$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Użyto zarchiwizowanego materiału mózgu zainfekowanego RABV, naprawionego przez PFA. Odpowiednie badania eksperymentalne na zwierzętach zostały ocenione przez komisję ds. opieki, użytkowania i etyki zwierząt Krajowego Urzędu ds. Rolnictwa, Bezpieczeństwa Żywności i Rybołówstwa w Meklemburgii-Pomorzu Przednim (LALFF M-V) i uzyskały zgodę z zezwoleniami 7221.3-2.1-002/11 (myszy) i 7221.3-1-068/16 (fretki). Ogólna opieka i metody stosowane w doświadczeniach na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi.
UWAGA: Ten protokół wykorzystuje różne toksyczne i/lub szkodliwe substancje, w tym PFA, metanol (MeOH), nadtlenek wodoru (H2O2), azydek sodu (NaN3), TBA, BA, BB i DPE. MeOH i TBA są wysoce łatwopalne. Unikaj narażenia, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne) i przeprowadzając eksperymenty w dygestorium. Odpady należy zbierać oddzielnie do odpowiednich pojemników i utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami. Wirus wścieklizny jest klasyfikowany jako patogen o poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL)-2 i dlatego może być zasadniczo traktowany w warunkach BSL-2. Niektóre działania, w tym procedury, które mogą generować aerozole, pracować z wysokimi stężeniami wirusów lub pracować z nowymi lyssawirusami, mogą wymagać klasyfikacji BSL-3. Profilaktyka przedekspozycyjna jest zalecana dla personelu wysokiego ryzyka, w tym opiekunów zwierząt i pracowników laboratoryjnych18,19. Zapoznaj się z przepisami władz lokalnych.
1. Utrwalenie tkanki mózgowej i sekcja
- Utrwalić próbki mózgu w odpowiedniej objętości 4% PFA w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS [pH 7,4]) przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 4 °C (z przybliżonym stosunkiem tkanki do utrwalacza 1:10 [v/v]).
- Próbki tkanek myć 3 razy w PBS przez co najmniej 30 minut przy każdym płukaniu i przechowywać je w 0,02% NaN3/PBS w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
- Pokrój tkankę na odcinki o grubości 1 mm za pomocą wibratomu (szybkość posuwu ostrza: 0,3–0,5 mm/s, amplituda: 1 mm, grubość warstwy: 1 000 μm).
- Aby zachować prawidłową sekwencję plastrów, przechowuj każdy fragment tkanki oddzielnie w studzience wielodołkowej płytki do hodowli komórkowej. Dodać 0,02% NaN3/PBS i przechowywać skrawki tkanek w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
2. Wstępna obróbka próbki metanolem
UWAGA: Wykonuj wszystkie etapy inkubacji z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Wstępna obróbka próbki służy ogólnemu celowi, jakim jest poprawa dyfuzji przeciwciał i zmniejszenie autofluorescencji tkanek poprzez ekspozycję na MeOH i H2O2 odpowiednio14.
- Przygotuj 20% (v/v), 40%, 60% i 80% roztwory MeOH w wodzie destylowanej. Na przykład, aby uzyskać 20% MeOH, dodaj 10 ml 100% MeOH do 40 ml wody destylowanej w odpowiednim szczelnym naczyniu i wymieszaj, odwracając je.
- Przenieść próbki do naczyń o odpowiedniej wielkości (np. probówek reakcyjnych o pojemności 5 ml). Zadbaj o to, aby używać materiałów odpornych chemicznie na odczynniki stosowane w tym protokole. Na przykład należy pamiętać, że podczas gdy polipropylen jest odpowiedni, polistyren nie.
UWAGA: Specyfikacje objętości w tym protokole odnoszą się do probówek reakcyjnych o pojemności 5 ml. Jeśli używane jest inne naczynie, odpowiednio dostosuj objętość.
- Inkubować próbki w 4 ml każdego stężenia przygotowanej serii roztworów MeOH w porządku rosnącym przez 1 godzinę każda.
- Inkubować próbki 2x przez 1 godzinę każda w czystym (100%) MeOH.
- Schłodzić próbki do temperatury 4 °C (np. w chłodziarce nadającej się do użytku laboratoryjnego).
