Artykuł metodologiczny

Wzmocniony nadzór nad wścieklizną za pomocą bezpośredniego szybkiego testu immunohistochemicznego

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59416

⸱

30 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Knoxville, TN, United States Department of Agriculture (USDA), 2Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Sutton, MA, United States Department of Agriculture (USDA), 3Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Milton, FL, United States Department of Agriculture (USDA), 4Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS), Wildlife Services, Concord, NH, United States Department of Agriculture (USDA), 5Lyssa LLC

W tym artykule

Podsumowanie

Bezpośredni szybki test immunohistochemiczny (DRIT) stanowi uznaną przez Światową Organizację Zdrowia Zwierząt i Światową Organizację Zdrowia (OIE/WHO) alternatywę dla testu na przeciwciała fluorescencyjne (DFA) do diagnozowania wścieklizny. Test ten pozwala na zastosowania w terenie, które można wykonać w ciągu około 1 godziny po pobraniu wycisków mózgu za pomocą mikroskopii świetlnej.

Streszczenie

Nadzór laboratoryjny jest integralną częścią działań związanych z zapobieganiem, kontrolą i zarządzaniem wścieklizną. Chociaż DFA jest złotym standardem w diagnostyce wścieklizny, istnieje potrzeba walidacji dodatkowych technik diagnostycznych w celu poprawy nadzoru nad wścieklizną, szczególnie w krajach rozwijających się. W tym miejscu przedstawiamy standardowy protokół dla DRIT jako alternatywnej, laboratoryjnej lub terenowej opcji testowania, która wykorzystuje mikroskopię świetlną w porównaniu z DFA. Wyciski dotykowe tkanki mózgowej pobranej od podejrzanych zwierząt są utrwalane w 10% buforowanej formalinie. DRIT wykorzystuje przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne specyficzne dla wirusa wścieklizny (sprzężone z biotyną), enzym peroksydazę streptawidyny i reporter chromogenu (taki jak acetylo-3-amino-9-etylokarbazol) do wykrywania inkluzji wirusa w zakażonej tkance. W ciągu około 1 godziny próbka tkanki mózgowej może zostać przetestowana i zinterpretowana przez DRIT. Ocena podejrzanych mózgów zwierząt testowanych z różnych gatunków w Ameryce Północnej, Azji, Afryce i Europie wykazała wysoką czułość i swoistość DRIT zbliżającą się do 100% z wynikami w porównaniu z DFA. Od 2005 r. program Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych ds. Dzikiej Przyrody (USDA WS) prowadzi na dużą skalę wzmocnione działania w zakresie nadzoru nad wścieklizną przy użyciu DRIT do przetestowania >94 000 próbek pobranych od dzikich zwierząt w strategicznych obszarach zarządzania wścieklizną. DRIT zapewnia potężne, ekonomiczne narzędzie do diagnozowania wścieklizny, które może być wykorzystywane przez laborantów i biologów terenowych w celu poprawy obecnych programów nadzoru, zapobiegania i kontroli wścieklizny na całym świecie.

Wprowadzenie

Chociaż DFA jest najczęściej używanym testem do rutynowej diagnostyki wścieklizny1, koszt zakupu i utrzymania mikroskopu fluorescencyjnego może być ograniczony dla krajów rozwijających się2,3,4 oraz dla szerokich, dużych programów wzmocnionego nadzoru nad wścieklizną3,4. Ponadto DFA wymaga możliwości schładzania próbek podczas utrwalania oraz inkubacji próbek powyżej temperatury otoczenia podczas reakcji przeciwciało-antygen, co może stanowić istotną przeszkodę w krajach bez odpowiedniej infrastruktury. Częściowo ze względu na ograniczenia związane z nowoczesnymi testami DFA, globalny wpływ wścieklizny był długo niedoceniany5.

W związku z tym, istnieje potrzeba walidacji dodatkowych technik diagnostycznych w celu poprawy nadzoru nad wścieklizną na całym świecie, szczególnie w krajach rozwijających się. Przedstawiony tutaj protokół DRIT oferuje laboratoryjną lub terenową alternatywę dla DFA, która wykorzystuje mikroskopię świetlną i nie wymaga chłodzenia ani inkubacji laboratoryjnej podczas testu6. DRIT i DFA są podobne pod tym względem, że obie techniki wykorzystują wyciski dotykowe próbek mózgu pobranych od potencjalnie wściekłych zwierząt. Jednak pierwszy etap DRIT wykorzystuje formalinę jako historyczny utrwalacz dla próbek, który dezaktywuje wirusa wścieklizny. Zapewnia to znaczną poprawę bezpieczeństwa biologicznego w porównaniu z acetonem używanym do mocowania próbek w protokole DFA3, co jest ważne nie tylko w laboratorium, ale być może nawet bardziej w środowiskach laboratoryjnych działających w terenie lub zdecentralizowanych. Do tej pory DRIT wykazuje czułość i swoistość równą DFA2,7,8,9.

