Ocena uniwersalnej zagnieżdżonej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w celu wykrycia lyssawirusów

Summary

Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją w pan-lyssavirus została opracowana w celu wykrywania wszystkich znanych lyssawirusów. Walidacja z wykorzystaniem próbek mózgu różnych gatunków zwierząt pod kątem wścieklizny wykazała, że metoda ta ma czułość i swoistość równoważną złotemu standardowi testu na przeciwciała fluorescencyjne i może być stosowana do rutynowej diagnostyki wścieklizny.

Abstract

Aby wykryć wirusa wścieklizny i inne gatunki z rodzaju Lyssavirus w rodzinie Rhabdoviridae, opracowano reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (zagnieżdżony RT-PCR) w celu wykrycia konserwatywnego regionu genu nukleoproteiny (N) lyssawirusów. Metoda wykorzystuje odwrotną transkrypcję (RT) przy użyciu wirusowego RNA jako matrycy i oligo (dT)₁₅ oraz losowych heksamerów jako starterów w celu syntezy wirusowego komplementarnego DNA (cDNA). Następnie wirusowe cDNA jest używane jako matryca do amplifikacji fragmentu genu N o długości 845 pz w pierwszej rundzie PCR przy użyciu zewnętrznych starterów, a następnie w drugiej rundzie zagnieżdżonego PCR w celu amplifikacji końcowego fragmentu 371 pz przy użyciu wewnętrznych starterów. Ta metoda może wykryć różne klady genetyczne wirusów wścieklizny (RABV). Walidacja, przy użyciu 9624 próbek mózgu od ośmiu gatunków zwierząt domowych w ciągu 10 lat klinicznych diagnoz i nadzoru nad wścieklizną w Chinach, wykazała, że metoda ma 100% czułość i 99,97% swoistość w porównaniu z bezpośrednim testem fluorescencyjnym przeciwciał (FAT), złotym standardem zalecanym przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) i Światową Organizację Zdrowia Zwierząt (OIE). Ponadto metoda ta może również specyficznie amplifikować docelowy fragment genu N 15 innych zatwierdzonych i dwóch nowych gatunków wirusów lizy w 10. raporcie Międzynarodowego Komitetu ds. Taksonomii Wirusów (ICTV), oceniany za pomocą mimicznego wykrywania zsyntetyzowanych plazmidów genu N wszystkich lyssawirusów. Metoda stanowi wygodną alternatywę dla FAT w diagnostyce wścieklizny i została zatwierdzona jako norma krajowa (GB/T36789-2018) w Chinach.

Introduction

Wścieklizna jest ogólnoświatową chorobą odzwierzęcą wywoływaną przez wirusy z rodzaju Lyssavirus¹. Lyssawirusy (rodzina Rhabdoviridae) to jednoniciowe wirusy RNA o genomie o długości około 12 kb, który koduje pięć białek: N, fosfoproteinę (P), białko macierzy (M), glikoproteinę (G) i duże białko lub polimerazę (L). Na podstawie sekwencji nukleotydowych genu N, odległości genetycznej i wzorców antygenowych, lizsanowirusy zostały podzielone na 16 gatunków, w tym klasyczny wirus wścieklizny (RABV) i wirusy pokrewne wściekliźnie (RRV): Wirus nietoperzy Lagos (LBV), wirus Duvenhage (DUVV), wirus Mokola (MOKV), europejski lyssawirus nietoperzy 1 (EBLV-1), europejski lyssawirus nietoperzy 2 (EBLV-2), australijski lyssawirus nietoperzy (ABLV), wirus Aravan (ARAV), wirus Ikoma (IKOV), lyssawirus nietoperzy Bokeloh (BBLV), lyssawirus nietoperzy Gannoruwa (GBLV), wirus Irkut (IRKV), wirus Khujand (KHUV), wirus nietoperzy Kaukazu Zachodniego (WCBV), wirus nietoperzy Shimoni (SHIBV) i lyssawirus nietoperzy Lleida (LLEBV)². Ostatnio zidentyfikowano dwa dodatkowe lyssawirusy: lyssawirus nietoperzy Kotalahti (KBLV) wyizolowany z nietoperza Brandta (Myotis brandtii) w Finlandii w 2017 roku³ oraz tajwański lyssawirus nietoperzy (TWBLV) wyizolowany od japońskiego pipistrelle (Pipistrellus abramus) na Tajwanie w Chinach w latach 2016–2017⁴.

