Artykuł metodologiczny

Technologia CRISPR/Cas9 w przywracaniu ekspresji dystrofiny w prekursorach mięśni pochodzących z iPSC

7.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59432

⸱

14 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Medical College of Georgia, Augusta University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół delecji exon23 oparty na Cas9, który przywraca ekspresję dystrofiny w iPSC z mysich fibroblastów skóry Dmdmdx i bezpośrednio różnicuje iPSC w miogenne komórki progenitorowe (MPC) za pomocą systemu aktywacji Tet-on MyoD.

Streszczenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest poważną postępującą chorobą mięśni spowodowaną mutacjami w genie dystrofiny, co ostatecznie prowadzi do wyczerpania komórek progenitorowych mięśni. Zgrupowana, regularnie rozmieszczona edycja genów 9 (CRISPR/Cas9) z krótkimi powtórzeniami palindromicznymi/CRISPR-associated 9 może przywrócić ekspresję genu dystrofiny. Autologiczne indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z komórek progenitorowych mięśni (MPC) mogą uzupełniać pulę komórek macierzystych/progenitorowych, naprawiać uszkodzenia i zapobiegać dalszym powikłaniom DMD bez powodowania odpowiedzi immunologicznej. W tym badaniu wprowadzamy kombinację CRISPR/Cas9 i niezintegrowanych technologii iPSC w celu uzyskania komórek progenitorowych mięśni z odzyskaną ekspresją białka dystrofiny. Krótko mówiąc, używamy nieintegrującego wektora Sendai do ustanowienia linii iPSC z fibroblastów skóry myszy Dmdmdx. Następnie używamy strategii delecji CRISPR/Cas9, aby przywrócić ekspresję dystrofiny poprzez niehomologiczne połączenie końcowe przeformułowanego genu dystrofiny. Po walidacji PCR zubożenia eksonu23 w trzech koloniach z 94 wybranych kolonii iPSC, różnicujemy iPSC w MPC poprzez indukowaną doksycykliną (Dox) ekspresję MyoD, kluczowego czynnika transkrypcyjnego odgrywającego znaczącą rolę w regulacji różnicowania mięśni. Nasze wyniki wskazują na możliwość zastosowania strategii delecji CRISPR/Cas9 w celu przywrócenia ekspresji dystrofiny w MPC pochodzącym z iPSC, co ma znaczny potencjał dla opracowania przyszłych terapii leczenia DMD.

Wprowadzenie

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest jedną z najczęstszych dystrofii mięśniowych i charakteryzuje się brakiem dystrofiny, dotykając 1 z około 5 000 nowonarodzonych chłopców na całym świecie1. Utrata funkcji genu dystrofiny powoduje strukturalne defekty mięśni prowadzące do postępującej degeneracji włókien mięśniowych1,2. System terapii genowej za pośrednictwem rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) został przetestowany w celu przywrócenia ekspresji dystrofiny i poprawy funkcji mięśni, takich jak wymiana genów za pomocą mikrodystrofiny (μ-Dys). Jednak podejście rAAV wymaga wielokrotnych wstrzyknięć w celu podtrzymania ekspresji funkcjonalnego białka3,4. Dlatego potrzebujemy strategii, która może skutecznie i trwale przywrócić ekspresję genu dystrofiny u pacjentów z DMD. Mysz Dmdmdx, mysi model DMD, ma mutację punktową w eksonie 23 genu dystrofiny, która wprowadza przedwczesny kodon terminacji i powoduje powstanie niefunkcjonalnego skróconego białka pozbawionego C-końcowej domeny wiążącej dystroglikan. Ostatnie badania wykazały zastosowanie technologii CRISPR/Cas9 do przywrócenia ekspresji genu dystrofiny poprzez dokładną korektę genów lub delecję zmutowanego eksonu u małych i dużych zwierząt5,6,7. Long et al.8 opisali metodę korygowania mutacji genu dystrofiny w linii zarodkowej myszy Dmdmdx za pomocą naprawy kierowanej homologią (HDR) opartej na edycji genomu CRISPR/Cas9. El Refaey et al.9 poinformowali, że rAAV może skutecznie wyciąć zmutowany ekson 23 u myszy dystroficznych. W tych badaniach gRNA zostały zaprojektowane w intronach 20 i 23 tak, aby powodować dwuniciowe pęknięcia DNA, które częściowo przywróciły ekspresję dystrofiny po naprawie DNA poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). Jeszcze bardziej ekscytujące jest to, że Amoasii et al.10 niedawno poinformowali o skuteczności i wykonalności edycji genu CRISPR za pośrednictwem rAAV w przywracaniu ekspresji dystrofiny w modelach psów, co jest niezbędnym krokiem w przyszłym zastosowaniu klinicznym.

