Artykuł metodologiczny

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

24.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59427

⸱

23 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute McGill University Health Centre, 2Department of Biological Sciences, Université de Québec à Montréal, 3Department of Microbiology & Immunology, McGill University, 4Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, McGill University, 5Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal, 6Département de microbiologie, infectiologie et immunologie, Université de Montréal

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Streszczenie

Bronchoskopia to procedura medyczna, w której zwykła sól fizjologiczna jest wstrzykiwana do płuc za pomocą bronchoskopu, a następnie zasysana jest zasysana, usuwając płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL). Płyn BAL jest bogaty w komórki, dzięki czemu może zapewnić "migawkę" środowiska immunologicznego płuc. Limfocyty T CD4 są najlepiej scharakteryzowanymi rezerwuarami wirusa HIV, chociaż istnieją mocne dowody sugerujące, że makrofagi tkankowe, w tym makrofagi pęcherzykowe (AM), służą również jako rezerwuary wirusa. Jednak nadal wiele nie wiadomo na temat roli AM w kontekście tworzenia i utrzymywania rezerwuarów HIV. Dlatego opracowanie protokołu przetwarzania płynu BAL w celu uzyskania komórek, które mogą być wykorzystane w testach wirusologicznych i immunologicznych w celu scharakteryzowania i oceny populacji i podzbiorów komórek w płucach, jest istotne dla zrozumienia roli płuc jako rezerwuarów wirusa HIV. W niniejszym artykule opisujemy taki protokół, wykorzystujący standardowe techniki, takie jak proste wirowanie i cytometria przepływowa. Limfocyty T CD4 i AM mogą być następnie wykorzystane do kolejnych zastosowań, w tym immunofenotypowania i kwantyfikacji DNA i RNA HIV.

Wprowadzenie

Jednym z najważniejszych wyzwań stojących przed wyleczeniem zakażenia wirusem HIV jest obecność utajonego rezerwuaru wirusa HIV, który powoduje odbicie wiremii osocza po przerwaniu terapii antyretrowirusowej (ART)1,2. Podczas gdy rezerwuar wirusa HIV podczas długotrwałej ART jest dobrze udokumentowany w kilku przedziałach tkankowych, w tym w wtórnych narządach limfatycznych, tkance limfatycznej związanej z jelitami (GALT) i ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), płuca były pomijane jako obszar badań od czasów przed ART3. Jednak płuca odgrywają kluczową rolę w patogenezie HIV. Rzeczywiście, objawy płucne były jednym z pierwszych wskaźników zakażeń oportunistycznych związanych z AIDS4. Nawet we współczesnej erze ART osoby zakażone wirusem HIV są bardziej narażone na rozwój zarówno zakaźnych, jak i niezakaźnych chorób płuc niż osoby bez wirusa HIV. Na przykład osoby zakażone wirusem HIV są narażone na podwyższone ryzyko inwazyjnego zakażenia paciorkowcowym zapaleniem płuc, a także przewlekłą obturacyjną chorobą płuc (POChP)5,6. Co więcej, koinfekcja gruźlicy (TB) i HIV jest poważnym wyzwaniem dla zdrowia publicznego w niektórych regionach świata, zwłaszcza w Afryce Subsaharyjskiej, ponieważ osoby zakażone wirusem HIV są od 16 do 27 razy bardziej narażone na gruźlicę niż osoby bez HIV7. Chociaż zaproponowano pewne wyjaśnienia tej podatności na infekcje płuc i choroby przewlekłe8,9,10, dokładne mechanizmy komórkowe, dzięki którym osoby z obniżonym mianem wirusa HIV w osoczu pozostają bardziej narażone na powikłania płucne, nie zostały w pełni wyjaśnione. Co ważne, HIV jest bardzo silnym czynnikiem ryzyka infekcji płuc i chorób przewlekłych, niezależnie od statusu palenia6.

Analiza środowiska immunologicznego płuc jest zatem kluczowa dla zrozumienia jego roli w zdrowiu i chorobie. Chociaż nieinwazyjne, indukowane próbki plwociny zwykle zawierają duże ilości komórek nabłonkowych i szczątków z rzadkimi limfocytami płucnymi i bez AM, co ogranicza ich rolę do określonych zastosowań. I odwrotnie, nie można uzyskać dużych biopsji tkanek przy braku podejrzenia choroby ze względu na związane z tym ryzyko znacznego krwawienia i odmy opłucnowej (zapadnięcia się płuca). Ponadto większość komórek odpornościowych płuc znajduje się głównie na poziomie błony śluzowej, gdzie płuca są stale stymulowane przez antygeny podczas oddychania. W tym celu bronchoskopia w celu uzyskania płynu BAL ma tę zaletę, że zapewnia stosunkowo bezpieczny dostęp do limfocytów i AM (patrz ryc. 1). Makrofagi stanowią największą część komórek w płynie BAL, a następnie limfocyty11. Przydatne jest zatem ustalenie metody, za pomocą której płyn BAL może być przetwarzany w celu wykorzystania w kolejnych zastosowaniach, takich jak immunofenotypowanie, hodowla komórkowa, transkryptomika lub jakiekolwiek inne zastosowania. Przedstawiony tutaj protokół przetwarzania płynu BAL został zaadaptowany z wcześniej opisanych ogólnych procedur i zoptymalizowany pod kątem różnych stosowanych dalszych testów. Metodologia ta pozwala na izolację zarówno limfoidalnych, jak i szpikowych komórek odpornościowych błony śluzowej płuc w celu ich charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej, a także oceny rezerwuaru wirusa HIV u osób dorosłych żyjących z HIV.

Aby ustalić ten protokół, użyliśmy następujących kryteriów rekrutacji uczestników badania15. Aby uczestnicy kwalifikowali się do udziału w tym badaniu, musieli być osobami zakażonymi wirusem HIV, które spełniały następujące kryteria: (1) na ART przez co najmniej 3 lata; (2) obniżona wiremia (VL) przez co najmniej 3 lata; (3) Liczba limfocytów T CD4 ≥200 / mm3; (4) chętnych do poddania się badaniom naukowym w zakresie spirometrii i bronchoskopii. Z badania wykluczono pacjentów z następującymi kryteriami: (1) przeciwwskazania do bronchoskopii; (2) wysokie ryzyko krwawienia: koagulopatia lub terapia warfaryną lub klopidogrelem; (3) małopłytkowość (niskie płytki krwi); (4) czynne zakażenie płuc lub inny ostry proces płucny; (5) ciąża/próba zajścia w ciążę.

Protokół

Ten protokół badawczy został opracowany bezpośrednio na podstawie zasad zawartych w Deklaracji Helsińskiej i otrzymał zgodę od Instytucjonalnych Komisji Rewizyjnych Centrum Zdrowia Uniwersytetu McGill (RI-MUHC, #15-031), Université du Québec à Montréal (UQAM, #602) oraz Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CR-CHUM, #15-180).

1. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe

UWAGA: Ta sekcja opisuje bronchoskopię wykonywaną przez licencjonowanego respirologa z pomocą terapeuty oddechowego16,17.

  1. Przygotuj elementy aparatury potrzebnej do zabiegu, w tym bronchoskop i sól fizjologiczną. Podawać spray znieczulający w tylną część gardła pacjenta. Jeśli to możliwe, unikaj nadmiernego stosowania znieczulenia miejscowego. Przyłóż przewody sercowe do klatki piersiowej w celu monitorowania tętna i rytmu oraz sondę tlenową do pierwszego palca dłoni w celu monitorowania saturacji tlenem. Włóż kaniulę nosową do nozdrzy, aby zapewnić dodatkowy tlen.
  2. Ułóż pacjenta, najlepiej w pozycji leżącej. Środek uspokajający należy podawać w następujący sposób: midazolam 0,01-0,04 mg/kg mc. i fentanyl 50-100 μg (w celu zwiększenia komfortu pacjenta i zminimalizowania odruchu kaszlowego) dożylnie, w obecności respirologa lub anestezjologa.
  3. Przesuwaj elastyczny bronchoskop, aż zaklinuje się w pożądanym podsegmentalnym oskrzelu. Wkraplać sól fizjologiczną (50-60 ml na raz) za pomocą strzykawki, a następnie delikatnie odsysać (50-80 mmHg). Płyn do płukania zbiera się w strzykawce, a następnie jest przenoszony do pojemnika zbiorczego.
  4. Powtórz spłukiwanie, aby uzyskać łącznie 200-300 ml płukania. Jeśli to możliwe, zbierz co najmniej 100 ml płynu BAL.
  5. Umieść płyn BAL na lodzie.

2. Izolacja komórek BAL

UWAGA: Poniższa procedura musi być przeprowadzona w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego, klasy II (BSL2) lub wyższej.

  1. Próbki BAL należy przechowywać na lodzie do czasu ich przetworzenia.
    1. Zmieszać BAL w oryginalnej probówce zbiorczej i przenieść go do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej. Jeśli płyn BAL wydaje się bardzo mętny lub zanieczyszczony tkanką nitkowatą, przefiltruj płyn przez nylonowy filtr siatkowy o średnicy 70 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml.
    2. Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml. Delikatnie rozdrobnić granulkę końcówką pipety i ponownie zawiesić ją w 1 ml pożywki RPMI 1640.
    3. Przenieść 1 ml supernatantu do każdej z 10 probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, a pozostałą część supernatantu do probówek o pojemności 15 ml po 10 ml w każdej. Przechowywać wszystkie probówki nad osadem w temperaturze -80 °C.
  2. Przetwórz osad komórek BAL.
    1. Zawiesić osad w 10 ml RPMI 1640 na każde 25 ml oryginalnej próbki. Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 15 ml (wyrzucić po upewnieniu się, że w osadzie jest wystarczająca ilość komórek).
    2. Zawiesić osad w 1 ml RPMI 1640 + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i policzyć za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru.
      nuta: Jeżeli płyn BAL nie zostanie oddzielony przez przyleganie komórek przed sortowaniem, należy przejść do sekcji 4.

3. Przyleganie komórek BAL (opcjonalnie)

UWAGA: Ten alternatywny protokół może być wykonany przed lub zamiast sortowania komórek. Poniższą procedurę należy przeprowadzić w sterylnych warunkach w szafie BSL2 (lub wyższej).

  1. Przenieś żądaną liczbę komórek BAL do sortowania do nowej probówki o pojemności 15 ml i uzupełnij odpowiednią objętość dla 1,5 x 106 makrofagów/ml. Umieścić 2 ml komórek na baseniku na płytkach 6-dołkowych i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z 5 % CO2 , aby dać czas na przyleganie.
  2. Po inkubacji ostrożnie odessać pożywkę zawierającą nieprzylegające komórki i przenieść ją do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w stężeniu 1 x 107 komórek/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) + 2 % FBS i przenieść zawiesinę do probówki z polistyrenu okrągłodennego o pojemności 5 ml. Ta frakcja limfocytów jest teraz gotowa do barwienia w celu sortowania komórek.
  3. Do pozostałych przylegających komórek na płytce dodać 1 ml roztworu do dysocjacji komórek na studzienkę (patrz tabela materiałów) i inkubować przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aż komórki łatwo oddzielą się od płytki za pomocą końcówki pipety.
  4. Delikatnie, ale dokładnie zeskrob przylegające komórki z powierzchni studzienki za pomocą końcówki pipety i użyj 1 ml płynu w studzience, aby pomóc w oderwaniu. Przenieś komórki do nowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj studzienki 1 ml PBS i dodaj go do tej samej probówki. Uzupełnić zawartość probówki do objętości 5 ml za pomocą PBS.
  5. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 1 x 10 7 komórek/ml PBS + 2% FBS i przenieść zawiesinę do probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml z okrągłym dnem. Ta frakcja szpikowa jest teraz gotowa do barwienia w celu sortowania komórek.

4. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

UWAGA: Poniższa procedura musi być przeprowadzona w sterylnych warunkach w szafie BSL2 (lub wyższej).

  1. W tym samym dniu bronchoskopii (zazwyczaj bezpośrednio przed pobraniem BAL) należy pobrać sześć probówek krwi żylnej od dawcy w probówkach z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) (około 10 ml na probówkę).
  2. Oddzielić krew przez odwirowanie probówek z krwią o sile 300 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść osocze do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml w podwielokrotnościach o pojemności 1 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  3. Wykonaj separację gradientu gęstości.
    1. Dodaj 2 ml RPMI 1640 do każdej probówki z krwią i dobrze wymieszaj za pomocą pipety serologicznej.
    2. Przenieść do 3 probówek po 50 ml i uzupełnić objętość w każdej probówce do 25 ml za pomocą RPMI 1640.
    3. Przygotować kolejną partię 3 probówek po 50 ml, z których każda zawiera 20 ml pożywki do separacji limfocytów (LSM) (patrz tabela materiałów) w temperaturze pokojowej. Powoli i delikatnie ułóż warstwę 25 ml rozcieńczonej krwi na wierzchu LSM dla każdej z trzech probówek, trzymając probówkę pod kątem 45°.
    4. Wirować przy 600 x g przez 25 minut przy suchej temperaturze przy niskim przyspieszeniu i bez zwalniania (hamulec wyłączony).
  4. Przeprowadzić płukanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC).
    1. Przenieść warstwę komórek na granicy dwóch faz ciekłych w probówce do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej; jeśli objętość jest większa niż 30 ml, podzielić ją na dwie probówki. Uzupełnić objętość w każdej probówce do objętości 50 ml za pomocą PBS.
    2. Wirować przy 700 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć jak najwięcej supernatantu.
    3. Zawiesić osad i uzupełnić objętość do 25 ml za pomocą PBS. Wirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć jak najwięcej supernatantu.
    4. Powtórzyć etap prania opisany w kroku 4.4.3.
    5. Zawiesić osad w 5 ml PBS + 2% FBS i policzyć komórki.

