Wykonywanie spektroskopii nanocząstek plazmonicznych za pomocą transmisyjnej mikroskopii kontrastowej interferencyjnej typu Nomarskiego

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest szczegółowe przedstawienie sprawdzonego podejścia do przygotowania próbek plazmonicznych nanocząstek i przeprowadzenia na nich spektroskopii pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC).

Streszczenie

Mikroskopia kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) to potężne narzędzie do obrazowania, które jest najczęściej używane do obrazowania obiektów w mikroskali za pomocą światła widzialnego. Celem tego protokołu jest uszczegółowienie sprawdzonej metody przygotowywania próbek nanocząstek plazmonicznych i wykonywania na nich spektroskopii pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii DIC. Aby przeprowadzić powtarzalne eksperymenty spektroskopowe, należy dokładnie wykonać kilka ważnych kroków. Po pierwsze, punkty orientacyjne mogą być wytrawione w podłożu próbki, co pomaga w zlokalizowaniu powierzchni próbki i śledzeniu obszaru zainteresowania podczas eksperymentów. Następnie podłoże musi zostać odpowiednio oczyszczone z zanieczyszczeń i zanieczyszczeń, które w inny sposób mogłyby utrudnić lub zasłonąć badanie próbki. Po prawidłowym przygotowaniu próbki należy wyrównać ścieżkę optyczną mikroskopu za pomocą oświetlenia Kohlera. W przypadku standardowego mikroskopu DIC typu Nomarskiego może być konieczna rotacja próbki, szczególnie gdy nanocząstki plazmoniczne wykazują właściwości optyczne zależne od orientacji. Ponieważ mikroskopia DIC ma dwa nieodłączne ortogonalne pola polaryzacji, zależny od długości fali wzór kontrastu DIC ujawnia orientację plazmonicznych nanocząstek w kształcie prętów. Wreszcie, akwizycja i analiza danych muszą być starannie przeprowadzone. Często przedstawia się dane ze spektroskopii opartej na DIC jako wartość kontrastu, ale możliwe jest również przedstawienie ich jako danych dotyczących intensywności. W tej demonstracji DIC do spektroskopii pojedynczych cząstek nacisk kładziony jest na sferyczne i pręcikowe nanocząstki złota.

Wprowadzenie

Od lat 80. mikroskopia kontrastowo-interferencyjna (DIC) była postrzegana głównie jako istotna metoda obrazowania zarezerwowana dla obiektów w skali mikro w naukach biologicznych. Jednak podczas jej opracowywania w latach 50. i 60. XX wieku była ona przeznaczona jako technika dla inżynierii materiałowej¹. Wraz z ostatnimi postępami w naukach o materiałach związanymi z nanocząsteczkami plazmonicznymi, wzrosło zainteresowanie charakterystyką materiałów za pomocą mikroskopii optycznej.

Do charakterystyki nanomateriałów dostępnych jest wiele technik optycznych (np. ciemne pole, jasne pole, światło spolaryzowane, fluorescencja itp.). Metoda ciemnego pola jest szeroko stosowana w badaniach nad nanocząsteczkami, jednak opiera się ona wyłącznie na zbieraniu światła rozproszonego i dostarcza ograniczonych informacji o złożonych próbkach². Fluorescencja może być przydatna, ale tylko w przypadku próbek luminescencyjnych lub takich, które można odpowiednio zabarwić. Mikroskopia DIC posiada kilka cech, które czynią ją cennym narzędziem do analizy nanocząsteczek. Najczęściej wymieniane zalety DIC w porównaniu z innymi metodami, w odniesieniu do plazmonicznych nanocząsteczek, to: brak konieczności barwienia próbek, brak efektów halo, mała głębia ostrości oraz wysoka rozdzielczość boczna³. DIC posiada dodatkowe atuty, które są wartościowe w badaniach nad plazmonicznymi nanocząsteczkami. Po pierwsze, występują dwa immanentne i ortogonalne pola polaryzacyjne, które mogą być mierzone jednocześnie do celów spektroskopowych². Po drugie, zdepolaryzowany sygnał nanocząsteczek nie jest rejestrowany w końcowym obrazie², co może być istotnym problemem w pomiarach spektroskopowych w ciemnym polu.

