być zróżnicowane w różne stany aktywowane poprzez różne terapie farmakologiczne10,11. Traktowanie HL60 N,N-dimetyloformamidem różnicuje linię komórkową w aktywowane neutrofile o silnej aktywności fagocytarnej11. Podczas gdy komórki HL-60 zostały zoptymalizowane i są często używane do tych testów fagocytozy10, inne pierwotne leukocyty wielojądrzaste mogą być używane jako ramię immunologiczne eksperymentu12.

Dodatkowo, te testy można uprościć13 lub multiplexed14, aby przyjrzeć się wielu opornym na antybiotyki szczepom bakterii, które mają być testowane. Metoda multipleksowa stała się bardziej wykonalna dzięki opracowaniu oprogramowania, które może skutecznie zliczać jednostki tworzące kolonie bakteryjne (CFU) na miejsce na płytce agarowej15. Tutaj opisujemy uproszczoną metodę wykorzystującą jeden szczep bakterii, komórki HL-60, dopełniacz małego królika i płytki z agarem z krwią. Dzięki tej metodzie można szybko ocenić wiele metod leczenia, aby odpowiedzieć na konkretne pytania badawcze dotyczące tego, w jaki sposób można modulować wrodzoną odpowiedź immunologiczną na infekcję bakteryjną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla, różnicowanie i walidacja komórek HL-60

  1. Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych HL-60 składającą się z 500 ml RPMI z L-glutaminą i 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej. Nie należy dodawać antybiotyków, ponieważ może to wpływać na różnicowanie komórek HL-60.
  2. Do rozmnażania/utrzymania komórek HL-60 należy hodować 5 x 106 komórek w 10 ml pożywki do hodowli komórek HL-60 w kolbach wentylowanych o długości 75 cm2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Pasaż komórek co 3-4 dni, aby utrzymać optymalne stężenie komórek.
    nuta: Stężenie komórek nie powinno przekraczać 5 x 106/ml.
  3. Generowanie zapasów roboczych komórek HL-60 poprzez porcjowanie około 1 x 106 komórek/ml w pożywce hodowlanej HL60 z 10% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) do probówek kriogenicznych o pojemności 1 ml.
    nuta: Zapas roboczy może być przechowywany w temperaturze -80 °C. Materiał wzorcowy należy przechowywać w temperaturze -120 °C.
  4. Różnicować komórki HL-60 poprzez hodowlę 1,5 x 107 komórek w 15 ml pożywki do hodowli komórek HL-60 z 0,6% N,N-dimetyloformamidem (DMF) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w sterylnych kolbach o średnicy 75 cm2 z filtrem przez 3 dni przed OPKA.
  5. Sprawdź, czy komórki HL-60 zostały pomyślnie zróżnicowane i są odpowiednie do użycia w teście OPKA, testując markery żywotności i powierzchni komórek zgodnie z ustalonymi protokołami cytometrii przepływowej16,17,18,19. Po różnicowaniu zbierz komórki HL-60 i wybarwij około 1 x 104 komórek fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami/barwnikami dla CD71, CD35, aneksyny V i jodku propidyny.
    nuta: Zróżnicowane komórki powinny mieć ≥65% żywotności, ≥55% CD35+ i ≤20% CD71+, zgodnie z ustalonymi protokołami walidacji14 (Rysunek 1).

2. Przygotowanie i odczynników OPKA

  1. Przygotuj 50 ml sterylnego buforu opsonizacyjnego B (OBB), mieszając 42,5 ml sterylnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z Ca2 + / Mg2+, 5 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i 2,5 ml 0,1% sterylnej żelatyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Zaopatrzyć się w uzupełnienie dla młodego królika i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Uzyskać lub przygotować płytki do hodowli bakterii (tj. 15 x 100 mm2 5% płytki agarowe z krwią owczą).

