Badanie zmian w mikrobiocie kątnicy po urazowym uszkodzeniu mózgu u myszy

Podsumowanie

Przedstawiono tutaj protokół indukcji rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu za pomocą urządzenia do bocznego wkłuwania płynu, a następnie pobierania zawartości kątnicy do analizy mikrobiomu jelitowego.

Streszczenie

Coraz więcej dowodów pokazuje, że oś mikrobiota-jelito-mózg odgrywa ważną rolę w patogenezie chorób mózgu. Kilka badań wykazało również, że urazowe uszkodzenia mózgu powodują zmiany w mikrobiocie jelitowej. Jednak mechanizmy leżące u podstaw dwukierunkowej regulacji osi mózg-jelito pozostają nieznane. Obecnie istnieje niewiele modeli do badania zmian w mikrobiocie jelitowej po urazowym uszkodzeniu mózgu. W związku z tym prezentowane badanie łączy protokoły indukowania urazowego uszkodzenia mózgu za pomocą urządzenia do bocznego udrażniania płynu oraz analizę próbek kątnicy po urazie w celu zbadania zmian w mikrobiomie jelitowym. Zmiany w składzie mikrobioty jelitowej po urazowym uszkodzeniu mózgu określa się za pomocą sekwencjonowania 16S-rDNA. Protokół ten zapewnia skuteczną metodę badania związków między mikroorganizmami jelitowymi a urazowym uszkodzeniem mózgu.

Wprowadzenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) jest globalnym problemem zdrowia publicznego i główną przyczyną zgonów i niepełnosprawności u młodych dorosłych^1,2. TBI powoduje wiele zgonów każdego roku, a osoby, które przeżyły, doświadczają różnych niepełnosprawności fizycznych, psychicznych, emocjonalnych i poznawczych. W związku z tym TBI jest dużym obciążeniem dla rodziny pacjenta i zasobów społecznych. TBI obejmuje zarówno pierwotne uszkodzenie mózgu, które występuje w momencie urazu, jak i wszelkie wtórne uszkodzenia mózgu, które rozwijają się od kilku godzin do miesięcy po początkowym urazie. Wtórne uszkodzenie mózgu jest wywoływane przez kilka kaskad biochemicznych, które są nie tylko szkodliwe dla mózgu, ale także mają znaczący negatywny wpływ na różne układy narządów, w tym układ pokarmowy³.

Obecnie istnieją trzy modele wywoływania TBI w eksperymentach na zwierzętach: płynne uderzenie w korę mózgową, kontrola wpływu kory mózgowej (CCI) i przyspieszenie spadku wagi. Boczne uszkodzenie płynu udarowego (LFPI) jest najczęściej używanym modelem do ustalenia rozlanego uszkodzenia mózgu (DAI)⁴. Urządzenie powoduje uszkodzenie mózgu poprzez kraniektomię poprzez zastosowanie krótkiego impulsu ciśnienia płynu do nienaruszonej opony twardej. Impuls ten powstaje w wyniku uderzenia wahadła. LFPI to powtarzalna i kontrolowana metoda modelowania do badań TBI.

Mikrobiom jest zdefiniowany jako zbiorowe genomy wszystkich mikroorganizmów rezydujących w ludzkim ciele. W szczególności mikroorganizmy jelitowe nie tylko odgrywają ważną rolę w homeostazie i funkcjonowaniu jelit, ale także regulują wiele aspektów fizjologii gospodarza i funkcjonowania innych narządów⁵. W ostatnich latach pojawia się coraz więcej dowodów wskazujących na to, że mikrobiota jelitowa reguluje rozwój i funkcjonowanie mózgu poprzez osie mózgowo-jelitowe⁶. Zaburzenia mikrobioty jelitowej są powiązane z kilkoma zaburzeniami funkcji mózgu, w tym chorobą Parkinsona, zaburzeniami nastroju i autyzmem⁷. Niedawne badania przedkliniczne wykazały również, że ostre uszkodzenie mózgu może wywoływać zmiany w mikrobiocie jelitowej^8,9.

