Analiza rozwoju komory serca podczas embriogenezy myszy z wykorzystaniem epifluorescencji całej góry

Summary

Prezentujemy protokoły do badania rozwoju serca myszy za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej na pełnych zarodkach myszy wypreparowanych z komorowych specyficznych dla komór MLC-2v-tdPomidorowych myszy reporterowych. Metoda ta pozwala nam bezpośrednio uwidocznić każdy etap powstawania komory podczas rozwoju serca myszy bez pracochłonnych metod histochemicznych.

Abstract

Celem tego protokołu jest opisanie metody preparacji embrionalnych zarodków myszy i wizualizacji embrionalnych komór myszy podczas rozwoju serca przy użyciu specyficznych dla komór fluorescencyjnych myszy reporterowych typu knock-in (MLC-2v-tdMyszy pomidorowe). Rozwój serca obejmuje liniowe tworzenie się rurki serca, pętlę cewy serca i przegrodę czterokomorową. Te złożone procesy są wysoce konserwatywne u wszystkich kręgowców. Embrionalne serce myszy jest szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem serca. Jednak ze względu na ich niezwykle małe rozmiary, preparowanie embrionalnych serc myszy jest technicznie trudne. Ponadto wizualizacja tworzenia się komór sercowych często wymaga hybrydyzacji in situ, barwienia beta-galaktozydazą przy użyciu myszy reporterowych LacZ lub barwienia immunologicznego pociętych serc embrionalnych. Tutaj opisujemy, jak przeprowadzić sekcję embrionalnych serc myszy i bezpośrednio uwidocznić tworzenie się komory komorowej myszy MLC-2v-tdTomato za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej całej góry. Dzięki tej metodzie możliwe jest bezpośrednie badanie tworzenia i zapętlania się cewy serca oraz tworzenia się czterech komór bez dalszej eksperymentalnej manipulacji zarodkami myszy. Chociaż linia myszy reporterowej MLC-2v-tdTomato jest używana w tym protokole jako przykład, protokół ten można zastosować do innych specyficznych dla serca fluorescencyjnych linii transgenicznych myszy reporterowych.

Introduction

Tworzenie się komory podczas rozwoju serca jest złożonym procesem przechodzącym przez kilka morfologicznie odrębnych etapów embrionalnych^1,2. Kształt półksiężyca komórek populacji progenitorów serca tworzy liniową rurkę serca, a następnie ulega wydłużeniu i zapętleniu, tworząc spiralny kształt rozwijającego się serca. Po procesie jego przegrody rozwijające się serce przekształca się w serce czterokomorowe. Przerwanie któregokolwiek z tych procesów skutkuje rozwojowymi wadami serca. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw tworzenia się komór podczas rozwoju serca. Pomimo licznych wcześniejszych badań nad rozwojem serca, nasza wiedza na temat tego złożonego procesu pozostaje ograniczona.

Hybrydyzacja in situ, immunohistochemia i barwienie beta-galaktozydazy przy użyciu myszy reporterowych LacZ były szeroko stosowane do badania tworzenia komór podczas rozwoju serca myszy poprzez znakowanie specyficznych dla serca lub komór genów lub białek strukturalnych (np. Nppa, Coup-TFII, Irx4, MLC-2a i MLC-2v)^{3,4,5,6,7,8,9,10}. Jednak te eksperymenty z wykorzystaniem embrionów myszy wymagają znacznego czasu i wiedzy specjalistycznej, ponieważ kilka różnych etapów eksperymentalnych musi być wykonywanych sekwencyjnie¹¹. Tutaj opisujemy prostą metodę mikroskopii epifluorescencyjnej całej góry do wizualizacji rozwijających się komór przy użyciu zarodków wypreparowanych z MLC-2v-tdMyszy reporterowe Tomato knock-in¹². Zaletą tej metody w porównaniu z poprzednio stosowanymi metodami jest uniknięcie skomplikowanych etapów eksperymentalnych, które często mogą prowadzić do powstania różnic eksperymentalnych. Głównym celem tego protokołu jest opisanie sposobu preparowania zarodków myszy i rozwijających się serc oraz zbadanie każdego etapu rozwoju komory serca myszy bez żmudnych eksperymentów histochemicznych. Metodę tę można łatwo zastosować do oceny rozwoju serca przy użyciu różnych innych transgenicznych linii myszy oznaczających wczesne markery sercowe (np. Mesp1Cre: Rosa26EYFP¹³, Isl1Cre: Rosa26EYFP¹³, Hcn4H2BGFP¹⁴, Hcn4Cre: Rosa mT/mG¹⁴, Nkx2-5Cre: Rosa mT/mG¹⁴, Hcn4-eGFP¹⁵, Isl1Cre: Rosa mT/mG¹⁴, Nkx2.5Cre: Rosa26tdTomato¹⁵ oraz TgMef2c-AHF-GFP¹⁶ myszy).

Protocol

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Centrum Medycznego Uniwersytetu Vanderbilt.

1. Pobieranie i sekcja zarodków myszy

1. Połącz 8-10-tygodniowe samice MLC-2v-tdTomato^+/- z 8-10-tygodniowymi samcami MLC-2v-tdTomato^+/- w celu uzyskania zarodków MLC-2v-tdTomato^+/+, MLC-2v-tdTomato^+/- i MLC-2v-tdTomato^-/-.
2. Każdego ranka sprawdzaj, czy w koferdamach nie ma zatyczek pochwowych. Południe w dniu wykrycia czopa dopochwowego jest uważane za E0,5.
   UWAGA: Badanie dopochwowe w celu wykrycia czopa pochwowego należy wykonać rano (w ciągu 8-24 godzin po aktywności seksualnej), ponieważ czop pochwowy może zostać utracony w ciągu dnia.
3. Poddaj eutanazji ciężarne matki w różnych dniach po stosunku (np. E8,5, E10,5 i E12,5) za pomocą inhalacji CO_{2 ,} a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
4. Połóż myszy na wznak i spryskaj 70% etanolem brzuch myszy, aby uniknąć zanieczyszczenia włosów myszy podczas sekcji.
5. Otwórz jamę brzuszną, nacinając zarówno skórę, jak i ścianę brzucha za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
6. Zlokalizuj obustronne rogi macicy w grzbietowej części jamy brzusznej.
7. Oddziel całą macicę, ostrożnie przecinając jajowody po obu stronach za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczyka.
8. Umieść całą wypreparowaną macicę na 10-centymetrowej szalce Petriego z lodowatym PBS i ostrożnie oddziel każdy worek owodniowy wzdłuż rogu macicy za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy.
9. Przenieś każdy zarodek do indywidualnych dołków z 6-dołkową płytką wypełnioną lodowatym PBS za pomocą pipety transferowej.
10. Pod mikroskopem preparacyjnym otwórz worek owodniowy i odsłonij każdy zarodek, odcinając pępowinę za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszcza w indywidualnym dołku 6-dołkowej płytki z lodowatym PBS.
11. Wytnij tkanki pozazarodkowe w jak największym stopniu, nie uszkadzając zarodka, używając ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszcza.
    UWAGA: Obrazowanie epifluorescencyjne całego zarodka myszy jest zwykle wykonywane przed preparacją rozwijającego się serca, jak opisano poniżej.
12. Przeciąć głowę zarodka za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszcza i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml ze 100 μl buforu A (25 mM NaOH i 0,2 mM EDTA) w celu genotypowania w celu skorelowania z wynikami obrazowania epifluorescencyjnego.
13. Otwórz klatkę piersiową zarodka za pomocą cienkich kleszczy, usuń serce z płuc i naczyń krwionośnych za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych i kleszczy, a następnie przenieś wypreparowane serce zarodkowe do studzienki 12-dołkowej z PBS za pomocą pipety transferowej. Wszystkie procedury preparacyjne wykonywane są pod mikroskopem preparacyjnym z oświetlaczem mikroskopu światłowodowego.
    UWAGA: Technicznie trudno było wypreparować embrionalne serca myszy w E8.0 lub E8.5, ze względu na ich niezwykle mały rozmiar i delikatną strukturę. Wczesne serca embrionalne (tj. E8.0 i E8.5) mogą być badane w obrębie całego zarodka bez sekcji.

2. Obrazowanie epifluorescencyjne w całości

1. Umieść 12-dołkową płytkę z mysimi sercami embrionalnymi pod epifluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym.
2. Pod epifluorescencyjnym mikroskopem preparacyjnym przy użyciu cienkich kleszczy ustaw serce zarodkowe tak, aby rozwijające się komory znajdowały się blisko badającego.
3. Dostosuj ostrość obrazu za pomocą obiektywu 0,63x (zakres zoomu od 3,15x do 18,9x) w trybie jasnego pola.
4. Rób ekspozycje w jasnym polu i rób wiele zdjęć. Obrazy były zwykle uzyskiwane przez jednosekundową ekspozycję. Jednak czasy naświetlania mogą się różnić w zależności od oświetlenia i specyfikacji aparatu i muszą być zoptymalizowane dla każdej konfiguracji.
5. Wyłącz oświetlacz mikroskopu światłowodowego i ustaw filtr na czerwoną fluorescencję (Ex545 nm/Em 605 nm), aby uwidocznić ekspresję tdTomato.
6. W razie potrzeby ponownie dostosuj ostrość obrazu.
7. Dostosuj jasność i kontrast, wykonuj ekspozycje z czerwoną jarzeniówką i rób wiele zdjęć.
   UWAGA: Zwykle używano następujących ustawień obrazu: czas ekspozycji 1 s, wzmocnienie 2x, nasycenie 1,0 i korekcja gamma 1,0. Optymalne ustawienie musi być zoptymalizowane dla każdego eksperymentu. Po określeniu optymalnego ustawienia należy użyć tego samego ustawienia w całym eksperymencie.

3. Genotypowanie

1. Gotować próbki z etapu 1.12 przez 1 godzinę w temperaturze 100 °C.
2. Wirować przez 2 minuty przy 11 360 x g, przenieść 20 μl supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 ml z 20 μl buforu B (40 mM Tris HCl, pH 5,5) i wymieszać.
3. Pobrać 4,5 μl zmieszanego supernatantu z kroku 3.2 jako matrycę DNA, połączyć go z 0,5 μl każdego ze specyficznych starterów do przodu i do tyłu (10 μM), 10 μl wstępnie zmieszanej polimerazy i buforu reakcyjnego (2x) (patrz tabela materiałów), a następnie dodać wodę do całkowitej objętości 20 μl. Sekwencje starterów są następujące.
   F1: 5'-TACCCACGGAGAAGAGAAGGACT-3'
   R1: 5'-TGGACTTCTTGGAACTGACTCTGT-3'
   F2: 5'-ACGGCACGCTGATCTACAAGGT-3'
   R2: 5'-TTTGCGCACAGCCCTGGGAT-3'
4. Uruchom reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) za pomocą następującego programu PCR (Tabela 1 i Tabela 2).
5. Uruchom próbki PCR i drabinkę DNA na 1% żelu agarozowym przy 140 V w 1x buforze TAE (Tris-acetate-EDTA) (40 mM Tris-acetate i 1 mM EDTA) przez 25 minut. Użyj drabinki DNA 100 pz, aby oszacować rozmiar prążków PCR.
6. Umieść żel DNA na transiluminatorze UV, aby zidentyfikować prążki DNA i włączyć światło UV.

Results

Podczas rozwoju serca, MLC-2v jest uważany za najwcześniejszy marker specyfikacji komory komorowej¹⁷. Jak pokazano w Rysunek 1, wypreparowaliśmy całe zarodki myszy i embrionalne serca myszy MLC-2v-tdTomato reporter myszy i zbadaliśmy ekspresję reportera MLC-2v-tdTomato podczas rozwoju serca. U myszy reporterowych typu knock-in MLC-2v-tdTomato konstytutywna ekspresja tdTomato w rozwijającym się sercu jest wizualizowana za pomocą obrazow...

Discussion

Opisana tutaj metoda jest stosunkowo prosta do zbadania rozwoju komór, bez wykonywania pracochłonnych eksperymentów w celu znakowania genów lub białek strukturalnych specyficznych dla komór lub serca. W ten sposób metoda ta minimalizuje różnice techniczne, które często występowały w wycinkach serca poddanych barwieniu immunologicznym.

Istnieją dwa kluczowe kroki do pomyślnego przeprowadzenia tej metody, w tym precyzyjne oszacowanie wieku embrionalnego myszy i sekcja embrionalnych serc. Praktyc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mikroskop preparacyjny	Leica	MZ125
drabinka DNA (100 pz)	Promega	G2101
	Leica	M165 FC
GoTaq Green master Mix	Promega	M712
PCR (master cycler)	Eppendorf	6336000023