Artykuł metodologiczny

Wykonywanie spektroskopii nanocząstek plazmonicznych za pomocą transmisyjnej mikroskopii kontrastowej interferencyjnej typu Nomarskiego

6.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59411

⸱

5 czerwca 2019

1Department of Chemistry and Biochemistry, Ohio University

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest szczegółowe przedstawienie sprawdzonego podejścia do przygotowania próbek plazmonicznych nanocząstek i przeprowadzenia na nich spektroskopii pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC).

Streszczenie

Mikroskopia kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) to potężne narzędzie do obrazowania, które jest najczęściej używane do obrazowania obiektów w mikroskali za pomocą światła widzialnego. Celem tego protokołu jest uszczegółowienie sprawdzonej metody przygotowywania próbek nanocząstek plazmonicznych i wykonywania na nich spektroskopii pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii DIC. Aby przeprowadzić powtarzalne eksperymenty spektroskopowe, należy dokładnie wykonać kilka ważnych kroków. Po pierwsze, punkty orientacyjne mogą być wytrawione w podłożu próbki, co pomaga w zlokalizowaniu powierzchni próbki i śledzeniu obszaru zainteresowania podczas eksperymentów. Następnie podłoże musi zostać odpowiednio oczyszczone z zanieczyszczeń i zanieczyszczeń, które w inny sposób mogłyby utrudnić lub zasłonąć badanie próbki. Po prawidłowym przygotowaniu próbki należy wyrównać ścieżkę optyczną mikroskopu za pomocą oświetlenia Kohlera. W przypadku standardowego mikroskopu DIC typu Nomarskiego może być konieczna rotacja próbki, szczególnie gdy nanocząstki plazmoniczne wykazują właściwości optyczne zależne od orientacji. Ponieważ mikroskopia DIC ma dwa nieodłączne ortogonalne pola polaryzacji, zależny od długości fali wzór kontrastu DIC ujawnia orientację plazmonicznych nanocząstek w kształcie prętów. Wreszcie, akwizycja i analiza danych muszą być starannie przeprowadzone. Często przedstawia się dane ze spektroskopii opartej na DIC jako wartość kontrastu, ale możliwe jest również przedstawienie ich jako danych dotyczących intensywności. W tej demonstracji DIC do spektroskopii pojedynczych cząstek nacisk kładziony jest na sferyczne i pręcikowe nanocząstki złota.

Wprowadzenie

Od 1980 roku, mikroskopia z kontrastem interferencyjnym (DIC) jest w dużej mierze postrzegana jako ważna metoda obrazowania zarezerwowana dla obiektów w mikroskali w naukach biologicznych. Jednak podczas swojego rozwoju w latach 50. i 60. XX wieku była przeznaczona jako technika dla materiałoznawstwa1. Wraz z ostatnimi postępami w materiałoznawstwie związanym z nanocząstkami plazmonicznymi wzrosło zainteresowanie charakteryzacją materiałów za pomocą mikroskopii optycznej.

Z pewnością dostępnych jest wiele technik optycznych do charakteryzacji nanomateriałów (np. ciemne pole, jasne pole, światło spolaryzowane, fluorescencja, itp.). Ciemne pole jest bardzo popularne w badaniach nad nanocząstkami, ale opiera się wyłącznie na zbieraniu rozproszeń i dostarcza ograniczonych informacji o złożonych próbkach2. Fluorescencja może być przydatna, ale tylko w przypadku próbek, które świecą lub które mogą być odpowiednio zabarwione. Mikroskopia DIC ma kilka cech, które sprawiają, że jest cennym narzędziem do analizy nanocząstek. Najczęściej wymienianymi zaletami DIC w porównaniu z innymi metodami i w odniesieniu do nanocząstek plazmonicznych są: brak konieczności barwienia próbki, brak efektów halo, mała głębia ostrości i wysoka rozdzielczość boczna3. DIC ma dodatkowe mocne strony, które są cenne dla badań nad nanocząstkami plazmonicznymi. Po pierwsze, obecne są dwa naturalne i ortogonalne pola polaryzacji, które mogą być mierzone jednocześnie dla celów spektroskopii2. Po drugie, zdepolaryzowany sygnał nanocząstek nie jest rejestrowany w końcowym obrazie2, co może być powodem do poważnych obaw w pomiarach spektroskopii w ciemnym polu.