DMD powoduje również zaburzenia komórek macierzystych11. W przypadku uszkodzenia mięśni, mieszkaniowe komórki macierzyste mięśni uzupełniają umierające komórki mięśniowe po różnicowaniu mięśni. Jednak następujące po sobie cykle uszkodzeń i napraw prowadzą do skrócenia telomerów w komórkach macierzystych mięśni12 i przedwczesnego wyczerpania puli komórek macierzystych13,14. Dlatego połączenie terapii autologicznymi komórkami macierzystymi z edycją genomu w celu przywrócenia ekspresji dystrofiny może być praktycznym podejściem do leczenia DMD. Technologia CRISPR/Cas9 zapewnia możliwość generowania autologicznych, genetycznie skorygowanych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu funkcjonalnej regeneracji mięśni i zapobiegania dalszym powikłaniom DMD bez powodowania odrzucenia immunologicznego. Jednak iPSC wiążą się z ryzykiem powstania nowotworu, które można złagodzić poprzez różnicowanie iPSC w miogenne komórki progenitorowe.

W tym protokole opisujemy użycie nieintegrującego wirusa Sendai do przeprogramowania fibroblastów skórnych myszy Dmdmdx na iPSC, a następnie odzyskania ekspresji dystrofiny poprzez delecję genomu CRISPR/Cas9. Po walidacji delecji Exon23 w iPSC za pomocą genotypowania, zróżnicowaliśmy skorygowane genomem iPSC w miogenne progenitory (MPC) poprzez różnicowanie miogenne indukowane przez MyoD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury związane ze zwierzętami i chirurgiczne były wykonywane zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Augusta (IACUC). Myszy karmiono standardową dietą i wodą ad libitum.

1. Izolacja pierwotnych mysich fibroblastów od dorosłych myszyDmd mdx

  1. Eutanazja dorosłych myszyDmd mdx (samiec, 2 miesiące) przez uduszenie CO2 i torakotomię zgodnie z IACUC zatwierdzonym przez Medical College of Georgia, Augusta University. Odetnij ogon sterylnym skalpelem w sterylnym stanie pod laminarnym kapturem. Opłucz ogon 70% etanolem przez 5 minut, a następnie umyj sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w naczyniu o średnicy 6 cm.
  2. Oderwij skórę ogona przez ostre nacięcie od podstawy do końca ogona wzdłuż skóry ogona, a następnie delikatnie oderwij skórę ogona pęsetą. Zmielić skórę do wielkości 1 mm3 za pomocą sterylnego skalpela i przenieść zmieloną tkankę skórną do 6 cm naczynia w minimalnym podłożu niezbędnym Dulbecco/Ham's F12 (DMEM/F12) zawierającym 0,1% kolagenazy dożylnej i 1 U/ml dypazy.
  3. Trawić tkankę skórną w naczyniu hodowlanym przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2
    4. .
  4. Pokryj 6-dołkową płytkę fibronektyną i 0,2% żelatyną (1 ml fibronektyny w 199 ml 0,2% żelatyny; Tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  5. Oddzielić strawioną tkankę skórną za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml i przenieść tkankę i supernatant do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 217 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1,5 ml pożywki fibroblastowej (tabela materiałów).
  6. Osadki zawierające niekompletnie strawioną tkankę skórną z etapu 1.5 należy wyhodować na 6-dołkowej płytce pokrytej fibronektyną i 0,2% żelatyną z etapu 1.4 w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Wymień pożywkę 24 godziny po wstępnym posiewie w celu usunięcia nieprzyłączonych komórek i zmieniaj pożywkę co 48 godzin.

2. Przeprogramowanie fibroblastów skóry myszy na iPSC

  1. Dwa dni przed transdukcją trawić mysie fibroblasty skórne z kroku 1.6 za pomocą roztworu do oddzielania komórek (tabela materiałów) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z wilgotną atmosferą 5% CO2 przez 5 minut.
  2. Policz komórki za pomocą hemekytometru i odwiruj przy 217 x g przez 3 minuty.
  3. Komórki nasienne o gęstości 1−2 x 10 5 komórek na studzienkę na płytkę 6-dołkową i hodowla z pożywką fibroblastową (tabela materiałów) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z wilgotną atmosferą 5% CO2 .
  4. W dniu transdukcji (dzień 0) oszacuj komórki i oblicz objętość każdego wirusa wymaganą do osiągnięcia docelowej wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5, 5 i 3 (tj. KOS MOI = 5, hc-Myc MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) zgodnie z instrukcją handlową.

