Ten test zabijania opsonofagocytarnego służy do porównywania zdolności komórek odpornościowych fagocytarnych do reagowania i zabijania bakterii w oparciu o różne metody leczenia i/lub warunki. Klasycznie test ten służy jako złoty standard do oceny funkcji efektorowych przeciwciał podniesionych przeciwko bakterii jako opsonina.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kluczowym aspektem odpowiedzi immunologicznej na bakteryjną kolonizację gospodarza jest fagocytoza. Test zabijania opsonofagocytarnego (OPKA) to procedura eksperymentalna, w której komórki fagocytarne są hodowane wspólnie z jednostkami bakteryjnymi. Komórki odpornościowe będą fagocytozę i zabijać kultury bakteryjne w sposób zależny od dopełniacza. Skuteczność zabijania komórek za pośrednictwem układu odpornościowego zależy od wielu czynników i może być wykorzystana do określenia, jak różne kultury bakteryjne wypadają w porównaniu z odpornością na śmierć komórki. W ten sposób można ocenić skuteczność potencjalnych terapii opartych na odporności w stosunku do określonych szczepów bakterii i/lub serotypy. W tym protokole opisujemy uproszczony OPKA, który wykorzystuje podstawowe warunki hodowli i zliczania komórek w celu określenia żywotności komórek bakteryjnych po jednoczesnej hodowli z warunkami leczenia i komórkami odpornościowymi HL-60. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w przypadku wielu różnych serotypów pneumokoków, szczepów otoczkowych i torebkowych oraz innych gatunków bakterii. Zaletami tego protokołu OPKA są jego prostota, wszechstronność (ponieważ test ten nie ogranicza się do leczenia przeciwciałami jako opsoninami) oraz minimalizacja czasu i odczynników do oceny podstawowych grup eksperymentalnych.
Wprowadzenie
Test zabijania opsonofagocytarnego (OPKA) jest kluczowym narzędziem do łączenia zmian w strukturze lub funkcji bakterii z późniejszymi zmianami w odpowiedzi immunologicznej i funkcji. W związku z tym jest często stosowany jako test uzupełniający w celu określenia odpornościowej skuteczności leczenia przeciwciałami, kandydatów na szczepionki, optymalizacji enzymów itp. Podczas gdy testy in vivo są niezbędne do określenia skutecznego klirensu lub ochrony w modelu infekcji bakteryjnej, OPKA może być używany do oceny wkładu immunologicznego w śmierć komórek bakteryjnych w najbardziej podstawowych składnikach: bakteriach, komórkach odpornościowych i eksperymentalnych terap....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla, różnicowanie i walidacja komórek HL-60
- Przygotuj pożywkę do hodowli komórkowych HL-60 składającą się z 500 ml RPMI z L-glutaminą i 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej. Nie należy dodawać antybiotyków, ponieważ może to wpływać na różnicowanie komórek HL-60.
- Do rozmnażania/utrzymania komórek HL-60 należy hodować 5 x 106 komórek w 10 ml pożywki do hodowli komórek HL-60 w kolbach wentylowanych o długości 75 cm2 w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Pasaż komórek co 3-4 dni, aby utrzymać optymalne stężenie komórek.
nuta: Stężenie komórek nie powinno przekracza....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Walidację różnicowania HL-60 należy przeprowadzić przed rozpoczęciem OPKA. Można to osiągnąć za pomocą cytometrii przepływowej w celu określenia zewnątrzkomórkowej ekspresji CD11b, CD35, CD71 oraz aneksyny V (Rysunek 1). Jako marker żywotności można również zastosować jodek propidyny. Po 3-dniowej inkubacji z DMF ekspresja CD35 powinna wzrosnąć (≥5% wszystkich komórek), a ekspresja CD71 powinna zmaleć (≤20% wszystkich komórek). Łączny procent komórek aneksyna V+ oraz jodek propidyny (PI+) po.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
OPKA odgrywają zasadniczą rolę w ocenie odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez szczepienia za pośrednictwem przeciwciał 6,8. Głównym znaczeniem tego uproszczonego OPKA jest zdolność adaptacji w warunkach, które mają być badane (tj. przeciwciała, leczenie enzymatyczne itp.). W tym sensie, chociaż test ten może być wykorzystany do zbadania udziału opsonin (tj. przeciwciał) w fagocytozie, może być również wykorzystany do oceny sposobów przezwyciężenia czynników .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) za jego nieocenioną pomoc w ustanowieniu testów OPKA w naszym laboratorium. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health Grant 1R01AI123383-01A1 dla FYA.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Aneksyna V (sprzężona z APC) | BioLegend | 640919 | |
| anty-CD35, ludzka (skoniugowana z PE) | BioLegend | 333405 | |
| anty-CD71, ludzka (skoniugowana z PE) | BioLegend | 334105 | |
| użycia (tj. Streptococcus pneumoniae, WU2) | Referencyjne Laboratorium Bakteryjne Układu Oddechowego (Dr. Moon Nahm) | ||
| płytki agarowe z krwią | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Płodowa surowica klonów | HyClone | SH30080.03 | |
| glicerol | Sigma | G9012-1L | |
| Komórki HL-60 | ATCC | CCL-240 | |
| Kontrola izotypu IgG (sprzężona PE) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimetyloformamid (DMF) | Fisher Chemiczny | UN2265 | |
| jodek propidyny | Sigma | P4864 | |
| RPMI z L-glutaminą | Corning | 10-040-CV |
Bibliografia
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