Badanie przeprowadzone przez Treangen et al.¹⁰ wykazało znaczące spadki u trzech gatunków drobnoustrojów i wzrost u dwóch gatunków drobnoustrojów po TBI wywołanym przez CCI. Dowody te wskazują, że modulacja mikrobioty jelitowej może być metodą terapeutyczną w leczeniu TBI. Jednak mechanizmy leżące u podstaw zmian mikrobioty jelitowej wywołanych uszkodzeniem mózgu pozostają nieznane. Z tego powodu potrzebny jest stosunkowo prosty i skuteczny model badania zmian w mikrobiocie jelitowej po TBI. W związku z tym w niniejszym badaniu przedstawiono protokół badania zmian w mikrobiocie jelitowej po TBI u myszy.

Protokół

Wszystkie przeprowadzone procedury zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Zhejiang. Wszystkie narzędzia i materiały używane w chirurgii są sterylne. Proces TBI trwa około 20 minut.

1. Opieka nad zwierzętami

1. W tym eksperymencie użyj 5- do 6-tygodniowych samców myszy C57BL/6J (20-25 g wagi).
2. Utrzymuj myszy w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności i upewnij się, że otrzymują jedzenie i wodę ad libitum. Zapewnij takie same ilości jedzenia i wody zarówno grupie pozorowanej, jak i TBI przez cały czas trwania badania.
3. Dołoż wszelkich starań, aby zminimalizować ból i dyskomfort zwierzęcia.

2. Indukcja urazowego uszkodzenia mózgu

1. Wstrzyknąć ketaminę (80-100 mg/kg)/ksylazynę (10 mg/kg) IP do znieczulenia. Przetestuj głębokość znieczulenia za pomocą odruchu wzrokowego lub odruchu bólowego. Używaj sztucznych łez lub nawilżającej maści do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
2. Po znieczuleniu ułóż mysz w pozycji leżącej. Użyj poduszki grzewczej o kontrolowanej temperaturze, aby utrzymać temperaturę 37 °C podczas zabiegu i przez 30 minut po TBI.
3. Ogol włosy w miejscu nacięcia.
4. Zdezynfekuj skórę głowy 70% etanolem za pomocą trzech naprzemiennych peelingów, a następnie nacinaj skórę głowy w płaszczyźnie strzałkowej.
5. Użyj kleszczy, aby cofnąć nacięcie po obu stronach i lekko oddzielić okostną.
6. Za pomocą markera narysuj okrąg (o średnicy 3 mm) w prawej okolicy ciemieniowej czaszki, w odległości 2 mm od linii środkowej.
7. Wywierć czaszkę wiertarką elektryczną. Upewnij się, że ten krok jest wykonywany ostrożnie, aby chronić oponę twardą przed uszkodzeniem.
8. Usuń płat kostny i odsłoń małe okienko kostne (o średnicy 3 mm).
9. Umieść plastikową kaniulę (średnica wewnętrzna = 2,5 mm, długość = 8 mm) nad kraniotomią i przymocuj kaniulę do czaszki za pomocą akrylu dentystycznego.
10. Napełnij kaniulę sterylnym 0,9% NaCl (sól fizjologiczna) za pomocą strzykawki (5 ml), aby upewnić się, że w kaniuli nie ma pęcherzyków.
11. Włącz oscyloskop i amplifier i upewnij się, że rurka wysokociśnieniowa urządzenia do bocznego uszkodzenia udaru płynem (LFPI) jest wolna od pęcherzyków powietrza. Przetestuj urządzenie, dostarczając około 10 impulsów, aż da stały sygnał. Dostosuj kąt położenia początkowego wahadła, aby osiągnąć intensywność impulsu około 2.0 atm.
12. Podłącz kaniulę urazową do urządzenia LFPI. Wywołaj uszkodzenie mózgu, pociągając za spust i zwalniając wahadło. Następnie uzyskaj impuls i prześlij go do opony twardej przez cały zamknięty system rurek wypełnionych płynem.
13. Operuj myszy w grupie pozorowanej za pomocą tej samej procedury chirurgicznej. Nie wykonuj LFPI.