figure-protocol-1

  1. Rozmrozić trzy probówki Sendai w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5-10 s i dodać obliczone objętości każdej z trzech probówek Sendai do 1 ml pożywki fibroblastowej (tabela materiałów).
  2. Usuń pożywkę fibroblastową z kroku 2.3 i dodaj mieszaninę wirusów przeprogramowujących do studzienek zawierających komórki. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z nawilżoną atmosferą o stężeniu 5%CO2.
  3. Zastąp pożywkę świeżą pożywką fibroblastową 24 godziny po transdukcji. Hoduj komórki przez jeden tydzień z wymianą pożywki co drugi dzień.
  4. Zbierz zakażone fibroblasty myszy w 7 dniu po transdukcji z 0,05% trypsyny/EDTA i umieść na szalkach, które są wcześniej pokryte fibronektyną i 0,2% żelatyną.
  5. Hodowlę zakażonych fibroblastów myszy z kroku 2.6 za pomocą kompletnej pożywki wzrostowej z embrionalnych komórek macierzystych myszy (ES) (tabela materiałów) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z wilgotną atmosferą 5% CO2 i codziennie zmieniać pożywkę.
  6. Od 8 dnia obserwuj płytkę pod odwróconym mikroskopem co drugi dzień, aby zidentyfikować pojawienie się grudek komórek z morfologią mysiego ES.

3. Wykorzystanie fosfatazy alkalicznej, żywego barwienia i cytometrii przepływowej do ilościowego określenia efektywności przeprogramowania

  1. Usuń pożywkę hodowlaną z każdej studzienki i płucz DMEM/F-12 przez 2-3 minuty.
  2. Nałożyć 2 ml 1x fosfatazy alkalicznej (AP) żywego roztworu roboczego (rozcieńczenie 1:500 w DMEM/F-12) na przylegające komórki i inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z wilgotną atmosferą 5% CO2 przez 30 minut.
  3. Odessać żywą plamę AP i umyć dwukrotnie PBS przez 5 minut każdy.
  4. Trawić komórki roztworem do oddzielania komórek (tabela materiałów) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z nawilżoną atmosferą 5% CO2 przez 5 minut. Wykonać cytometrię przepływową w celu określenia wydajności przeprogramowania.

4. Wybieranie i zbieranie komórek podobnych do ES

  1. Zbadaj kolonie z kroku 2.8 pod odwróconym mikroskopem.
  2. Zaznacz kolonie na dnie naczynia za pomocą markera do samotuszącego przedmiotu.
  3. Zastosuj natłuszczone pierścienie klonujące, aby przykryć zaznaczone kolonie komórek. Dodać 100 μl 0,05% trypsyny/EDTA do każdego pierścienia klonującego w temperaturze 37 °C przez 5 minut, a następnie przenieść strawione komórki za pomocą końcówek pipet o pojemności 100 μl na 48-dołkowe płytki hodowlane zawierające pożywkę wzrostową mES.
  4. Inkubować komórki na 48-dołkowych płytkach hodowlanych w inkubatorze o temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 . Przełóż komórki do naczynia o średnicy 6 cm, gdy osiągną 70% zbieżności.
  5. Powtórzyć kroki 4.3 i 4.4 kilka razy, aż do uzyskania jednolitych klonów w kształcie akademika.

5. Zamrażanie iPSC do kriokonserwacji

  1. Oddziel wybrane iPSC z kroku 4.5 za pomocą trypsyny, wersetu i osocza pisklęcego (TVP; Tabela materiałów) roztwór w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2 przez 30 min.
  2. Zebrać komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 217 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml zamrożonej pożywki mysiej ES (tabela materiałów), aby uzyskać 1 ml na kriowial.
  4. Dodaj komórki do kriowialiów i zamroź za pomocą pojemnika do zamrażania, który zapewnia krytyczną, powtarzalną szybkość chłodzenia -1 °C/min wymaganą do kriokonserwacji w temperaturze -80 °C przez noc.
  5. Przenieść zamrożone fiolki do zbiornika z ciekłym azotem.