Celem niniejszego artykułu jest przedstawienie przejrzystej metodologii wykorzystania mikroskopii DIC Nomarskiego w świetle przechodzącym do przeprowadzania spektroskopii plazmonicznych nanocząstek. Chociaż DIC jest potężną techniką, którą można zastosować do bardzo zróżnicowanych materiałów, jest to również metoda wymagająca dużych umiejętności i wiedzy w celu jej prawidłowego zastosowania podczas obrazowania nanocząstek. Mikroskopia DIC Nomarskiego w świetle przechodzącym posiada złożoną drogę optyczną¹, która zostanie tutaj omówiona jedynie krótko. Tor optyczny DIC przedstawiono na Rysunku 1. Światło przechodzi przez mikroskop, najpierw przechodząc przez polaryzator i pryzmat Nomarskiego rozdzielający wiązkę, a następnie będąc ogniskowane przez kondensor na płaszczyznę próbki. Po przejściu przez obiektyw światło napotyka pryzmat Nomarskiego łączący wiązki oraz analizator, zanim trafi do detektora. Dwa polaryzatory i pryzmaty Nomarskiego są kluczowe dla powstania obrazu DIC i odpowiadają za wytworzenie dwóch ortogonalnych pól polaryzacji w metodzie DIC¹. Czytelnicy zainteresowani zgłębieniem zasad działania i drogi optycznej mikroskopów DIC Nomarskiego lub różnic między DIC Nomarskiego a innymi rodzajami DIC proszeni są o zapoznanie się z innymi rzetelnymi opracowaniami na te tematy^1,4,5,6,7.

Równie ważne jest zrozumienie podstawowej natury nanocząsteczek plazmonicznych przed podjęciem prób przeprowadzenia ich spektroskopii, niezależnie od tego, czy odbywa się to za pomocą DIC Nomarskiego, ciemnego pola czy jakiejkolwiek innej techniki mikroskopowej. W dziedzinie plazmoniki nanocząsteczki definiuje się jako cząstki o rozmiarach rzędu 10-100 nm^8,9. Nanocząsteczki mogą przyjmować wiele kształtów (np. sfery, pręty, gwiazdy, hantle itp.), a większość ich istotnych właściwości wynika z oddziaływań ze światłem w zakresie ultrafioletu, światła widzialnego i bliskiej podczerwieni widma elektromagnetycznego. Termin „plazmoniczny” nie ogranicza się wyłącznie do nanocząsteczek¹⁰; jednak w kontekście nanocząsteczek jest on używany w odniesieniu do lokalnego powierzchniowego rezonansu plazmonowego (LSPR). LSPR to zjawisko, w którym elektrony przewodnictwa w nanocząsteczce oscylują wskutek oddziaływania kulombowskiego z promieniowaniem elektromagnetycznym o bardzo specyficznym i stosunkowo wąskim pasmie częstotliwości⁸. Przy tych samych częstotliwościach nanocząsteczki plazmoniczne wykazują zwiększone pochłanianie i rozpraszanie światła, co czyni je widocznymi w mikroskopii optycznej. W wielu przypadkach preferowane jest obserwowanie nanocząsteczek przy zastosowaniu filtrów pasmowych przed kondensorem², aby poprawić kontrast obrazowania i wyeliminować światło, które nie wywołuje efektu LSPR. Stosowanie filtrów umożliwia również przeprowadzenie eksperymentów spektroskopowych na pojedynczych cząstkach.

Zachowanie optyczne związane z LSPR jest silnie zależne od rozmiaru i kształtu nanocząstek i może być badane za pomocą wielu technik mikroskopii optycznej. Jednak w celu odczytania informacji o orientacji nanocząstek plazmonicznych o kształcie anizotropowym (tj. niesferycznym), konieczne jest wykorzystanie polaryzacji pola świetlnego. Poprzez ostrożne obracanie pola polaryzacji lub podłoża z próbką w małych przyrostach, możliwe jest monitorowanie zależnych od orientacji właściwości spektroskopowych poszczególnych nanocząstek. Rotacja i polaryzacja mogą również pomóc w ustaleniu, czy dana cecha widmowa wynika z oscylacji dipolowych czy z oscylacji wyższego rzędu elektronów powierzchniowych nanocząstki. Jednak w przypadku nanocząstek izotropowych (tj. sferycznych), profil widmowy pozostaje w zasadzie niezmienny podczas obracania próbki w świetle spolaryzowanym.

