Prezentowany zestaw diagnostyczny FL-DNA to oszczędzająca czas i przyjazna dla użytkownika metoda określania wiarygodnego prawdopodobieństwa wystąpienia zmian rakowych jelita grubego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena ryzyka i rozpowszechnienia raka jelita grubego za pomocą wykrywania integralności DNA kału
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Obecnie DNA kału może być izolowane i analizowane za pomocą kilku metod. Długie fragmenty DNA w kale można wykryć za pomocą testu qPCR, który zapewnia wiarygodne prawdopodobieństwo obecności zmian przednowotworowych lub nowotworowych jelita grubego. Metoda ta, zwana fluorescencyjną długą DNA (FL-DNA), jest szybką, nieinwazyjną procedurą, która stanowi ulepszenie systemu prewencji pierwotnej. Metoda ta opiera się na ocenie integralności DNA kału poprzez ilościową amplifikację określonych celów genomowego DNA. W szczególności ocena fragmentów DNA dłuższych niż 200 pz pozwala na wykrycie pacjentów ze zmianami w obrębie jelita grubego o bardzo wysokiej swoistości. Jednak ten system i wszystkie obecnie dostępne testy DNA kału wiążą się z pewnymi ogólnymi problemami, którymi należy się zająć (np. częstotliwość, z jaką należy przeprowadzać testy, i optymalna liczba próbek kału pobieranych w każdym punkcie czasowym dla każdej osoby). Jednak główną zaletą FL-DNA jest możliwość stosowania go w połączeniu z testem stosowanym obecnie w programie badań przesiewowych CRC, znanym jako immunochemiczny test na krew utajoną w kale (iFOBT). Rzeczywiście, oba testy można wykonać na tej samej próbce, co zmniejsza koszty i pozwala lepiej przewidzieć ostateczną obecność zmian w jelitie grubym.
Wprowadzenie
Rak jelita grubego (CRC) wywodzi się z wieloetapowego procesu, w którym zdrowy nabłonek powoli przekształca się w gruczolaki lub polipy, które z czasem przekształcają się w nowotwory złośliwe1,2. Pomimo wysokiej zachorowalności na CRC, w ciągu ostatniej dekady zaobserwowano tendencję spadkową w odsetku zgonów3. Rzeczywiście, wczesne narzędzia diagnostyczne przyjęte w programach badań przesiewowych doprowadziły do wczesnego wykrywania i usuwania gruczolaków lub polipów przednowotworowych4. Jednak ze względu na różne ograniczenia techniczne żadna z tych metod nie jest optymalna. Rzeczywiście, w celu poprawy czułości i swoistości, zaproponowano wiele testów DNA kału samodzielnie lub w połączeniu z obecnymi rutynowymi testami diagnostycznymi5,6.
Zazwyczaj, zdrowa błona śluzowa wydziela do strumienia kałowego apoptotyczne kolonocyty, podczas gdy chora błona śluzowa złuszcza nieapoptotyczne kolonocyty. Fragmenty o długości 200 pz lub większej charakteryzują nieapoptotyczne DNA. To DNA nazywa się długim DNA (L-DNA) i stało się użytecznym biomarkerem do wczesnej diagnozy raka jelita grubego. L-DNA można wyizolować z próbki kału i określić ilościowo metodą qPCR przy użyciu zestawu FL-DNA do diagnostyki in vitro7,8,9,10,11,12.
Test składa się z dwóch testów do wykrywania fragmentów FL-DNA w zakresie od 138 pz do 339 pz. Każdy test umożliwia amplifikację FL-DNA (FAM), a także kolce DNA (HEX). Aby zapewnić optymalną amplifikację wszystkich fragmentów, test został podzielony na dwa testy (nazwane "A" i "B"). Test A wykrywa dwa regiony eksonu 14 genu APC (NM_001127511) i fragment eksonu 7 genu TP53 (NM_001276760). Test B wykrywa fragment eksonu 14 genu APC (NM_001127511) oraz dwa regiony eksonów 5 i 8 genu TP53 (NM_001276760). Testy nie rozróżniają wykrytych regionów. Kolce w DNA odpowiadają DNA łososia Oncorhynchus keta i umożliwiają weryfikację, czy procedura została wykonana prawidłowo, oraz sprawdzenie ewentualnej obecności inhibitorów, co może dać fałszywie ujemne wyniki. Stężenie FL-DNA ocenia się za pomocą bezwzględnej kwantyfikacji przy użyciu metody krzywej standardowej i wyraża się je w ng/reakcję.