Celem tego artykułu jest przedstawienie jasnej metodologii wykorzystania mikroskopii DIC w świetle przechodzącym do wykonywania spektroskopii na plazmonicznych nanocząstkach. Chociaż DIC jest potężną techniką, którą można zastosować do bardzo zróżnicowanych materiałów, jest to również technika, która wymaga dużych umiejętności i zrozumienia, aby prawidłowo ją obsługiwać podczas obrazowania nanocząstek. Mikroskopia Nomarski DIC oparta na transmisji ma złożoną ścieżkę światła1, która zostanie tutaj tylko pokrótce omówiona. Ciąg optyczny DIC jest wyświetlany w Rysunek 1. Światło jest przepuszczane przez mikroskop, najpierw przepuszczane przez polaryzator i pryzmat Nomarskiego rozdzielający wiązkę, zanim zostanie skupione przez kondensator na płaszczyźnie próbki. Po przejściu przez obiektyw, światło napotyka pryzmat Nomarskiego łączący wiązkę i analizator przed wyjściem do detektora. Dwa polaryzatory i pryzmaty Nomarskiego mają kluczowe znaczenie dla tworzenia obrazu DIC i są odpowiedzialne za wytwarzanie dwóch ortogonalnych pól polaryzacji DIC1. Czytelnik zainteresowany dowiedzeniem się więcej o zasadach działania i ścieżce optycznej mikroskopów Nomarski DIC lub różnicach między Nomarski DIC a innymi stylami DIC powinien zapoznać się z innymi dobrze napisanymi relacjami na te tematy1,4,5,6,7.

Równie ważne jest zrozumienie podstawowej natury plazmonicznych nanocząstek przed próbą przeprowadzenia na nich spektroskopii, czy to za pomocą Nomarski DIC, ciemnego pola, czy jakiejkolwiek innej techniki mikroskopowej. W dziedzinie plazmoniki nanocząstki definiuje się jako cząstki o wymiarach w skali 10-100 nm8,9. Nanocząstki mogą przybierać różne kształty (np. kule, pręty, gwiazdy, hantle itp.), a większość ich ważnych właściwości wynika z oddziaływań ze światłem w zakresie ultrafioletu, widzialności i bliskiej podczerwieni widma elektromagnetycznego. Termin "plazmoniczny" nie ogranicza się do nanocząstek10; jednak przy omawianiu nanocząstek używa się go w odniesieniu do zlokalizowanego powierzchniowego rezonansu plazmonów (LSPR). LSPR to zjawisko, w którym elektrony przewodnictwa w nanocząstce oscylują pod wpływem oddziaływania kulombowskiego z promieniowaniem elektromagnetycznym o bardzo specyficznym i stosunkowo wąskim paśmie częstotliwości8. Przy tych samych częstotliwościach nanocząstki plazmoniczne wykazują zwiększoną absorpcję i rozpraszanie światła, dzięki czemu można je obserwować za pomocą mikroskopii optycznej. W wielu przypadkach preferowane jest obserwowanie nanocząstek podczas umieszczania filtrów pasmowoprzepustowych przed kondendenserem2, aby poprawić kontrast obrazowania i wyeliminować światło, które nie wywołuje efektu LSPR. Zastosowanie filtrów umożliwia również przeprowadzanie eksperymentów ze spektroskopią pojedynczych cząstek.

Zachowanie optyczne związane z LSPR jest wysoce zależne od rozmiaru i kształtu nanocząstek, i może być badane za pomocą wielu technik mikroskopii optycznej. Jednakże, aby rozszyfrować informacje o orientacji plazmonicznych nanocząstek o anizotropowym (tj. niesferycznym) kształcie, konieczne jest wykorzystanie polaryzacji pola świetlnego. Poprzez ostrożne obracanie pola polaryzacyjnego lub substratu próbki w małych przyrostach, możliwe jest monitorowanie zależnych od orientacji właściwości spektroskopowych poszczególnych nanocząstek. Rotacja i polaryzacja mogą również pomóc w ustaleniu, czy cecha widmowa jest spowodowana dipolarną lub wyższej kolejności oscylacją elektronów powierzchniowych nanocząstki. Jednak w przypadku nanocząstek izotropowych (tj. sferycznych) profil widmowy pozostaje zasadniczo niezmieniony po obróceniu próbki w świetle spolaryzowanym.