Od 2005 roku, program USDA WS przeprowadził na dużą skalę wzmożone działania w zakresie nadzoru nad wścieklizną w Ameryce Północnej, używając DRIT jako część kompleksowego programu zarządzania wścieklizną dzikich zwierząt10. Wzmocniony nadzór nad wścieklizną jest stosowany jako uzupełnienie nadzoru i testów w zakresie zdrowia publicznego opartego na narażeniu i testuje przede wszystkim dzikie gatunki mezomięsożerców, w tym szopy pracze (Procyon lotor), pasiaste (Mephitis mephitis), lisy szare (Urocyon cinereoargenteus), lisy rude (Vulpes vulpes) i kojoty (Canis latrans), które nie były narażone na działanie promieniowania obcego u ludzi lub zwierząt domowych. Tusze zwierzęce użyte w testach zostały przekazane do USDA WS w ramach wzmożonego nadzoru nad wścieklizną i obejmowały gatunki wektorów wścieklizny, które: są chore lub dziwnie się zachowują; znalezione martwe, zabite na drodze lub uciążliwe; i nie są związane z narażeniem ludzi lub zwierząt domowych. DRIT zapewnia test diagnostyczny na wściekliznę, który może być stosowany przez wyszkolonych biologów terenowych z niewielkim lub żadnym doświadczeniem laboratoryjnym w celu poprawy nadzoru nad wścieklizną i zmniejszenia obciążenia finansowego i obciążenia laboratoriów diagnostycznych zdrowia publicznego10. Podstawowe szkolenie DRIT dla pracowników terenowych USDA WS trwa zazwyczaj od 1,5 do 2 dni, co obejmuje około 4 godzin zajęć w klasie obejmujących podstawowe zasady bezpieczeństwa biologicznego, metody pobierania próbek i procesy DRIT, a także >8 godzin czasu laboratoryjnego na przeprowadzenie testu. Możliwości szkoleniowe były dostępne dla USDA WS i współpracowników programu za pośrednictwem Centrów Kontroli i Prewencji Chorób (CDC), Lyssa LLC i The Wistar Institute.

W obszarach zarządzania strategicznego, USDA WS przetestował ponad 94 000 próbek dzikich zwierząt za pomocą DRIT i wykrył ponad 1 850 wściekłych próbek, które prawdopodobnie pozostałyby niewykryte, opierając się jedynie na testach zdrowia publicznego podejrzanych zwierząt. Ulepszone dane dotyczące nadzoru nad wścieklizną dostarczone przez wyniki DRIT mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia pełniejszej czasowej i przestrzennej reprezentacji wścieklizny w krajobrazie w celu wsparcia programów doustnych szczepień przeciwko wściekliźnie dla dzikich zwierząt w całych Stanach Zjednoczonych10,11. Podobnie, prowincjonalne agencje ochrony przyrody w Kanadzie włączyły DRIT do zakrojonych na szeroką skalę działań związanych z nadzorem wścieklizny dzikich zwierząt w połączeniu ze swoimi programami zdrowia publicznego z sukcesem8. Zarówno USDA WS, jak i kanadyjskie programy nadzoru DRIT wykorzystały krajowe laboratoria referencyjne do potwierdzenia wścieklizny przez DFA i przeprowadzenia odpowiedniego typowania wariantu wirusa8. Co więcej, biolodzy terenowi USDA WS wysyłają 10% negatywnych próbek do potwierdzenia DFA do laboratoriów referencyjnych, a od 2008 r. uczestniczą w odbywających się dwa razy w roku testach biegłości DRIT przeprowadzanych przez Laboratorium Higieny Stanu Wisconsin w ramach standardowych środków zapewnienia jakości.

Celem tej metody jest zaoferowanie alternatywnego podejścia do testów diagnostycznych wścieklizny, które można wykonać w zdecentralizowanych laboratoriach, w terenie lub w obszarach bez rutynowego dostępu do mikroskopii elektronowej.

Protokół

Każda osoba przeprowadzająca testy diagnostyczne przeciwko wściekliźnie powinna otrzymać standardową serię szczepień przedekspozycyjnych przeciwko wściekliźnie i być poddawana regularnej ocenie serologicznej przeciwciał, w razie potrzeby z szczepieniami przypominającymi. Osoby nieobjęte taką pracą nie powinny wchodzić do laboratoriów ani obszarów, w których prowadzone są takie prace. Wszelkie manipulacje tkankami i szkiełkami powinny być przeprowadzane tak, aby nie rozpylać cieczy ani nie wytwarzać cząstek unoszących się w powietrzu. Wyciągi nie są wymagane, ale jeśli jest to możliwe, mogą zapewnić dodatkową ochronę przed zapachami, ektopasożytami i fragmentami kości. Podczas pobierania próbek i badania należy nosić minimalne środki ochrony osobistej, w tym rękawice i okulary ochronne

.