3. Leczenie pooperacyjne

1. Po wywołaniu urazu mózgu należy zdjąć plastikową kaniulę i zszyć nacięcie. Podczas zabiegu należy podawać buprenorfinę (2 mg/kg) SQ lub IP, a następnie co 6-12 godzin przez trzy dni.
2. Połóż mysz na poduszce grzewczej, aż będzie gotowa do chodzenia. Ustaw temperaturę poduszki grzewczej na 37 °C, aby przyspieszyć resuscytację anestezjologiczną.
3. Umieść mysz z powrotem w klatce i podawaj jedzenie i wodę ad libitum.

4. Laparotomia i pobranie próbki z kątnicy

1. Poddaj myszy eutanazji za pomocą CO₂ , a następnie zwichnięcia szyjki macicy w odpowiednich punktach czasowych.
   UWAGA: W tym eksperymencie wybrano punkty czasowe 1 h, 6 h, 1 d, 3 d i 7 d pourazowego uszkodzenia mózgu, aby przeanalizować dynamiczną ewolucję mikrobioty jelitowej.
2. Usuń włosy z powierzchni brzucha. Zdezynfekuj brzuch 70% etanolem.
3. Umieść sterylną serwetkę na myszy. Wykonaj nacięcie od linii środkowej dolnej części brzucha, tuż nad napletkiem u samców myszy.
4. Po odsłonięciu jelit zlokalizuj jelito ślepe i delikatnie oddziel je od innych przewodów jelitowych. Unikaj chwytania jelita ślepego ząbkowanymi lub ostrymi kleszczami. Używaj kleszczy atraumatycznych, takich jak kleszcze Adson z ząbkami.
5. Wytnij kątnicę ostrymi nożyczkami.
6. Zawartość jelita ślepego należy ręcznie wyekstrahować na sterylny opatrunek i przechowywać w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
7. Zawartość jelita ślepego należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy mikrobiomu.