Metoda FL-DNA to nieinwazyjny i niedrogi test DNA kału, który w połączeniu z immunologicznym testem na krew utajoną w kale (iFOBT), jest obecnie używany w programach badań przesiewowych CRC i pozwala na lepsze przewidywanie zmian rakowych i/lub gruczolaka wysokiego ryzyka12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pacjenci zostali zrekrutowani w Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) w Meldola (FC, Włochy) w latach 2013–2015. Włączeni pacjenci zostali objęci protokołem IRSTB02, zatwierdzonym przez Komitet Etyki IRST - IRCCS AVR (25/10/2012, wersja 1). Wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Od wszystkich pacjentów uzyskano pisemną zgodę na udział w badaniu.
1. Izolacja DNA z kału
- Użyj zestawu do przygotowania próbek kału (patrz Tabela materiałów). Wybierz i opracuj materiał kałowy, przeprowadzając ekstrakcję zgodnie z instrukcjami producenta. DNA po oczyszczeniu można amplifikować bezpośrednio lub przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.
2. Przygotowanie kontroli pozytywnej, standardów, DNA spike-in oraz próbek klinicznych
- Przygotowanie standardów i próbek
- Aby przygotować kontrolę dodatnią, standardy, DNA spike-in oraz wszystkie próbki kliniczne, odwiruj alikwoty kontroli dodatniej, standardów i DNA spike-in, a następnie resuspenduj każdy odczynnik, dodając odpowiednią ilość dołączonej wody (patrz poniżej). Następnie ostrożnie wymieszaj kontrolę dodatnią, standard i DNA spike-in w wirówce typu vortex, a potem wiruj przez 10 s. Aby uzyskać pełną resuspensję suchych odczynników, przechowuj odczynniki w formie płynnej w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min przed użyciem.
- Kontrola dodatnia to ludzkie DNA w formie suchej. Resuspenduj każdą alikwotę przy użyciu 750 µL wody.
- DNA spike-in to DNA łososia (Oncorhynchus keta), które służy jako egzogenna kontrola wewnętrzna do weryfikacji ewentualnej obecności inhibitorów w próbkach DNA wyizolowanych z kału. Resuspenduj każdą alikwotę przy użyciu 100 µL wody.
- Aby przygotować krzywą standardową, wykonaj cztery rozcieńczenia 1:5, zaczynając od roztworu zapasowego. Punkty standardowe muszą wynosić 10 ng/reakcję, 2 ng/reakcję, 0,4 ng/reakcję oraz 0,08 ng/reakcję.
- Aby przygotować kontrolę dodatnią, standardy, DNA spike-in oraz wszystkie próbki kliniczne, odwiruj alikwoty kontroli dodatniej, standardów i DNA spike-in, a następnie resuspenduj każdy odczynnik, dodając odpowiednią ilość dołączonej wody (patrz poniżej). Następnie ostrożnie wymieszaj kontrolę dodatnią, standard i DNA spike-in w wirówce typu vortex, a potem wiruj przez 10 s. Aby uzyskać pełną resuspensję suchych odczynników, przechowuj odczynniki w formie płynnej w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min przed użyciem.
- Przygotowanie 1x DNA spike-in
- Przygotuj kontrolę DNA spike-in bezpośrednio przed użyciem.
- Przygotuj 1x kontrolę DNA spike-in, mieszając 5 µL FL-DNa spike z 20 µL sterylnej wody. Liczbę próbek 1x kontroli DNA spike-in należy przygotować zgodnie z liczbą próbek do analizy, powiększoną o kontrolę dodatnią.
- Przygotowanie próbek
- Wymieszaj 75 µL próbek (próbek klinicznych lub kontroli dodatniej) z 25 µL 1x DNA spike-in, uzyskując objętość całkowitą 10 µL.
3. Amplifikacja i oznaczenie wartości FL-DNA za pomocą qPCR Easy PGX
UWAGA: Gotowe mieszaniny do amplifikacji, zawierające specyficzne startery i sondy skierowane przeciwko ludzkiemu DNA oraz kontroli wewnętrznej, są dostarczane w formie liofilizowanej w paskach 8-dołkowych dla FL-DNA Mix A oraz FL-DNA Mix B. Standardy, kontrole dodatnie i ujemne oraz próbki muszą być amplifikowane przy użyciu obu liofilizowanych mieszanin. Wyłącznie próbki kliniczne muszą być amplifikowane w dubletach przy użyciu obu liofilizowanych mieszanin.
- Zapoznaj się z Tabelą Materiałów w celu uzyskania informacji o urządzeniu do qPCR i oprogramowaniu operacyjnym.
- Uruchom oprogramowanie operacyjne i skonfiguruj płytkę oraz profil termiczny:
- Skonfiguruj płytkę zgodnie z Tabelą 1.
- Ustaw typ studzienki dla wszystkich ośmiu pozycji w kolumnie 1 na Standard.
- Ustaw typ studzienki dla studzienek A2 i B2 na NTC.