Oglądane przez mikroskop DIC (Rysunek 2), nanocząstki mają przewiewny dysk z białym i czarnym wyglądem rzucanym w cień na szarym tle. Sferyczne nanocząstki zachowają ten wygląd podczas rotacji i zmiany filtrów pasmowoprzepustowych; jednak cząstki będą stopniowo znikać z pola widzenia, w miarę jak centralna długość fali filtra będzie coraz bardziej oddzielana od jedynej dipolarnej długości fali LSPR w sferze11. Wygląd nanoprętów może się dość drastycznie zmienić, gdy są obracane2. Nanopręty mają dwa pasma LSPR o zachowaniu dipolarnym, których lokalizacja jest oparta na fizycznych wymiarach nanoprętów. Gdy oś podłużna nanopręta jest zorientowana równolegle do jednego z pól polaryzacyjnych DIC, przewiewny dysk będzie wyglądał na cały biały lub całkowicie, jeśli będzie oglądany z filtrem pasmowoprzepustowym powiązanym z tą długością fali LSPR. Po obróceniu próbki o 90° przyjmie ona przeciwny kolor. Alternatywnie, ponieważ oś poprzeczna nanopręta jest prostopadła do osi podłużnej, pręt przyjmie przeciwny kolor podczas przełączania między filtrami, które pasują do długości fal LSPR dla dwóch osi. W innych orientacjach i ustawieniach filtrów, nanopręty będą wyglądać bardziej jak kule, prezentując różnorodne rzucane cień, przewiewne wzory dysków. W przypadku nanoprętów o osi poprzecznej < 25 nm wykrycie sygnału o tej długości fali LSPR za pomocą mikroskopii DIC może być trudne.

Aby przeprowadzić spektroskopię pojedynczych cząstek, ważne jest użycie odpowiednich komponentów optycznych i ich prawidłowe ustawienie. Musi być użyty obiektyw zdolny do mikroskopii DIC. Do eksperymentów z pojedynczymi cząstkami idealne są obiektywy olejowe 80x lub 100x. Pryzmaty Nomarski DIC zwykle występują w trzech odmianach: standardowej, o wysokim kontraście i wysokiej rozdzielczości. Idealny typ w dużym stopniu zależy od celu eksperymentu i wielkości nanocząstek. Standardowe pryzmaty są dobre dla wielu eksperymentów; Jednak podczas pracy z mniejszymi nanocząstkami (< 50 nm) pryzmaty o wysokim kontraście mogą być korzystne, ponieważ kontrast cząstek zmniejsza się wraz ze zmniejszaniem się wielkości cząstek11. Regulacja kontrastu DIC odbywa się poprzez obracanie polaryzatora lub translację jednego z pryzmatów DIC, w zależności od marki lub modelu mikroskopu6.

Po ustawieniu oświetlenia Kohlera i ustawień polaryzatora, bardzo ważne jest, aby nie zmieniać tych ustawień podczas zbierania danych spektroskopowych. Ponadto podczas zbierania danych należy utrzymywać stały średni sygnał tła, nawet podczas przełączania między filtrami i ustawieniami kąta. Rzeczywista idealna wartość tła zależy od zakresu dynamicznego kamery naukowej, ale ogólnie rzecz biorąc, tło powinno mieścić się w zakresie 15%–40% maksymalnego poziomu wykrywania kamery. Zmniejsza to prawdopodobieństwo nasycenia matrycy aparatu, zapewniając jednocześnie optymalny kontrast cząstek. Do zbierania danych spektroskopowych konieczna jest praca z kamerą naukową, która rejestruje obrazy w czerni i bieli, w przeciwieństwie do kamery kolorowej.

Przygotowanie próbki to kolejny krytyczny aspekt obrazowania plazmonicznych nanocząstek. Konieczne jest, aby operatorzy mikroskopii DIC rozumieli właściwości optyczne próbki i jej substrat. "Wstępnie oczyszczone" szkło mikroskopu nie jest wystarczająco przygotowane do obrazowania nanocząstek i musi zostać odpowiednio oczyszczone przed osadzeniem próbki, aby zapewnić niezakłóconą obserwację próbki. Wiele protokołów czyszczenia szkiełek mikroskopowych zostało już wcześniej udokumentowanych12, ale nie jest to krok, który jest zwykle zgłaszany w badaniach eksperymentalnych.

