Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59414

⸱

24 kwietnia 2019

 , 
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln

W tym artykule

Podsumowanie

Aby w sposób powtarzalny zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, zoptymalizowano jednocząsteczkową fluorescencję RNA in situ (RNA-FISH) dla komórek nieprzylegających. Oocyty zebrano, zhybrydyzowano z sondami specyficznymi dla transkryptu i oznaczono ilościowo za pomocą oprogramowania do kwantyfikacji obrazu.

Streszczenie

Obecne metody rutynowo używane do ilościowego oznaczania mRNA w oocytach i zarodkach obejmują cyfrową reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (dPCR), ilościową, RT-PCR (RT-qPCR) w czasie rzeczywistym i sekwencjonowanie RNA. Gdy techniki te są wykonywane przy użyciu pojedynczego oocytu lub zarodka, mRNA o niskiej kopii nie są wiarygodnie wykrywane. Aby przezwyciężyć ten problem, oocyty lub zarodki można połączyć ze sobą w celu analizy; Często jednak prowadzi to do dużej zmienności między próbkami. W tym protokole opisujemy zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) przy użyciu rozgałęzionej chemii DNA. Technika ta identyfikuje przestrzenny wzorzec mRNA w poszczególnych komórkach. Gdy technika ta jest połączona z oprogramowaniem komputerowym do wyszukiwania i śledzenia miejsc, można również określić ilościowo obfitość mRNA w komórce. Dzięki tej technice zmienność w grupie eksperymentalnej jest zmniejszona, a do wykrycia istotnych różnic między grupami eksperymentalnymi potrzeba mniej oocytów i zarodków. Dostępne na rynku zestawy SM-FISH z rozgałęzionym DNA zostały zoptymalizowane pod kątem wykrywania mRNA w pociętych tkankach lub przylegających komórkach na szkiełkach. Jednak oocyty nie przylegają skutecznie do szkiełek, a niektóre odczynniki w zestawie były zbyt ostre, co powodowało lizę oocytów. Aby zapobiec tej lizie, w zestawie FISH wprowadzono kilka modyfikacji. W szczególności do permeabilizacji i płukania oocytów przeznaczone do immunofluorescencji oocytów i zarodków zastąpiły zastrzeżone. Permeabilizację, płukanie i inkubacje za pomocą sond i wzmacniacza przeprowadzono na płytkach 6-dołkowych, a oocyty umieszczono na szkiełkach pod koniec protokołu za pomocą pożywki montażowej. Modyfikacje te pozwoliły przezwyciężyć ograniczenia dostępnego na rynku zestawu, w szczególności proces lizy oocytów. Aby dokładnie i powtarzalnie zliczyć liczbę mRNA w poszczególnych oocytach, wykorzystano oprogramowanie komputerowe. Razem protokół ten stanowi alternatywę dla PCR i sekwencjonowania w celu porównania ekspresji określonych transkryptów w pojedynczych komórkach.

Wprowadzenie

Reakcja polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) jest uznawana za złoty standard w oznaczaniu ilościowym mRNA. Obecnie stosuje się dwie metody: cyfrową PCR (dPCR)1 oraz ilościową PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)2. Spośród tych dwóch technik PCR, dPCR wykazuje większą czułość niż qPCR, co sugeruje możliwość jej wykorzystania do pomiaru poziomu mRNA w pojedynczych komórkach. Jednak w naszych badaniach analiza dPCR mRNA o niskiej liczności w pulach od 5 do 10 oocytów na każdą próbkę doświadczalną dostarczyła danych o niskiej powtarzalności i wysokiej zmienności3. Jest to prawdopodobnie spowodowane błędem eksperymentalnym związanym z ekstrakcją RNA oraz wydajnością odwrotnej transkrypcji. Sekwencjonowanie RNA przeprowadzono również na pojedynczych oocytach mysich i ludzkich4,5. Technika ta wymaga etapów amplifikacji cDNA niezbędnych do generowania bibliotek, co prawdopodobnie zwiększa zmienność w obrębie grupy doświadczalnej. Co więcej, transkrypty o niskiej liczności mogą pozostać niewykrywalne. Chociaż ceny sekwencjonowania spadły w ciągu ostatnich kilku lat, koszty analiz bioinformatycznych wciąż mogą być barierą finansową. Wreszcie, lokalizacja mRNA jest procesem dynamicznym, a zmiany przestrzenne wpływają na funkcję białek6. Dlatego postanowiliśmy wdrożyć technikę, która pozwoliłaby na uzyskanie dokładnych i powtarzalnych pomiarów ilościowych oraz określenie lokalizacji poszczególnych cząsteczek mRNA w pojedynczych oocytach.