5. Sortowanie całych komórek BAL i PBMC

UWAGA: Poniższa procedura musi być przeprowadzona w sterylnych warunkach w BSL2 (lub wyższym).

  1. Przygotować bufor sortujący zawierający PBS + 5% FBS + 25 mM HEPES (pH 7,4). Przygotuj 5 ml okrągłodennych probówek z polistyrenu z 1 ml FBS do zbierania posortowanych podzbiorów komórek.
  2. Wykonaj barwienie.
    1. Przygotować 3 probówki z polistyrenu okrągłodennego o pojemności 5 ml, każda dla BAL (całe komórki lub frakcje limfocytów i szpiku po przyleganiu) i PBMC (patrz punkt 4). Dla każdego podzestawu przygotuj jedną probówkę z komórkami do sortowania i dwie probówki po 5 x 105 komórek do użycia do kontroli barwienia niebarwionego i żywotności.
    2. Wirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatanty, ponownie zawiesić komórki do kontroli w 100 μl PBS i przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu, gdy kontrole kompensacyjne będą mogły być przygotowane zgodnie z opisem w kroku 5.2.6.
    3. Przygotować odczynnik blokujący receptor Fc (FcR) w stosunku 1:20 w PBS + 5% FBS (patrz Tabela materiałów - aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała z FcR na komórkach wykazujących ekspresję FcR). Ponownie zawiesić komórki, aby posortować je w proporcji 1 x 107 komórek w 250 μl mieszaniny blokującej FcR. Inkubować je przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    4. Po inkubacji dodać do komórek odpowiedni koktajl przeciwciał (patrz tabela 1) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności.
    5. Po 1 godzinie barwienia dodać 1 ml PBS do komórek i odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze sortującym, aby uzyskać 1 x 107 komórek w 250 μl. W razie potrzeby przefiltrować komórki przez filtr 70 μm.
    6. Przygotuj mechanizmy kontroli wynagrodzeń.
      1. Dodać po trzy krople anty-mysich kulek kompensacyjnych Ig, κ i kontroli ujemnej (patrz tabela materiałów) na 1 ml PBS w probówce do mikrowirówki i przenieść 100 μl do każdej okrągłodennej probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml, która ma być użyta do kompensacji. Przygotuj jedną tubkę dla każdego fluorochromu obecnego w koktajlu, który ma być użyty.
      2. Dodaj 1 μl każdego przeciwciała z koktajlu do innej probówki zawierającej kulki. Dodać 1 μl barwnika żywotności do jednej z probówek zawierających 5 x 105 komórek odłożonych na bok w kroku 5.2.1. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
      3. Dodać 1 ml PBS do każdej probówki i odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 μl PBS. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu, gdy będzie potrzebna.
    7. Posortuj komórki przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) do probówek zbiorczych przygotowanych z 1 ml FBS i delikatnie zamieszaj, aby pokryć boki probówek surowicą.
      1. Sortuj komórki BAL pod niskim ciśnieniem. Najpierw należy wykluczyć szum i uwzględnić żywe komórki CD45+, a w tej populacji wyprowadzić komórki dubletowe (patrz Rysunek 3). W większej populacji szpikowej sortuj podwójnie dodatnie komórki CD206 i CD169 jako AM; w mniejszej populacji limfocytów wyizoluj komórki CD3 + i posortuj zarówno pojedyncze populacje dodatnie CD4, jak i CD8 (patrz Rysunek 3; strategia bramkowania szczegółowo opisana w sekcji reprezentatywnych wyników).
      2. Podczas sortowania PBMC najpierw bramkują komórki, aby wykluczyć szum i uwzględnić żywe komórki CD45 +, a w tej populacji wyprowadzają komórki dubletowe. Następnie bramka na komórkach CD3 i w populacji CD3-, najpierw bramka na CD14 i sortowanie monocytów jedno-dodatnich, a następnie w bramie populacji CD3 + na CD4 i CD8 i sortowanie obu pojedynczych dodatnich populacji (strategia bramkowania szczegółowo opisana w sekcji Reprezentatywne wyniki.

6. Immunofenotypowanie AM i PBMC

UWAGA: Poniższa procedura musi być przeprowadzona w sterylnych warunkach w szafie BSL2 (lub wyższej).

  1. Dodaj do 1 miliona AM i PBMC do dwóch oddzielnych okrągłodennych probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
  2. Wykonaj blokowanie FcR, aby poprawić swoistość barwienia przeciwciałami. W tym celu ponownie zawieś komórki w 100 μl PBS + 2% FBS i dodaj 1,4 μl odczynnika blokującego FcR. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 oC.
  3. Wykonaj barwienie zewnątrzkomórkowe.
    1. Po inkubacji z blokiem FcR dodać pożądany zewnątrzkomórkowy koktajl przeciwciał, wirować probówki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności.
    2. Przemyć 2x, dodając 500 μl PBS i odwirowując przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować do utrwalania i przepuszczalności (patrz Tabela materiałów dla konkretnych użytych odczynników).
    1. Przygotować roztwór do przepuszczalności z 1 częścią buforu do przepuszczalności i 3 częściami buforu rozcieńczalnika. Zawiesić osad w 1 ml roztworu do permeabilizacji i inkubować przez 40 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
    2. Przygotować roztwór do płukania, używając 1 części buforu do przemywania i 4 częściH2O. Dodać 2 ml roztworu płuczącego do przepuszczalnych komórek i odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant.
  5. Wykonaj barwienie wewnątrzkomórkowe.
    1. Zawiesić komórki w 100 μl 1x roztworu do płukania, dodać pożądane przeciwciała wewnątrzkomórkowe, zawirować probówki i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności.
    2. Dodać 2 ml roztworu płuczącego i odwirować przy 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS. Przechowywać ogniwa w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu, aż będą potrzebne.

7. Reszta komórek BAL

UWAGA: Poniższa procedura musi być przeprowadzona w sterylnych warunkach w szafie BSL2 (lub wyższej).

  1. Jeśli pozwala na to liczba komórek, kriokonserwować żywe komórki z osadu komórkowego BAL (od kroku 2.2.2).
    1. Przygotować pożywkę do zamrażania zawierającą 90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO).
    2. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 1,5 ml pożywki do zamrażania w fiolce kriogenicznej. Przenieść fiolki kriogeniczne do pojemnika do zamrażania o kontrolowanej szybkości (patrz Tabela Materiałów) i umieścić je w temperaturze -80 °C. Po osiągnięciu temperatury przenieść komórki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Zachowaj komórki BAL w postaci suchych granulek.
    1. Przenieś pozostałe komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować w wirówce nablatowej o sile 6 000 x g przez 1 min. Usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu. Przechowywać granulki w temperaturze -80 °C.