Pod obserwacją w mikroskopie DIC (Rycina 2), nanocząstki posiadają tarczę Airy o biało-czarnym wyglądzie z rzucanym cieniem na szarym tle. Sferyczne nanocząstki zachowują taki wygląd podczas obrotu oraz przy zmianie filtrów pasmowych; jednakże cząstki będą stopniowo znikać z pola widzenia w miarę jak centralna długość fali filtra będzie coraz bardziej oddalać się od jedynej dipolarnej długości fali LSPR sfery¹¹Wygląd nanopyłków może ulec dość gwałtownej zmianie podczas ich obracania²Nanopręty posiadają dwa pasma LSPR o charakterze dipolowym, których położenie zależy od wymiarów fizycznych nanoprętów. Gdy oś podłużna nanopręta jest zorientowana równolegle do jednego z pól polaryzacji DIC, plamka Airy’ego będzie całkowicie biała lub całkowicie czarna, jeśli jest obserwowana przy użyciu filtra pasmowo-przepustowego odpowiadającego danej długości fali LSPR. Po obróceniu próbki 90°przybierze ona kolor przeciwny. Alternatywnie, ponieważ oś poprzeczna nanopręta jest prostopadła do osi podłużnej, pręt przybierze kolor przeciwny podczas przełączania między filtrami odpowiadającymi długościom fal LSPR dla obu osi. Przy innych orientacjach i ustawieniach filtrów nanopręty będą przypominać bardziej sfery, wykazując różnorodne wzory krążków Airy’ego z rzucanym cieniem. W przypadku nanoprętów z osią poprzeczną < Przy 25 nm może być trudne wykrycie sygnału przy tej długości fali LSPR z użyciem mikroskopii DIC.

Aby przeprowadzić spektroskopię pojedynczych cząstek, ważne jest zastosowanie odpowiednich komponentów optycznych i ich właściwe wyrównanie. Należy użyć obiektywu umożliwiającego mikroskopię DIC. W eksperymentach z pojedynczymi cząstkami idealne są obiektywy olejowe 80x lub 100x. Pryzmaty Nomarskiego DIC występują zazwyczaj w trzech odmianach: standardowej, o wysokim kontraście i o wysokiej rozdzielczości. Wybór optymalnego typu zależy w dużym stopniu od celu eksperymentu oraz rozmiaru nanocząstek. Pryzmaty standardowe są odpowiednie do wielu doświadczeń, jednak w przypadku pracy z mniejszymi nanocząstkami (< 50 nm) korzystne mogą być pryzmaty o wysokim kontraście, ponieważ kontrast cząstek maleje wraz ze zmniejszaniem się ich rozmiaru¹¹. Regulacja kontrastu DIC odbywa się poprzez obrót polaryzatora lub przesuwanie jednego z pryzmatów DIC, w zależności od marki lub modelu mikroskopu⁶.

Po ustawieniu oświetlenia Kohlera oraz polaryzatora, krytyczne jest, aby nie zmieniać tych ustawień podczas gromadzenia danych spektroskopowych. Ponadto, podczas zbierania danych należy przez cały czas utrzymywać stały średni sygnał tła, nawet przy zmianie filtrów i ustawień kątowych. Rzeczywista idealna wartość tła zależy od zakresu dynamicznego kamery naukowej, ale ogólnie tło powinno mieścić się w zakresie 15%–40% maksymalnego poziomu detekcji kamery. Zmniejsza to prawdopodobieństwo nasycenia matrycy kamery, umożliwiając jednocześnie optymalny kontrast cząstek. Do gromadzenia danych spektroskopowych niezbędne jest korzystanie z kamery naukowej rejestrującej obrazy w czerni i bieli, w przeciwieństwie do kamery kolorowej.

Przygotowanie próbki jest kolejnym krytycznym aspektem obrazowania nanocząstek plazmonicznych. Operatorzy mikroskopii DIC muszą posiadać wiedzę na temat właściwości optycznych próbki oraz zastosowanego podłoża. Szkło mikroskopowe określane jako „wstępnie oczyszczone” nie jest wystarczająco przygotowane do obrazowania nanocząstek i musi zostać odpowiednio oczyszczone przed naniesieniem próbki, aby zapewnić niezakłóconą obserwację. Wiele protokołów czyszczenia szkiełek mikroskopowych zostało wcześniej opisanych¹², jednak etap ten zazwyczaj nie jest raportowany w badaniach eksperymentalnych.