Metoda hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej z wykorzystaniem rozgałęzionego DNA (branched DNA) wzmacnia sygnał fluorescencyjny, a nie RNA/cDNA, co umożliwia detekcję pojedynczych cząsteczek mRNA w poszczególnych komórkach 7,8,9. Analizę przeprowadza się poprzez serię etapów hybrydyzacji, amplifikacji (przy użyciu rozgałęzionego DNA) oraz znakowania fluorescencyjnego w celu wzmocnienia sygnału fluorescencji7. Technika ta rozpoczyna się od wiązania par sond oligonukleotydowych o długości od 18 do 25 zasad, które są komplementarne do konkretnego mRNA3,8,10. Dla każdego transkryptu projektuje się od piętnastu do dwudziestu par sond, co zapewnia specyficzność względem docelowego transkryptu. Po hybrydyzacji specyficznej dla mRNA następują sondy preamplifikacyjne i amplifikacyjne, które tworzą strukturę rozgałęzioną. Do każdego amplifikatora wiąże się około 400 fluoroforów, co skutkuje 8000-krotnym wzrostem fluorescencji, umożliwiając detekcję pojedynczych cząsteczek mRNA (Rysunek 1)11.

Schemat amplifikacji mRNA; etapy wiązania celu, przedwzmacniacza, wzmacniacza i znacznika; ekspresja genów.
Rycina 1: Schemat protokołu SM-FISH. Przedstawiono sekwencyjną hybrydyzację sondy specyficznej dla transkryptu, rozgałęzionego wzmacniacza DNA oraz fluoroforu z docelowym mRNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Poprzednie badania z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ pojedynczych cząsteczek (SM-FISH) pozwoliły na lokalizację mRNA β-aktyny w pojedynczych neuronach12 oraz DNA wirusa brodawczaka ludzkiego w liniach komórkowych raka szyjki macicy7. Oprogramowanie komputerowe Spot Finding and Tracking Program identyfikuje pojedyncze, punktowe sygnały fluorescencyjne i było z sukcesem stosowane do kwantyfikacji liczby cząsteczek mRNA w każdej komórce3,13.

Opierając się na wynikach detekcji mRNA w neuronach12, wysunęliśmy hipotezę, że SM-FISH okaże się użytecznym narzędziem do ilościowego oznaczania poziomów transkryptów w oocytach i embrionach myszy, w tym mRNA o niskiej liczności. Jednak technika ta jest zoptymalizowana do stosowania w przyległych komórkach utrwalonych oraz w przekrojach tkanek utrwalonych formaliną i zatopionych w parafinie (FFPE). Oocyty nie mogą przylegać do szkiełka, nawet jeśli jest ono pokryte poli-L-lizyną. Ponadto są one bardziej delikatne niż komórki somatyczne i przekroje tkanek, co prowadzi do lizy komórek podczas kontaktu z niektórymi z zastrzeżonych buforów zawartych w komercyjnie dostępnych zestawach3. Aby pokonać te trudności, oocyty utrwalono i przenoszono ręcznie pomiędzy kroplami buforów. Dodatkowo, bufory do permeabilizacji i płukania w zestawach zostały zastąpione w celu zmniejszenia lizy komórkowej. Projektowane sondy nabywa się wraz z zestawem FISH lub można zamówić sondy do konkretnych transkryptów. Każdy zastrzeżony zestaw sond jest dostępny w jednym z trzech kanałów fluorescencji (C1, C2 i C3), co umożliwia multipleksowanie. W niniejszym doświadczeniu oocyty myszy poddano podwójnemu barwieniu i analizie ilościowej przy użyciu sondy C2 do Nanog oraz sondy C3 do Pou5f1. Sondy te wybrano na podstawie zgłaszanej ekspresji Nanog i Pou5f1 w oocytach i embrionach. Po zakończeniu etapów hybrydyzacji oocyty umieszczono w kroplach medium montażowego anti-fade w celu naniesienia ich na szkiełka histologiczne. Obrazy konfokalne wykorzystano do ilościowego oznaczenia liczby punktowych sygnałów fluorescencyjnych, które reprezentują pojedyncze cząsteczki mRNA. Oprócz ilościowego oznaczania mRNA, obrazowanie ukazało również rozkład przestrzenny konkretnego mRNA w komórce, czego nie są w stanie osiągnąć inne metody ilościowego oznaczania RNA. Technika ta wykazała niską zmienność w obrębie grupy eksperymentalnej, co pozwoliło na wykorzystanie mniejszej liczby oocytów w każdej grupie w celu zidentyfikowania istotnych różnic między grupami eksperymentalnymi3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury dotyczące zwierząt zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Nebraska-Lincoln, a wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. W badaniu tym myszy nieliniowe CD-1 miały dostęp ad libitum do standardowej karmy dla gryzoni i wody; były utrzymywane w 12-godzinnym cyklu ciemność:światło.