6. Barwienie immunofluorescencyjne dla markerów komórek macierzystych w iPSC

  1. Wysiewać iPSC z kroku 5.1 hodowane z pożywką mES do 8-dołkowego szkiełka komorowego pokrytego poli-D-lizyną/lamininą (tabela materiałów) o odpowiedniej gęstości, aby osiągnąć między 1−2 x 104 komórek na basenik, a następnie inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C z nawilżoną atmosferą 5% CO2 przez 48 godzin.
  2. Zanurz szkiełka w 4% formaldehydzie na 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zanurz szkiełka w PBS dwukrotnie na 5 minut za każdym razem.
  3. Inkubować skrawki z mysim odczynnikiem blokującym IgG (tabela materiałów) i 5% surowicy koziej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciała w rozcieńczalniku białkowym (mysz-anty-SSEA1, 1:100, królik-anty-Nanog, 1:500; królik-anty-POU klasa 5 homeobox 1 [OCT4], 1:500; królik-anty-SRY-box 2 [SOX2], 1:500; królik-anty-Lin-28 homolog A [Lin28A], 1:400) (Tabela materiałów). Nałożyć przeciwciała na komórki i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze.
  5. Odrzucić pierwszorzędowy roztwór przeciwciała i przemyć szkiełka 3 razy w PBS.
  6. Zastosować drugie przeciwciała (Alexa488 - sprzężone kozie przeciwciało anty-mysie i Alexa555 - sprzężone kozie przeciwciało anty-królik, 1:400 każde) w rozcieńczalniku białkowym M.O.M. na szkiełkach i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Umyj szkiełka 3x w sekcjach PBS i zamontuj pożywką montażową zawierającą 4'6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI).
  8. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu konfokalnego.

7. Badanie pluripotencji iPSC in vivo

  1. Dysocjację iPSC z kroku 5.1 na pojedyncze komórki za pomocą roztworu TVP w inkubatorze o temperaturze 37 °C z nawilżoną atmosferą 5% CO2 przez 30 minut.
  2. Policz komórki za pomocą hemekytometru i odwiruj przy 217 x g przez 3 minuty.
  3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad z pożywką mES w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml o stężeniu 5 x 105 komórek/30 μl do przeszczepu komórek.
  4. Usuń włosy z obu tylnych kończyn myszy z niedoborem odporności za pomocą maszynki do strzyżenia włosów.
  5. Znieczulić myszy ketaminą (100 mg/kg) i oczyścić miejsce wstrzyknięcia 75% alkoholem.
  6. Wstrzyknąć domięśniowo 30 μl zawiesiny iPSC z kroku 7.3 do mięśnia brzuchatego łydki za pomocą igły 31 G.
  7. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu zbierz mysie mięśnie brzuchate łydki i osadź w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zamroź szybko i pokrój na sekcje 5 μm15,16.
  8. Utrwal skrawki w 4% formaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyj szkiełka dwukrotnie w PBS przez 5 minut za każdym razem.
  9. Zablokuj komórki 5% rozcieńczalnikiem białka surowicy koziej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  10. Dodać rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe (królicze przeciwciało anty-AFP, 1:50; królicze anty-SMA 1:50; królicze anty-TH, 1:50) do szkiełek i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze.
  11. Odrzucić roztwór przeciwciała pierwotnego, przemyć komórki 3x (5 min/mycie) w PBS, dodać rozcieńczone w stosunku 1:400 kozie przeciwciało anty-królicze Alexa555 do szkiełek i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  12. Umyj szkiełka 3x (5 min/mycie) w PBS i zamontuj sekcje z medium montażowym zawierającym DAPI.

8. Budowa wektora lentiwirusowego CRISPR/Cas9 celującego w introny flankujące ekson dystrofiny 23

  1. Zaprojektuj dwie pary oligonukleotydów gRNA ukierunkowanych na ekson dystrofiny 23 po bokach intronu za pośrednictwem http://crispor.tefor.net/crispor.py.
    UWAGA: Zaprojektowane pary są następujące:
    i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3'
    i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3'
    i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3'
    i23anty-sensowne: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3').
  2. Trawić i defosforylować 5 μg lentiwirusowego plazmidu CRISPR (lenti-CRISPRv2-blast [prezent od Mohana Babu] i lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [prezent od Kristen Brennand]) (tabela materiałów) za pomocą BsmB1/Esp3I przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Na 5 μg plazmidów dodać 3 μl enzymu ograniczającego BsmB1, 3 μl szybkiej fosfatazy alkalicznej, 6 μl 10x buforu trawienia enzymów i 0,6 μl 100 mM DTT w 60 μl reakcji).
  3. Załaduj reakcje na 0,8% żel agarozowy. Uruchom żel pod napięciem 100−150 V przez 30 minut.
  4. Oczyść strawiony plazmid w żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) i eluuj w 20 μlH2O.
  5. Fosforylować i wyżarzać każdą parę oligonukleotydów gRNA zawierających 1 μl każdego oligonukleotydu w 100 μM, 1 μl 10x buforu ligacyjnego T4, 0,5 μl kinazy polinukleotydowej T4 (PNK), 6,5 μl ddH2O w temperaturze 37 °C przez 30 min, a następnie 95 °C przez 5 min, a następnie obniżyć do 25 °C w temperaturze 5 °C/min.
  6. Zmocuj rozcieńczenia 1:200 wyżarzonych oligonukleotydów gRNA do plentiCRISPR V2-Blast lub plentiGuide-Hygro-iRFP670. Zmieszać 50 ng roztrawionych wektorów BsmB1/Esp3I z 1 μl rozcieńczonego oligo duplexu i 5 μl 2x buforu ligazy plus 1 μl ligazy w 11 μl układu reakcyjnego i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Przeprowadzić przemianę z 3 μl produktu do ligacji w 50 μl kompetentnych komórek (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta.
  8. Przekształcone kompetentne komórki rozprowadzić na płytce agarowej ze 100 μg/ml karbenicyliny i inkubować w temperaturze 31,5 °C przez 18 godzin.
  9. Pobrać kolonie za pomocą sterylnych końcówek pipet o pojemności 10 μl i hodować je w 5 ml wspaniałego bulionu (tabela materiałów) zawierającego 100 μg/ml karbenicyliny w temperaturze 31,5 °C, 185 obr./min w inkubatorze z wytrząsarką przez 21 godzin.
  10. Oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawów mini-prep i midi-prep (tabela materiałów).
  11. Sprawdź plazmidy mini-prep przez trawienie restrykcyjne. Dla układu reakcyjnego o pojemności 20 μl należy dodać 1 μg plazmidowego DNA, 2 μl buforu reakcyjnego trawienia (tabela materiałów) i 1 μl mieszaniny enzymów restrykcyjnych (0,5 μl KpnI-HF i 0,5 μl AgeI-HF dla plentiCRISPR V2-Blast-i22; 0,5 μl NotI-HF i 0,5 μL EcoRI-HF dla plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Inkubować układ reakcyjny przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  12. Załaduj reakcje na 0,8% żel agarozowy. Uruchom żel pod napięciem 100−150 V przez 30 min.
    UWAGA: Prawidłowe pasma dla plentiCRISPR V2-Blast-i22 powinny wynosić 622 bp i 12,2 kb, a prawidłowe pasma dla plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23 powinny wynosić 2,6 kb i 7,1 kb.

9. Opakowanie wektorów lentiwirusowych

  1. Hodowla 7 x 105 293FT komórek w 5 ml pożywki DMEM zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej w 6 cm naczyniu przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Przygotuj koktajl (1 μg plentiCRISPR V2-Blast-i22 lub plentiGuide-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng plazmidu pakującego psPAX2, 250 ng plazmidu otoczkowego pMD2.G i 5 μl odczynnika do transfekcji A [Tabela materiałów] w 100 μl zredukowanej pożywki MEM w surowicy).
  3. Przygotować mieszaninę 5 μl odczynnika do transfekcji B (tabela materiałów) w 100 μl zredukowanej pożywki MEM w surowicy.
  4. Dodać 100 μl mieszaniny odczynnika B do transfekcji do mieszaniny plazmidowej z kroku 9.2 i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodaj kompleks DNA-lipid (z kroku 9.4) kroplami do komórek 293FT. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  6. Następnego dnia dodać wzmacniacz produkcji wirusa (500x) (tabela materiałów) do każdej potrawy i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  7. Przez następne dwa dni pobieraj pożywkę z komórek za pomocą pipet i przefiltruj pożywkę przez filtr 0,45 μm w celu usunięcia komórek.

10. Zagęszczenie i oczyszczanie wektorów lentiwirusowych

  1. Wytrącić wektor lentiwirusowy w pożywce o stopniu 9.7 przez noc w temperaturze 4 °C za pomocą 5x glikolu polietylenowego 4000 (PEG4000, 8,5% stężenia końcowego) i 4 M NaCl (0,4 M stężenie końcowe).
  2. Odwirować pożywkę wirusową zawierającą roztwór PEG4000 w temperaturze 2,095 x g i temperaturze 4 °C przez 30 minut, usunąć i wyrzucić supernatant.
  3. Ponownie zawiesić granulki z 500 μl pożywki MEM o obniżonej surowicy (miano lentiwirusa: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1,56 x 108, lenti-iRFP670-gRNAi23: 1,3 x 108, lenti-CRISPR V2-control: 3,13 x 107, lenti-iRFP670-kontrola: 5,9 x 107). Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