Wszystkie ssaki są podatne na wściekliznę; jednak żadne poważne zmiany patodonoliczne ani specyficzne objawy kliniczne nie pozwalają na jego identyfikację, a diagnozę można postawić tylko w laboratorium⁵. Najczęściej stosowaną metodą diagnozowania wścieklizny jest FAT, który jest uważany za złoty standard zarówno przez WHO, jak i OIE^5,6. Niemniej jednak FAT może dawać niewiarygodne wyniki na zdegradowanych/autolizowanych próbkach tkanki mózgowej. Ponadto nie można go używać do oznaczania próbek płynów biologicznych, takich jak płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF), ślina i mocz, co w dużej mierze wyklucza jego zastosowanie w diagnostyce antemortem⁷. Alternatywne konwencjonalne testy diagnostyczne, takie jak test zakażenia posiewem tkankowym wścieklizny (RTCIT) i test inokulacji myszy (MIT), wymagają kilku dni⁶, co jest główną wadą, gdy niezbędna jest szybka diagnoza.

Różne molekularne testy diagnostyczne (np. wykrywanie wirusowego RNA przez RT-PCR, test immunoenzymatyczny PCR [PCR-ELISA], hybrydyzacja in situ i PCR w czasie rzeczywistym) są używane jako szybkie i czułe techniki do diagnozowania wścieklizny⁸. RT-PCR jest obecnie zalecany przez OIE do rutynowej diagnostyki wścieklizny, a heminested (hn) PCR jest opisany w Podręczniku Testów Diagnostycznych i Szczepionek dla Zwierząt Lądowych OIE w celu wykrycia wszystkich lyssawirusów⁵. W tym miejscu opisujemy zagnieżdżony wirus pan-lyssavirus RT-PCR, który umożliwia specyficzne i czułe wykrywanie wszystkich 18 gatunków wirusa lyssa porównywalne lub przewyższające te uzyskane przez FAT. Zasada działania metody polega na tym, że RT docelowego RNA (konserwatywny region genu N lyssawirusa) jest przekształcany w cDNA, a następnie amplifikacja cDNA przez dwie rundy PCR. cDNA przechodzi pierwszą rundę PCR z zewnętrznymi starterami w celu amplifikacji fragmentu o długości 845 pz; następnie druga runda PCR wykorzystuje produkt pierwszej rundy PCR jako matrycę do amplifikacji fragmentu 371 pz za pomocą wewnętrznych starterów. Dwie rundy PCR znacznie zwiększają czułość testu.

Protocol

Użycie myszy w tym protokole zostało zatwierdzone przez Komitet Administracyjny ds. Dobrostanu Zwierząt Instytutu Wojskowej Medycyny Weterynaryjnej, Akademii Wojskowych Nauk Medycznych, Chiny (Autoryzacja Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych, numer zezwolenia JSY-DW-2010-02). Przestrzegano wszystkich instytucjonalnych i krajowych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystywania.

1. Ekstrakcja RNA

1. Ekstrahować RNA z tkanki mózgowej podejrzanej o wściekliznę, biopsji skóry, śliny lub płynu mózgowo-rdzeniowego lub z hodowli komórkowej zakażonej RABV, przy użyciu metod ekstrakcji na bazie izotiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu lub dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji wirusowego RNA. Przygotowany RNA należy natychmiast zużyć lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne.