1. Przygotowanie niezbędnych pożywek

  1. Aby przygotować pożywkę podstawową (OMM), do 100 mL sterylnej wody dodać 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4 oraz 1,7 mM CaCl2-2H2O.
    UWAGA: Pożywkę OMM można przechowywać do 1 miesiąca.
  2. Aby przygotować pożywkę kompletną (OMOPS), do roztworu OMM rozcieńczonego w sterylnej wodzie w stosunku 1:10 dodać 20 mM kwasu 3-morfolinopropano-1-sulfonowego (MOPS), 1,2 mM MgSO4-7H2O, 0,5 mM glukozy, 6 mM L-mleczanu, 1 mM ala-gln, 0,1 mM tauryny, 1x nieessentialnych aminokwasów (NEAA), 0,01 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 10 µM kwasu alfa-liponowego, 10 µg/mL nierozcieńczonego gentamycyny, 21 mM 1 M NaOH, 5 mM NaHCO3, 0,2 mM pirogronianu, 0,5 mM cytrynianu oraz 4 mg/mL FAF BSA, tak aby uzyskać objętość całkowitą 100 mL. Pożywkę wysterylizować za pomocą filtra 0,22 µM.
    UWAGA: Pożywkę OMOPS można przechowywać do 1 tygodnia.
  3. Aby przygotować pożywkę utrzymującą (HM), do OMOPS dodać 5% płodowej surowicy bydlęcej. Przygotować 2 mL HM na jedną mysz.
  4. Aby przygotować roztwór hialuronidazy, do 1 mL HM dodać 0,1 mg/mL hialuronidazy pochodzącej z jąder bydlęcych.
  5. Aby przygotować bufor do fiksacji, połączyć 4% paraformaldehydu w 10 mL 1x PBS z 0,1% poliwinilopirorolidonu (PVP) klasy embrionalnej14.
  6. Aby przygotować 50 mL buforu do płukania (WB), do 1x PBS dodać 0,1% niejonowego surfaktantu oraz 0,1% PVP14.
  7. Aby przygotować 10 mL buforu do permeabilizacji, do 1x PBS dodać 1% niejonowego surfaktantu14.
    UWAGA: Opisane powyżej bufory do płukania i permeabilizacji zastępują bufory zastrzeżone zawarte w komercyjnie dostępnych zestawach.

2. Pobieranie owulowanych oocytów od samic myszy

  1. Przygotowanie:
    1. Stymuluj myszy samice w wieku 5–8 tygodni poprzez doszpikowe (IP) wstrzyknięcie 5 IU ekwinnej gonadotropiny kosmórkowej (eCG), a następnie 5 IU ludzkiej gonadotropiny kosmórkowej (hCG) po upływie 44–48 h15,16.
    2. Przechowuj szalki Petriego o średnicy 35 mm zawierające 2 mL HM na podgrzewaczu ustawionym na 37 °C. Do szalki Petriego o średnicy 60 mm nanieś pipetą jedną kroplę 100 µL HM zawierającą rozcieńczoną hialuronidazę, a następnie trzy krople po 50 µL HM bez hialuronidazy. Przed użyciem umieść szalki z kroplami na podgrzewaczu w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Krople z hialuronidazą należy przygotować bezpośrednio przed sekcją każdej pary jajowodów, aby zapobiec odparowaniu i zagęszczeniu składników HM z hialuronidazą lub bez niej.
  2. Uśmierć myszy 16 h po wstrzyknięciu hCG drogą IP, stosując przedawkowanie izofluranu, a następnie zwichnięcie stawów szyjnych.
  3. Oczyść mysz za pomocą 70% etanolu. Odsłoń jamę brzuszną i zlokalizuj żeński układ rozrodczy. Chwyć jajnik pincetą, a następnie usuń więzadła macicy i nadmiar tkanki tłuszczowej z okolic jajnika. Odetnij jajowód od macicy i umieść parę jajnik-jajowód w ciepłym HM w szalce 35 mm.
  4. Usuń jajnik oraz wszelką otaczającą go tkankę tłuszczową. Przerwij ścianę nabrzmiałej kątownicy jajowodu, używając igły 27G o długości ½ cala. Przesuń jajowód w miejscu przerwania, aby wypchnąć kompleksy komórek cumulus-oocyt (COC). Przenieś owulowane oocyty, które prawdopodobnie znajdują się w metafazie II (MII) mejozy, do kropli 100 μL zawierającej pożywkę HM z hialuronidazą za pomocą pipety ustnej (Rysunek 2).

