Method Article

Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

DOI:

10.3791/59413

⸱

April 17th, 2019

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest opisanie metody preparacji embrionalnych zarodków myszy i wizualizacji embrionalnych komór myszy podczas rozwoju serca przy użyciu specyficznych dla komór fluorescencyjnych myszy reporterowych typu knock-in (MLC-2v-tdMyszy pomidorowe). Rozwój serca obejmuje liniowe tworzenie się rurki serca, pętlę cewy serca i przegrodę czterokomorową. Te złożone procesy są wysoce konserwatywne u wszystkich kręgowców. Embrionalne serce myszy jest szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem serca. Jednak ze względu na ich niezwykle małe rozmiary, preparowanie embrionalnych serc myszy jest technicznie trudne. Ponadto wizualizacja tworzenia się komór sercowych często wymaga hybrydyzacji in situ, barwienia beta-galaktozydazą przy użyciu myszy reporterowych LacZ lub barwienia immunologicznego pociętych serc embrionalnych. Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić sekcję embrionalnych serc myszy i bezpośrednio uwidocznić tworzenie się komory komorowej myszy MLC-2v-tdTomato za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej całej góry. Dzięki tej metodzie możliwe jest bezpośrednie badanie tworzenia i zapętlania się cewy serca oraz tworzenia się czterech komór bez dalszej eksperymentalnej manipulacji zarodkami myszy. Chociaż linia myszy reporterowej MLC-2v-tdTomato jest używana w tym protokole jako przykład, protokół ten można zastosować do innych specyficznych dla serca fluorescencyjnych linii transgenicznych myszy reporterowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie się komory podczas rozwoju serca jest złożonym procesem przechodzącym przez kilka morfologicznie odrębnych etapów embrionalnych1,2. Kształt półksiężyca komórek populacji progenitorów serca tworzy liniową rurkę serca, a następnie ulega wydłużeniu i zapętleniu, tworząc spiralny kształt rozwijającego się serca. Po procesie jego przegrody rozwijające się serce przekształca się w serce czterokomorowe. Przerwanie któregokolwiek z tych procesów skutkuje rozwojowymi wadami serca. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw tworzenia się komór podczas rozwoju serca. Pomimo liczny....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu Vanderbilt.

1. Pobieranie i sekcja zarodków myszy

  1. Połącz 8-10-tygodniowe samice MLC-2v-tdTomato+/- z 8-10-tygodniowymi samcami MLC-2v-tdTomato+/- w celu uzyskania zarodków MLC-2v-tdTomato+/+, MLC-2v-tdTomato+/- i MLC-2v-tdTomato-/-.
  2. Każdego ranka sprawdzaj, czy w koferdamach nie ma zatyczek pochwowych. Południe w dniu wykrycia czopa dopochwowego jest uważane za E0,5.
    UWAGA: Badanie dopochwowe w celu wykrycia czopa poch....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas rozwoju serca, MLC-2v jest uważany za najwcześniejszy marker specyfikacji komory komorowej17. Jak pokazano w Rysunek 1, wypreparowaliśmy całe zarodki myszy i embrionalne serca myszy MLC-2v-tdTomato reporter myszy i zbadaliśmy ekspresję reportera MLC-2v-tdTomato podczas rozwoju serca. U myszy reporterowych typu knock-in MLC-2v-tdTomato konstytutywna ekspresja tdTomato w rozwijającym się sercu jest wizualizowana za pomocą obrazow.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda jest stosunkowo prosta do zbadania rozwoju komór, bez wykonywania pracochłonnych eksperymentów w celu znakowania genów lub białek strukturalnych specyficznych dla komór lub serca. W ten sposób metoda ta minimalizuje różnice techniczne, które często występowały w wycinkach serca poddanych barwieniu immunologicznym.

Istnieją dwa kluczowe kroki do pomyślnego przeprowadzenia tej metody, w tym precyzyjne oszacowanie wieku embrionalnego myszy i sekcja embrionalnych serc. Praktyc.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH R03 HL140264 (Y.-J. N) oraz Gilead Sciences Research Scholar Program (Y.-J. n).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
mikroskop preparacyjnyLeicaMZ125
drabinka DNA (100 pz)PromegaG2101
LeicaM165 FC
GoTaq Green master MixPromegaM712
PCR (master cycler)Eppendorf6336000023
Mikroskop preparacyjny epifluorescencyjny

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
  2. Paige, S. L., Plonowska, K., Xu, A., Wu, S. M. Molecular regulation of cardiomyocyte differentiation. Circulation Research. 116 (2), 341-353 (2015).
    3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Embryonic Heart DissectionWhole Mount EpifluorescenceMLC 2v tdTomato ReporterHeart Tube FormationChamber SeptationEmbryo GenotypingFluorescent MicroscopyCardiac Chamber DevelopmentMouse EmbryogenesisVentricular Chamber Visualization

Related Articles