Ostatnim elementem spektroskopii pojedynczych cząstek są metody analizy danych. Należy zmierzyć maksymalną i minimalną intensywność dla każdej nanocząstki, a także średnią wartość lokalnego tła. Analizowane cząstki powinny znajdować się w obszarach wolnych od zanieczyszczeń tła, defektów podłoża lub nierównomiernego oświetlenia. Jedną z metod określania profilu spektralnego nanocząstki jest obliczenie kontrastu cząstki dla każdej długości fali przy użyciu poniższego równania^11,13,14,15:

Alternatywnie, widmo pojedynczej cząstki można rozdzielić na poszczególne komponenty sygnału maksymalnego i minimalnego, które reprezentują dwa pola polaryzacji DIC, wyświetlając w ten sposób dwa jednocześnie zebrane widma zależne od kierunku, zgodnie z dwoma równaniami:

Protokół

1. Przygotowanie próbek przy użyciu standardowych szkiełek przedmiotowych

1. Przygotowanie szkiełek przedmiotowych do nanoszenia próbek.
   UWAGA: W niektórych przypadkach bardziej odpowiednie może być przechowywanie szkła w wodzie ultrapurej zamiast w etanolu. Jednak przechowywanie w wodzie lub powietrzu sprawia, że szkło z czasem staje się hydrofobowe.
   1. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy zakupić szklane lub kwarcowe szkiełka przedmiotowe oraz szkiełka nakrywkowe.
   2. Za pomocą rylca należy wykonać płytką i krótką rysę w centrum każdego szkiełka nakrywkowego.
   3. Należy oczyścić całe szkło mikroskopowe, nawet jeśli zostało zakupione jako „wstępnie oczyszczone”, aby usunąć odłamki szkła, kurz, pył, pozostałości organiczne i wszelkie inne zanieczyszczenia wpływające na jakość obrazowania lub nanoszenie próbek.
      UWAGA: Poniższa metoda czyszczenia sprawdza się w przypadku rodzajów próbek opisanych w niniejszym protokole i pozwala uniknąć stosowania agresywnych chemikaliów. Silniejsze odczynniki chemiczne mogą trawić szkło i wymagają większej ostrożności podczas obchodzenia się z nimi i ich utylizacji.
      1. Umieścić szkło mikroskopowe w statywach, a następnie w zlewce lub naczyniu do barwienia. Nie należy kłaść szkła mikroskopowego na dnie zlewek i innych naczyń laboratoryjnych bez użycia statywów, ponieważ każdy element i powierzchnia szkła powinny być w pełni wystawione na działanie środków czyszczących.
      2. Wlać ~1 mL detergentu w płynie (Tabela materiałów) do naczynia i uzupełnić naczynie wodą. Sonicować przez 30 min.
         UWAGA: Po rozpoczęciu procesu czyszczenia szkło należy dotykać wyłącznie w rękawiczkach, aby uniknąć pozostawienia śladów odcisków palców na szkle.
      3. Wylać zawartość płynną naczynia do czyszczenia do zlewu. Przepłukać naczynie kilka razy wodą ultrapurej, aby usunąć wszelkie ślady detergentu. Napełnić naczynie wodą ultrapurej. Sonicować naczynie ze szkłem mikroskopowym przez kolejne 30 min.
      4. Powtórzyć poprzedni krok co najmniej raz. Wykonywać kolejne cykle sonikacji w wodzie do momentu, gdy stanie się oczywiste, że wszystkie ślady detergentu zostały usunięte.
      5. Wylać zawartość naczynia do czyszczenia. Przepłukać naczynie wodą ultrapurej. Napełnić naczynie etanolem. Sonicować szkło mikroskopowe przez 30 min.
      6. Wylać zawartość naczynia do czyszczenia do pojemnika na odpady. Napełnić ponownie etanolem. Przykryć naczynie, aby zapobiec utracie etanolu w wyniku odparowania. Przechowywać szkło mikroskopowe w tym naczyniu do czasu przeprowadzenia eksperymentu. Szkiełka pozostają czyste i zdatne do użycia tak długo, jak pozostają zanurzone w etanolu w zamkniętym naczyniu.
2. Przygotowanie roztworu nanocząsteczek
   1. Za pomocą mikropipety pobrać 100 µL aliquoty roztworu nanocząsteczek złota o stężeniu 0,05 mg/mL z oryginalnego pojemnika do przechowywania i przenieść roztwór do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL.
   2. Wirować próbkę przez 10 min przy 6 000 x g.
   3. Usunąć nadsącz za pomocą mikropipety, aby usunąć nadmiar surfaktantu.
   4. Za pomocą mikropipety dodać 100 µL wody ultrapurej do probówki wirówkowej.
      UWAGA: Jeśli nie uda się usunąć całego nadsączu przy pierwszej próbie, należy powtórzyć etapy wirowania i resuspensji.
   5. Krótko wymieszać próbkę w wstrząsarku typu vortex, aby zresuspender osad. Bezpośrednio po tym sonicować przez 20 min, aby w pełni zresuspender i rozbić agregaty nanocząsteczek.
      UWAGA: Jeśli próbka nie zostanie użyta natychmiast, należy ją ponownie sonicować przez 20 min przed naniesieniem roztworu na szkło mikroskopowe.
3. Nanoszenie próbki
   1. Wyjąć oczyszczone szkiełka nakrywkowe i przedmiotowe z pojemników do przechowywania. Osuszyć szkło strumieniem sprężonego azotu lub argonu.
   2. Za pomocą mikropipety nanieść metodą drop-casting 6 µL roztworu nanocząsteczek z kroku 1.2.5 na szkiełko nakrywkowe. Aby równomiernie rozprowadzić kroplę, ostrożnie położyć na wierzchu szkiełka nakrywkowego drugi, większy element szkła mikroskopowego, np. drugie szkiełko nakrywkowe lub szkiełko przedmiotowe. Unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza między dwiema warstwami szkła.
      1. Odwrócić podłoże z próbką i uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego wąską linią lakieru do paznokci, aby zapobiec odparowaniu roztworu medium.
      2. Alternatywnie, aby obrazować próbkę „na sucho”, pozostawić roztwór na szkiełku nakrywkowym na 5–15 min, a następnie usunąć zbędny element szkła. Delikatnie osuszyć szkiełko nakrywkowe strumieniem sprężonego azotu lub argonu.
   3. Jeśli to możliwe, obrazować próbki natychmiast po przygotowaniu. Jeśli nie jest to możliwe, przechowywać próbki w zamkniętym naczyniu, np. w szalce Petriego, do czasu obrazowania.