Konfiguracja pipety, schemat systemu przenoszenia płynów do eksperymentów laboratoryjnych i pipetowania.
Rysunek 2: Elementy pipety ustnej używanej do przenoszenia oocytów. (A) końcówka ustna (B) filtr 0.22 um, 4mm (C) rurka aspiratora (D) końcówka pipety 1000 μL (E) pipeta Pasteura 9". Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Za pomocą pipety ustnej pipetować kompleksy oocytów MII z komórkami cumulus w medium HM zawierającym hialuronidazę, aby usunąć komórki cumulus. Po całkowitym uwolnieniu oocytów z komórek cumulus, przenieść każdy oocyt do kropli płuczącej zawierającej samo HM, używając pipety ustnej. Powtórzyć tę czynność dla każdej kropli płuczącej. Nie przenosić oocytów fragmentujących lub przezroczystych15.
    UWAGA: Ważne jest, aby przenosić oocyty z każdej kropli w szalce 35 mm przy użyciu jak najmniejszej ilości HM. Dotyczy to każdego przeniesienia w protokole. Oocyty MII nie mogą pozostawać w medium HM zawierającym hialuronidazę dłużej niż przez jedną minutę.

3. Barwienie oocytów metodą SM-FISH

  1. Utrwal oocyty w pojedynczej studience płytki 6-studzienkowej zawierającej 500 µL buforu do fiksacji. Zanurzyć w dołku 20 lub mniej oocytów. Inkubować przez 20 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Każdy etap barwienia SM-FISH odbywa się w oddzielnej studience stołowej płyty 6-dołkowej o stożkowym dnie. Należy upewnić się, że oocyty są całkowicie zanurzone w buforach i nie unoszą się na ich powierzchni. Każdy etap należy przeprowadzić z maksymalnie 20 oocytami w każdej studience.
  2. Przenieś utrwalone oocyty do 500 μL buforu do płukania (WB opisanego w kroku 1.6) przez 10 min każde. Powtórzyć czynność jeszcze 2 razy.
  3. Inkubować oocyty w buforze do permeabilizacji przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Bufor do permeabilizacji opisany w kroku 1.7 zastępuje zastrzeżony bufor do permeabilizacji.
    1. Przygotować zestawy sond i krótko odwirować je w mikrocentryfudze. Każdy zestaw sond ogrzewać przez 10 min w 40 °C łaźnia wodna lub inkubator. Schłodzić do temperatury pokojowej.
      UWAGA: Ten etap należy przeprowadzić podczas inkubacji w warunkach permeabilizacji
  4. Przemyj oocyty w 500 µL western blotu przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść oocyty do 80 μL buforu Protease III Buffer (dostępnego w zestawie), rozcieńczonego w stosunku 1:8 w 1X PBS, przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: The 80 µL objętość ta odpowiednio pokrywa dno pojedynczego dołka w płytce 6-dołkowej.
  6. Przemyć oocyty w 500 µL western blotu przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  7. Rozcieńczyć podgrzane zestawy sond dla Nanog, Pou5f1, i DapB (gen kontroli negatywnej), 1:50 w rozcieńczalniku do sond. Inkubować oocyty w 80 μL sondy specyficznej dla transkryptu przez 2 godziny w temperaturze 40° C.
    UWAGA: Każdy zestaw sond zastrzeżonych jest dostępny w jednym z trzech kanałów fluorescencji (C1, C2 i C3). Nanog i Pou5f1 sondy zostały odpowiednio oznakowane C2 i C3.
  8. Doprowadzić do temperatury pokojowej zastrzeżone odczynniki: Amplifier 1 (AMP 1), Amplifier 2 (AMP 2), Amplifier 3 (AMP 3) oraz Amplifier 4-fluorescence (AMP 4-FL).
    UWAGA: Ten krok należy przeprowadzić podczas 2-godzinnej inkubacji sond specyficznych dla transkryptu.
  9. Przenieś oocyty do 500 μL do WB i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  10. Inkubować oocyty sekwencyjnie w buforach amplifikacyjnych.
    1. Inkubować oocyty w 80 µL AMP1 przez 30 min w temperaturze 40° CPrzenieś oocyty do 500 µL analizy Western blot przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    2. Inkubować oocyty w 80 µL AMP2 przez 15 min w temperaturze 40 °CPrzenieść oocyty do 500 µL analizy WB przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    3. Inkubować oocyty w 80 µL AMP3 przez 30 min w temperaturze 40 °CPrzenieść oocyty do 500 µL przez 10 min w temperaturze pokojowej dla WB.
      UWAGA: Pozostałą część protokołu należy przeprowadzić w ciemności, ponieważ AMP-FL zawiera fluorofor. Podczas pracy z mikroskopem stereoskopowym należy maksymalnie ograniczyć natężenie światła.
    4. Dodaj oocyty do 80 μL AMP4-FL przez 15 min w 40° C.
      UWAGA: AMP4-FL jest dostarczany jako alternatywny bufor-A (Alt-A), Alt-B lub Alt-C. Należy wybrać bufor AMP4-FL w zależności od pożądanej długości fali emisji.
  11. Przemyj oocyty w 500 µL WB przez 10 min w temperaturze pokojowej. Inkubować oocyty w 80 µL DAPI przez 20 min w temperaturze pokojowej. Przemyć oocyty w 500 µL analizy WB przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  12. Pipeta 12 µL medium montażowego zapobiegającego blaknięciu na środek szkiełka przedmiotowego, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do odczynnika. Przenieść oocyty wraz z jak najmniejszą ilością buforu WB do medium montażowego i nałożyć szkiełko nakrywkowe.
    1. Przechylić szkiełko nakrywkowe pod kątem, a następnie powoli i delikatnie położyć je na cieczy znajdującej się na szkiełku przedmiotowym. Należy unikać zbyt silnego dociskania nakrywki, aby zapobiec deformacji oocytów i powstaniu pęcherzyków powietrza.
    2. Przechowywać preparaty w ciemnym pudełku do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Brzegi szkiełek zakryć bezbarwnym lakierem do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe.
  13. Przy użyciu standardowego mikroskopu należy zlokalizować oocyty na szkiełku i zakreślić je markerem permanentnym.
    UWAGA: Ten krok nie jest wymagany, ale ułatwia lokalizację oocytów na szkiełku. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy wykonać obrazowanie szkiełek w ciągu od 1 do 5 dni, ponieważ sygnał fluorescencyjny zacznie zanikać.