11. Usunięcie eksonu 23 w iPSC myszy za pomocą dwóch przewodnikowych RNA (gRNA) sprzężonych z Cas9

  1. Umieść iPSC myszy z kroku 4.5 na 24-dołkowej płytce pokrytej fibronektyną i żelatyną.
  2. Gdy komórki osiągną 50% zbieżności, należy przejść na świeżą pożywkę hodowlaną (kompletna pożywka do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy) zawierającą 8 μg/ml polibrenu).
  3. Dodać 100 μl roztworu cząstek lentiwirusa z kroku 10.3, w tym lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 i kontrolnego (pusty wektor: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) do iPSC myszy. Inkubować komórki przez 3 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  4. Wybrać stabilnie zainfekowane komórki pożywką zawierającą 2,5 μg/ml blasticydyny i 100 μg/ml higromycyny B, określając minimalne stężenie blasticydyny i higromycyny B wymagane do zabicia niezakażonej komórki.
    UWAGA: Niezainfekowane komórki zostałyby zabite przez blastycydynę i higromycynę B.
  5. Trawić wybrane mysie iPSC za pomocą 0,5 ml roztworu TVP w każdym dołku (płytka 24-dołkowa) i inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  6. Dysocjować iPSC na pojedyncze komórki za pomocą pipetowania, policzyć komórki za pomocą komory do liczenia komórek, a następnie rozcieńczyć około 150 strawionych pojedynczych komórek pożywką mES w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  7. Po około 10 dniach należy pobrać pojedyncze kolonie pod mikroskopem odwróconym, używając sterylnych końcówek do pipet o pojemności 10 μl (należy pobrać 96 kolonii).
  8. Przenieść pobrane kolonie do 50 μl roztworu TVP do każdej studzienki (płytka 96-dołkowa, po jednej kolonii w każdym dołku), trawić w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie wysiewać strawione komórki na dwie 96-dołkowe płytki hodowlane, aby utrzymać kulturę (jedną do genotypowania).
  9. Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C aż do uzyskania 70% zlewu.

12. Identyfikacja kolonii iPSC z delecją exon23

  1. Usuń pożywkę z płytki 96-dołkowej, gdy kolonie komórek osiągną 70% konfluencji.
  2. Dodać 25 μl odczynnika do lizy (tabela materiałów) zawierającego roztwór proteinazy K (1 ml proteinazy K w 100 ml odczynnika do lizy) do każdego dołka i przenieść lizat na 96-dołkową płytkę PCR.
  3. Uszczelnić płytkę do PCR i inkubować płytki w temperaturze 55 °C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 45 minut w celu lizy komórek i denaturacji proteinazy K.
  4. Przeprowadzić reakcję PCR z 2 μl lizatu z kroku 12.3. Do 20 μl reakcji PCR dodać 2 μl lizatu, 10 μl 2x premiksu polimerazy DNA (tabela materiałów), 7 μl wody wolnej od DNaz i 1 μl starterów DMD exon 23 (tabela 1).
  5. Dla reakcji PCR należy zastosować następujące parametry: 98 °C przez 1 min, 35 cykli po 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 15 s, 72 °C przez 30 s i końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 1 min.
  6. Załaduj reakcję PCR na 2% żel agarozowy. Uruchom żel pod napięciem 100−150 V przez 30 minut.
  7. Sprawdź żel w świetle UV (skuteczność wybijania wynosi 3/94).

13. Wykorzystanie systemu aktywacji Tet-on MyoD do bezpośredniego różnicowania iPSC na miogenne komórki progenitorowe (MPC)

  1. Zapakuj mysz LV-TRE-VP64 MyoD-T2A-dsRedExpress2 i LV-TRE-VP16 MyoD-T2A-dsRedExpress2 (prezent od Charlesa Gersbacha) (tabela materiałów) zgodnie z wcześniejszym opisem dla wektorów lenti-CRISPRv2-blast i lenti-gRNA-iRFP670 w sekcjach 9 i 10.
  2. Zainfekuj iPSC myszy lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 lub lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2, jak opisano wcześniej dla wektorów lenti-CRISPRv2-blast i lenti-gRNA-iRFP670 w krokach 11.1−11.3.
  3. Wybierz komórki z 1 μg/ml puromycyny po trzech dniach infekcji, aby uzyskać czystą transdukowaną populację komórek.
  4. Dodać 3 μg/ml doksycykliny do pożywek hodowlanych (10% FBS DMEM) w celu różnicowania MPC. Wymieniaj świeżą pożywkę uzupełnioną doksycykliną co dwa dni.

14. Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją do oceny dynamicznego różnicowania mięśni i ekspresji eksonu DMD 22-24

  1. Ekstrahować komórkowe RNA po 0, 3, 6 i 10 dniach po leczeniu doksycykliną za pomocą odczynnika do izolacji RNA, odwrotnie transkrybować RNA do cDNA za pomocą zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA (tabela materiałów).
  2. Dla układu reakcyjnego qPCR o objętości 20 μl dodać 1 μl cDNA, 10 μl buforu reakcyjnego PCR (tabela materiałów), 8 μl DNAH2Oi 1 μl mieszaniny starterów do przodu i do tyłu (dehydrogenaza gliceraldehydo-3-fosforanowa [GAPDH], mięśnie szkieletowe [ACTA1], egzon OCT4 i DMD22, ekson DMD23 i ekson DMD24, zob. tabela 1).
  3. Dla reakcji PCR należy zastosować następujące parametry: 50 °C przez 2 min, 95 °C przez 2 min, 40 cykli po 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min, krzywa topnienia od 65,0 °C do 95,0 °C, przyrost 0,5 °C.

15. Barwienie immunofluorescencyjne łańcucha ciężkiego miozyny 2 (MYH2) i ekspresja białka dystrofiny

  1. Indukowane doksycykliną, zmodyfikowane komórki lenti-TRE-MyoD z kroku 13.4 na 8-dołkowych szkiełkach hodowlanych.
  2. Utrwal komórki w 4% formaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umyj szkiełka dwukrotnie w PBS przez 5 minut za każdym razem.
  3. Zablokuj komórki 5% rozcieńczalnikiem białka surowicy koziej przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Dodać do szkiełek przeciwciało królicze przeciwko dystrofinie (1:300) i mysie przeciwciało anty-MYH2 (1:100), inkubować w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze.
  5. Odrzucić roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, przemyć komórki 3x (5 min/mycie) w PBS, dodać 1:400 rozcieńczonego koziego przeciwciała anty-królika Alexa488 i sprzężonego z Alexa555 koziego przeciwciała anty-myszy do szkiełek i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Umyj szkiełka 3x (5 min/mycie) w PBS i zamontuj sekcje z medium montażowym zawierającym DAPI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ustanowienie iPSC pochodzących z fibroblastów skóry Dmdmdx. Wykazaliśmy skuteczność generowania mysich iPSC z fibroblastów skóry pochodzących z myszyDmd mdx przy użyciu wektorów przeprogramowania bez integracji. Rysunek 1A wykazał, że pojawienie się kolonii podobnych do embrionalnych komórek macierzystych (ESC) po trzech tygodniach od zakażenia. Oceniamy skuteczność indukcji iPSC za pomocą barwienia żywą fosfatazą alkaliczną (AP); Ry...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD) jest destrukcyjną i ostatecznie śmiertelną chorobą dziedziczną charakteryzującą się brakiem dystrofiny, prowadzącą do postępującego zaniku mięśni 1,2. Nasze wyniki pokazują przywróconą ekspresję genu dystrofiny w miogennych komórkach progenitorowych pochodzących zDmd mdx iPSC przez podejście delecji egzonu23 za pośrednictwem CRISPR / Cas9. Takie podejście ma trzy zalety.

Po pierwsze, wyge...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Tang i Weintraub byli częściowo wspierani przez NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Instrumenty
Igła o rozmiarze 31 Różne 
Ostre nacięcieróżne 
Sterylne skalpeleróżne 
Pęsetyróżne 
Pożywka fibroblastowa (na 100 ml kompletnej pożywki)Numer katalogowyfirmyObjętość
2-merkaptoetanol (55 mM)Gibco21-985-0230,1 ml
antybiotyk przeciwgrzybiczy Slution 100xCORNINGMT30004CI1 ml
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoki poziom glukozySIGMAD642987 mL
Płód Surowica bydlęca CharakterystykaHyCloneSH30396.0310 ml
roztworu L-glutaminySIGMAG75131 ml
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x) Gibco111400761 ml
roztworu TVP (na 500 ml kompletnego roztworu)Numer katalogowyfirmyObjętość
Surowica kurczakaGibco16110-0825 ml
EDTASigma-AldrichE6758186 mg
soli fizjologicznejbuforowanej fosforanami do 500 ml
trypsyny (2,5%)Thermo150900465 ml
Pożywka wzrostowa mES (na 500 ml kompletnego roztworu)Numer katalogowyfirmyObjętość
2-merkaptoetanol (55 mM)Gibco21-985-0230,5 ml
antybiotyku przeciwgrzybiczego Slution 100xCORNINGMT30004CI5 ml
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoki poziom glukozySIGMAD6429408,5 ml
Płodowa surowica bydlęca ScharakteryzowanyHyCloneSH30396.0375 ml
roztworu L-glutaminySIGMAG75135 ml
rekombinowany mysi czynnik hamujący białaczkę (LIF), 0,5 x 106 U/mlEMD Millipore CorpCS210511500 μ L
Suplement inhibitora MEK/GS3 EMDMillipore CorpCS210510-500UL500 μ
Roztwór aminokwasów endogennych L MEM (100x) Gibco111400765 ml
Pożywki z komórek ES nie powinny być przechowywane dłużej niż 4 tygodnie, a z inhibitorami nie dłużej niż 2 tygodnie.
mES mrożone podłoże (na 50 ml kompletnego roztworu)FirmaNumer katalogowyObjętość
sulfoxide dimetylu (DMSO)SIGMAD26505 ml
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoka zawartość glukozySIGMAD642924,9 ml
Płodowa surowica bydlęca Charakteryzującysię HyklonSH30396.0325 ml
rekombinowany czynnik hamujący białaczkę myszy (LIF), 0,5 x 106 U / mlEMD Millipore CorpCS21051150 μ L
Nazwa firmy zajmującej się materiałem / sprzętemNumer katalogowyRRID
0,05% Trypsyna / 0,53 mM EDTACORNING25-052-CI
4% ParaformaldehydThermo scientificJ19943-k2
Roztwór AccutaseSIGMAA6964Roztwór do odłączania komórek
AgeI-HFNEBR3552L
Alexa488-sprzężone kozie przeciwciało anty-mysieInvitrogenA32723AB_2633275
Alexa488-sprzężone kozie przeciwciało anty-króliczeInvitrogenA32731AB_2633280
Alexa555-sprzężone kozie przeciwciało anty-króliczeInvitrogenA32732AB_2633281
anty-AFPThermo scientificRB-365-A1AB_59574
anty-&alfa;-Gładki Aktyna mięśniowa (D4K9N) XPCST19245SAB_2734735
anty-DystrofinaThermoPA5-32388AB_2549858
anty-LIN28A (D1A1A) XP     CST8641SAB_10997528
anty-MYH2DSHBmAb2F7AB_1157865
anty-Nanog-XPCST8822SAB_11217637
anty-Oct-4A (D6C8T)CST83932SAB_2721046
anty-Sox2abcamab97959AB_2341193
anty-SSEA1(MC480) CST4744sAB_1264258
anty-TH (H-196)SANTA CRUZ sc-14007AB_671397
Fosfataza alkaliczna Live Stain (500x)ThermoA14353
Blasticidin SSigma-Aldrich203350
BsmBI/Esp3INEBR0580L/R0734L
Milipor karbenicyliny205805-250MG
Kolagenaza IV Worthington Biochemical CorporationLS004189
Kompetentne komórkiTakaRa636763
CutSmart NEBB7204S
CytoTune-iPS 2.0 Zestaw do przeprogramowania SendaiThermoA16517
Odczynnik do lizy DirectPCR (komórka)VIAGEN BIOTECH302-C
Dispaza (1 U/mL)STEMCELL Technologies7923
Chlorowodorek doksycyklinyFisher BioReagentsBP26535
EcoRI-HFNEBR3101L
Fibronektyna osocze bydlęceSIGMAF1141
 