5. Ekstrakcja DNA oraz sekwencjonowanie i analiza danych 16S-rDNA

1. Izolacja DNA z kału
   UWAGA: Do tego eksperymentu użyto dostępnego na rynku zestawu do izolacji DNA (Tabela Materiałów).
   1. Za pomocą skalpela zeskrob 300 mg kału do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i umieść probówkę na lodzie.
   2. Dodać 1 ml buforu hamującego do każdej próbki. Wirować w sposób ciągły przez 1 minutę lub do momentu, gdy próbka kału zostanie dokładnie zhomogenizowana.
   3. Odwirować próbkę z maksymalną prędkością przez 1 minutę w celu osadzenia cząstek kału.
   4. Pobrać pipetą 2 μl proteinazy K do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Odmierzyć pipetą 600 μl supernatantu z kroku 5.1.3 do probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml zawierającej proteinazę K. Następnie dodaj 600 μl buforu 1 i wiruj przez 15 s.
   5. Inkubować próbkę w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
   6. Do lizatu dodać 600 μl 100% etanolu (w stosunku 1:1) i wymieszać przez wirowanie. Odwirować na krótko z maksymalną prędkością, aby usunąć krople z wnętrza pokrywy probówki.
   7. Nanieść 600 μl lizatu na kolumnę wirową. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 min. Odrzuć przepływ. Powtórz ten krok jeszcze raz. Następnie przenieść kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml.
   8. Otwórz kolumnę wirowania i dodaj 500 μl buforu 2. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 min. Wyjąć kolumnę i umieścić ją w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
   9. Dodać 500 μl buforu 3 do kolumny. Wirować z maksymalną prędkością przez 3 minuty. Odrzuć przepływ. Powtórz proces wirowania jeden raz, aby upewnić się, że bufor 3 jest całkowicie wymyty.
   10. Umieścić kolumnę wirową w nowej probówce o pojemności 2 ml i odpipetować 200 μl buforu 4 bezpośrednio na membranę. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę w celu wymycia DNA.
2. Sekwencjonowanie i analiza danych 16S-rDNA
   1. Użyj 20-30 ng DNA do wygenerowania amplikonów.
   2. Stosować komercyjnie dostępne startery przeznaczone dla stosunkowo konserwatywnych regionów graniczących z hiperzmiennymi regionami V3 i V4 bakterii 16S rDNA. W niniejszej pracy zastosowano startery do przodu zawierające sekwencję "CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT" oraz startery odwrotne zawierające sekwencję "GGACTACNVGGGTWTCTAATCC".
   3. Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR, dodając 2,5 μl buforu 1, 2 μl dNTP, 1 μl każdego startera, 0,5 μl polimerazy DNA i 20 ng matrycy DNA w probówce. Użyj ddH₂O, aby dostosować układ reakcyjny do 25 μL.
   4. Ustawić parametry reakcji PCR w następujący sposób: przeprowadzić wstępną denaturację w temperaturze 94 °C przez 3 minuty jeden raz. Przeprowadzić denaturację w temperaturze 94 °C przez 5 s, wyżarzanie w temperaturze 57 °C przez 90 s, przedłużyć w temperaturze 72°C przez 10 s i powtórzyć to 24 razy.
   5. Wykonaj sekwencjonowanie sparowanych końców PE250/300 zgodnie z instrukcją producenta i użyj pakietu do analizy danych QIIME do analizy danych 16S rRNA.
      UWAGA: W tym eksperymencie sekwencjonowanie DNA i analiza danych zostały wykonane głównie przez profesjonalną firmę zajmującą się sekwencjonowaniem.

Wyniki

Ustanowienie TBI jest pokazane w Rysunek 1. Po znieczuleniu i dezynfekcji skóra głowy została nacięta strzałkowo (Rysunek 1A). Kraniotomia (o średnicy 3 mm) została wprowadzona do trepanacji czaszki nad prawą korą ciemieniową za pomocą wiertła elektrycznego, opona twarda pozostała nienaruszona (Ryc. 1B,C). Plastikowa kaniula została umieszczona nad okienkiem kostnym i przycementowana do czaszki za pomoc...

Dyskusja

Przedstawiono prosty i skuteczny protokół określania zmian w mikrobiocie jelita ślepego po TBI u myszy. Indukcja uszkodzenia mózgu i pobranie próbek zawartości kątnicy są kluczowymi elementami protokołu.

Pomimo tego, że naukowcy badali zmiany mikrobioty jelitowej po TBI, uszkodzenie mózgu wykorzystane w tych badaniach to CCI-8 i modele wywołane spadkiem masy ciała/uderzeniem⁹. Jednak model CCI w większości replikuje stłuczenie mózgu, a model spad...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do izolacji DNA	QIAGEN	51604	Do szybkiego oczyszczania genomowego DNA z próbek kału
Usługa analizy genów	GENEWIZ		Usługa analizy genów
Poduszka grzewcza	Shanghai SAFE Biotech Co.	Wtryskiwacz poduszki grzewczej	TR-200
	Pierwszy stowarzyszony szpital, Szkoła Medyczna, Wtryskiwacz Uniwersytetu
Urządzenie LFPI	Virginia Commonwealth University	FP302	Urządzenie LFPI
Mikro wiertarka czaszkowa	RWD Life Science	78061	Mikro wiertło czaszkowe
Jod powidonu	Pierwszy stowarzyszony szpital, Szkoła Medyczna, Uniwersytet		Powidon Jod