4. Przetwarzanie obrazów

  1. Wykonaj obrazowanie trójwymiarowe oocytów, stosując mikroskopię konfokalną z krokiem w osi z.
    UWAGA: Aby dokładnie przeanalizować obrazy, każdy krok w osi z powinien wynosić 1.0 µm/warstwę.
  2. Zapisz obrazy konfokalne jako skompresowane pliki nd2 lub poszczególne pliki .TIFF dla każdego oocytu. Oba typy obrazów są kompatybilne z programem do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym Fiji.
  3. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie Fiji z otwartym dostępem (https://imagej.net/Fiji/Downloads). 
    1. Przeciągnij pliki nd2 do programu Fiji i wybierz hyperstack. Jeśli obrazy konfokalne zostały zapisane jako pliki .TIFF, przejdź do kroku 4.4.
      UWAGA: Po przeciągnięciu pliku nd2 do programu Fiji menu rozwijane hyperstack powinno pojawić się automatycznie.
    2. Kliknij kartę Image, wybierz Color, a następnie kliknij Split Channels, aby rozdzielić kanały fluorescencyjne pliku nd2.
    3. Wygeneruj poszczególne pliki .TIFF dla każdego przekroju z oocytu w każdym kanale fluorescencyjnym. Kliknij kartę Image, wybierz Stacks, a następnie kliknij Stack to Images. Kliknij kartę Image, wybierz Type, a następnie kliknij RGB Color, aby przekonwertować każdy przekrój z na oddzielny obraz kolorowy RGB.
      UWAGA: Kolor RGB jest sztuczny i może być dowolnie wybrany dla każdej długości fali emisji.
    4. Zapisz każdy przekonwertowany obraz jako plik .TIFF. Obrazy z jednego oocytu dla każdego kanału fluorescencyjnego umieść w nowym folderze, aby uniknąć pomyłek podczas składania obrazów (krok 4.3).
  4. Znormalizuj każdy obraz .TIFF dla Pou5f1 oraz Nanog przy użyciu obrazów kontroli negatywnej (DapB).
    UWAGA: Normalizację wykonuje się przy użyciu programu do edycji zdjęć. Należy upewnić się, że z każdego obrazu kontrolnego usunięto ten sam poziom fluorescencji tła.
  5. Otwórz każdy znormalizowany plik .TIFF w programie Fiji, aby złożyć wszystkie przekroje z dla każdego oocytu w każdej długości fali.
    1. Kliknij kartę Plugins, wybierz Stitching, a następnie kliknij Grid/Collection (Rycina 3A). Z menu rozwijanego wybierz Sequential Images i kliknij OK (Rycina 3B).
    2. Przeglądaj katalog i wybierz folder zawierający wszystkie obrazy przekrojów z dla pojedynczego oocytu przy jednej długości fali (patrz krok 4.3.4). Kliknij OK.
    3. Przesuń suwak na dole złożonego obrazu do odpowiedniego kanału kolorów dla użytej długości fali i utwórz końcowy złożony obraz RGB, klikając Image, wybierając Type i klikając RGB Color.
      UWAGA: Obraz ten zostanie wykorzystany do ilościowego oznaczania fluorescencji opisanego w kroku 4.6 poniżej.
  6. Konwertuj złożony obraz na 32-bitowy obraz z maksymalną projekcją. Kliknij Image, wybierz Type, a następnie kliknij 32-bit (Rycina 3C). Zapisz ten obraz jako nowy plik .TIFF.