Na koniec, metody analizy danych są ostatnim składnikiem spektroskopii pojedynczych cząstek. Należy zmierzyć maksymalne i minimalne natężenia dla każdej nanocząstki, a także lokalną średnią tła. Interesujące cząstki powinny znajdować się w obszarach, w których nie ma zanieczyszczeń tła, wad podłoża ani nierównomiernego oświetlenia. Jedną z metod określania profilu widmowego nanocząstki jest obliczanie kontrastu cząstek na każdej długości fali, przy użyciu poniższego równania11,13,14,15:

figure-introduction-1

Alternatywnie, widmo pojedynczej cząstki można podzielić na poszczególne maksymalne i minimalne składowe sygnału, które reprezentują dwa pola polaryzacji DIC, wyświetlając w ten sposób dwa jednocześnie zebrane widma zależne od kierunku, za pomocą dwóch równań:

figure-introduction-2

figure-introduction-3

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbki za pomocą standardowych szkiełek mikroskopowych

  1. Przygotuj szklane szkiełka mikroskopowe do osadzania próbki.
    UWAGA: W niektórych okolicznościach bardziej odpowiednie może być przechowywanie szkła w ultraczystej wodzie zamiast w etanolu. Jednak przechowywanie w wodzie lub powietrzu sprawia, że szkło z czasem staje się hydrofobowe.
    1. Aby uzyskać najlepsze wyniki, kup szkiełka mikroskopowe szklane lub kwarcowe i szkło nakrywkowe.
    2. Za pomocą pisaka do trasowania umieść płytki i krótki ślad zadrapania na środku każdego szklanego szkiełka nakrywkowego.
    3. Wyczyść wszystkie szkła mikroskopu, nawet jeśli zostały zakupione jako "wstępnie oczyszczone", aby usunąć odłamki szkła, kurz, proszek, pozostałości organiczne i wszelkie inne zanieczyszczenia, które wpływają na jakość obrazowania lub osadzanie próbki.
      UWAGA: Poniższa metoda czyszczenia działa dobrze w przypadku opisanych tutaj typów próbek i pozwala uniknąć stosowania chemikaliów. Ostrzejsze chemikalia mogą wytrawić szkło i wymagają większej ostrożności przy obchodzeniu się i utylizacji.
      1. Umieść szkło mikroskopowe na stojakach do przechowywania, a następnie w zlewce lub w słoiku do barwienia. Nie umieszczaj szkła mikroskopu na dnie zlewek i innych szklanych naczyń laboratoryjnych bez stojaków, ponieważ każdy kawałek i powierzchnia szkła mikroskopu powinna być całkowicie wystawiona na działanie środków czyszczących.
      2. Wlej ~1 ml płynnego detergentu (tabela materiałów) do pojemnika i uzupełnij pojemnik wodą. Sonikacja przez 30 min.
        UWAGA: Po rozpoczęciu procesu czyszczenia należy obchodzić się ze szkłem wyłącznie w rękawiczkach, aby uniknąć pozostawienia śladów odcisków palców na szkle.
      3. Wylej płynną zawartość pojemnika do czyszczenia do zlewu. Wypłucz pojemnik kilka razy ultraczystą wodą, aby usunąć wszelkie ślady detergentu. Napełnij pojemnik ultraczystą wodą. Sonikować pojemnik ze szkłem mikroskopowym przez kolejne 30 minut.