1. Kolekcja pnia mózgu

  1. Próbki pnia mózgu należy pobrać natychmiast po pobraniu tusz lub upewnić się, że tusze są umieszczane w zamrażarkach w celu przechowywania do czasu późniejszych badań. Jeśli tusze zwierzęce są zamrożone, rozmrozić je w temperaturze otoczenia przed pobraniem pnia mózgu, aby ułatwić zbieranie. W niektórych okolicznościach próbki pobiera się bezpośrednio z zamrożonego zwierzęcia.
  2. W przypadku zwierząt, które są świeżo zebrane lub zostały rozmrożone do temperatury otoczenia, należy ułożyć zwierzę na wznak na płaskiej powierzchni z lekko obróconym kręgosłupem szyjnym w kierunku badającego. Badanie palpacyjne w celu identyfikacji stawu atlantyczno-potylicznego po stronie bocznej kręgosłupa szyjnego.
    1. W przypadku tusz, które są jeszcze całkowicie zamrożone, jeśli jest to możliwe, ułóż zwierzę na wznak w sposób opisany powyżej. Użyj pił, noży, nożyc do kości lub podobnego sprzętu, aby całkowicie oddzielić głowę od ciała.
      nuta: Cały używany sprzęt, który nie jest jednorazowym użyciem, powinien być dokładnie czyszczony między próbkami.
  3. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie na poziomie stawu szczytowo-potylicznego w aspekcie brzusznym, przecinając wszystkie warstwy mięśni i tkanek miękkich, w tym tchawicę i przełyk. Kontynuuj aż do zbliżenia przedniej części kręgów kręgosłupa szyjnego. W przypadku zamrożonej tkanki użyj ostrza skalpela, aby usunąć wszelkie pozostałe warstwy mięśni i tkanek miękkich, aby odsłonić otwór wielki.
  4. Przesuń głowę zwierzęcia do wyprostowania na końcu zakresu, aż pień mózgu będzie widoczny. Użyj ostrza skalpela, aby usunąć wszystkie widoczne tkanki pnia mózgu/ośrodkowego układu nerwowego (OUN) do pobrania próbki. W przypadku zamrożonej próbki użyj ostrza skalpela, aby usunąć jak najwięcej zamrożonej tkanki pnia mózgu/OUN z wnętrza czaszki.
  5. Umieść próbki pnia mózgu w nietłukącym się pojemniku (np. metalowej puszce na maść, kriofiolce itp.) i odpowiednio oznacz.
  6. Należy upewnić się, że próbki pnia mózgu są badane natychmiast po pobraniu za pomocą testu DRIT, przechowywane w lodówce (4 °C) do 24 godzin przed badaniem lub zamrażane (-20 °C) do czasu badania, jeśli badanie odbędzie się później niż 24 godziny po pobraniu próbki.

2. Przygotowanie materiałów do DRIT

  1. Ustawienie 10 naczyń do barwienia szkiełek (Rysunek 1)
    nuta: Naczynia do barwienia są na tyle głębokie, że pozwalają na całkowite zanurzenie szkiełka (średnica 96 mm, wysokość 72 mm, głębokość 42 mm, objętość 250 ml). 6
    1. Napełnij naczynie 1 10% formaliną buforowaną fosforanem. Wymień formalinę po 2 testach lub co tydzień.
    2. Napełnij naczynia 2, 4 i 5 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami z 1% tween-80 (TPBS). Wymień na świeży TPBS przed każdym testem.
    3. Napełnij naczynie 3 3% nadtlenkiem wodoru. Wymienić nadtlenek wodoru przed każdym badaniem.
    4. Napełnij naczynia 6, 8, 9 i 10 wodą destylowaną lub dejonizowaną. Wymień wodę przed każdym testem.
    5. Napełnij naczynie 7 preparatem hematoksyliny Gills #2 rozcieńczonym w stosunku 1:1 w wodzie destylowanej6. Wymień hematoksylinę po 2 testach lub co tydzień.
      nuta: Zgodnie z oryginalnym protokołem DRIT opracowanym przez CDC12, można zastosować stosunek 1:2 hematoksyliny Gills do wody, jeśli barwienie przeciwstawne jest zbyt ciemne.
  2. Przygotowanie roztworu podstawowego aminoetylokarbazolu (AEC)
    1. Za pomocą szklanej pipety umieścić 5 ml N,N-dimetyloformamidu w szklanym pojemniku.
    2. Dodać jedną tabletkę 20 mg 3-amino-9-etylokarbazolu i wstrząsać aż do całkowitego rozpuszczenia. Oznacz słoik napisem "AEC stock" i datą wyprodukowania zapasu.
      nuta: Roztwór podstawowy AEC może być przechowywany w lodówce (4 °C) i używany przez 1-2 miesiące.
  3. Przygotowanie rozcieńczenia roboczego AEC
    1. Dodać 7 ml buforu octanowego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Za pomocą szklanej pipety dodać 0,5 ml roztworu podstawowego AEC do probówki wirówkowej.
    3. Dodać 0,075 ml 3% nadtlenku wodoru do probówki.
    4. Przefiltrować roztwór za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.
      nuta: Rozcieńczenie robocze AEC powinno być wytwarzane tuż przed każdym testem DRIT, ponieważ jest stabilne tylko przez 2-3 godziny.