- Ustaw typ studzienki dla C2 i D2 (kontrole dodatnie) na Unknown.
- Ustaw typ studzienki dla wszystkich pozostałych pozycji na Unknown.
- Zaznacz wszystkie 96 pozycji i dodaj barwniki FAM oraz HEX. Kliknij Sync Plate.
- Ustaw profil termiczny zgodnie z Tabelą 2.
- Skonfiguruj płytkę zgodnie z Tabelą 1.
- Wiruj odpowiednią liczbę pasków przez 10 s, aby zgromadzić zawartość na dnie probówek.
- Ostrożnie usuń uszczelnienia z pasków, dbając o zachowanie zawartości, i dodaj do odpowiednich pasków: kontrola ujemna: 20 µL wody; próbka: 20 µL DNA; krzywa standardowa: 20 µL standardu 1, 2, 3 lub 4; kontrola dodatnia: 20 µL kontroli dodatniej.
- Starannie zamknij wszystkie paski za pomocą płaskich nakrętek optycznych do 8 pasków i wymieszaj wortexie przez kilka sekund.
- Wiruj paski przez 10 s i wprowadź je do urządzenia. Następnie uruchom pomiar.
- Uruchom oprogramowanie operacyjne i skonfiguruj płytkę oraz profil termiczny:
4. Analiza danych
UWAGA: Analiza danych może być przeprowadzona automatycznie lub ręcznie, w zależności od oprogramowania (patrz Tabela materiałów).
- Po zakończeniu procesu należy wybrać kolumny A, C, E, G dla „FAM: FL-DNA-A" i "HEX: IC, a kolumny B, D, F, H dla „FAMFL-DNA-B" i "HEX: IC.
- Ustaw następujące parametry dla Standardowe ilości początkowe10 ng/reakcję dla studzienek A1 i B1, 2 ng/reakcję dla C1 i D1, 0,4 ng/reakcję dla E1 i F1 oraz 0,08 ng/reakcję dla G1 i H1.
- Zestaw Próg fluorescencji wartości do 150 dla obu kanałów: FAM (FL-DNA A i FL-DNA B) oraz HEX (IC).
- W pudełku Tabela wyników, kliknij Opcje kolumn | Zaznacz wszystko | Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. aby uzyskać wyniki w obu kanałach wraz z ich odpowiednimi wartościami Cq (∆R) oraz końcowymi wartościami ∆R.
UWAGA: Wartości te są dostarczane przez oprogramowanie instrumentu do Real Time PCR. ΔR last odpowiada wartości fluorescencji znormalizowanej do ostatniego cyklu amplifikacji. - W polu Tabela wyników kliknij prawym przyciskiem myszy na tabelę, aby otworzyć menu kontekstowe, a następnie kliknij Wyślij do programu Excel aby wyeksportować surowe dane.
- Sprawdź wartości standardów, aby zweryfikować przydatność krzywej wzorcowej.
- Dla każdej mieszaniny FL-DNA należy sprawdzić wartość R2 wartości z kolumny [„R² (∆R)”] oraz wartości wydajności z kolumny [„Efficiency (%)”]. Jeśli mieszczą się one w dopuszczalnym zakresie, można przystąpić do analizy zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela 3).
- Jeśli wyniki w kanale FAM nie mieszczą się w oczekiwanym zakresie, pomiń jeden punkt krzywej standardowej i przeprowadź ponowną analizę serii.
- Wyznaczyć wartości kontroli negatywnej i pozytywnej, korzystając z poniższego wzoru, przyjmując wartości „No Cq” jako zero:
- Porównaj otrzymane wartości z wartościami podanymi w Tabela 4.
- Jeśli wyniki kontroli reakcji mieszczą się w zakresie wartości oczekiwanych, należy przystąpić do analizy próbek.
UWAGA: Należy zweryfikować, czy uzyskane wartości Cq wynikają z rzeczywistej reakcji amplifikacji (sigmoidalna krzywa fluorescencji), a nie z artefaktu (liniowa krzywa fluorescencji). - Aby przeanalizować przydatność próbki do każdej mieszaniny FL-DNA, należy porównać wartości Cq w kanale HEX. Jeśli wartość wynosi ≥16, można przystąpić do analizy próbek. Jeśli wartość wynosi <16 lub nie uzyskano wartości Cq, prawdopodobnie wynika to z błędu podczas dozowania FL-DNA Spike. W związku z tym analiza próbek nie jest możliwa.
- Oblicz średnią z wartości Cq w kanale „HEX” dla kontroli pozytywnej, korzystając z następującego wzoru:
- Oblicz średnią z wartości Cq w kanale „HEX” dla powtórzeń próbek, korzystając z następującego wzoru:
- Oblicz wartości ∆CqHEX zgodnie z następującym wzorem:
- Porównaj wartości ∆CqHEX próbek z wartościami podanymi w Tabela 5.