2. Obrazowanie DIC

1. Ustawienie obiektywu i kondensora.
   1. Po umieszczeniu próbki na mikroskopie należy znaleźć płaszczyznę ogniskowania przechodzącą przez próbkę. Najpierw zlokalizuj i ustaw ostrość na wcześniej wykonanym nacięciu. Następnie precyzyjnie dostrój ostrość, aż w polu widzenia pojawią się nanocząstki.
   2. Aby precyzyjnie ustawić kondensor, zastosuj metodę oświetlenia Köhlera.⁵ Oświetlenie Köhlera przy dużym powiększeniu (80x, 100x) łatwiej uzyskać, ustawiając je najpierw przy mniejszym powiększeniu, np. 20x.
      UWAGA: Zazwyczaj oświetlenie Köhlera nie wymaga ponownej regulacji podczas obrazowania pojedynczej próbki. Dobrą praktyką jest jednak weryfikacja poprawności ustawienia oświetlenia Köhlera przy zmianie preparatu na nowy slajd mikroskopowy.
2. Optymalizacja ustawień kontrastu.
   1. Wybierz w próbce obszar zainteresowania do obrazowania. Wycentruj ten obszar w polu widzenia kamery i w razie potrzeby skoryguj ostrość.
      1. Jeśli mikroskop posiada konstrukcję de Senarmonta, zacznij od ustawienia polaryzatora blisko maksymalnego wygaszenia tła, a następnie stopniowo obracaj polaryzator w kierunku zmniejszania wygaszenia tła. Intensywność tła będzie stopniowo wzrastać.
      2. Jeśli mikroskop nie posiada konstrukcji de Senarmonta, zacznij od ustawienia toru optycznego przy maksymalnym wygaszeniu tła. W tym przypadku stopniowo reguluj pozycję pryzmatu obiektywu w kierunku zmniejszania wygaszenia tła.
         UWAGA: Optymalne ustawienie uzyskuje się, gdy nanocząstki osiągają największą różnicę intensywności (tj. kontrast) w stosunku do uśrednionej lokalnej wartości tła. W przypadku nanocząstek plazmonicznych optymalny kontrast jest zazwyczaj osiągany przy stosunkowo ciemnym tle, czyli przy ustawieniach bliskich maksymalnemu wygaszeniu tła.
3. Obrazowanie próbki.
   1. Wyłącz oświetlenie pomieszczenia, aby zapobiec oddziaływaniu światła rozproszonego na proces.
   2. Podczas obserwacji nanocząstek za pomocą naukowej kamery obrazującej określ poziom tła. Używając filtra przepustowego o szerokości połówkowej (FWHM) 10 nm, którego długość fali centralnej pokrywa się z główną długością fali LSPR, obejrzyj obszar zainteresowania. Reguluj intensywność lampy lub czas ekspozycji, aż poziom tła znajdzie się w zakresie 15%–40% maksymalnej pojemności kamery, a żadne obiekty w obszarze zainteresowania nie będą wykazywać intensywności sygnału przekraczającej 90% maksymalnej intensywności kamery.
      UWAGA: Celem kroku 2.3.2 jest zapobieganie nasyceniu sensora podczas przełączania filtrów. Idealny poziom tła będzie różnić się w zależności od próbek i kamer. Po zakończeniu tego kroku można regulować czas ekspozycji, ale nie intensywność lampy.
   3. Wykonaj obrazowanie próbki za pomocą serii filtrów przepustowych, z których każdy ma FWHM 10 nm i które łącznie umożliwiają obrazowanie w całym interesującym zakresie długości fal. Upewnij się, że intensywność tła pozostaje spójna między poszczególnymi obrazami (z dokładnością do ~5%), regulując czas ekspozycji. Po zmianie filtra ponownie ustaw ostrość próbki przed przechwyceniem obrazu.
   4. Zapisz obrazy jako nieskompresowane pliki TIFF i/lub w natywnym formacie plików oprogramowania, aby zachować wszystkie informacje.
4. Obracanie próbki.
   1. Po zebraniu obrazów próbki w jej pierwotnej pozycji można ją teraz obrócić i obrazować w dodatkowych orientacjach w torze świetlnym. Wykonuj obroty w regularnych odstępach (np. 10° lub 15°) w zakresie 180° lub 360°.
      UWAGA: Obracanie wymaga obrotowego stolika mikroskopowego.
   2. Podobnie jak w sekcjach 2.1-2.3, dostosuj ustawienia kamery, aby zapewnić spójny poziom tła między obrazami.
      UWAGA: Nie należy wprowadzać żadnych korekt w oświetleniu Köhlera.

3. Analiza danych przy użyciu programu ImageJ

UWAGA: Poniższe obliczenia można przeprowadzić w różnych pakietach oprogramowania, a czasami w programie natywnym używanym do pozyskiwania obrazów. ImageJ jest bezpłatnie dostępnym oprogramowaniem z National Institutes of Health (NIH).

1. Oblicz kontrast lub intensywność cząstek.
   1. Otwórz obraz w programie ImageJ.
   2. Wybierz narzędzie Rectangle (prostokąt) i obrysuj prostokątem główny obszar zainteresowania.
   3. Na pasku narzędzi wybierz Image, następnie Zoom, a potem To Selection. Okno obrazu zostanie przybliżone do wybranego obszaru.
   4. Na pasku narzędzi wybierz Image, następnie Adjust, a potem Brightness/Contrast. Pojawi się nowe okno. Aby umożliwić lepszy podgląd obszaru próbki, dostosuj cztery ustawienia: Minimum, Maximum, Brightness oraz Contrast. Regulacje te nie zmieniają danych naukowych, a jedynie poprawiają widoczność obszaru próbki.
      UWAGA: Kroki 3.1.3 i 3.1.4 można wykonywać wielokrotnie i w odwrotnej kolejności.
   5. Korzystając ponownie z narzędzia prostokąta, obrysuj ramką pierwszą nanocząstkę do pomiaru. Ramka powinna być tylko nieco większa niż krążek Airy’ego nanocząstki.
   6. Na pasku narzędzi wybierz Analyze, następnie Measure. Pojawi się nowe okno podające wartości Minimum, Maximum oraz Mean Intensity (intensywność średnią) dla pikseli znajdujących się wewnątrz wybranej ramki.
   7. Przesuń ramkę używaną do pomiaru nanocząstki na obszar bezpośrednio sąsiadujący z cząstką, gdzie kontrast tła jest stosunkowo jednorodny i nie występują żadne cząstki ani zanieczyszczenia. Zachowaj oryginalny rozmiar ramki.
   8. Użyj narzędzia Measure, aby wyznaczyć Mean Intensity dla obszaru tła.
   9. Zmierz pozostałe cząstki oraz sąsiadujący z każdą z nich obszar tła.
   10. Powtórz ten proces dla każdej cząstki na wszystkich obrazach w serii.
   11. Wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć kontrast lub intensywność każdej cząstki dla wszystkich długości fal i kątów.
   12. Oblicz kontrast każdej cząstki, korzystając z następującego równania^13,14,15:
       