3. Bezpośredni szybki test immunohistochemiczny

  1. Oznacz szklane szkiełka mikroskopowe unikalnym numerem dla każdej próbki za pomocą odpornego na rozmazywanie, wodoodpornego, trwałego markera atramentowego.
    1. Za pomocą ostrza skalpela wyjmij pień mózgu z pojemnika i połóż na ręczniku papierowym. Delikatnie zetrzyj nadmiar płynu, krwi lub sierści drugim ręcznikiem papierowym, aby odsłonić tylko tkankę pnia mózgu13. W razie potrzeby przekrój tkankę pnia mózgu, aby odsłonić przekrój poprzeczny.
    2. Bardzo delikatnie przyłóż szkiełko mikroskopowe do przekroju poprzecznego tkanki pnia mózgu. Przyłóż szkiełko do pnia mózgu w kilku punktach bez ruchu bocznego, aby umożliwić przeniesienie wielu obszarów pnia mózgu do slide13. Upewnij się, że tylko 1 lub 2 warstwy komórek są przenoszone z tkanki mózgowej na szkiełko za pomocą delikatnego dotyku. Do przymocowania tkanki pnia mózgu do szkiełek nie jest potrzebny żaden środek montażowy. Uwzględnij zarówno kontrolę pozytywną, jak i negatywną w każdym przebiegu DRIT.
  2. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez około 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zanurz szkiełka w 10% buforowanej formalinie na 10 minut (danie 1).
  4. Wyjmij szkiełka z formaliny i zanurz je w roztworze TPBS (naczynie 2).
  5. Zanurz szkiełka w 3% nadtlenku wodoru na 10 minut (danie 3).
  6. Wyjmij szkiełka z nadtlenku wodoru i zanurz je w świeżym TPBS (naczynie 4). Po usunięciu nadmiaru nadtlenku wodoru umieść szkiełka w świeżym TPBS (naczynie 5) i pracuj z jednym szkiełkiem na raz, podczas gdy pozostałe szkiełka pozostaną zanurzone w TPBS.
  7. Weź szkiełka z TPBS (danie 5) pojedynczo, strząśnij i osusz nadmiar buforu, a następnie ułóż na zwilżonym ręczniku papierowym na stole laboratoryjnym, jako podstawę "komory wilgotnościowej". Za pomocą pipety upuść na każde szkiełko ilość pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko wirusowi wścieklizny, aby pokryć tkankę OUN. Inkubuj szkiełka przez 10 minut w komorze wilgotnościowej (tj. przykrywaj szkiełka płytkami studzienkowymi lub inną prostą pokrywą, gdy leżą na zwilżonym ręczniku papierowym) w temperaturze pokojowej (Rysunek 2).
  8. Wyjmij szkiełka z komory wilgotnościowej, strząśnij i zetrzyj nadmiar koniugatu, a następnie zanurz szkiełka w TPBS (użyj ponownie tego samego TPBS w naczyniu 5).
  9. Pracując z jednym szkiełkiem na raz, podczas gdy inne pozostają zanurzone w TPBS - użyj pipety, aby upuścić wystarczającą ilość kompleksu streptawidyna-peroksydazyna, aby pokryć tkankę OUN. Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Wyjmij szkiełka z komory wilgotnościowej, strząśnij i zetrzyj nadmiar kompleksu, a następnie zanurz je w TPBS (naczynie 5).
  11. Pracując z jednym szkiełkiem na raz, strząśnij i osusz nadmiar buforu, podczas gdy inne pozostają zanurzone w TPBS - użyj pipety, aby upuścić wystarczającą ilość AEC (przygotowanie wyjaśniono powyżej i należy je wykonać bezpośrednio przed użyciem), aby pokryć tkankę OUN. Inkubować w komorze wilgotnościowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej (naczynie 6).
  13. Umieść szkiełka w przeciwbarwieniu z hematoksyliny Gills (rozcieńczonej 1:1 wodą destylowaną) na 2 minuty (danie 7).
  14. Natychmiast zanurz wszystkie szkiełka w wodzie destylowanej (naczynie 8). Powtórzyć dwa razy ze świeżą wodą za każdym razem (potrawy 9 i 10).
  15. Pracując z jednym szkiełkiem na raz, podczas gdy inne pozostają zanurzone w wodzie destylowanej (naczynie 10) — strząśnij i zetrzyj nadmiar wody, a następnie użyj rozpuszczalnego w wodzie środka montażowego, aby przymocować szkiełko nakrywkowe.
  16. Użyj mikroskopu świetlnego z obiektywem 20x, aby wyświetlić szkiełka i obiektywem 40x, jeśli potrzebna jest dokładniejsza kontrola.