      4. Powtórz poprzedni krok co najmniej jeszcze raz. Wykonaj dodatkowe rundy sonikacji w wodzie, aż stanie się oczywiste, że wszystkie ślady detergentu zostały usunięte.
      5. Wylej zawartość pojemnika do czyszczenia. Wypłucz pojemnik ultraczystą wodą. Napełnij pojemnik etanolem. Sonizacja szkła mikroskopowego przez 30 min.
      6. Wylej zawartość pojemnika do czyszczenia do pojemnika na odpady. Uzupełnij etanolem. Przykryj pojemnik, aby zapobiec utracie etanolu w wyniku parowania. Przechowuj szkło mikroskopu w tym pojemniku do czasu eksperymentu. Szkiełka pozostają czyste i nadają się do użytku tak długo, jak długo pozostają zanurzone w etanolu w zakrytym pojemniku.
  2. Przygotowanie roztworu nanocząstek
    1. Za pomocą mikropipety wyjąć 100 μl podwielokrotności roztworu nanocząstek złota o stężeniu 0,05 mg/ml z oryginalnego pojemnika do przechowywania i wyrzucić roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    2. Odwirować próbkę przez 10 minut przy 6 000 x g.
    3. Usunąć supernatant za pomocą mikropipety w celu usunięcia nadmiaru środka powierzchniowo czynnego.
    4. Za pomocą mikropipety umieść 100 μl ultraczystej wody w probówce wirówkowej.
      UWAGA: Jeśli nie można usunąć całego supernatantu za pierwszym razem, powtórzyć etapy wirowania i ponownego zawieszenia.
    5. Krótko zmieszać próbkę, aby ponownie zawiesić osad. Natychmiast po tym należy przeprowadzić sonikację przez 20 minut, aby całkowicie zawiesić i rozbić agregaty nanocząstek.
      UWAGA: Jeśli próbka nie zostanie natychmiast użyta, należy ją ponownie poddać sonikacji przez 20 minut przed nałożeniem roztworu na szkło mikroskopu.
  3. Osadzanie próbki
    1. Wyjąć oczyszczone szkiełka nakrywkowe i szkiełka mikroskopowe z pojemników do przechowywania. Wysuszyć szklankę azotem lub argonem pod ciśnieniem.
    2. Za pomocą mikropipety odlać kroplowo 6 μl roztworu nanocząstek z kroku 1.2.5 na szkiełko nakrywkowe. Aby równomiernie rozprowadzić kroplę, ostrożnie umieść drugi, większy kawałek szkła mikroskopowego na wierzchu szkiełka nakrywkowego, takiego jak drugi szkiełko nakrywkowe lub szkiełko mikroskopowe. Unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza między dwoma kawałkami szkła.
      1. Odwrócić podłoże próbki i uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego wąską linią lakieru do paznokci, aby zapobiec parowaniu roztworu pożywki.
      2. Alternatywnie, aby zobrazować próbkę "na sucho", należy pozostawić roztwór na 5–15 minut na szkiełku nakrywkowym przed wyjęciem niechcianego kawałka szkła. Delikatnie wysuszyć szkiełko nakrywkowe azotem lub argonem pod ciśnieniem.
    3. Jeśli to możliwe, zobrazuj próbki natychmiast po przygotowaniu. Jeśli nie jest to możliwe, należy przechowywać próbki w zakrytym pojemniku, takim jak szalka Petriego, do czasu wykonania obrazowania.