3. Przygotowanie próbek bakteryjnych

  1. Uzyskać zapas szczepu(-ów) bakteryjnego(-ych), który ma być poddany(-e) badaniu.
    nuta: W tym protokole stosuje się serotyp 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, hojnie dostarczony przez dr Moon Nahma).
  2. Hoduj szczep bakterii w odpowiednim bulionie (tj. bulionie Todda-Hewitta + 0,5% ekstraktu drożdżowego dla tego szczepu WU2) przez około 2−4 godziny w temperaturze 37 °C.
    nuta: Gęstość optyczna kultury przy 600 nm (OD600) powinna wynosić od 0,6 do 0,8.
  3. Osadzaj bakterie przez odwirowanie przy 6 000 x g przez 2 minuty i ponownie zawieś komórki w 10-30 ml 15% glicerolu w odpowiednim bulionie. Porcję kultury bakteryjnej (500 μl na podwielokrotność) przelać do sterylnych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Rozmrozić jedną fiolkę z wywarem bakteryjnym w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Osadzać komórki bakteryjne i ponownie zawijać w 500 μl OBB w sterylnych warunkach.
  5. Przygotować różne rozcieńczenia materiału bakteryjnego w OBB (tj. 10 μl bez rozcieńczenia, 10 μl z 1:10, 10 μl z 1:100 itd.). Wykonać test OPKA (sekcje 4–6, w tym kokultura HL-60/dopełniacza) zgodnie z opisem poniżej, używając różnych rozcieńczeń nieleczonego materiału bakteryjnego. Hodować płytki przez noc w temperaturze 30 °C (bez CO2 ).
    nuta: Temperatura 30 °C jest specyficzna dla WU2, aby zapobiec przerostowi; inne szczepy/serotypy mogą rosnąć optymalnie w temperaturze 37 °C.
  6. Policzyć kolonie dla każdego rozcieńczenia niepoddanego działaniu substancji bakteryjnej hodowanej jednocześnie z komórkami HL-60 i dopełniaczem. Określ, które rozcieńczenie bakterii daje optymalną liczbę policzalnych kolonii (około 80-120 CFU dla nieleczonych bakterii hodowanych wspólnie z komórkami HL-60). Należy zwrócić uwagę na to rozcieńczenie dla przyszłych OPKA zawierających ten szczep bakteryjny.

4. Leczenie i hodowla bakterii

  1. Rozmrozić jedną probówkę wywaru bakteryjnego przygotowanego w kroku 3.3. Bakterie w osadach (6 000 x g przez 2 min) i ponownie zawiesić osad komórkowy w OBB w optymalnym rozcieńczeniu, jak określono w kroku 3.6.
  2. Odpipetować 10 μl zawieszonego rozcieńczenia bakteryjnego na basenie na okrągłodennej 96-dołkowej płytce do hodowli komórek.
  3. Dodać 20 μl odpowiedniego przeciwciała lub leczenia farmakologicznego do każdej studzienki doświadczalnej w dwóch egzemplarzach.
    nuta: W tym protokole przeciwciało specyficzne dla serotypu wytworzone u myszy dodaje się jako leczenie X, a enzym hydrolazy glikozydowej, o którym wiadomo, że degraduje kapsułkę polisacharydową serotypu 3, dodaje się jako leczenie Y (Rysunek 2) < klasa sup = "xref">4,< klasa sup = "xref">20. W przypadku studzienek kontrolnych należy użyć 1x PBS lub OBB, w zależności od buforu używanego do studzienek leczniczych.
  4. Potrząsać płytką z próbką z prędkością około 90 obr./min przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Dostosuj te warunki w zależności od optymalnej temperatury lub warunków wstrząsania testowanych zabiegów.

5. Współkultura bakterii HL-60

  1. Przygotować komórki HL-60, zbierając zróżnicowane komórki HL-60, które są traktowane DMF trzy dni wcześniej (patrz krok 1.4) do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Osadzać komórki (500 x g, 3 min), wyrzucić supernatant i przemyć co najmniej 10 ml 1x PBS.
  2. Umyte komórki należy otopić (500 x g, 3 min), odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w OBB (zacząć od 1 ml OBB i dostosować do końcowego stężenia 1 x 107/ml po zliczeniu komórek).
  3. Dodać dopełniacz dla młodego królika (sterylna, nierozcieńczona surowica dla młodego królika, w wieku 3-4 tygodni) w końcowej objętości 1:5.
    nuta: Końcowe stężenie mieszaniny HL-60-dopełniacza powinno wynosić 1 x 107/ml. W przypadku badania zależności od dopełniacza można użyć drugiego roztworu zawierającego aktywne komórki HL-60 z inaktywowanym termicznie dopełniaczem (dopełniacz można inaktywować przez inkubację w łaźni wodnej w temperaturze >55 °C przez co najmniej 30 minut).
  4. Po zakończeniu 1-godzinnej hodowli bakteryjnej (etap 4.4) podzielić każdą próbkę (tj. 10 μl z każdej studzienki o pojemności 30 μl do dwóch nowych studzienek) do zduplikowanych studzienek dla dwóch grup (tj. użyć tylko 20 μl oryginalnej kokultury o pojemności 30 μl, aby uwzględnić błąd pipetowania): jeden zestaw będzie współhodowany z dopełniaczem HL-60, a jeden będzie zawierał tylko bakterie. Dodać 50 μl mieszaniny dopełniacza HL-60 (z kroku 5.3) do każdego zestawu studzienek doświadczalnych (delegowany +HL-60); dodać 50 μl samego OBB do samych studzienek bakterii (delegowane -HL-60).
    nuta: W tym przykładzie do początkowej kohodowli z 5 x 10 komórkami HL-60 o pojemności 5/50 μl wykorzystuje się około 800 bakteryjnych CFU. Jeśli ta wielokrotność infekcji jest zbyt wysoka lub zbyt niska, jak wskazują końcowe liczby kolonii, dostosuj początkowe rozcieńczenie bakterii w przeciwieństwie do liczby komórek HL-60.
  5. Wstrząsać 96-dołkową płytką w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę (bez CO2 ).