Wyniki

Pozytywne wyniki z DRIT pokazują czerwone wewnątrzcytoplazmatyczne inkluzje wirusowe, które mogą różnić się kształtem i rozmiarem (Rysunek 3) w cytoplazmie niebieskawych ciał komórkowych. Inkluzje wydają się gładkie, z bardzo jasnymi marginesami i mniej intensywnie zabarwionym obszarem centralnym. Intensywność i rozkład antygenu są rejestrowane po wykryciu inkluzji. Intensywność jest stopniowana od +4 do +1. Szkiełko kontroli dodatniej powinno mieć intensywny, rażący purpurowy blask, który jest określany jako intensywność +4. Niewielka utrata koloru może wystąpić zwłaszcza wtedy, gdy obchodzenie się z próbką nie było optymalne (tj. tkanka próbki uległa nieznacznemu rozkładowi) i należy je ocenić na +3. Zauważalnie matowa plama jest oceniana jako +2 do +1, nie jest uważana za diagnostyczną pod kątem zakażenia wirusem wścieklizny i jest oznaczona jako nieokreślona.

Dodatkowo, dystrybucja antygenu jest oceniana od +4 do +1, gdzie +4 oznacza rozkład antygenu składający się z obfitości dużych i małych inkluzji różniących się wielkością i kształtem, obecnych w każdym polu (lub prawie każdym polu) widzenia w wyciśnieniu dotyku tkanki OUN. Kontrola pozytywna ma zazwyczaj rozkład antygenu +4. Rozkład antygenu +3 zostanie przypisany, gdy występują inkluzje w różnych rozmiarach w większości, ale nie we wszystkich polach widzenia. Jeśli inkluzje zostaną znalezione w 10%-50% pól mikroskopowych, przypisywana jest dystrybucja antygenu +2. Gdy inkluzje zostaną znalezione w <10% pól mikroskopowych, przypisywany jest rozkład antygenu +1.

Większość tkanek OUN z obecnym wirusem wścieklizny wykazuje typowe inkluzje wirusowe o intensywności +3 lub +4 i dystrybucji antygenu. Jeśli wyniki wskazują na intensywność +2 lub +1 lub rozkład antygenu +2 lub +1, próbkę uznaje się za "nieokreśloną" i uzasadnione jest powtórzenie testu. Jeżeli ta sama próbka ma powtarzający się wynik badania nieokreślonego, próbka powinna zostać wysłana do laboratorium referencyjnego w celu przeprowadzenia DFA lub powiązanych badań potwierdzających.

Próbka testowa za pomocą DRIT jest uważana za ujemną na obecność antygenów wirusa wścieklizny po tym, jak szkiełko zawierające tkankę OUN zostało zeskanowane w powiększeniu 200X lub większym i nie wykryto typowych inkluzji wirusa (Rysunek 4). Próbki ujemne wykazują niebieskawe ciała komórkowe z niewielkim lub żadnym niespecyficznym zabarwieniem.

figure-results-1
Rysunek 1: Ustawienie 10 naczyń do barwienia szkiełek z odczynnikami do testów. Naczynia są oznaczone nazwą odczynnika w kolejności potrzebnej do przestrzegania protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Prosta komora wilgotnościowa utworzona za pomocą mokrego ręcznika papierowego i płytek do hodowli komórkowych. Prosta komora wilgotnościowa wykorzystująca mokry ręcznik papierowy i płytki do hodowli komórkowych pozwala na aplikację w terenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Reprezentatywne slajdy z dodatnimi inkluzjami wirusa wścieklizny z intensywnością +4 i dystrybucją antygenu +4.(A i B) wykazują dodatnie inkluzje wirusa wścieklizny przy 200-krotnym powiększeniu. (C i D) wykazują dodatnie inkluzje wirusa wścieklizny przy 400-krotnym powiększeniu. Podziałka = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Reprezentatywne preparaty próbek ujemnych bez inkluzji wirusa wścieklizny. (A i B) pokazują próbki ujemne dla inkluzji wirusa wścieklizny przy 200-krotnym powiększeniu. (C i D) pokazują próbki ujemne pod kątem inkluzji wirusa wścieklizny przy 400-krotnym powiększeniu. Podziałka skali = 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentatywne fotografie urządzeń testowych DRIT używanych przez USDA WS. A) Ruchomy punkt badawczy w zamkniętej przyczepie do transportu. B) Pojazd rekreacyjny doposażony w pojazd do badania DRIT. (C) Placówka badawcza DRIT we współpracy z laboratorium uniwersyteckim. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