- Dla każdej mieszaniny (Mieszanina A i Mieszanina B) należy porównać wartości Cq w kanale FAM z wartościami podanymi w Tabela 6.
- Aby wyznaczyć wartość FL-DNA dla każdej odpowiedniej próbki, należy zastosować następujący wzór, przyjmując wartości „No Cq” jako zero:
UWAGA: Ryzyko i rozpowszechnienie raka jelita grubego są funkcją oceny iFOBT oraz FL-DNA zgodnie z wynikami nomogramu Fagana uzyskanymi przez Rengucciego i współpracowników.12 (Tabela 7).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schemat postępowania w tym protokole przedstawiono na Rysunku 1. Schemat obejmuje dwa etapy kontrolne oraz różne działania w zależności od wyników tych etapów. Po pierwsze, jeśli próbka wykazuje niewłaściwe kontrole, należy powtórzyć amplifikację. Po drugie, jeśli amplifikacja jest zahamowana, próbka musi zostać poddana ponownej obróbce od samego początku lub zaklasyfikowana jako niewartościowa.
Rysunek 2 przedstawia krzywe fluorescencji uzyskane z próbek pozy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wcześniejsze badania wykazały, że analiza integralności DNA stolca pobranego metodą ręczną i półautomatyczną może stanowić alternatywne narzędzie do wczesnego wykrywania zmian w jelitie grubym 7,8,9,10,11,12. Molekularne, nieinwazyjne testy przesiewowe zostały opracowane na przestrzeni lat w celu wykrywania raka jelita grubeg...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Maura Menghi jest pełnoetatowym pracownikiem Diatech Pharmacogenetics srl.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki z polipropylenu twist-lock o pojemności 1,5 ml i 2 ml (wolne od inhibitorów DNaz, RNaz, DNA i PCR) | Materiały eksploatacyjne wymagane do ekstrakcji DNA i Real Time PCR | ||
| Absolutny etanol (jakość stopnia analitycznego) | Odczynnik wymagany do ekstrakcji DNA | ||
| Wirówka stołowa | Maksymalna prędkość 20000 x g. Przyrząd wymagany do ekstrakcji DNA | ||
| Oprogramowanie do analizy EasyPGX wersja 2.0.0 | Oprogramowanie do analizy Diatech Pharmacogenetics | RT800-SW | |
| EasyPGX Wirówka/wir 8-dołkowe paski | Diatech Pharmacogenetics | RT803 | Instrument zalecany do testu Real Time PCR |
| EasyPGX qPCR 96 | Diatech Pharmacogenetics | RT800-96 | Instrument zalecany do testu Real Time PCR |
| EasyPGX ready FL-DNA | Diatech Pharmacogenetics | RT029 | Zestaw wymagany do testu Real Time PCR |
| Mikropipety (objętości od 1 do 1.000 &mikro; L) | Materiały eksploatacyjne wymagane do ekstrakcji DNA i Real Time PCR | ||
| Bezpudrowe rękawiczki | jednorazowe Materiały eksploatacyjne wymagane do ekstrakcji DNA i Real Time PCR | ||
| QIAamp Fast DNA Stool | Qiagen | 51604 | Zestaw zalecany do ekstrakcji i oczyszczania DNA ze stolca |
| Sterylne końcówki filtrujące Bez DNaz i RNaz (objętości od 1 do 1.000 &mikro; L) | Materiały eksploatacyjne wymagane do ekstrakcji DNA i Real Time PCR | ||
| Blok termiczny, np. suchy blok EasyPGX | Diatech Pharmacogenetics | RT801 | Przyrząd wymagany do ekstrakcji DNA |
| Vortex, np. Wirówka EasyPGX/vortex 1,5 ml | Diatech Pharmacogenetics | RT802 | Instrument wymagany do ekstrakcji DNA |
Bibliografia
- Fearon, E. R. Molecular Genetics of Colorectal Cancer. Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).
- Sears, C. L., Garrett, W. S. Microbes, Microbiota, and Colon Cancer. Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).
- SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2019).
- Levin, B., et al. Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology. Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).
- Bosch, L. J., et al. Molecular tests for colorectal cancer screening. Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).
- Ahlquist, D. A. Molecular detection of colorectal neoplasia. Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).
- Calistri, D., et al. Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).
- Calistri, D., et al. Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool. Neoplasia. 6, 536-540 (2004).
- Calistri, D., et al. Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer. Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).
- Calistri, D., et al. Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).
- De Maio, G., et al. Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis. World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).
- Rengucci, C., et al. Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis. Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection
Posted by JoVE Editors on 9/28/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection. An affiliation was updated.
The first affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy
