Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59437

⸱

21 maja 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Queen's University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje dwie metody ilościowego określania reakcji obronnych u Arabidopsis thaliana po ekspozycji na elicytory immunologiczne: przejściowy wybuch oksydacyjny i zahamowanie wzrostu siewki.

Streszczenie

Rośliny wykształciły silny system odpornościowy, który pozwala na rozpoznawanie patogenów i ochronę przed chorobami. W artykule opisano dwa testy, które można wykorzystać do pomiaru siły aktywacji immunologicznej Arabidopsis thaliana po leczeniu cząsteczkami elicytora. Na wstępie przedstawiono metodę wychwytywania szybko indukowanego i dynamicznego wybuchu oksydacyjnego, który można monitorować za pomocą testu opartego na luminolach. Druga przedstawiona jest metoda opisująca, w jaki sposób można zmierzyć indukowane przez układ immunologiczny hamowanie wzrostu siewek. Protokoły te są szybkie i niezawodne, nie wymagają specjalistycznego szkolenia ani sprzętu i są szeroko stosowane do zrozumienia genetycznych podstaw odporności roślin.

Wprowadzenie

Aby dostrzec i obronić się przed patogenami, rośliny wykształciły receptory rozpoznawania wzorców związanych z błoną (PRR), które wykrywają konserwatywne cząsteczki drobnoustrojów na zewnątrz komórki, znane jako wzorce molekularne związane z mikrobami (MAMPs)1. Wiązanie MAMP z pokrewnymi im PRR inicjuje sygnalizację immunologiczną za pośrednictwem kinazy białkowej, co skutkuje odpornością na choroby o szerokim spektrum działania2. Jedną z najwcześniejszych reakcji po aktywacji PRR jest fosforylacja i aktywacja integralnych białek RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) błony komórkowej, które katalizują produkcję zewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS)3,4. ROS odgrywają ważną rolę w ustalaniu odporności na choroby, działając zarówno jako wtórni przekaźnikowie do propagacji sygnalizacji immunologicznej, jak i bezpośrednie środki przeciwdrobnoustrojowe5. Pierwsza obserwacja wybuchu oksydacyjnego wywołanego przez układ immunologiczny została opisana przy użyciu bulw ziemniaka odmiany siewnej. Rishiri po szczepieniu Phytophthora infestans6. Produkcja ROS została oceniona na kilku gatunkach roślin przy użyciu dysków liściowych7, kultur zawiesinowych komórek8 i protoplasts6. Opisana tutaj jest prosta metoda oznaczania produkcji ROS wywołanej wzorcem w krążkach liściowych Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

W odpowiedzi na percepcję MAMP, aktywowane białka RBOH katalizują produkcję rodników ponadtlenkowych (O2-), rodników hydroksylowych (•OH) i tlenu singletowego (1O2), które są przekształcane w nadtlenek wodoru (H2O2) w przestrzeni zewnątrzkomórkowej9. H2O2można określić ilościowo za pomocą chemiluminescencji na bazie luminolu w obecności czynnika utleniającego peroksydazy chrzanowej (HRP)10. HRP utleniaH2O2, generując jon wodorotlenkowy (OH−) i gazowy tlen (O2), które reagują z luminolem, tworząc niestabilny produkt pośredni, który uwalnia foton światła10. Emisja fotonów może być określana ilościowo jako względne jednostki światła (RLU) za pomocą czytnika mikropłytek lub imagera zdolnego do wykrywania luminescencji, które stały się standardowymi elementami wyposażenia w większości laboratoriów molekularnych. Mierząc światło wytwarzane w odstępach 40-60 minut, przejściowy wybuch oksydacyjny można wykryć już po 2-5 minutach od zabiegu elicytorem, osiągając szczyt po 10-20 minutach i powracając do poziomu podstawowego po ~60 minutach11. Skumulowane światło wytworzone w tym czasie może być wykorzystane jako miara siły immunologicznej odpowiadającej aktywacji białek RBOH 12. Dogodnie test ten nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani kłopotliwego przygotowania próbki.