2. Odwrotna transkrypcja wirusowego RNA

1. Wyjmij odczynniki RT wymienione w Tabeli 1 z zamrażarki, trzymaj je na lodzie, a następnie rozmrozić i zwirować przed użyciem.
2. Przygotować 12 μl mieszaniny reakcyjnej RT w probówce PCR o pojemności 0,2 ml z odczynnikami wymienionymi w tabeli 1. Pozwolić na zmiany w pipetowaniu, przygotowując objętość mieszanki wzorcowej o co najmniej jednej wielkości reakcji większą niż jest to wymagane.
3. Dodać 8 μl próbki, RNA kontroli dodatniej lub kontroli ujemnej do mieszaniny reakcyjnej RT na stacji roboczej PCR w pomieszczeniu z szablonami. Kontrola pozytywna RT to RNA wyekstrahowane z hodowli komórkowej zakażonej utrwalonym szczepem RABV CVS-11 (prowokacyjny wirus standard-11) i przechowywany w temperaturze -80 °C. Kontrola ujemna zawiera DDh₂O wolne od RNaz.
4. Wymieszać zawartość probówek RT przez wirowanie, a następnie krótko odwirować.
5. Załaduj probówki reakcyjne do termocyklera. Ustaw program syntezy cDNA w następujących warunkach: 42 °C przez 90 minut, 95 °C przez 5 minut i 4 °C w zawieszeniu. Ustawić objętość reakcji na 20 μl. Rozpocznij przebieg RT.

3. Pierwsza runda PCR

1. Odczynniki PCR wymienione w Tabeli 2 należy przechowywać na lodzie w czystym pomieszczeniu do czasu użycia, a następnie rozmrozić je i zwirować.
2. Przygotować mieszaninę PCR pierwszej rundy w probówce PCR o pojemności 0,2 ml z odczynnikami wymienionymi w Tabeli 2.
3. Dodaj próbkę cDNA lub plazmidu o objętości 2 μl do mieszaniny PCR pierwszej rundy w stacji roboczej PCR w pomieszczeniu z szablonami. Kontrolą dodatnią PCR jest cDNA CVS-11 przygotowane w sposób opisany w kroku 2.3 dla powyższej metody RT. Kontrola ujemna PCR to ddH₂O.
4. Przenieść uszczelnione probówki do termocyklera PCR i poddać cyklowi zgodnie z parametrami wymienionymi w tabeli 3.

4. Druga runda PCR

1. Przygotować drugą rundę mieszaniny PCR w probówce PCR o pojemności 0,2 ml, używając odczynników wymienionych w Tabeli 4.
2. Dodać 2 μl produktu PCR pierwszej rundy do mieszanki PCR drugiej rundy. Ponadto należy uwzględnić ddH₂O jako negatywną kontrolę drugiej rundy PCR.
3. Wykonaj cykle termiczne PCR, stosując te same parametry, które podano w kroku 3.4.

5. Analiza produktów PCR za pomocą elektroforezy na żelach agarozowych

1. Przygotuj 1,5% żel agarozowy, dodając 1,5 g agarozy do 100 ml Tris-acetate-EDTA (TAE) i dokładnie rozpuszczając, podgrzewając w kuchence mikrofalowej.
2. Dodać bromek etydyny (EB) (o końcowym stężeniu 0,01%) lub inny handlowy substytut EB. Wlej żel do formy i pozostaw do zastygnięcia w temperaturze otoczenia na co najmniej 30 minut.
3. Przygotować próbki ładujące, mieszając 5 μl każdego produktu PCR z 1 μl buforu ładującego 6x.
4. Załaduj próbki i odpowiedni marker DNA oddzielnie do studzienek i uruchom żel przez około 30-45 minut przy napięciu 120 V, aż linia barwnika znajdzie się w około 75%-80% w dół żelu.
5. Wyłącz zasilanie, odłącz elektrody od źródła zasilania, a następnie ostrożnie wyjmij żel z pudełka na żel
.
6. Użyj urządzenia dokumentującego żel UV, aby zwizualizować i sfotografować fragmenty DNA.