DRIT jest elastyczną metodą odpowiednią do nadzoru w terenie w celu wykrywania obecności wirusa wścieklizny, która może być stosowana w zdecentralizowanych obszarach laboratoryjnych. Chociaż możliwe jest przeprowadzenie całego testu w terenie, na przykład na tylnej klapie ciężarówki, idealnym rozwiązaniem jest posiadanie małej, wewnętrznej przestrzeni przeznaczonej na DRIT ze względu na problemy z chemikaliami, sprzętem i magazynowaniem zapasów. Ponadto należy wziąć pod uwagę przestrzeganie wszystkich obowiązujących federalnych, stanowych i lokalnych przepisów i regulacji dotyczących stosowania i utylizacji chemikaliów. Obecnie USDA WS posiada 15 obiektów DRIT do badania próbek z 17 stanów. Obiekty USDA WS DRIT są tworzone we współpracy z uniwersyteckimi i stanowymi laboratoriami zdrowia publicznego, w wyznaczonych pomieszczeniach w większych obiektach oraz w zamkniętych przyczepach, które zostały zmodernizowane i przystosowane do pełnienia funkcji mobilnych jednostek testowych w przypadku wystąpienia sytuacji kryzysowej, w której kluczowe znaczenie ma wzmocnione testy nadzoru nad wścieklizną z natychmiastowym czasem realizacji (Rysunek 5).

Podczas gdy test zakończył się sukcesem przy użyciu materiału pnia mózgu o różnej jakości, optymalna jest świeża tkanka pnia mózgu bez rozkładu tkanki. W miarę jak dochodzi do rozkładu, wysuszenia lub upłynnienia, jakość próbki spada, a test może wykryć więcej niespecyficznych barwień, które mogą zmylić wyniki. Ta obserwacja jest podobna w przypadku DFA i DRIT2. Pień mózgu/OUN należy pobrać tak szybko, jak to możliwe, a następnie przechowywać w stanie zamrożonym (-20 °C) do czasu badania.

Zazwyczaj większość obiektów USDA WS przetwarza od 12 do 24 szkiełek jednocześnie podczas sesji DRIT, w tym jedną kontrolę pozytywną i jedną kontrolę ujemną, które zostały potwierdzone przez DFA. Kontrole dodatnie i ujemne stanowią punkt odniesienia dla każdej serii DRIT w celu zapewnienia, że test zakończył się sukcesem i potwierdzenia, czy na szkiełkach testowych pojawiają się pytania interpretacyjne. Jeśli próbka nie zostanie uznana za jednoznacznie dodatnią lub negatywną, jest oznaczana jako nieokreślona i badana po raz drugi przez DRIT. Jeśli próbka ta nie jest jednoznacznie dodatnia lub ujemna po dwóch testach DRIT, jest wysyłana do laboratorium referencyjnego w celu przeprowadzenia badań DFA lub pokrewnych.

Podobnie jak w przypadku każdego testu diagnostycznego, "rozwiązywanie problemów" jest przydatne w przypadku nieoczekiwanych wyników. Na przykład, jeśli próba DRIT zakończy się niepowodzeniem (tj. kontrola pozytywna nie wykazuje intensywności barwienia +3 lub +4 i rozkładu antygenu), upewnij się, że wszystkie chemikalia i odczynniki nie straciły ważności. Odkryliśmy, że używanie nowo otwartej butelki z nadtlenkiem wodoru co najmniej raz w tygodniu jest pomocne w zapobieganiu niespecyficznemu barwieniu przez utlenianie tkanki mózgowej. Dodatkowo zalecamy wymianę buforu octanowego co najmniej raz w roku, niezależnie od daty ważności podanej na etykiecie.

Istnieje wiele zalet DRIT w porównaniu z DFA, w tym niższe koszty, możliwość wykonania testu poza scentralizowanym laboratorium, potrzeba tylko mikroskopii świetlnej zamiast mikroskopu fluorescencyjnego oraz stosunkowo prosty proces szkolenia dla osób podających i odczytujących test 2,3,4. Te zalety, w połączeniu z czułością i swoistością DRIT, które są porównywalne z DFA 2,7,8,9, dowiodły już, że test służy jako ważne narzędzie w szeroko zakrojonych programach wzmocnionego nadzoru nad wścieklizną 8,10 w Ameryce Północnej. Ponadto DRIT ma potencjał, aby umożliwić zwiększony nadzór i szybsze testowanie w krajach rozwijających się lub innych obszarach o ograniczonych zasobach, zwłaszcza po ostatnich wytycznych OIE/WHO jako zalecany test.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim pracownikom USDA Wildlife Services, którzy obecnie lub wcześniej pobierali próbki do zwiększonego nadzoru nad wścieklizną i przeprowadzili DRIT w celu diagnozy wścieklizny. Dziękujemy również wielu współpracownikom, którzy pomagają nam w zbieraniu danych w ramach wzmocnionego nadzoru nad wścieklizną. Dziękujemy również Centrom Kontroli i Prewencji Chorób oraz Instytutowi Wistar za dostęp do krytycznych odczynników wymaganych do przeprowadzenia DRIT oraz za zapewnienie możliwości szkoleniowych. Ponadto doceniamy diagnostykę potwierdzającą i pomoc techniczną świadczoną przez Centra Kontroli i Prewencji Chorób oraz przez Wadsworth Center wraz z Departamentem Zdrowia Stanu Nowy Jork. Korzystanie z jakichkolwiek produktów komercyjnych służy wyłącznie celom porównawczym i nie stanowi poparcia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3-amino-9-etylokarbazol (tabletki AEC; 50 sztuk)Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)A6926
Bufor octanowy, 0.1M, 5.2 pH, 32 uncjePoly Scientific R& D Corp. (https://www.polyrnd.com/)s140
Ag Tek MiniScalpel, PN110, Niesterylny #10, 40 za opakowaniePatterson Veterinary (https://www.pattersonvet.com/)PN110Wyposażenie uzupełniające do pobierania próbek wycisków dotykowych; Dostępne również za pośrednictwem jednorazowej strzykawki Clipper Distributing (http://www.clipperdist.net/)
BD Luer-Lok bez igły, 10 ccFisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-823-2ANumer producenta BD 309604
Lornetka z głowicą Seidentopf lub odpowiednikiemWielu dostawców
Niebieska prostokątna utylizacja z oceną UN Kontener, 5GBerlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)1147T01BLUDodatkowe wyposażenie do przechowywania/utylizacji odpadów chemicznych (hematoksylina skrzelowa i roztwór AEC)
Corning Square i prostokątne szkło osłonowe, 24x60Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)12-553-465Corning Numer producenta 2975246
Końcówki do pipet Corning Universal Fit: stelażowe, niesterylne (1-200ul)Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)07-200-300Numer producenta Corning 4863
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 ml, polipropylenFisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-959-70CNumer producenta Corning 352097
Falcon 96-Well Assay Plates (pokrywki płytek do hodowli tkankowych)Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)08-772-5Corning Numer producenta 353910
Filtr strzykawkowy 25 mm marki Fisher, nylon, 0,45 i mu; m, SterileFisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)09-719D
Fisher Chemical Gill Method Hematoxylin Stain (Gill-2), 4LFisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)CS401-1D
Fisherbrand Sharps-A-Gator Pojemniki na ostre przedmioty w miejscu użycia, 5 qtFisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)14-827-122Wyposażenie uzupełniające do prawidłowego przygotowania laboratorium BSL-2
Fluoro-Gel z buforem Tris (Gel/Mount Media), 20 mlVWR, część Avantor (https://vwr.com)102092-122Substytut fluorożelu dla BioMeda™ Gel-Mount, Mikroskopia elektronowa Sciences
Formalina, Buforowana, 10%, 4LFisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)SF100-4Dostępne każdy lub w przypadku 4
Gilson Pipetman P200 Pipet, 50-200 μ LDaigger Scientific (https://www.daigger.com)EF9930E
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem hyklonu, 1x Roztwór, 1 l (PBS)Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)SH30256LSMożna użyć alternatywnego produktu w postaci suchego proszku
Nadtlenek wodoru, 3%Wielu dostawcówWszelkie dostępne na rynku źródło, takie jak marki apteczne lub sklepowe itp.
Obiektyw mikroskopu soczewkowego 20x i 40xWielu dostawców
Lysol IC Quarternary Disinfecting Cleaner, 1GDaigger Scientific (https://www.daigger.com)EF8481Materiały uzupełniające do prawidłowej dezynfekcji laboratoryjnej BSL-2 Marka
Miltex Jednorazowy skalpel Rozmiar 22 (rozmiar alternatywny dla MiniScalpela)AMD Next (www.amdnext.com)999112314Wyposażenie uzupełniające do pobierania próbek wycisków dotykowych; Rozmiar alternatywny dla Ag Tek MiniScalpel
N,N-dimetyloformamidu, opakowanie ze szkła bursztynowego, 500 mlFisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)D119-500
Streptawidyna znakowana peroksydazą, 50 mlSeraCare (https://www.seracare.com/)5550-0001Test immunologiczny i zestawy KPL Numer referencyjny 71-00-38
Sól fizjologiczna w proszku buforowana fosforanami (alternatywa dla Fisher liquid PBS)Sigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)P3813Musi być przygotowany w 1 l wody destylowanej; Dostępne w ilościach 1, 10 i 50 opakowań
Przeciwciało pierwszorzędowe: Antynukleoproteina poliklonalna lub koktajl biotynylowanych przeciwciałPrzechowywać w temperaturze 4 stopni C
Jednorazowe pipety serologiczne PYREX, szklane, sterylne, zatkane, Corning, 1.0 mlVWR, część Avantor (https://vwr.com)7078D-1VWR Numer producenta 89091-220
Jednorazowe pipety serologiczne PYREX, szklane, sterylne, zatkane, Corning, 10.0 mlVWR, część Avantor (https://vwr.com)7078D-10VWR Numer producenta 89091-106
Jednorazowe pipety serologiczne PYREX, szklane, sterylne, zatkane, Corning, 5,0 mlVWR, część Avantor (https://vwr.com)7078D-5VWR Numer producenta 89091-484
Richard-Allan Scientific Gills Hematoxylin Stain No. 2, 1PT (alternatywa dla powyższego)Fisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)22-050-201Thermo Scientific Numer producenta 72504
Uchwyty do prowadnic, 24-miejscoweVWR, część Avantor (https://vwr.com)25608-868Sakura® Numer dostawcy Finetek: 4465; Dostępne u wielu dostawców
Blaszane pudełka na próbki, 1/2 uncjiVWR, część Avantor (https://vwr.com)101412-452Dodatkowy sprzęt do przechowywania próbek tkanki mózgowej
Taylor 2-Event Digital Timer/ClockWielu dostawcówWyposażenie uzupełniające
Zestaw do barwienia szkiełek Tissue-TekVWR, część Avantor (https://vwr.com)25608-902Sakura® Numer dostawcy Finetek: 4551; Dostępne u wielu dostawców
TWEEN 80, glikol polietylenowy, 500 mlSigma Aldrich (https://www.sigmaaldrich.com/)P1754Dostępne również w pojemnościach 25 mL, 1 L i 1 G Napełniacz
do pipet VWR FLIP (0,05-100 ml)VWR, część Avantor (https://vwr.com)53497-055
Miękkie nitrylowe rękawice diagnostyczne VWR, L (100 sztuk w opakowaniu)VWR, część Avantor (https://vwr.com)89038-272Wyposażenie dodatkowe do odpowiednich środków ochrony indywidualnej
Woda, dejonizowana (20 l)VWR, część Avantor (https://vwr.com)10806-022
Fiolki na próbki z przezroczystego szkła Wheaton, 8 mlFisher Scientific (część Thermo Fisher Scientific https://www.fishersci.com/us/en/home.html)06-408CDWK Nauki przyrodnicze Numer producenta 224884
Powlekane na biało, dwudołkowe szkiełka mikroskopowe, 14 mmTekdon Incorporated (https://www.tekdon.com/coated-microscope-slides.html)2-140
Biały prostokątny pojemnik na odpady UN, 5GBerlin Packaging (https://www.berlinpackaging.com/)1147T01WHTDodatkowe wyposażenie do przechowywania/utylizacji odpadów chemicznych (Formalina)
anty-lizsywirusa

Bibliografia

  1. Dean, D. J., Abelseth, M. K., Atanasiu, P. Laboratory techniques in rabies. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Koprowski, H. 23, World Health Organization. eds 88-89 (1996).
  2. Durr, S., et al. Rabies diagnosis for developing countries. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2 (3), e206(2008).
  3. Rupprecht, C., et al. Progress in the development of a direct rapid immunohistochemical test for diagnosing rabies. , (2014).
  4. Rupprecht, C. E., et al. Additional Progress in the Development and Application of a Direct, Rapid Immunohistochemical Test for Rabies Diagnosis. Journal of Veterinary Science. 5 (2), (2018).
  5. Coleman, P. G., Fevre, E. M., Cleaveland, S. Estimating the public health impact of rabies. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 140-142 (2004).
  6. Standard Operating Procedure for the Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) for the detection of rabies virus antigens. , Centers for Disease Control and Prevention. (2016).
  7. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  8. Middel, K., Fehlner-Gardiner, C., Pulham, N., Buchanan, T. Incorporating Direct Rapid Immunohistochemical Testing into Large-Scale Wildlife Rabies Surveillance. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 21(2017).
  9. Coetzer, A., Sabeta, C. T., Markotter, W., Rupprecht, C. E., Nel, L. H. Comparison of biotinylated monoclonal and polyclonal antibodies in an evaluation of a direct rapid immunohistochemical test for the routine diagnosis of rabies in southern Africa. PLOS Neglected Tropical Diseases. 8 (9), e3189(2014).
  10. Kirby, J., et al. Enhanced Rabies Surveillance to Support Effective Oral Rabies Vaccination of Raccoons in the Eastern United States. Tropical Medicine and Infectious Disease. 2 (3), 34(2017).
  11. Slate, D., et al. Oral rabies vaccination in north america: opportunities, complexities, and challenges. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (12), e549(2009).
  12. Direct Rapid Immunohistochemistry Test (DRIT) protocols. , Available from: https://rabiessurveillanceblueprint.org/Direct-Rapid-Immunohistochemistry?lang=fr (2019).
  13. Khalid, A., Haque, A. Touch Impression Cytology Versus Frozen Section as Intraoperative Consultation Diagnosis. 2, (2004).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mikroskopia wietlnametoda odciskowa tkanki m zgukompleks streptawidyna peroksydazaroztw r roboczy AECbarwienie kontrastowe hematoksylin Gillaprzeciwcia a przeciwko wirusowi w cieklizny10 buforowana formalinaroztw r TPBS

Powiązane artykuły