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAEX II (500)		QIAGEN20051
Żelatyna ze skóry świni, typ ASIGMAG1890
HardSet AntiFade Podłoże montażowe z DAPIVectorH-1500
Hygromycyna B (50 mg / ml)Invitrogen10687010
Ketamina HCL do wstrzykiwańHENRY SCHEIN ZDROWIE ZWIERZĄT45822
KpnI-HFNEBR3142L
CRISPRv2-blastAddgene83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670Addgene99377
Lipofectamin 3000 Transfekcja KitInvitrogenL3000015
LV-TRE-VP64-mysz MyoD-T2A-dsRedExpress2   Mysz Addgene60625
LV-TRE-VP16 MyoD-T2A-dsRedExpress2Addgene60626
Mysz na myszy (M.O.M.) Zestaw podstawowyVectorBMK-2202
NotI-HFNEBR3189L
Opti-MEM I Zredukowane podłoże surowicoweThermoFisher31985070
Glikol polietylenowy 4,000Alfa AesarAAA161510B
PolybreneSIGMATR1003
Corning  BioCoat Preparat do hodowli poli-D-lizyny/laminyCORNINGCB354688
PowerUp SYBR Green Master MixThermoFisherA25742
PrimeSTAR Max PremixTakaRaR045
Proteinaza KVIAGEN BIOTECH507-PKP
Dichlorowodorek puromycynyMP BiomedicalsICN19453980
qPCR Lentivirus Zestaw do miareczkowaniaabmLV900
Zestaw do szybkiej ligacjiNEBM2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)QIAGEN27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)QIAGEN12945
Zestaw do odwrotnej transkrypcji RevertAid RTThermo scientificK1691
RNAzol RTCentrum Badań Molekularnych, INCRN 190
T4 Bufor reakcyjny ligazy DNANEBB0202S
T4 Kinaza polinukleotydowaNEBM0201S
Wspaniały bulion Zmodyfikowanybioodczynniki FisheraBP9729-600
Odczynnik ViralBoost (500x)ALSTEMVB100
chirurgiczne

Bibliografia

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244(2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Edycja gen w CRISPR Cas9przywr cenie ekspresji dystrofinydystrofia mi niowa Duchenne aniehomologiczne czenie ko c wdelecja eksonu 23r nicowanie indukowane przez MyoDprzeprogramowanie wektorem Sendaiwalidacja PCRelektroforeza w elu agarozowym

Powiązane artykuły