6. Charakterystyka zagnieżdżonego RT-PCR

1. 6.1. Swoistość i czułość w wykrywaniu plazmidów 18 lyssawirusów
   1. Zamów 18 komercyjnych plazmidów zawierających pełny gen N każdego wirusa lyssa (16 gatunków ICTV i dwa nowe gatunki) do PCR.
   2. Oblicz liczbę kopii plazmidu, używając liczby Avogadro (_{N A}) i następującego wzoru.
      [(g/μL plazmidowego DNA)/(długość plazmidu w bp x 660)] x 6,022 x 10²³ = liczba cząsteczek/μL
   3. Przygotować roztwory podstawowe (2,24 x 10⁹ cząsteczek/μl) wszystkich 18 plazmidów w ddH₂O.
   4. Wykonać dziewięć 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń wszystkich 18 plazmidów w ddH₂O. Rozcieńczyć 10 μl każdego plazmidu w 90 μl ddH₂O. Wirować i krótko odwirować.
   5. Wykonać amplifikację PCR zgodnie z opisem w punktach 3-5.
   6. Przeanalizuj specyficzność i czułość zagnieżdżonego PCR, wykrywając serię plazmidów wirusa lyssa.
2. Określenie detekcji limit
   1. Dostosuj miano szczepu wirusa wścieklizny CVS-11 do 10^5,5 TCID₅₀/ml (miano wirusa określone zgodnie z Podręcznikiem OIE)⁵.
   2. Wykonaj pięć 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń CVS-11 (roztwór podstawowy to 10^5,5 TCID₅₀/ml), jak opisano w kroku 6.1.4.
   3. Przeprowadzić ekstrakcję RNA i procedury amplifikacji RT-PCR wszystkich rozcieńczeń wirusa, jak opisano w sekcjach 1-5.
3. Porównanie zagnieżdżonego RT-PCR ze "złotym standardem" FAT
   1. Przetestuj wszystkie próbki kliniczne za pomocą zagnieżdżonego RT-PCR, a następnie potwierdź wyniki za pomocą FAT⁵ i sekwencjonowania genu N⁹.
   2. Używanie znormalizowanych danych do analizy statystycznej za pomocą SAS 9.1. Użyj testu kappa i testu chi-kwadrat McNemara do statystycznego porównania testów diagnostycznych (polecenie SAS: proc freq; table/agree). Obliczanie przedziałów ufności przy założeniu rozkładu dwumianowego.
4. Ocena skuteczności w badaniu próbek zdegradowanych
   1. Wystawić dwie potwierdzone klinicznie próbki tkanki mózgowej wściekłych psów w temperaturze 37 °C.
   2. Oznaczenie dwóch próbek w każdym dniu ekspozycji w temperaturze 37 °C za pomocą zagnieżdżonego RT-PCR, FAT i klasy MIT5.

Results

Wyniki zagnieżdżonego RT-PCR w celu wykrycia 18 gatunków lyssawirusa są pokazane w Rysunek 1. Wszystkie kontrole dodatnie PCR wykazały oczekiwane 845 pz w pierwszej rundzie i 371 pz w drugiej rundzie amplifikacji bez pasma w kontroli negatywnej. Wszystkie 18 lyssawirusów wytworzyło oczekiwane pasma 845 i/lub 371 bp, co wskazuje, że zagnieżdżony RT-PCR wykrył wszystkie 18 lyssawirusów. Szesnaście plazmidów lyssawirusów miało skuteczną amplifikację w dwóch rundach PCR, ale dwa, a mianowicie AR...

Discussion

Obecnie RABV jest głównym wirusem lizy odpowiedzialnym za prawie wszystkie ludzkie i zwierzęce przypadki wścieklizny w Chinach, a także w innych krajach. Ponadto wariant IRKV został po raz pierwszy zidentyfikowany u nietoperza Murina leucogaster w prowincji Jilin w północno-wschodnich Chinach w 2012 r.¹⁰ r. i zgłoszono, że spowodował śmierć psa w prowincji Liaoning w 2017 r.¹¹ . Ostatnio nowy wirus lyssa, TWBLV, został również zidentyfikowany u japońskiego...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 i razy; TAE	Various	Various 6
&; bufor ładowania	TakaRa	9156
Agaroza	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	Różne	różne
znaczniki DL 2,000	Takara	3427A
dNTP (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2,5 mM)	TakaRa	4030
	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μ L)	TakaRa	RR001
System obrazowania żelu	UVITEC	Fire Reader
Probówki mikrocentyfugi	Różne	różne
odwrotna transkryptaza M-MLV (200 IU /&mikro; L)	TakaRa	2641A
Spektrofotometr NanoDrop 1000	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
Maszyna do PCR	Probówki do PCR BIO-RAD	T100
	Różne
Polimearaza DNA o wysokiej wierności Phusion	NOWA ANGLIA BioLabs	M0530S
Pipettory	różne	różne
losowe startery	TakaRa	3801
Inhibitor RNazy (40 j.m. /&mikro; L)	TakaRa	2313A
DDHsub2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10&razy;)	TakaRa	9152A Końcówki
	Różne	Różne
Mikser wirowy	Różne	Różne