8. Kwantyfikacja DNA i RNA HIV

UWAGA: Poniższa procedura musi być przeprowadzona w sterylnych warunkach w szafie BSL2 (lub wyższej).

  1. Kwantyfikacja całkowitego DNA HIV
    1. Aby uniknąć zahamowania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z pozostałościami lizatu BAL, należy użyć zestawu do ekstrakcji DNA (patrz tabela materiałów) w celu ekstrakcji DNA z próbki komórek BAL zgodnie z instrukcjami producenta. Użyć 15 μl tego DNA w połączeniu z mieszanką wzorcową w etapie wstępnej amplifikacji opisanym poniżej (etap 8.1.3).
    2. Przygotować rozcieńczenia krzywej wzorcowej.
      1. Jak wyżej, użyj zestawu do ekstrakcji DNA, aby wyekstrahować DNA z osadu 2 x 106 komórek ACH-2 (patrz tabela materiałów).
      2. Po elucji DNA należy wykonać seryjne 10-krotne rozcieńczenia DNA ACH-2, aby wygenerować sześć rozcieńczeń, w zakresie od 3 x 105 komórek do 3 komórek na 15 μl.
    3. Wykonaj krok preamplifikacji.
      1. W oddzielnym pomieszczeniu przygotować mieszankę wzorcową dla n + 2 próbek składających się z 1x buforu polimerazy, 3 mM MgCl2, 300 μM dNTP i 2,5 U polimerazy Taq DNA (patrz tabela materiałów) i 300 nM każdego z czterech starterów (patrz krok 8.1.3.2). Wykonaj wszystkie pomiary w trzech studzienkach.
      2. Użyj starterów hCD3OUT5', hCD3OUT3', ULF1 i UR1 do wygenerowania amplifikowanego DNA zarówno z ludzkiego CD3, jak i HIV (patrz sekwencje w Tabeli 2). Zauważ, że oba geny są wstępnie amplifikowane w tej samej probówce. Delikatnie wymieszaj i odkręć rurkę, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
      3. Rozprowadzić 35 μl mieszanki wzorcowej na basenik na 96-dołkowej płytce PCR i dodać 15 μl wzorca lub próbki DNA. Całkowita objętość reakcyjna wynosi 50 μl.
      4. Wykonać wstępną amplifikację (denaturacja w temperaturze 95 °C przez 8 minut, a następnie 12 cykli w temperaturze 95 °C przez 1 min, 55 °C przez 40 s, 72 °C przez 1 minutę i wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 15 minut).
    4. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym.
      1. Aby określić ilościowo DNA CD3 i HIV, należy przygotować dwie mieszaniny główne zawierające 1x główną mieszaninę reakcji PCR (patrz Tabela materiałów), odpowiednie startery 1,250 nM i sondę 100 nM. Użyj starterów HCD3IN5' i HCD3IN3' i sondy CD3 FamZen do ilościowego określenia ludzkiego CD3 w jednej reakcji, a starterów UR2 i LambdaT i sondy UHIV FamZen do ilościowego określenia DNA HIV w innej reakcji (patrz sekwencje w Tabeli 2). Rozprowadzić 13,6 μl każdej mieszanki w probówkach dostosowanych do qPCR.
      2. Rozcieńczyć produkt PCR przed amplifikacją w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie, bez DNazy, RNazy i proteazy. Dodać 6,4 μl każdej rozcieńczonej próbki do 13,6 μl mieszanki qPCR w probówkach dostosowanych do qPCR, uzyskując całkowitą objętość reakcji 20 μl.
      3. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym za pomocą następującego programu: denaturacja w temperaturze 95 °C przez 4 minuty i 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 3 s i 60 °C przez 10 s z pojedynczą akwizycją.
      4. Ekstrapolować liczbę kopii wirusa HIV i równoważników komórek w każdej probówce reakcyjnej z krzywych wzorcowych. Oblicz liczbę kopii DNA wirusa HIV/106 komórek.
  2. Kwantyfikacja RNA wirusa HIV
    1. Ekstrahować RNA z próbki komórek BAL za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj 17 μl tego RNA w etapie odwrotnej transkrypcji i wstępnej amplifikacji opisanym poniżej (krok 8.2.4).
    2. RNA LTR-gag syntetyzowane in vitro i precyzyjnie oznaczone ilościowo jest stosowane jako standard; jest on dodawany do ekstraktu RNA zdrowego dawcy w celu normalizacji GUSB. Przygotować sześć seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń tego wzorca, odpowiadających 3 x 105 komórek trzem kopiom RNA LTR-gag w 17 μl.
    3. Rozprowadzić 17 μl każdego wzorcowego rozcieńczenia i każdą próbkę na 96-dołkowej płytce do PCR i poddać próbki działaniu DNazy (patrz tabela materiałów) przez 10 minut w temperaturze 25 °C w celu usunięcia zanieczyszczającego genomowego DNA. Zatrzymać reakcję przez dodanie 2 μl 25 mM EDTA i inkubować próbki przez 10 minut w temperaturze 65 °C.
    4. Wykonaj odwrotną transkrypcję (RT) i PCR przed amplifikacją.
      1. Wykonaj ten krok za pomocą jednoetapowego zestawu RT-PCR (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj starterów GUSB do przodu 1, GUSB do tyłu 1, UR1 i ULF1, aby wygenerować amplifikowane cDNA zarówno z ludzkiego GUSB jako genu porządkowego, jak i LTR-gag HIV RNA (patrz sekwencje w Tabeli 2). Wartości GUSB zostaną użyte do normalizacji wartości HIV.
      2. Rozprowadzić 31 μl mieszanki wzorcowej na basenik na tę samą 96-dołkową płytkę PCR zawierającą wzorce i próbki poddane działaniu DNazy i dobrze wymieszać. Całkowita objętość reakcyjna wynosi 50 μl.
      3. Uruchom płytę na 16 cykli zgodnie z instrukcjami producenta, w temperaturze wyżarzania 55 °C.
    5. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym.
      1. Przygotować dwie mieszaniny wzorcowe zawierające 1x główną mieszaninę reakcji PCR (jak powyżej w kroku 8.1.4.1), odpowiednie startery 1250 nM i sondę 100 nM. Użyj starterów GUSB do przodu 2, GUSB do tyłu 2 i sondy GUSB-HEX, aby określić ilościowo cDNA GUSB w jednej reakcji; użyć starterów UR2, LambdaT i sondy UHIV FamZen do ilościowego określenia cDNA HIV w innej reakcji (patrz sekwencje w Tabeli 2).
      2. Rozprowadzić 13,6 μl każdej mieszanki wzorcowej w probówkach dostosowanych do qPCR. Rozcieńczyć produkty PCR przed amplifikacją RT w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie, bez DNazy, RNaz i proteazy, a następnie dodać 6,4 μl każdej rozcieńczonej próbki lub wzorca do odpowiedniej mieszanki PCR. Całkowita objętość reakcji wynosi 20 μL.
      3. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym za pomocą następującego programu: denaturacja w temperaturze 95 °C przez 4 minuty i 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 3 s i 60 °C przez 10 s z pojedynczą akwizycją (wybierz kanał zielony dla FamZen i żółty dla HEX).

Wyniki

U większości osób niepalących płyn BAL otrzymuje się w sterylnym pojemniku i jest on lekko mętną cieczą o żółto-pomarańczowym kolorze. Płyn może mieć bardziej różowy odcień, jeśli podczas bronchoskopii u dawcy wykonano biopsje wewnątrzoskrzelowe i wystąpiło niewielkie krwawienie. W przypadku dawców palących płyn może mieć ciemniejszy kolor. Po wirowaniu nadsącz BAL będzie niemal przejrzysty i lekko pomarańczowy, natomiast osad komórkowy może mieć kolor od złamanej bieli do ciemnobrązowego, w zależności od stanu próbki oraz tego, czy dawca był palaczem.

Podczas zliczania całej próbki BAL można zaobserwować różne typy komórek, w tym większe, okrągłe makrofagi o średnicy około 17 µm oraz mniejsze okrągłe limfocyty o średnicy około 7,3 µm18,19 (patrz Rysunek 2). U palaczy makrofagi są powiększone o około 40%18. Rozróżnienie między typami komórek pozwala na oddzielne zliczanie makrofagów i limfocytów. W polu widzenia mogą być również widoczne fragmenty debris, zwłaszcza w próbkach pobranych od palaczy. Makrofagi są najliczniejszym typem komórek w BAL, stanowiąc około 85% komórek u osób niepalących20, a u palaczy ich liczba jest zwiększona, przez co mogą wydawać się niemal jedynym obecnym typem komórek.

Komórki BAL mają tendencję do agregacji, dlatego należy je dokładnie mieszać podczas wszystkich manipulacji. Osad może wydawać się ciemny nawet po kilku etapach płukania. Jeśli po barwieniu do sortowania komórek w frakcji widoczne są włókniste zanieczyszczenia, przed podaniem do sortera należy przepuścić komórki przez filtr 70 µm.

Sortowanie komórek BAL musi być przeprowadzone przy niskim ciśnieniu, aby zapewnić odpowiednio duży rozmiar kropli, umożliwiający zmieszczenie makrofagów. W pierwszej kolejności wyznacza się bramkę obejmującą wszystkie komórki CD45+21, a następnie, na podstawie żywotności, wyklucza się wszystkie martwe komórki (patrz Rysunek 3). Następnie wybiera się komórki pojedyncze (singlety), a w obrębie tej grupy wyznacza się dwie populacje na podstawie wielkości i morfologii, mianowicie większe komórki mieloidalne oraz mniejsze limfocyty (patrz Rysunek 3). Wśród większych komórek wyznacza się bramkę dla CD20622,23 oraz CD16922, a komórki podwójnie dodatnie są sortowane jako AM, natomiast wśród mniejszych komórek wybiera się komórki CD3+ i wyznacza bramki dla CD4 i CD8; sortuje się komórki pojedynczo dodatnie dla CD4 oraz pojedynczo dodatnie dla CD8 (patrz Rysunek 3). Wykorzystane markery dobrano na podstawie wcześniej opisanych fenotypów AM, takich jak receptor mannozowy CD206, występujący w komórkach fagocytarnych23, oraz receptor sialoadhezyny CD16922.

Podczas sortowania PBMC komórki są najpierw bramkowane na podstawie rozproszenia światła w przód (FSC) i prostopadle (SSC), co powinno wykazać homogeniczną populację limfocytów; wszystkie te komórki są wybierane, z wyłączeniem szumów blisko osi zerowej (dane nie pokazano). Populacja jest bramkowana pod kątem żywotności oraz CD45, a do dalszych analiz wykorzystuje się żywe komórki CD45+. Następnie populacja ta jest bramkowana na CD3; w celu wyizolowania monocytów, populacja CD3- jest następnie bramkowana na CD14 i sortowane są wszystkie komórki pojedynczo dodatnie. Aby wyizolować subpopulacje limfocytów, komórki CD3+ są bramkowane na CD4 i CD8, a następnie sortowane są zarówno populacje pojedynczo dodatnie, jak i podwójnie dodatnie.

Schemat izolacji komórek płucnych i krwinek do analizy PCR rezerwuaru HIV i cytometrii przepływowej.
Rycina 1: Przegląd protokołu. Schemat przedstawiający przebieg protokołu, w tym potencjalne dalsze zastosowania otrzymanych próbek. PBMC = mononuklearne komórki krwi obwodowej; BAL = płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe; LSM = medium do separacji limfocytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Obrazy mikroskopowe, analiza komórek krwi, limfocyty (L), monocyty (M), erytrocyty (RBC).
Rycina 2: Obraz pola widzenia mikroskopu dla całej cieczy z BAL. Obrazy mikroskopowe od (A) osoby niepalącej i (B) osoby palącej z widocznymi limfocytami (L), makrofagami (M) oraz erytrocytami (RBC). Powiększenie wynosi 1,000x (okular 10x i obiektyw 100x z imersją olejową). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schematy cytometrii przepływowej, wykresy FSC/SSC dla żywotności komórek i identyfikacji limfocytów T w immunofenotypowaniu.
Rysunek 3: Reprezentatywna strategia bramkowania dla sortowania komórek z całkowitego BAL. Strategia bramkowania wykorzystana do sortowania makrofagów pęcherzykowych (AM) oraz limfocytów T CD4 i CD8 z próbek całkowitego BAL. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

PróbkaPrzeciwciałoFluorochromKlonObjętość na test (µL)
BAL i PBMCLive/DeadAPC-H7-1
CD45PE-Cy7HI305
CD3Alexa700UCHT12
CD4PE-cy5RPA-T44
CD8BV605SK13
Tylko BALCD206PE19.210
CD169BB5157-2395
Tylko PBMCCD14BV786M5E25

Tabela 1: Panel przepływowy do sortowania całych komórek BAL oraz izolowanych PBMC.

CelKrokNazwa starteraSekwencja startera
Całkowite DNA HIV lub RNA HIV LTR-GagPCR w etapie preamplifikacjiUR15'-CCA TCT CTC TCC TTC TAG C-3'
ULF15'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3'
PCR w czasie rzeczywistymUR25'-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3'
LambdaT5'-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3'
UHIV FamZen: 5'-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3'
DNA CD3PCR w etapie preamplifikacjiHCD3 wyjście 5'5'-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3'
HCD3 wyjście 3'5'-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3'
PCR w czasie rzeczywistymHCD3 w pozycji 5'5'-GGC TAT CAT TCT TCT TCA AGG T-3'
HCD 3 w 3'5'-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3'
CD3 FamZen:5'-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3'
RNA GUSBPreamplifikacja PCRGUSB Forward 1: 5’-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3’
GUSB Reverse 1: 5’- GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3’
PCR w czasie rzeczywistymGUSB Forward 2: 5'-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3’
GUSB Reverse 2: 5'- CCT TGT CTG CTG CAT AGT TAG A-3'
GUSB-HEX:5'-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3'

Tabela 2: Sekwencje starterów i sond do ilościowego oznaczania DNA i RNA HIV.

Dyskusja

W tym artykule opisaliśmy metodę przetwarzania płynu BAL w celu uzyskania limfocytów T CD4 i AM, wraz z dopasowanymi PBMC, które można badać w celu zbadania rezerwuaru HIV w płucach. Niedawno informowaliśmy o kwantyfikacji DNA HIV w limfocytach T CD4 z dopasowanych próbek krwi obwodowej i BAL, a nasza grupa wykazała, że HIV jest 13 razy bardziej obfity w limfocytach T CD4 w płucach niż w tych z krwi obwodowej15. Jednak poziomy DNA HIV w AM są zależne od dawcy, a więc do tej pory nie było spójnej korelacji między poziomami DNA HIV w limfocytach w porównaniu z makrofagami15. Dostęp do tych pierwotnych podzbiorów komórek makrofagów będzie jednak istotnym narzędziem do zbadania tego pytania i lepszego zrozumienia wiremii w płucach w kontekście rezerwuaru HIV.

W erze pre-ART i w kilku innych badaniach z wykorzystaniem płynu BAL uczestnicy przeszli bronchoskopię w celu zdiagnozowania podejrzenia patologii lub uzyskania diagnozy mikrobiologicznej objawów ze strony układu oddechowego3. Udało nam się jednak zrekrutować uczestników bez żadnych aktywnych objawów lub patologii płucnych, a wszyscy uczestnicy podpisali formularz zgody etycznej15. Udało nam się zrekrutować uczestników z naszego centrum, którzy brali udział w innych badaniach, takich jak badanie przesiewowe spirometryczne w kierunku obturacyjnej choroby płuc24, a także tych, którzy byli poddawani innym procedurom badawczym, takim jak leukafereza i kolonoskopia. Wcześniejsze badania przeprowadzone wśród osób żyjących z HIV wykazały, że altruizm jest kluczowym czynnikiem motywującym do udziału w badaniach naukowych25. Podobnie jak w przypadku wielu ludzkich okazów, zauważyliśmy dużą zmienność między osobami. Nie było sposobu, aby "przewidzieć", od których uczestników otrzymamy BAL z dobrą i słabą wydajnością komórek. W przeciwieństwie do krwi obwodowej, która daje dość stałą liczbę limfocytów, liczba komórek w płynie BAL jest bardzo zmienna. Wstrzyknięcie większej objętości soli fizjologicznej do płuc (z nadzieją na uzyskanie większego zwrotu płynu BAL) nie zawsze jest możliwe, ponieważ większe objętości soli fizjologicznej często wiążą się z częstszym kaszlem i wyższym ryzykiem gorączki po bronchoskopii. Zauważyliśmy, że użycie bronchoskopu o mniejszej (a nie większej) średnicy umożliwiło respirologowi dotarcie głębiej w oskrzela i uzyskanie płynu zawierającego większą ilość komórek. Spójnym odkryciem było to, że palacze tytoniu mieli znacznie większy odsetek AM niż limfocytów w płynie BAL, czego można się spodziewać, ponieważ AM pochłaniają szczątki i cząstki stałe. Ponadto zaobserwowaliśmy, że płyn BAL od palaczy zawierał zanieczyszczenia, które mogą blokować używany sprzęt, taki jak maszyny do PCR i cytometry przepływowe. Podobne problemy można zaobserwować na obszarach o dużym zanieczyszczeniu lub osobach częściej narażonych na złą jakość powietrza.

Jeśli chodzi o ich rolę w tworzeniu rezerwuarów wirusa HIV i trwałości wirusa, kluczową kwestią jest czystość limfocytów T CD4 i AM. Z tego powodu zdecydowaliśmy się na użycie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) w celu uzyskania wysoce czystych populacji komórek. Możliwe jest również, że pobrany płyn BAL może być zanieczyszczony krwią, ponieważ podczas bronchoskopii spodziewane jest niewielkie krwawienie; obecność naiwnych limfocytów B wskazywałaby na to, a komórki można myć w buforze do lizy czerwonych krwinek, aby obejść ten problem. Innym wyzwaniem związanym z badaniem płynu BAL jest ilościowe określenie markerów stanu zapalnego i cytokin, które są ważne dla zrozumienia trwałości wirusa HIV26. Ponieważ wkroplona sól fizjologiczna rozcieńcza płyn BAL, poziomy mediatorów stanu zapalnego i cytokin mogą być trudne do zmierzenia. Chociaż zaproponowano współczynnik korygujący mocznik w celu uwzględnienia rozcieńczenia, istnieje stosunkowo niewiele literatury opisującej jego stosowanie27,28.

AM są wysoce autofluorescencyjne, co stanowi problem podczas sortowania komórek i analizy fenotypowej cytometrii przepływowej. W szczególności efekt ten jest bardziej wyraźny u palaczy, u których AM mogą być całkowicie czarne, co znacząco wpływa na ich autofluorescencję. Po wzbudzeniu przez standardowy niebieski laser o długości fali 488 nm, autofluorescencja AM osiąga szczyt przy około 540 nm, co pokrywa się z widmami fluorescencji powszechnie stosowanych koniugatów, takich jak FITC i PE29,30. Warto zauważyć, że do wzbudzenia FITC i PE można użyć dwóch oddzielnych laserów (np. PE przez żółty/zielony laser, a FITC przez niebieski laser 488). Aby przezwyciężyć nieodłączną autofluorescencję za pomocą FITC, użyliśmy niebarwionych AM do określenia tła autofluorescencji. Ponadto stosowanie kontroli fluorescencji minus jeden (FMO) może być bardzo przydatne w zwalczaniu tych problemów technicznych. Można stosować większe kulki (np. 7,5 μm), które są bliższe rozmiarem do kompensacji populacji makrofagów, w porównaniu z mniejszymi kulkami (np. 3,0 μm), które można wykorzystać do kompensacji populacji limfocytów. Jeszcze bardziej odpowiednim podejściem byłoby użycie niewielkiej frakcji komórek jako kontroli pojedynczego barwienia, przy użyciu znanego, wysoce eksprymowanego markera na podzbiorze, takiego jak HLA-DR lub CD45, sprzężonego z każdym z pożądanych fluorochromów, co pozwoliłoby na znacznie dokładniejszą kompensację niż można osiągnąć za pomocą koralików. W przypadku próbek palaczy taktyka ta jest szczególnie przydatna, ponieważ makrofagi są znacznie większe i bardziej autofluorescencyjne. Ponadto, począwszy od etapu przygotowania, cała próbka BAL może być hodowana na płytce przed sortowaniem zgodnie z opisem w sekcji 3 protokołu, aby umożliwić rozdzielenie populacji przez przestrzeganie zaleceń. W ten sposób przylegające makrofagi można wyizolować z innych nieprzylegających komórek, takich jak limfocyty. Kompensacja jest znacznie mniej trudna, jeśli populacje limfocytów i AM są rozdzielane, a nie badane razem; Jednak poleganie na przestrzeganiu zaleceń spowoduje utratę makrofagów, co jest ważnym czynnikiem, gdy liczba komórek już się ogranicza. Ponadto etap adherencji może spowodować niepożądaną aktywację przylegających monocytów, co może wpłynąć na dalsze wyniki generowane przy użyciu tych komórek. Wartość efektywnego sortowania komórek w czystsze populacje musi być porównana z ograniczeniem polegającym na posiadaniu mniejszej liczby takich komórek w kolejnych eksperymentach.

Inne modele, w szczególności modele mysie, zostały wykorzystane do badania cech immunologicznych i biologii makrofagów. Chociaż modele te są niezwykle przydatne i pozwalają na doskonały wgląd w typ komórki, który jest trudny do manipulowania, mają ograniczenia. Wiele markerów powierzchni komórek różni się między myszami a ludźmi, tak że immunofenotyp ludzkich AM nie jest w pełni poznany. Jednak ten system modelowy wymaga połączenia kilku myszy do testów ze względu na niską liczbę komórek dostępnych od każdego zwierzęcia. Ponadto konieczność łączenia okazów wyklucza rozważania na temat predyspozycji genetycznych i płci. Ostatnio wykazano, że płeć odgrywa rolę w zakaźności makrofagów przez HIV-1 ze względu na zróżnicowaną ekspresję czynnika restrykcyjnego SAMHD-131. Naczelne inne niż ludzie (NHP) reprezentują model najbardziej zbliżony do człowieka i ułatwiły badanie zakażenia małpim wirusem niedoboru odporności (SIV) i jego wpływu na układ odpornościowy, dostarczając informacji na temat roli makrofagów rezydujących w tkankach w porównaniu z makrofagami pochodzącymi z monocytów. U makaków rezusów wykazano również, że makrofagi płucne izolowane z BAL są siedliskiem wirusa kompetentnego do replikacji; Test wzrostu wirusa (VOA) zastosowano do analizy zachowania SIV w komórkach rezydujących w tkance32. Takie odkrycie ma istotną wartość badawczą, ale musi jeszcze zostać zweryfikowane na ludziach, zanim będzie można je zastosować, a wysoki koszt stosowania NHP wyklucza wykorzystanie dużych populacji próbek. Ponadto ludzkie AM będą przydatne w wielu innych zastosowaniach, takich jak testy in vitro zakażeń wirusowych/mikrobiologicznych oraz w badaniach innych patogenów, takich jak gruźlica/koinfekcja HIV.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować swoim fundatorom: Kanadyjskim Instytutom Badań nad Zdrowiem (CIHR) (grant #153082 dla CC, MAJ, NC); Réseau SIDA et maladies infectieuses du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S), którzy przyznali fundusze CC i MAJ oraz Wydziałowi Medycyny Uniwersytetu McGill, który przyznał fundusze CC. Badanie to było również częściowo wspierane przez Canadian Institutes of Health Research (CIHR) finansowany przez Canadian HIV Cure Enterprise (CanCURE) Team Grant HB2 – 164064 dla MAJ, CC i NC. MAJ posiada CIHR Canada Research Chair poziom 2 w dziedzinie immunowirusologii, a CC i NC posiadają odpowiednio wynagrodzenie badawcze FRQ-S Junior 1 i Junior 2. ET posiada tytuł magistra stypendium RI-MUHC.

Ponadto, autorzy pragną podziękować Josée Girouard i całemu personelowi klinicznemu zaangażowanemu w koordynację i pobieranie próbek, a także terapeutom oddechowym; Ekaterina Iourtchenko, Hélène Pagé-Veillette i Marie-Hélène Lacombe na platformie immunofenotypowania RI-MUHC; oraz dr Mariannie Orlovej za udostępnienie zdjęć mikroskopowych. Co najważniejsze, autorzy pragną podziękować wielu wolontariuszom, bez których te badania nie byłyby możliwe.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
70 &mikro; m Sterylne sitko komórkoweFisher Scientific 22363548Nylonowe filtry siatkowe z 70 i mikro; m pory w celu usunięcia zanieczyszczeń z próbki BAL przed sortowaniem
Komórki ACH-2NIH349HIV-1 utajony klon limfocytów T z jedną zintegrowaną kopią wirusową, które nie wykazują ekspresji CD4
BD FACSAriaBD BiosciencesN/ASorter komórek (skonfigurowany do jednoczesnego wykrywania 16 kolorów)
BD LSRFortessa X-20BD BiosciencesN/A Cytometr przepływowy (skonfigurowany do jednoczesnego wykrywania 14 kolorów)
BronchoskopOlympusBF-1TH190 Bronchoskop terapeutyczny EEIII HD; szerokość kanału 2,8 mm; średnica zewnętrzna 6,0 mm
Roztwór do dysocjacji komórekSigmaC5914 Nieenzymatyczny preparat do delikatnego usuwania przylegających typów komórek z powierzchni plastikowych lub szklanych.
CD169  BB515BD Biosciences565353Przeciwciało cząsteczkowe wiążące kwas sjalowy stosowane w cytometrii przepływowej
CD14  BV786BD Biosciences563698Przeciwciało przeciwko receptorowi endotoksyny stosowane w cytometrii przepływowej
CD206  PEBD Biosciences555954Przeciwciało przeciwko receptorowi mannozy stosowane w cytometrii przepływowej
CD3  Alexa700BD Biosciences557943przeciwciało koreceptorowe limfocytów T stosowane w cytometrii przepływowej
CD4  PE-Cy5BD Biosciences555348przeciwciało koreceptorowe limfocytów T stosowane w cytometrii przepływowej
CD45  PE Cy-7BD Biosciences557748Białkowe przeciwciało fosfatazy tyrozynowej sprzężone z receptorem stosowane w cytometrii przepływowej
CD8  BV605BD Biosciences564116przeciwciało koreceptorowe limfocytów T stosowane w cytometrii przepływowej
CompBead PlusBD560497Anty-mysz  Ig, κ   i kontroli ujemnej mikrocząstki polistyrenu stosowane do optymalizacji kompensacji fluorescencji w cytometrii przepływowej
DNase IInvitrogen18068015Trawi jedno- i dwuniciowe DNA do oligodeksyrybonuleotydów zawierających fosforan 5' w celu usunięcia zanieczyszczeń z RNA
dNTP Zestaw 100 mMInvitrogen  10297-018Składa się z czterech deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) do stosowania w PCR
Dimetylosulfotlenek (DMSO)SigmaD8418  Niepolarny, protowy rozpuszczalnik stosowany do produkcji pożywki do kriokonserwacji żywych komórek
EDTAInvitrogenAM9912Stosowany do zatrzymywania aktywności enzymu Dnazy I
FBSBisent Bioproducts080-150Wysokiej jakości płodowa surowica bydlęca do uzupełnienia pożywki
Odczynnik blokujący FcR, HumanMiltenyi130-059-901Wiąże się z receptorem Fc na powierzchni komórki, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał
przepływowychFlowJo v10FlowJo LLC NiedotyczyOprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej używane do wszystkich analiz
HLA-DR  BV650BD Biosciences564231MHC klasa II przeciwciało receptora powierzchniowego komórki stosowane do cytometrii przepływowej
HyClone HEPES roztwórFisher ScientificSH3023701Bufor zapewniający utrzymanie fizjologicznego pH 
Żywy/Martwy  APC-H7InvitrogenL34975Marker żywotności stosowany do cytometrii przepływowej
Pożywka do separacji limfocytów (LSM)Bioprodukty żubra350-000-CLPolisacharoza do izolacji PBMC z krwi pełnej
. Frosty Pojemnik do zamrażaniaThermoFisher5100-0001Pojemnik do zamrażania zapewniający szybkość chłodzenia bardzo bliską -1 ° C/min, optymalna szybkość dla zachowania komórek
OneComp eBeadsInvitrogen01-1111-41Przeciwciała przeciwko myszom, szczurom i chomikom do kompensacji próbek PBMC
PBS 1xBisent Bioproducts311-010-CLSól fizjologiczna buforowana fosforanem do mycia i barwienia komórek
Probówki PCR Corbett Rotor-GeneAxygenPCR-0104-C4-paskowe probówki PCR o pojemności 0,1 ml do stosowania z Corbett Rotor-Gene
PerfeCTa qPCR ToughMixQuantabio951122x skoncentrowany gotowy do użycia koktajl reakcyjny do amplifikacji PCR matryc DNA 
QiaAmp DNA Mini KitQiagen51304Zestaw do izolacji genomowego, mitochondrialnego, bakteryjnego, pasożytniczego lub wirusowego DNA. Zawiera kolumny wirujące QIAamp Mini, proteinazę K QIAGEN, odczynniki,, probówki zbiorcze
RNeasy Mini KitQiagen74104Kit do oczyszczania do 100 i mikro; g całkowite RNA z komórek, tkanek i drożdży. Zawiera kolumny RNeasy Mini Spin, probówki zbiorcze, odczynniki i wolne od RNaz
Rotor-Gene QQiagen9001550Cykler do PCR w czasie rzeczywistym
RPMI 1640 1xBisent Bioproducts350-000-CLPożywka do hodowli komórkowych
Sterylna wodaBioproduktyżubra 809-115-CLDNazy, RNazy i proteazy wolne
od indeksu górnego&handel; III Jednoetapowy system RT-PCR Zestaw Invitrogen12574018RT-PCR, który wykonuje zarówno syntezę cDNA, jak i amplifikację PCR w jednej probówce. Zawiera SuperScript III RT/Platinum Taq Mix, 2x Reaction Mix (zawierający 0,4 mM każdego dNTP, 3,2 mM MgSO4), polimerazę Taq DNA z siarczanem magnezu
 Invitrogen18038-042Termostabilny enzym, który syntetyzuje DNA z jednoniciowych matryc w obecności dNTP i startera. Zawiera polimerazę DNA Taq, 10x bufor PCR,
zestaw czynnika transkrypcyjnego562725 BD Biosciencesdobarwienia wewnątrzkomórkowego do cytometrii przepływowej. Zawiera bufor do utrwalania/przepuszczalności, bufor rozcieńczalniczy, bufor do trwałej ondulacji/płukania
Trypan BlueSigmaT8154Barwnik żywotności do zliczania komórek za pomocą hemacytometru 
Mr chlorku magnezu

Bibliografia

  1. Chun, T. W., Fauci, A. S. Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).
  2. Finzi, D., et al. Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy. Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).
  3. Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection. Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).
  4. Center for Disease Control and Prevention. A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California. Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).
  5. Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus. Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).
  6. Kunisaki, K. M. Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease? Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).
  7. World Health Organization. WHO | Tuberculosis and HIV. , https://www.who.int/hiv/topics/tb/en (2018).
  8. Jambo, K. C., et al. Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function. Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).
  9. Yeligar, S. M., et al. Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ. AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).
  10. Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages. AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).
  11. Holt, P. G., et al. Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure. Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).
  12. Brenchley, J. M., et al. High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage. Mucosal Immunology. 1, 49(2007).
  13. Mwandumba, H. C., et al. Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection. The Journal of Immunology. 172, 4592(2004).
  14. Gordon, S. B., et al. Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses. Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).
  15. Costiniuk, C. T., et al. HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy. AIDS. 32, 2279-2289 (2018).
  16. American Thoracic Society. American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage. , https://www.thoracic.org/professionals/clinical-resources/critical-care/clinical-education/critical-care-procedures/bronchoalveolar-lavage.php (2004).
  17. King, T. E. Jr Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate. , https://www.uptodate.com/contents/basic-principles-and-technique-of-bronchoalveolar-lavage?topicRef=105799&source=see_link (2018).
  18. Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls. European Respiratory Journal. 50, (2017).
  19. Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls. Blut. 50, 243-248 (1985).
  20. Heron, M., et al. Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung. Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).
  21. Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
  22. Yu, Y. R. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).
  23. Geiser, M. Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles. Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).
  24. Costiniuk, C. T., et al. Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study. HIV Medicine. , (2019).
  25. Balfour, L., et al. Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173). AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).
  26. Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir. Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).
  27. Rennard, S. I., et al. Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution. Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).
  28. Twigg, H. L., et al. Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects. The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).
  29. Duan, M., et al. Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease. The Journal of Immunology. 189, 946(2012).
  30. Garn, H. Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung. Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).
  31. Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages. The Journal of Infectious Diseases. , (2018).
  32. Avalos, C. R., et al. Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Makrofagi p cherzykowelimfocyty T CD4cytometria przep ywowaizolacja kom rekwirowanieblokowanie receptor w Fcmononuklearne kom rki krwi obwodowej
Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.