Schemat interfejsu oprogramowania ImageJ przedstawiający konfigurację szycia zbioru siatki dla analizy obrazów mikroskopowych.
Rysunek 3: Szycie obrazów z serii z obrazowania konfokalnego oocytów. (A) Zrzut ekranu przedstawiający narzędzie Plug-in Grid/Collection w programie Fiji, które zostało wykorzystane do stworzenia obrazów kompozytowych oocytu. (B) Funkcja Sequential Images wykorzystuje nakładanie się fluorescencji między kolejnymi plikami .TIFF w celu wygenerowania obrazu kompozytowego. (C) Obraz kompozytowy został zapisany jako 32-bitowy plik .TIFF. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Pobrać i zainstalować program Spot Finding and Tracking Program13, który jest dostępny na stronie internetowej D.R. Larson, badaczki z National Cancer Institute w ramach National Institutes of Health (https://ccr.cancer.gov/Laboratory-of-Receptor-Biology-and-Gene-Expression/daniel-r-larson). Pobrać i zainstalować otwartą maszynę wirtualną dla systemu operacyjnego Interactive Data Language (IDL), która jest wymagana do uruchomienia programu Spot Finding and Tracking Program (http://www.spacewx.com/pdf/idlvm.pdf).  
  2. Otworzyć w programie Spot Finding and Tracking Program 32-bitowy obraz złożony (stitched image), wygenerowany w kroku 4.6 (Rysunek 4A). Wybrać menu rozwijane Localize dropdown i kliknąć Localize (Rysunek 4B), co pozwoli obliczyć liczbę punktów (spots) znalezionych na obrazie.
    UWAGA: Każdy policzony punkt reprezentuje pojedynczą cząsteczkę mRNA. Ustawienia pasma przepustowego (band pass) oraz progu fotonowego (photon threshold) przedstawiono na zrzucie ekranu (Rysunek 4B). W niniejszym protokole zastosowano domyślne wartości dla każdego ustawienia progu. Reprezentatywne punkty pozytywne oraz tła przedstawiono na rysunku (Rysunek 4C).