2. Obrazowanie DIC

  1. Wyrównaj obiektyw i kondensator.
    1. Po umieszczeniu próbki na mikroskopie znajdź płaszczyznę ogniskową, na której znajduje się próbka. Najpierw zlokalizuj utworzoną wcześniej rysę i skup się na niej. Następnie dostosuj ostrość, aż pojawią się nanocząsteczki.
    2. Aby określić dokładne umiejscowienie skraplacza, użyj metody oświetlenia Kohlera. 5 Oświetlenie Kohlera przy dużym powiększeniu (80x, 100x) jest łatwiejsze do osiągnięcia, najpierw ustawiając oświetlenie Kohlera na mniejsze powiększenie, takie jak 20x.
      UWAGA: Zazwyczaj oświetlenie Kohler nie musi być ponownie regulowane podczas obrazowania pojedynczej próbki. Dobrą praktyką jest jednak sprawdzenie, czy oświetlenie Kohler jest prawidłowo ustawione podczas przełączania na nowy szkiełko mikroskopowe.
  2. Zoptymalizuj ustawienia kontrastu.
    1. Wybierz obszar zainteresowania w próbce do obrazowania. Wyśrodkuj obszar w polu widzenia aparatu i w razie potrzeby dostosuj ostrość.
      1. Jeśli mikroskop ma konstrukcję de Senarmont, zacznij od polaryzatora ustawionego na bliskie maksymalnego wygaszania tła i stopniowo obracaj polaryzator w kierunku zmniejszającego się wygaszania tła. Intensywność tła będzie stopniowo rosła.
      2. Jeśli mikroskop nie ma konstrukcji de Senarmonta, zacznij od ciągu optycznego ustawionego na maksymalne wygaszanie tła. W takim przypadku należy stopniowo dostosowywać położenie pryzmatu obiektywnego w kierunku zmniejszającego się wygaszania tła.
        UWAGA: Idealne ustawienie uzyskuje się, gdy nanocząstki osiągają największą różnicę intensywności (tj. kontrast) od uśrednionej lokalnej wartości tła. W przypadku nanocząstek plazmonicznych optymalny kontrast uzyskuje się zwykle przy stosunkowo ciemnym tle, a więc przy ustawieniach bliskich maksymalnemu wygaszaniu tła.
  3. Zobrazuj próbkę.
    1. Wyłącz oświetlenie w pomieszczeniu, aby zapobiec interakcji rozproszonego oświetlenia z procesem.
    2. Oglądając nanocząstki za pomocą kamery do obrazowania naukowego, określ optymalny poziom tła. Korzystając z filtra pasmowoprzepustowego 10 nm o pełnej szerokości i połowie maksimum (FWHM), którego centralna długość fali znajduje się równolegle z główną długością fali LSPR, wyświetl obszar zainteresowania. Dostosuj intensywność lampy lub czas naświetlania, aż poziom tła znajdzie się w zakresie 15%–40% maksymalnego poziomu głośności aparatu i żadne obiekty w obszarze zainteresowania nie będą wykazywać intensywności sygnału przekraczającej 90% maksymalnego poziomu intensywności aparatu.
      UWAGA: Celem kroku 2.3.2 jest zapobieganie nasyceniu czujnika podczas przełączania między filtrami. Idealny poziom tła będzie się różnić w zależności od próbki i kamery. Po wykonaniu tego kroku można dostosować czas naświetlania, ale nie intensywność lampy.
    3. Zobrazuj próbkę za pomocą szeregu filtrów pasmowoprzepustowych, z których każdy ma FWHM 10 nm i które jako całość umożliwiają obrazowanie w całym zakresie długości fali. Upewnij się, że intensywność tła pozostaje spójna na każdym obrazie (w granicach ~5% od siebie), dostosowując czas ekspozycji. Po przełączeniu filtrów ponownie ustaw ostrość próbki przed przechwyceniem obrazu.
    4. Zapisz obrazy jako nieskompresowane pliki TIFF i/lub w natywnym formacie oprogramowania, aby zachować wszystkie informacje.
  4. Obrócić próbkę.
    1. Po zebraniu obrazów próbki w jej pierwotnym położeniu, próbkę można teraz obrócić i zobrazować w dodatkowych orientacjach na ścieżce światła. Wykonuj obrót w regularnych odstępach czasu (np. 10° lub 15°) w zakresie 180° lub 360°.
      UWAGA: Obrót wymaga obrotowego stolika na próbki.
    2. Podobnie jak w sekcjach 2.1-2.3, dostosuj ustawienia kamery, aby zapewnić stały poziom tła z obrazu na obraz.
      UWAGA: Nie należy dokonywać żadnych regulacji oświetlenia Kohler.

3. Analiza danych za pomocą ImageJ

UWAGA: Poniższe obliczenia mogą być wykonywane w różnych pakietach oprogramowania, a czasami w natywnym programie używanym do zbierania obrazów. ImageJ to bezpłatne oprogramowanie firmy National Institutes of Health (NIH).

  1. Oblicz kontrast lub intensywność cząstek.
    1. Otwórz obraz za pomocą ImageJ.
    2. Wybierz narzędzie Prostokąt i narysuj prostokąt wokół głównego obszaru zainteresowania.
    3. Na pasku narzędzi wybierz pozycję Obraz, następnie pozycję Powiększenie, a następnie pozycję Do zaznaczenia. Okno obrazowania zostanie powiększone na wybranym obszarze.
    4. Na pasku narzędzi wybierz Obraz, następnie Dostosuj, a następnie Jasność/Kontrast. Pojawi się nowe okno. Aby umożliwić lepsze wyświetlanie obszaru próbki, dostosuj cztery ustawienia: Minimum, Maksimum, Jasność i Kontrast. Korekty te nie zmieniają danych naukowych, a jedynie umożliwiają lepszą widoczność obszaru próbki.
      UWAGA: Kroki 3.1.3 i 3.1.4 można wykonać wielokrotnie i w odwrotnej kolejności.
    5. Używając ponownie narzędzia prostokąta, narysuj ramkę wokół pierwszej nanocząstki, która ma być zmierzona. Pudełko powinno być tylko nieznacznie większe niż przewiewny dysk nanocząstki.
    6. Na pasku narzędzi wybierz pozycję Analizuj, a następnie pozycję Zmierz. Pojawi się nowe okno, w którym wyświetlane są wartości minimalne, maksymalne i średnie dla pikseli znajdujących się w zaznaczonym polu.
    7. Przeciągnij pole używane do pomiaru nanocząstki do obszaru bezpośrednio przylegającego do cząstki, gdzie kontrast tła jest stosunkowo równy i nie ma w nim żadnych cząstek ani zanieczyszczeń. Zachowaj oryginalny rozmiar pudełka.
    8. Użyj narzędzia Miarka, aby określić średnią intensywność dla obszaru tła.
    9. Zmierz pozostałe cząstki i przyległy obszar tła dla każdej z nich.
    10. Powtórz ten proces dla każdej cząstki na wszystkich obrazach z serii.
    11. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć kontrast lub intensywność każdej cząstki we wszystkich długościach fal i pod wszystkimi kątami.
    12. Oblicz kontrast każdej cząstki, korzystając z następującego równania13,14,15:
      figure-protocol-1
      UWAGA: Korzystając z tego równania, kontrast cząstek powinien zawsze wynosić > 0.
    13. Obliczyć maksymalną wartość cząstki skorygowaną o tło, dzieląc zmierzoną maksymalną intensywność cząstek przez średnią tła:
      figure-protocol-2
    14. Podobnie należy obliczyć minimalną wartość skorygowaną o tło, dzieląc zmierzoną minimalną intensywność cząstek przez średnią tła:
      figure-protocol-3
      UWAGA: Zgodnie z obliczeniami maksimum powinno mieć wartość większą niż jeden, podczas gdy minimum będzie mniejsze niż jeden. Dopuszczalne jest odjęcie każdej wartości przez "1", tak aby średnie tło było zasadniczo równe zero, maksimum było reprezentowane jako wartość dodatnia, a wartość minimalna miała przypisaną wartość ujemną16. To ostatnie podejście pozwala analitykowi oddzielnie rozważyć, co dzieje się wzdłuż każdego z pól polaryzacji, co jest przydatne podczas badania cząstek anizotropowych.
    15. Aby wykreślić profil widmowy w danej pozycji nanocząstek, należy wykreślić dane z długością fali wzdłuż osi x i kontrastem lub intensywnością wzdłuż osi y.
    16. Aby narysować na wykresie profil obrotowy przy danej długości fali, należy wykreślić kąt obrotu wzdłuż osi x oraz kontrast lub intensywność wzdłuż osi y.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas pracy z próbkami, które są wystarczająco duże, aby można je było zobaczyć gołym okiem, umieszczanie punktów orientacyjnych na szklanym podłożu nie jest zwykle wymagane. Jednak podczas pracy z nanomateriałami lub gdy wymagana jest rotacja próbki, punkty orientacyjne mogą stanowić łatwą metodę lokalizowania, rozróżniania i śledzenia orientacji próbki. Chociaż bardziej wyrafinowane techniki mogą być wykorzystywane do pozostawiania punktów orientacyjnych na szklanych podłożach

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas obrazowania za pomocą mikroskopii DIC bardzo ważne jest zoptymalizowanie komponentów optycznych przed zebraniem danych. Nawet niewielkie korekty polaryzatora w trakcie eksperymentu mogą mieć znaczący wpływ na dane końcowe6. Co więcej, różne materiały wymagają różnych ustawień polaryzatora. Chociaż zastosowano tutaj duże rozmiary kroków, aby zademonstrować wpływ kąta polaryzacji, w rzeczywistym eksperymencie konieczne jest zoptymalizowanie ustawienia polaryzatora w zakresie 1°–2° od optymal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Podziękowania

Dr Anthony S. Stender pragnie podziękować za wsparcie techniczne ze strony Instytutu Nanoskali i Zjawisk Kwantowych (NQPI) na Uniwersytecie Ohio. Ten artykuł był możliwy dzięki funduszom na rozpoczęcie działalności udzielonym dr Stenderowi przez Uniwersytet Ohio.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Contrad 70Decon Labs, Inc.1002Do czyszczenia szkła mikroskopu, Dostępne u wielu dostawców chemikaliów
EtanolFisher ScientificA962-4Do czyszczenia i przechowywania szkła mikroskopu
Szkiełka nakrywkowe domikroskopu Ted Pella260148
Szkiełka mikroskopowe szklaneTed Pella26007
Złote nanoprętyNanopartzDIAM-SPR-25-650
Złote nanosfery (80 nm)Sigma Aldrich742023-25ML
ImageJNIHN/ADarmowe oprogramowanie dostępne do analizy danych z NIJ
Lakier do paznokciMikroskopia elektronowa Sciences72180
Mikroskop Nikon Ti-ENikonN/A
AzotAirgasN/A
ORCA Flash 4.0 V2+ cyfrowa kamera sCMOSPióro do pisania Hamamatsu77054098
AmazonN/AWiele opcji dostępnych online za mniej niż 10 USD. Nie trzeba kupować drogiej wersji.
ultraczysta18 megaomów
gazowy Woda