6. Posiewanie próbek i inkubacja przez noc

  1. Rozcieńczyć każdą studzienkę w stosunku 1:5 środkiem OBB, tak aby każda próbka miała objętość co najmniej 50 μl.
  2. Pobrać pipetą 50 μl każdej próbki bezpośrednio na wyznaczony obszar płytki do hodowli bakterii, zapewniając odpowiednie odstępy między próbkami. W przypadku okrągłych płytek agarowych o wymiarach 15 x 100 mmnależy odpipetować około 4 próbek na jedną płytkę.
  3. Przykryj próbki i pozostaw do wyschnięcia na około 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Odwrócić płytki i kulturę przez noc w temperaturze 30 °C (bez CO2 ). Alternatywnie, hodowla jest umieszczana na płytkach w słoikach beztlenowych, aby sprawdzić, czy warunki beztlenowe wpływają na wzrost bakterii lub kontrolować morfologię.
  5. Po całonocnej hodowli należy policzyć kolonie w każdym wyznaczonym obszarze próbki. Analizuj dane, porównując liczbę żywych komórek w każdym zestawie z odpowiednią kontrolą i/lub próbkami, które nie otrzymują kohodowli komórek HL-60 (wskazujące na 100% przeżycia komórek, 0% zabijania komórek).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Walidację różnicowania HL-60 należy przeprowadzić przed rozpoczęciem OPKA. Można to osiągnąć za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia zewnątrzkomórkowej ekspresji CD11b, CD35, CD71 oraz aneksyny V (Rysunek 1). Jako marker żywotności można również zastosować jodek propidyny. Po 3-dniowej inkubacji z DMF ekspresja CD35 powinna wzrosnąć (≥5% wszystkich komórek), a ekspresja CD71 powinna zmaleć (≤20% wszystkich komórek). Łączny procent komórek aneksyna V+ oraz jodek propidyny (PI+) po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

OPKA odgrywają zasadniczą rolę w ocenie odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez szczepienia za pośrednictwem przeciwciał 6,8. Głównym znaczeniem tego uproszczonego OPKA jest zdolność adaptacji w warunkach, które mają być badane (tj. przeciwciała, leczenie enzymatyczne itp.). W tym sensie, chociaż test ten może być wykorzystany do zbadania udziału opsonin (tj. przeciwciał) w fagocytozie, może być również wykorzystany do oceny sposobów przezwyciężenia czynników ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) za jego nieocenioną pomoc w ustanowieniu testów OPKA w naszym laboratorium. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health Grant 1R01AI123383-01A1 dla FYA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aneksyna V (sprzężona z APC)BioLegend640919
anty-CD35, ludzka (skoniugowana z PE)BioLegend333405
anty-CD71, ludzka (skoniugowana z PE)BioLegend334105
użycia (tj. Streptococcus pneumoniae, WU2)Referencyjne Laboratorium Bakteryjne Układu Oddechowego (Dr. Moon Nahm) 
płytki agarowe z krwiąHardy DiagnosticA10
Płodowa surowica klonówHyCloneSH30080.03
glicerolSigmaG9012-1L
Komórki HL-60ATCCCCL-240
Kontrola izotypu IgG (sprzężona PE)BioLegend400907
N,N-dimetyloformamid (DMF)Fisher ChemicznyUN2265
jodek propidynySigmaP4864
RPMI z L-glutaminąCorning10-040-CV
Szczep bakteryjny do

Bibliografia

  1. Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
  2. Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
  3. Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
  4. Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
  5. Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).
  6. Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
  7. Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
  8. Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
  9. Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
  10. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  11. Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
  12. Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
  13. Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
  14. Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
  15. Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
  16. Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).
  17. Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).
  18. Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).
  19. Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
  20. Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Różnicowanie komórek HL60fagocytoza bakteryjnaanaliza cytometrycznaStreptococcus pneumoniaezabijanie zależne od dopełniaczajednostki tworzące koloniekokultura komórek odpornościowychefekty leczenia lekamiocena eliminacji bakterii
Test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.