- Przygotować roztwór wybielający (5%H2O2w MeOH), na przykład rozcieńczając 30% roztwór podstawowy H2O2 w stosunku 1:6 w czystym (100%) MeOH i schłodzić go w temperaturze 4 °C.
- Usunąć 100% MeOH ze schłodzonych próbek i dodać 4 ml wstępnie schłodzonego roztworu wybielającego (5% H2O2 w MeOH). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Roztwór wybielający należy wymienić na 4 ml 80% MeOH i inkubować przez 1 godzinę. Kontynuować stosowanie przygotowanych serii roztworów MeOH w porządku malejącym przez 1 godzinę każdy, aż próbki będą inkubowane przez 1 godzinę w 4 ml 20% MeOH.
- Przemyć próbki 1x przez 1 godzinę 4 ml PBS.
3. Barwienie immunologiczne
UWAGA: Wykonuj wszystkie etapy inkubacji z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Aby zapobiec rozwojowi drobnoustrojów, dodać NaN3 do końcowego stężenia 0,02% do roztworów w tej sekcji. Próbki tkanek są dodatkowo przepuszczalne przez obróbkę niejonowymi detergentami Triton X-100 i Tween 20. Normalna surowica służy do blokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał. Glicyna i heparyna są dodawane w celu zmniejszenia znakowania immunologicznego background14.
- Próbki przemyć 2x po 1 h w 4 ml 0,2% Triton X-100/PBS.
- Próbki należy przepuszczać przez 2 dni w temperaturze 37 °C za pomocą 4 ml 0,2% Triton X-100/20% DMSO/0,3 M glicyny/PBS.
- Zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał przez inkubację próbek przez 2 dni w temperaturze 37 °C w 4 ml 0,2% Triton X-100/10% DMSO/6% normalnej surowicy/PBS.
UWAGA: Użyj normalnej surowicy tego samego gatunku, w której wyhodowano przeciwciało drugorzędowe, aby osiągnąć idealne wyniki blokowania.
- Próbki inkubować w 2 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (3% normalna surowica/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 z heparyną] + pierwszorzędowe przeciwciało/przeciwciała) przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Odświeżyć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego po 2,5 dnia.
- W przypadku PTwH rozpuścić sól sodową heparyny w wodzie destylowanej w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 10 mg/ml (roztwór ten należy przechowywać w porcjach w temperaturze 4 °C). Dodać roztwór podstawowy do 0,2% Tween 20/PBS do końcowego stężenia 10 μg/mL.
UWAGA: Wybór odpowiedniego rozcieńczenia przeciwciał może wymagać optymalizacji. Ogólnie rzecz biorąc, dobrym punktem wyjścia są standardowe stężenia immunohistochemiczne .
- Próbki należy myć przez 1 dzień w 4 ml PTwH, wymieniając bufor do przemywania co najmniej 4–5 razy w ciągu dnia i pozostawiając końcowe płukanie na noc.
- Próbki inkubować w 2 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych (3% normalna surowica/PTwH + przeciwciało/przeciwciała drugorzędowe) przez 5 dni w temperaturze 37 °C. Odświeżyć roztwór przeciwciała drugorzędowego po 2,5 dnia.
- Rozcieńczyć drugorzędowe przeciwciało/przeciwciała w stosunku 1:500 w roztworze przeciwciała drugorzędowego (tj. 4 μl w 2 ml).
- Myj próbki przez 1 dzień, jak opisano w kroku 3.5, pozostawiając ostatnie mycie na noc.
4. Barwienie jądrowe
UWAGA: Wykonuj wszystkie etapy inkubacji z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Jeśli barwienie jądrowe nie jest wymagane lub długość fali wzbudzenia/widmo emisyjne TO-PRO-3 jest wymagane do wzbudzenia lub wykrycia innego fluoroforu, pomiń ten krok.
- Rozcieńczyć barwienie kwasem nukleinowym TO-PRO-3 w stosunku 1:1,000 w PTwH i inkubować próbki w 4 ml roztworu do barwienia jądrowego przez 5 godzin.
- Myć próbki przez 1 dzień zgodnie z opisem w kroku 3.5, pozostawiając końcowe płukanie na noc.