Bibliografia

  1. Pluta, M. Ch 7: Differential Interference Contrast in. Advanced Light Microscopy. 2, Elsevier. 146-197 (1989).
  2. Stender, A. S., Wang, G., Sun, W., Fang, N. Influence of Gold Nanorod Geometry on Optical Response. ACS Nano. 4 (12), 7667-7675 (2010).
  3. Stender, A. S., et al. Single Cell Optical Imaging and Spectroscopy. Chemical Reviews. 113 (4), 2469-2527 (2013).
  4. Mehta, S. B., Sheppard, C. J. R. Partially coherent image formation in differential interference contrast (DIC) microscope. Optics Express. 16 (24), 19462-19479 (2008).
  5. Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 1: Fundamentals of Light Microscopy. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second edition. , Wiley. 1-20 (2012).
  6. Stender, A. S., Augspurger, A. E., Wang, G., Fang, N. Influence of Polarization Setting on Gold Nanorod Signal at Nonplasmonic Wavelengths Under Differential Interference Contrast Microscopy. Analytical Chemistry. 84 (12), 5210-5215 (2012).
  7. Wang, G., Sun, W., Luo, Y., Fang, N. Resolving Rotational Motions of Nano-objects in Engineered Environments and Live Cells with Gold Nanorods and Differential Interference Contrast Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 132 (46), 16417-16422 (2010).
  8. Kelly, K. L., Coronado, E., Zhao, L. L., Schatz, G. C. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. The Journal of Physical Chemistry B. 107 (3), 668-677 (2003).
  9. Mulvaney, P. Not All That's Gold Does Glitter. MRS Bulletin. 26 (12), 1009-1014 (2012).
  10. Maier, S. A. Plasmonics: Fundamentals and Applications. , Springer US. (2007).
  11. Sun, W., Wang, G., Fang, N., Yeung, E. S. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Microscopy: Selectively Imaging Nanoparticle Probes in Live Cells. Analytical Chemistry. 81 (22), 9203-9208 (2009).
  12. Cras, J. J., Rowe-Taitt, C. A., Nivens, D. A., Ligler, F. S. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. Biosensors and Bioelectronics. 14 (8), 683-688 (1999).
  13. Augspurger, A. E., Sun, X., Trewyn, B. G., Fang, N., Stender, A. S. Monitoring the Stimulated Uncapping Process of Gold-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles. Analytical Chemistry. 90 (5), 3183-3188 (2018).
  14. Murphy, D. B., Davidson, M. W. Ch 2: Light and Color. Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging, Second Edition. , Wiley. 21-33 (2012).
  15. Wayne, R. Ch 3: The Dependence of Image Formation on the Nature of Light. Light and Video Microscopy (Second Edition). , Academic Press. 43-78 (2014).
  16. Stender, A. S., Wei, X., Augspurger, A. E., Fang, N. Plasmonic Behavior of Single Gold Dumbbells and Simple Dumbbell Geometries. The Journal of Physical Chemistry C. 117 (31), 16195-16202 (2013).
  17. Hu, M., et al. Dark-field microscopy studies of single metal nanoparticles: understanding the factors that influence the linewidth of the localized surface plasmon resonance. Journal of Materials Chemistry. 18 (17), 1949-1960 (2008).
  18. Choo, P., et al. Wavelength-Dependent Differential Interference Contrast Inversion of Anisotropic Gold Nanoparticles. The Journal of Physical Chemistry C. 122 (47), 27024-27031 (2018).
  19. Funston, A. M., Novo, C., Davis, T. J., Mulvaney, P. Plasmon Coupling of Gold Nanorods at Short Distances and in Different Geometries. Nano Letters. 9 (4), 1651-1658 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia DICspektroskopia pojedynczych cz steczeko wietlenie K hlerafiltr pasmowyanaliza w programie ImageJpomiar kontrastuprofilowanie intensywno ciobr t polaryzatoraprzygotowanie pr bki

Powiązane artykuły