       UWAGA: Zgodnie z tym równaniem, kontrast cząstki powinien być zawsze > 0.
   13. Oblicz maksymalną wartość cząstki skorygowaną o tło, dzieląc zmierzoną maksymalną intensywność cząstki przez średnią tła:
       
   14. Analogicznie oblicz minimalną wartość skorygowaną o tło, dzieląc zmierzoną minimalną intensywność cząstki przez średnią tła:
       
       UWAGA: Z obliczeń wynika, że wartość maksymalna powinna być większa od jeden, natomiast minimalna mniejsza od jeden. Dopuszczalne jest odjęcie od każdej wartości „1”, tak aby średnie tło wynosiło w zasadzie zero, wartość maksymalna była reprezentowana jako wartość dodatnia, a minimalna jako ujemna¹⁶. To drugie podejście pozwala analitykowi na oddzielne rozważenie zjawisk zachodzących wzdłuż każdego z pól polaryzacji, co jest przydatne podczas badania cząstek anizotropowych.
   15. Aby wykreślić profil spektralny w określonej pozycji nanocząstki, nanieś dane z długością fali na osi x oraz kontrastem lub intensywnością na osi y.
   16. Aby wykreślić profil rotacyjny przy danej długości fali, nanieś kąt obrotu na osi x oraz kontrast lub intensywność na osi y.

Wyniki

W przypadku pracy z próbkami na tyle dużymi, że są widoczne gołym okiem, zazwyczaj nie ma potrzeby nanoszenia punktów orientacyjnych na podłożu szklanym. Jednak przy pracy z nanomateriałami lub gdy wymagana jest rotacja próbki, punkty orientacyjne mogą stanowić prostą metodę lokalizacji, rozróżniania i śledzenia orientacji próbki. Chociaż do nanoszenia punktów orientacyjnych na podłożach szklanych można wykorzystać bardziej zaawansowane techniki¹⁷, zarysowanie szkł...

Dyskusja

Podczas obrazowania za pomocą mikroskopii DIC bardzo ważne jest zoptymalizowanie komponentów optycznych przed zebraniem danych. Nawet niewielkie korekty polaryzatora w trakcie eksperymentu mogą mieć znaczący wpływ na dane końcowe⁶. Co więcej, różne materiały wymagają różnych ustawień polaryzatora. Chociaż zastosowano tutaj duże rozmiary kroków, aby zademonstrować wpływ kąta polaryzacji, w rzeczywistym eksperymencie konieczne jest zoptymalizowanie ustawienia polaryzatora w zakresie 1°–2° od optymal...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	Do czyszczenia szkła mikroskopu, Dostępne u wielu dostawców chemikaliów
Etanol	Fisher Scientific	A962-4	Do czyszczenia i przechowywania szkła mikroskopu
Szkiełka nakrywkowe do	mikroskopu Ted Pella	260148
Szkiełka mikroskopowe szklane	Ted Pella	26007
Złote nanopręty	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
Złote nanosfery (80 nm)	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	Darmowe oprogramowanie dostępne do analizy danych z NIJ
Lakier do paznokci	Mikroskopia elektronowa Sciences	72180
Mikroskop Nikon Ti-E	Nikon	N/A
Azot	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ cyfrowa kamera sCMOS	Pióro do pisania Hamamatsu	77054098
	Amazon	N/A	Wiele opcji dostępnych online za mniej niż 10 USD. Nie trzeba kupować drogiej wersji.
		ultraczysta	18 megaomów

gazowy Woda