UWAGA: Po przemyciu próbki można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C do czasu oczyszczenia optycznego.
5. Oczyszczanie tkanek
UWAGA: Wykonuj wszystkie etapy inkubacji z delikatnymi oscylacjami i, jeśli nie wskazano inaczej, w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem. Próbki tkanek są odwadniane w stopniowanej serii roztworów TBA. Ponieważ barwienie immunologiczne wymaga roztworów wodnych, wszystkie procedury barwienia muszą zostać zakończone przed usunięciem tkanek. Dopasowanie klirensu optycznego i współczynnika załamania światła uzyskuje się poprzez leczenie mieszaniną BA, BB i DPE. Roztwór oczyszczający jest uzupełniony o DL-α-tokoferol jako przeciwutleniacz13.
- Przygotuj 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% i 96% roztwory TBA w wodzie destylowanej. Na przykład, aby uzyskać 30% TBA, dodaj 15 ml 100% TBA do 35 ml wody destylowanej w odpowiednim szczelnym naczyniu i wymieszaj przez odwrócenie.
UWAGA: TBA ma temperaturę topnienia 25–26 °C; W związku z tym ma tendencję do bycia stałym w temperaturze pokojowej. W celu przygotowania roztworów TBA należy podgrzać dobrze zamkniętą butelkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub łaźni wodnej.
- Odwodnić próbki po 4 ml każdego stężenia z przygotowanej serii roztworów TBA w porządku rosnącym przez 2 godziny każda. Pozostaw 96% TBA włączone na noc.
- Próbki należy dalej odwadniać w czystej (100%) TBA przez 2 godziny.
- Przygotować roztwór czyszczący BABB-D15.
UWAGA: BABB-D15 jest kombinacją BA i BB (BABB), która jest mieszana z DPE w stosunku x:1, gdzie x jest określone w nazwie roztworu, w tym przypadku 15.
- W przypadku BABB wymieszaj jedną część BA z dwiema częściami BB.
- Wymieszaj BABB i DPE w proporcji 15:1.
- Dodać 0,4% obj. DL-α-tokoferolu (witamina E).
UWAGA: Na przykład w przypadku 20 ml BABB-D15 wymieszaj 6,25 ml BA z 12,5 ml BB. Dodaj 1,25 ml DPE i uzupełnij go 0,08 ml DL-α-tokoferolu.
- Próbki należy oczyścić w roztworze klarującym, aż staną się optycznie przezroczyste (2–6 godzin).
- Próbki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C w BABB-D15, chronione przed światłem, do czasu montażu i obrazowania.
6. Przykładowy montaż
- Za pomocą drukarki 3D wydrukuj komorę obrazowania i pokrywę (materiał: kopoliester [CPE], dysza: 0,25 mm, wysokość warstwy: 0,06 mm, grubość ścianki: 0,88 mm, liczba ścianek: 4, wypełnienie: 100%, brak konstrukcji nośnej; odpowiednia . Plik STL można znaleźć w <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59402/3D_ImagingChamber.stl" target="_blank">Materiały uzupełniające tego protokołu).
- Zmontuj komorę obrazowania (rysunek 2).
- Zamontuj okrągłe szkiełko nakrywkowe (średnica: 30 mm) na komorze obrazowania z gumy silikonowej RTV-1 (jednoskładnikowa wulkanizacja w temperaturze pokojowej). Usuń nadmiar gumy silikonowej wacikiem zwilżonym wodą i utwardź przez noc.
- Zamontuj okrągłe szkiełko nakrywkowe (średnica: 22 mm) na wieczku z gumy silikonowej RTV-1. Usuń nadmiar gumy silikonowej wacikiem zwilżonym wodą i utwardź przez noc.
- Umieść próbkę w komorze obrazowania, dodaj niewielką objętość BABB-D15 i włóż pokrywkę. Napełnij komorę BABB-D15 przez wlot za pomocą igły podskórnej (27 G x 3/4 cala [0,40 mm x 20 mm]).
- Zatkać wlot i uszczelnić komorę obrazowania gumą silikonową RTV-1. Utwardzać przez noc w ciemności.
7. Obrazowanie i przetwarzanie obrazów
- Skonfiguruj akwizycję obrazu, wybierając odpowiednie linie laserowe, aby dopasować je do użytych fluoroforów. Dostosuj zakresy wykrywania każdego detektora, aby zapobiec nakładaniu się sygnału między kanałami.
UWAGA: Przykładowe zakresy wykrywania dla Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 i TO-PRO-3 wynoszą odpowiednio 500–550 nm, 590–620 nm i 645–700 nm.
- Wybierz parametry akwizycji, zdefiniuj górną i dolną granicę stosu z i pobierz stos obrazów.
UWAGA: Przykładowe parametry akwizycji to skan sekwencyjny o rozmiarze piksela 60-90 nm, rozmiarze kroku z 0,5 μm, średniej liniowej 1, prędkości skanowania 400 Hz oraz wielkości otworka 1 jednostki Airy.
- Przetwarzaj stos obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy obrazu (np. Fidżi) w celu wygenerowania projekcji 3D lub przeprowadzenia dogłębnych analiz.
UWAGA: Ze względu na duży rozmiar pozyskanych plików graficznych zwykle konieczne jest użycie stacji roboczej.
- Otwórz plik pobierania lub obrazu w Fidżi (punkt menu Plik | Otwórz | Wybierz pliki).
- Jeśli używasz, na przykład, . LIF zaznacz lub odznacz żądane opcje w oknie dialogowym Bio-Formats. Wyświetlanie stosu za pomocą programu Hyperstack. Poza tym nie są konieczne żadne konkretne wybory ani znaczniki. Naciśnij przycisk OK.
- Jeśli plik zawiera wiele stosów obrazów, wybierz te, które mają być analizowane i potwierdź, naciskając OK.
- Wykonaj korekcję wybielania, dzieląc scalony obraz na poszczególne kanały (punkt menu Obraz | Kolor | Narzędzie Kanały, a następnie wybierz Więcej | Podział kanałów). Dla każdego kanału wybierz korekcję wybielania (punkt menu Obraz | Dostosuj | Korekcja wybielacza) i wybierz Prosty współczynnik (intensywność tła: 0.0).
UWAGA: W niektórych przypadkach, na przykład, gdy nie ma liniowego zaniku sygnału lub sygnał jest ogólnie zbyt słaby, prosty współczynnik może się nie powieść. Możesz też wypróbować Exponential Fit lub pominąć korekcję wybielacza.
- Dostosuj jasność i kontrast dla każdego kanału za pomocą suwaków (punkt menu Obraz | Dostosuj | Jasność | Kontrast).
- Scalanie kanałów (Obraz | Kolor | Scal kanały), utwórz kompozyt (punkt menu Obraz | Kolor | Narzędzie Kanały, a następnie wybierz Więcej | Utwórz kompozyt) i przekonwertuj go na format RGB (Obraz | Kolor | Narzędzie Kanały, a następnie wybierz Więcej | Konwertuj na RGB).
- W razie potrzeby zmień rozmiar stosu obrazów, aby skrócić czas obliczeń i zmniejszyć rozmiar pliku (punkt menu Obraz | Dostosuj | Rozmiar, zaznaczone obie opcje plus interpolacja dwuliniowa).
- Generowanie rzutu 3D (punkt menu Obraz | Stosy | Projekt 3D). Wybierz Najjaśniejszy punkt jako metodę projekcji i ustaw odstępy między plasterkami tak, aby odpowiadały rozmiarowi kroku z uzyskanego stosu obrazów. Aby uzyskać maksymalną jakość, ustaw przyrost kąta obrotu na 1 i włącz interpolację. W razie potrzeby zmodyfikuj całkowity obrót, progi przezroczystości i krycie.
- W razie potrzeby dostosuj ponownie kontrast i jasność, konwertując projekcję 3D z powrotem na format 8-bitowy (punkt menu Obraz | Rodzaj | 8-bitowy). Użyj odpowiednich suwaków (punkt menu Obraz | Dostosuj | Jasność | Kontrast) i ponownie przekonwertuj stos obrazów na format RGB zgodnie z opisem w kroku 7.3.4.
- Zapisz projekcję 3D jako . Plik TIF (format pliku obrazu) i plik .AVI (format pliku wideo).