Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w pan-lyssavirus została opracowana w celu wykrywania wszystkich znanych lyssawirusów. Walidacja z wykorzystaniem próbek mózgu różnych gatunków zwierząt pod kątem wścieklizny wykazała, że metoda ta ma czułość i swoistość równoważną złotemu standardowi testu na przeciwciała fluorescencyjne i może być stosowana do rutynowej diagnostyki wścieklizny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena uniwersalnej zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w celu wykrycia lyssawirusów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby wykryć wirusa wścieklizny i inne gatunki z rodzaju Lyssavirus w rodzinie Rhabdoviridae, opracowano reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (zagnieżdżony RT-PCR) w celu wykrycia konserwatywnego regionu genu nukleoproteiny (N) lyssawirusów. Metoda wykorzystuje odwrotną transkrypcję (RT) przy użyciu wirusowego RNA jako matrycy i oligo (dT)15 oraz losowych heksamerów jako starterów w celu syntezy wirusowego komplementarnego DNA (cDNA). Następnie wirusowe cDNA jest używane jako matryca do amplifikacji fragmentu genu N o długości 845 pz w pierwszej rundzie PCR przy użyciu zewnętrznych starterów, a następnie w drugiej rundzie zagnieżdżonego PCR w celu amplifikacji końcowego fragmentu 371 pz przy użyciu wewnętrznych starterów. Ta metoda może wykryć różne klady genetyczne wirusów wścieklizny (RABV). Walidacja, przy użyciu 9624 próbek mózgu od ośmiu gatunków zwierząt domowych w ciągu 10 lat klinicznych diagnoz i nadzoru nad wścieklizną w Chinach, wykazała, że metoda ma 100% czułość i 99,97% swoistość w porównaniu z bezpośrednim testem fluorescencyjnym przeciwciał (FAT), złotym standardem zalecanym przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) i Światową Organizację Zdrowia Zwierząt (OIE). Ponadto metoda ta może również specyficznie amplifikować docelowy fragment genu N 15 innych zatwierdzonych i dwóch nowych gatunków wirusów lizy w 10. raporcie Międzynarodowego Komitetu ds. Taksonomii Wirusów (ICTV), oceniany za pomocą mimicznego wykrywania zsyntetyzowanych plazmidów genu N wszystkich lyssawirusów. Metoda stanowi wygodną alternatywę dla FAT w diagnostyce wścieklizny i została zatwierdzona jako norma krajowa (GB/T36789-2018) w Chinach.
Wprowadzenie
Wścieklizna jest ogólnoświatową chorobą odzwierzęcą wywoływaną przez wirusy z rodzaju Lyssavirus1. Lyssawirusy (rodzina Rhabdoviridae) to jednoniciowe wirusy RNA o genomie o długości około 12 kb, który koduje pięć białek: N, fosfoproteinę (P), białko macierzy (M), glikoproteinę (G) i duże białko lub polimerazę (L). Na podstawie sekwencji nukleotydowych genu N, odległości genetycznej i wzorców antygenowych, lizsanowirusy zostały podzielone na 16 gatunków, w tym klasyczny wirus wścieklizny (RABV) i wirusy pokrewne wściekliźnie (RRV): Wirus nietoperzy Lagos (LBV), wirus Duvenhage (DUVV), wirus Mokola (MOKV), europejski lyssawirus nietoperzy 1 (EBLV-1), europejski lyssawirus nietoperzy 2 (EBLV-2), australijski lyssawirus nietoperzy (ABLV), wirus Aravan (ARAV), wirus Ikoma (IKOV), lyssawirus nietoperzy Bokeloh (BBLV), lyssawirus nietoperzy Gannoruwa (GBLV), wirus Irkut (IRKV), wirus Khujand (KHUV), wirus nietoperzy Kaukazu Zachodniego (WCBV), wirus nietoperzy Shimoni (SHIBV) i lyssawirus nietoperzy Lleida (LLEBV)2. Ostatnio zidentyfikowano dwa dodatkowe lyssawirusy: lyssawirus nietoperzy Kotalahti (KBLV) wyizolowany z nietoperza Brandta (Myotis brandtii) w Finlandii w 2017 roku3 oraz tajwański lyssawirus nietoperzy (TWBLV) wyizolowany od japońskiego pipistrelle (Pipistrellus abramus) na Tajwanie w Chinach w latach 2016–20174.
Wszystkie ssaki są podatne na wściekliznę; jednak żadne poważne zmiany patodonoliczne ani specyficzne objawy kliniczne nie pozwalają na jego identyfikację, a diagnozę można postawić tylko w laboratorium5. Najczęściej stosowaną metodą diagnozowania wścieklizny jest FAT, który jest uważany za złoty standard zarówno przez WHO, jak i OIE5,6. Niemniej jednak FAT może dawać niewiarygodne wyniki na zdegradowanych/autolizowanych próbkach tkanki mózgowej. Ponadto nie można go używać do oznaczania próbek płynów biologicznych, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), ślina i mocz, co w dużej mierze wyklucza jego zastosowanie w diagnostyce antemortem7. Alternatywne konwencjonalne testy diagnostyczne, takie jak test zakażenia posiewem tkankowym wścieklizny (RTCIT) i test inokulacji myszy (MIT), wymagają kilku dni6, co jest główną wadą, gdy niezbędna jest szybka diagnoza.
Różne molekularne testy diagnostyczne (np. wykrywanie wirusowego RNA przez RT-PCR, test immunoenzymatyczny PCR [PCR-ELISA], hybrydyzacja in situ i PCR w czasie rzeczywistym) są używane jako szybkie i czułe techniki do diagnozowania wścieklizny8. RT-PCR jest obecnie zalecany przez OIE do rutynowej diagnostyki wścieklizny, a heminested (hn) PCR jest opisany w Podręczniku Testów Diagnostycznych i Szczepionek dla Zwierząt Lądowych OIE w celu wykrycia wszystkich lyssawirusów5. W tym miejscu opisujemy zagnieżdżony wirus pan-lyssavirus RT-PCR, który umożliwia specyficzne i czułe wykrywanie wszystkich 18 gatunków wirusa lyssa porównywalne lub przewyższające te uzyskane przez FAT. Zasada działania metody polega na tym, że RT docelowego RNA (konserwatywny region genu N lyssawirusa) jest przekształcany w cDNA, a następnie amplifikacja cDNA przez dwie rundy PCR. cDNA przechodzi pierwszą rundę PCR z zewnętrznymi starterami w celu amplifikacji fragmentu o długości 845 pz; następnie druga runda PCR wykorzystuje produkt pierwszej rundy PCR jako matrycę do amplifikacji fragmentu 371 pz za pomocą wewnętrznych starterów. Dwie rundy PCR znacznie zwiększają czułość testu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Użycie myszy w tym protokole zostało zatwierdzone przez Komitet Administracyjny ds. Dobrostanu Zwierząt Instytutu Wojskowej Medycyny Weterynaryjnej, Akademii Wojskowych Nauk Medycznych, Chiny (Autoryzacja Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych, numer zezwolenia JSY-DW-2010-02). Przestrzegano wszystkich instytucjonalnych i krajowych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania.
1. Ekstrakcja RNA
- Ekstrahować RNA z tkanki mózgowej podejrzanej o wściekliznę, biopsji skóry, śliny lub płynu mózgowo-rdzeniowego lub z hodowli komórkowej zakażonej RABV, przy użyciu metod ekstrakcji na bazie izotiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu lub dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji wirusowego RNA. Przygotowany RNA należy natychmiast zużyć lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne.
2. Odwrotna transkrypcja wirusowego RNA
- Wyjmij odczynniki RT wymienione w Tabeli 1 z zamrażarki, trzymaj je na lodzie, a następnie rozmrozić i zwirować przed użyciem.
- Przygotować 12 μl mieszaniny reakcyjnej RT w probówce PCR o pojemności 0,2 ml z odczynnikami wymienionymi w tabeli 1. Pozwolić na zmiany w pipetowaniu, przygotowując objętość mieszanki wzorcowej o co najmniej jednej wielkości reakcji większą niż jest to wymagane.
- Dodać 8 μl próbki, RNA kontroli dodatniej lub kontroli ujemnej do mieszaniny reakcyjnej RT na stacji roboczej PCR w pomieszczeniu z szablonami. Kontrola pozytywna RT to RNA wyekstrahowane z hodowli komórkowej zakażonej utrwalonym szczepem RABV CVS-11 (prowokacyjny wirus standard-11) i przechowywany w temperaturze -80 °C. Kontrola ujemna zawiera DDh2O wolne od RNaz.
- Wymieszać zawartość probówek RT przez wirowanie, a następnie krótko odwirować.
- Załaduj probówki reakcyjne do termocyklera. Ustaw program syntezy cDNA w następujących warunkach: 42 °C przez 90 minut, 95 °C przez 5 minut i 4 °C w zawieszeniu. Ustawić objętość reakcji na 20 μl. Rozpocznij przebieg RT.
3. Pierwsza runda PCR
- Odczynniki PCR wymienione w Tabeli 2 należy przechowywać na lodzie w czystym pomieszczeniu do czasu użycia, a następnie rozmrozić je i zwirować.
- Przygotować mieszaninę PCR pierwszej rundy w probówce PCR o pojemności 0,2 ml z odczynnikami wymienionymi w Tabeli 2.
- Dodaj próbkę cDNA lub plazmidu o objętości 2 μl do mieszaniny PCR pierwszej rundy w stacji roboczej PCR w pomieszczeniu z szablonami. Kontrolą dodatnią PCR jest cDNA CVS-11 przygotowane w sposób opisany w kroku 2.3 dla powyższej metody RT. Kontrola ujemna PCR to ddH2O.
- Przenieść uszczelnione probówki do termocyklera PCR i poddać cyklowi zgodnie z parametrami wymienionymi w tabeli 3.
4. Druga runda PCR
- Przygotować drugą rundę mieszaniny PCR w probówce PCR o pojemności 0,2 ml, używając odczynników wymienionych w Tabeli 4.
- Dodać 2 μl produktu PCR pierwszej rundy do mieszanki PCR drugiej rundy. Ponadto należy uwzględnić ddH2O jako negatywną kontrolę drugiej rundy PCR.
- Wykonaj cykle termiczne PCR, stosując te same parametry, które podano w kroku 3.4.
5. Analiza produktów PCR za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych
- Przygotuj 1,5% żel agarozowy, dodając 1,5 g agarozy do 100 ml Tris-acetate-EDTA (TAE) i dokładnie rozpuszczając, podgrzewając w kuchence mikrofalowej.
- Dodać bromek etydyny (EB) (o końcowym stężeniu 0,01%) lub inny handlowy substytut EB. Wlej żel do formy i pozostaw do zastygnięcia w temperaturze otoczenia na co najmniej 30 minut.
- Przygotować próbki ładujące, mieszając 5 μl każdego produktu PCR z 1 μl buforu ładującego 6x.
- Załaduj próbki i odpowiedni marker DNA oddzielnie do studzienek i uruchom żel przez około 30-45 minut przy napięciu 120 V, aż linia barwnika znajdzie się w około 75%-80% w dół żelu.
- Wyłącz zasilanie, odłącz elektrody od źródła zasilania, a następnie ostrożnie wyjmij żel z pudełka na żel .
- Użyj urządzenia dokumentującego żel UV, aby zwizualizować i sfotografować fragmenty DNA.
6. Charakterystyka zagnieżdżonego RT-PCR
- 6.1. Swoistość i czułość w wykrywaniu plazmidów 18 lyssawirusów
- Zamów 18 komercyjnych plazmidów zawierających pełny gen N każdego wirusa lyssa (16 gatunków ICTV i dwa nowe gatunki) do PCR.
- Oblicz liczbę kopii plazmidu, używając liczby Avogadro (N A) i następującego wzoru.
[(g/μL plazmidowego DNA)/(długość plazmidu w bp x 660)] x 6,022 x 1023 = liczba cząsteczek/μL - Przygotować roztwory podstawowe (2,24 x 109 cząsteczek/μl) wszystkich 18 plazmidów w ddH2O.
- Wykonać dziewięć 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń wszystkich 18 plazmidów w ddH2O. Rozcieńczyć 10 μl każdego plazmidu w 90 μl ddH2O. Wirować i krótko odwirować.
- Wykonać amplifikację PCR zgodnie z opisem w punktach 3-5.
- Przeanalizuj specyficzność i czułość zagnieżdżonego PCR, wykrywając serię plazmidów wirusa lyssa.
- Określenie detekcji limit
- Dostosuj miano szczepu wirusa wścieklizny CVS-11 do 105,5 TCID50/ml (miano wirusa określone zgodnie z Podręcznikiem OIE)5.
- Wykonaj pięć 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń CVS-11 (roztwór podstawowy to 105,5 TCID50/ml), jak opisano w kroku 6.1.4.
- Przeprowadzić ekstrakcję RNA i procedury amplifikacji RT-PCR wszystkich rozcieńczeń wirusa, jak opisano w sekcjach 1-5.
- Porównanie zagnieżdżonego RT-PCR ze "złotym standardem" FAT
- Przetestuj wszystkie próbki kliniczne za pomocą zagnieżdżonego RT-PCR, a następnie potwierdź wyniki za pomocą FAT5 i sekwencjonowania genu N9.
- Używanie znormalizowanych danych do analizy statystycznej za pomocą SAS 9.1. Użyj testu kappa i testu chi-kwadrat McNemara do statystycznego porównania testów diagnostycznych (polecenie SAS: proc freq; table/agree). Obliczanie przedziałów ufności przy założeniu rozkładu dwumianowego.
- Ocena skuteczności w badaniu próbek zdegradowanych
- Wystawić dwie potwierdzone klinicznie próbki tkanki mózgowej wściekłych psów w temperaturze 37 °C.
- Oznaczenie dwóch próbek w każdym dniu ekspozycji w temperaturze 37 °C za pomocą zagnieżdżonego RT-PCR, FAT i klasy MIT5.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wyniki zagnieżdżonej RT-PCR służącej do wykrywania 18 gatunków lyssavirusów przedstawiono na Rysunku 1. Wszystkie pozytywne kontrole PCR wykazały oczekiwane 845 bp w pierwszej oraz 371 bp w drugiej rundzie amplifikacji, natomiast w kontroli negatywnej nie pojawił się żaden prążek. Wszystkie 18 lyssavirusów wygenerowało oczekiwane prążki o wielkości 845 i/lub 371 bp, co wskazuje, że zagnieżdżona RT-PCR wykryła wszystkie 18 lyssavirusów. Szesnaście plazmidów lyssavirusów uległo wydajnej amplif...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecnie RABV jest głównym wirusem lizy odpowiedzialnym za prawie wszystkie ludzkie i zwierzęce przypadki wścieklizny w Chinach, a także w innych krajach. Ponadto wariant IRKV został po raz pierwszy zidentyfikowany u nietoperza Murina leucogaster w prowincji Jilin w północno-wschodnich Chinach w 2012 r.10 r. i zgłoszono, że spowodował śmierć psa w prowincji Liaoning w 2017 r.11 . Ostatnio nowy wirus lyssa, TWBLV, został również zidentyfikowany u japońskiego...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Badanie było wspierane przez Narodowy Kluczowy Plan Badań i Rozwoju (Grant nr 2016YFD0500401) oraz Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31302043).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 50 i razy; TAE | Various | Various 6 | |
| &; bufor ładowania | TakaRa | 9156 | |
| Agaroza | US Everbright® Inc | A-2015-100g | |
| ddH2O | Różne | różne | |
| znaczniki DL 2,000 | Takara | 3427A | |
| dNTP (10 mM) | TakaRa | 4019 | |
| dNTPs (2,5 mM) | TakaRa | 4030 | |
| Tanon | EPS300 | ||
| Ex-Taq (5 U/μ L) | TakaRa | RR001 | |
| System obrazowania żelu | UVITEC | Fire Reader | |
| Probówki mikrocentyfugi | Różne | różne | |
| odwrotna transkryptaza M-MLV (200 IU /&mikro; L) | TakaRa | 2641A | |
| Spektrofotometr NanoDrop 1000 | Thermoscientific | ND1000 | |
| Oligo (dT)15 | TakaRa | 3805 | |
| Maszyna do PCR | Probówki do PCR BIO-RAD | T100 | |
| Różne | |||
| Polimearaza DNA o wysokiej wierności Phusion | NOWA ANGLIA BioLabs | M0530S | |
| Pipettory | różne | różne | |
| losowe startery | TakaRa | 3801 | |
| Inhibitor RNazy (40 j.m. /&mikro; L) | TakaRa | 2313A | |
| DDHsub2O | TakaRa | 9102 | |
| Taq Buffer (10&razy;) | TakaRa | 9152A Końcówki | |
| Różne | Różne | ||
| Mikser wirowy | Różne | Różne |
Bibliografia
- Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
- Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
- Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
- Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
- World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. , Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
- Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
- Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530(2009).
- Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
- Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
- Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
- Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
- Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