Analiza mikroskopowa lokalizacji; etapy przetwarzania obrazu; interfejs oprogramowania; liczba punktów 761; dane fluorescencyjne.
Rycina 4: Ilościowe oznaczanie mRNA przy użyciu programu Spot Finder and Tracking. (A) Poszczególne obrazy z serii z zostały połączone w sposób opisany na Rycini 3 i zapisane jako 32-bitowy plik .TIFF z maksymalną projekcją. (B) Obraz kompozytowy otwarto w programie Spot Finder and Tracking. Funkcję Localize wykorzystano do zliczenia fluorescencyjnych punktów (czerwona ramka). Filtr pasmowy (band pass) oraz próg fotonowy są zaznaczone niebieską ramką. (C) Niebieska strzałka wskazuje sygnał dodatni (powyżej progu). Biała strzałka pokazuje punkt fluorescencyjny poniżej progu, który zatem nie został zliczony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po zakończeniu protokołu wynikiem będą poszczególne obrazy z serii z mikroskopii konfokalnej (Rycina 4A i Rycina 5), obrazy zszyte (Rycina 4C) oraz liczba cząsteczek mRNA (Rycina 4B). W przypadku zastosowania multipleksowania dostępne będą również obrazy nałożone, pokazujące znakowanie dwóch różnych mRNA (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szereg drobnych kroków podczas protokołu zapewni udaną fluorescencję i dokładne zliczanie mRNA. Po pierwsze, protokół musi być wykonany natychmiast po pobraniu i utrwaleniu oocytów. Należy pamiętać, że PVP dodaje się do 4% buforu utrwalającego paraformaldehyd, aby zapobiec sklejaniu się oocytów. Stwierdziliśmy, że konieczne jest przeprowadzenie eksperymentu natychmiast po pobraniu i utrwaleniu oocytów. Każde opóźnienie skutkuje znacznie niższym sygnałem fluorescencji, co skutkowałoby niedoliczeniem transkryptów. Wynika t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Danielowi R. Larsonowi za hojną pomoc w instalacji i korzystaniu z Programu do Wyszukiwania i Śledzenia Miejsc 13 oraz za wsparcie techniczne University of Nebraska Lincoln Microscopy Core dla obrazowania mikroskopii konfokalnej. Badanie to stanowi wkład Wydziału Badań Rolniczych Uniwersytetu Nebraski w Lincoln w stanie Nebraska i było wspierane przez UNL Hatch Funds (NEB-26-206/Numer dostępu -232435 i NEB-26-231/Numer dostępu -1013511).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(±)-&alfa;-Kwas liponowySigma-AldrichT1395Albumina kwasu alfa liponowego
, surowica bydlęca, niskotłuszczowakwasowość MP Biomedicals, LLC199899FAF BSA
BD 10 ml strzykawka TBBecton, Dickinson and Company30965910 ml
Igła BD PrecisionGlideBecton, Dickinson and Company305109Igła o rozmiarze 27 1/2 Dwuwodny
chlorek wapniaSigma-AldrichC7902CaCl2-2H2O
Kwas cytrynowySigma-AldrichC2404Cytrynian
D-(+)-glukozaSigma-AldrichG6152Glukoza
FosforanNa2HPO4
Łatwa do trzymania szalka PetriegoFalcon Corning35100835 mm
Edetate DisodiumAvantor8994-01EDTA
Extra Fine Bonn NożyczkiFine Science Tools14084-08Proste, ostre/ostre, nieząbkowane, 13mm krawędzie tnące
Surowica bydlęca płoduAtlanta biologiczneS10250FBS
Roztwór odczynnika gentamycynygibco15710-064Gentamycyna
GlutaMAX-I (100X)gibco35050-061Glutamax
Gold Seal Micro SzkiełkaGold Seal303925 x 75mm
Gonadotropina, z surowicy ciężarnych klaczySigmaG4877eCG
hCG rekombinowanaNHPPAFP8456AhCG
hialuronidaza, typ IV-S: z jąder bydlęcychSigma-AldrichH3884Hialuronidaza
Styl jubilerskiKleszcze Integra17-305XKleszcze 4-3/8", styl 5F, Prosty, Micro Fine Jaw
L-(+)-Kwas mlekowy, wolny kwas MP Biomedicals, LLC190228L-Mleczan
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma-AldrichM2773MgSO4-7H2O
MEM Aminokwasy endogenneCorning 25-025-CL
Szklana osłona mikroskopuFisher Scientific12-542-C25 x 25x 0,15 mm szkiełka nakrywkowe
Mm-Nanog-O2-C2 Sonda RNAscopeZaawansowana diagnostyka komórek501891-C2Sonda Nanog
Mm-Pou5f1-O1-C3 Sonda RNAscopeZaawansowana diagnostyka komórek501611-C3Pou5f1 Sonda
MOPSSigma-AldrichM3183
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148Paraformaldehyd
PES 0,22 um Membrana -sterylnaMillex-GPSLGP033RS0,22 um filtry
PoliwinylopirolidonSigma-AldrichP0930PVP
Chlorek potasuSigma-Aldrich60128KCl
Fosforan potasu jednozasadowySigma-Aldrich60218KH2PO4
Odczynnik przeciwblakowy Prolong GoldinvitrogenP36934Odczynnik zapobiegający blaknięciu bez
DAPI RNAscope DAPIZaawansowana diagnostyka komórek320858DAPI
RNAscope FL AMP 1Zaawansowana diagnostyka komórek320852Wzmacniacz 1
RNAscope FL AMP 2Zaawansowana diagnostyka komórek320853Wzmacniacz 2
RNAscope FL AMP 3Zaawansowany Diagnostyka komórkowa320854Wzmacniacz 3
RNAscope FL AMP 4 ALT AZaawansowana diagnostyka komórek320855Wzmacniacz 4 ALT A
RNAscope FL AMP 4 ALT BZaawansowana diagnostyka komórek320856Wzmacniacz 4 ALT B
RNAscope FL AMP 4 ALT CZaawansowana diagnostyka komórek320857Wzmacniacz 4 ALT C
RNAscope Zestaw odczynników do fluorescencyjnego wykrywania multipleksuZaawansowana diagnostyka komórkowa320851zestaw odczynników FISH
Sonda RNAscope 3-plex Sonda kontroli ujemnejZaawansowana diagnostyka komórkowa320871kontrola ujemna
Sonda RNAscope 3-plex Kontrola pozytywnaZaawansowana diagnostyka komórek320881kontrola pozytywna
Sonda RNAscope Rozcieńczalnikzaawansowanej diagnostyki komórek300041Sonda do rozcieńczalnika
RNAscope Proteaza IIIZaawansowana diagnostyka komórkowa322337Proteaza III
RNAscope Proteaza III i Zestaw odczynników IVZaawansowana diagnostyka komórkowa322340Zestaw proteazy FISH
RNAscope Protease IVZaawansowana diagnostyka komórkowa322336Igła proteazy IV
S / S z Luer Hub 30GComponent Supply Co.NE-301PL-50igła o rozmiarze 30
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS6297NaHCO3
Chlorek soduSigma-AldrichS6191NaCl
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich306576NaOH
Pirogronian sodu, >= 99%Sigma-AldrichP5280Roztwór pirogronianu
6 naczyń studzienkowychAgtechincD18Naczynie 6-dołkowe
TaurynaSigma-AldrichT8691Naczynie do
hodowli tkankowychFalcon Corning353002Szalka 60 mm
Triton X-100Sigma-AldrichX100Triton X-100
disodowy NEAA do Tauryny

Bibliografia

  1. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  2. MacK, E. M., Smith, J. E., Kurz, S. G., Wood, J. R. CAMP-dependent regulation of ovulatory response genes is amplified by IGF1 due to synergistic effects on Akt phosphorylation and NF-kB transcription factors. Reproduction. 144 (5), 595-602 (2012).
  3. Xie, F., Timme, K. A., Wood, J. R. Using Single Molecule mRNA Fluorescent in Situ Hybridization (RNA-FISH) to Quantify mRNAs in Individual Murine Oocytes and Embryos. Scientific Reports. 8 (1), 7930(2018).
  4. Ruebel, M. L., et al. Obesity modulates inflammation and lipidmetabolism oocyte gene expression: A single-cell transcriptome perspective. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (6), 2029-2038 (2017).
  5. Borensztein, M., Syx, L., Servant, N., Heard, E. Mouse Oocyte Development. 1818, 51-65 (2018).
  6. Jansova, D., Tetkova, A., Koncicka, M., Kubelka, M., Susor, A. Localization of RNA and translation in the mammalian oocyte and embryo. PLoS ONE. 13 (3), 1-25 (2018).
  7. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-611 (2001).
  8. Wang, F., et al. RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  9. Itzkovitz, S., van Oudenaarden, A. Validating transcripts with probes and imaging technology. Nature Methods. 8 (4), S12-S19 (2011).
  10. Derti, A., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  11. Larson, B., Malayter, D., Shure, M. Multiplexed Detection of Cytokine Cancer Biomarkers using Fluorescence RNA In Situ Hybridization and Cellular Imaging. BioTek Application Notes. , https://www.biotek.com/resources/application-notes/multiplexed-detection-of-cytokine-cancer-biomarkers-using-fluorescence-rna-in-situ-hybridization-and-cellular-imaging/ 1-5 (2016).
  12. Buxbaum, A. R., Wu, B., Singer, R. H. Single β-Actin mRNA Detection in Neurons Reveals a Mechanism for Regulating Its Translatability. Science. 343 (6169), 419-422 (2014).
  13. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  14. Herrick, J. R., Paik, T., Strauss, K. J., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Building a better mouse embryo assay: effects of mouse strain and in vitro maturation on sensitivity to contaminants of the culture environment. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (2), 237-245 (2016).
  15. Pohlmeier, W. E., Xie, F., Kurz, S. G., Lu, N., Wood, J. R. Progressive obesity alters the steroidogenic response to ovulatory stimulation and increases the abundance of mRNAs stored in the ovulated oocyte. Molecular Reproduction and Development. 81 (8), 735-747 (2014).
  16. Xie, F., Anderson, C. L., Timme, K. R., Kurz, S. G., Fernando, S. C., Wood, J. R. Obesity-dependent increases in oocyte mRNAs are associated with increases in proinflammatory signaling and gut microbial abundance of lachnospiraceae in female mice. Endocrinology. 157 (4), 1630-1643 (2016).
  17. Hirao, Y., Yanagimachi, R. Detrimental effect of visible light on meiosis of mammalian eggs in vitro. Journal of Experimental Zoology. , (1978).
  18. Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. Effects of light on development of mammalian zygotes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (36), 14293-14293 (2007).
  19. Komminoth, P., Werner, M. Target and signal amplification: Approaches to increase the sensitivity of in situ hybridization. Histochemistry and Cell Biology. 108 (4-5), 325-333 (1997).
  20. Hornick, J. E., Duncan, F. E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Multiple follicle culture supports primary follicle growth through paracrine-acting signals. Reproduction. 145 (1), 19-32 (2013).
  21. Vlasova-St. Louis, I., Bohjanen, P. Feedback Regulation of Kinase Signaling Pathways by AREs and GREs. Cells. 5 (1), 4(2016).
  22. Gilbert, C., Svejstrup, J. Q. RNA Immunoprecipitation for Determining RNA-Protein Associations In Vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 75 (1), 27.4.1-27.4.11 (2006).
  23. Kwon, S., Chin, K., Nederlof, M., Gray, J. W. Quantitative, in situ analysis of mRNAs and proteins with subcellular resolution. Scientific Reports. 7 (1), 16459(2017).
  24. Voigt, F., et al. Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Reports. 21 (13), 3740-3753 (2017).
  25. Halstead, J. M., Wilbertz, J. H., Wippich, F., Lionnet, T., Ephrussi, A., Chao, J. A. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods in Enzymology. 572, Elsevier Inc. (2016).
  26. Cookson, W., Liang, L., Abecasis, G., Moffatt, M., Lathrop, M. Mapping complex disease traits with global gene expression. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 184-194 (2009).
  27. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nature Reviews Genetics. 11, 855(2010).
  28. Freimer, N., Sabatti, C. The Human Phenome Project. Nature Genetics. 34, 15(2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

FISH pojedynczych cz steczekkwantyfikacja mRNAfluorescencyjna hybrydyzacja in situledzenie i wykrywanie punkt wmikroskopia konfokalnapermeabilizacja oocyt wrozcie czanie buforu proteazylokalizacja mRNAanaliza kolokalizacji
Zastosowanie jednocząsteczkowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (SM-FISH) do ilościowego oznaczania i lokalizacji mRNA w mysich oocytach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.