Osiągając szczyt krótko po wykryciu MAMP, wybuch oksydacyjny jest uważany za wczesną odpowiedź immunologiczną, wraz z aktywacją MAPK i produkcją etylenu5. Późniejsze reakcje immunologiczne obejmują przeprogramowanie transkrypcji, zamknięcie aparatów szparkowych i odkładanie kalozy2,5. Długotrwała ekspozycja na MAMP nieustannie aktywuje kosztowną energetycznie sygnalizację immunologiczną, co skutkuje zahamowaniem wzrostu roślin, co wskazuje na kompromis między rozwojem a odpornością13. Hamowanie wzrostu siewek (SGI) jest szeroko stosowane do oceny produkcji immunologicznej u Arabidopsis i jest integralną częścią identyfikacji kilku kluczowych składników sygnalizacji immunologicznej, w tym PRRs14,15,16. W związku z tym w niniejszej pracy dodatkowo przedstawiono test na SGI wywołany wzorcem u rzodkiewnika, w którym siewki są hodowane na płytkach wielodołkowych zawierających standardowe pożywki lub pożywki uzupełnione elicytorem immunologicznym przez 8-12 dni, a następnie ważone za pomocą wagi analitycznej.

Aby zademonstrować, jak testy ROS i SGI mogą być używane do monitorowania sygnalizacji za pośrednictwem PRR, wybrano trzy genotypy, które reprezentują różne wyniki immunologiczne: (1) dziki typ Arabidopsis Columbia (Col-0), (2) dominująco-ujemny mutant bak1-5, w którym wielofunkcyjny koreceptor PRR BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) nie działa w sygnalizacji immunologicznej17, 18, oraz (3) recesywny mutant cpk28-1, który nie posiada białka regulatorowego CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) i wykazuje podwyższone odpowiedzi immunologiczne19,20. Testy ROS i SGI przedstawiono w odpowiedzi na syntetycznie wytworzony epitop peptydu elf18 bakteryjnego czynnika wydłużenia Tu (EF-Tu), rozpoznany u Arabidopsis przez PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Protokoły te mogą być używane z innymi elicytorami immunologicznymi, takimi jak białko ruchliwości bakteryjnej flagelina14 lub endogenne białka elicytorowe roślin (AtPeps)16, jednak należy zauważyć, że reakcja roślin różni się w zależności od elicitora21. Testy ROS i SGI mogą być wykorzystywane do szybkiej i ilościowej oceny wczesnych i późnych odpowiedzi za pośrednictwem PRR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wykrywanie wyrzutu ROS w krążkach liści Arabidopsis po wywołaniu odpowiedzi immunologicznej

  1. Wzrost i pielęgnacja roślin.
    1. Aby zsynchronizować kiełkowanie, przeprowadź stratyfikację nasion Arabidopsis , zawieszając około 50 nasion w 1 mL sterylnego 0,1% agaru [w/v] i przechowując w temperaturze 4 °C (bez dostępu światła) przez 3-4 dni.
      UWAGA: Stratyfikuj kontrolę z linii typu dzikiego (np. Col-0) oraz genotypy o wysokiej i niskiej odpowiedzi immunologicznej (odpowiednio cpk28-1 i bak1-5, ) w celu wykorzystania ich jako kontrol wewnętrznych.
    2. Wysiej nasiona do gleby i inkubuj w standardowych warunkach krótkiego dnia (22 °C, 10 h światła, natężenie światła 150 μE/m2/s oraz wilgotność względna 65-70%).
    3. Po około 7 dniach za pomocą pęsety przesadź poszczególne siewki do nowych doniczek, zachowując odstęp co najmniej 4 cm, aby umożliwić pełny rozwój rozety. Przesadź 6-12 siewek na genotyp i przywróć standardowe warunki krótkiego dnia. Regularnie podlewaj i nawoź rośliny (1 g/L nawozu 20-20-20 co 2 tygodnie).
  2. Pobieranie krążków liściowych do płytek 96-dołkowych w celu regeneracji nocnej.
    1. W 4-5 tygodniu po kiełkowaniu (Rycina 1A), za pomocą ostrego wycinaka do biopsji o średnicy 4 mm pobierz jeden krążek liścia z każdej rośliny, unikając nerwu głównego i uważając, aby ograniczyć uszkodzenia tkanki (Rycina 1B). Umieść krążki liściowe w nieużywanej płytce luminometru 96-dołkowej zawierającej 100 μL ddH2O, stroną adaksjalną skierowaną do góry, aby zapobiec wysychaniu22 (Rycina 1C). W przypadku oceny wielu elicytorów, pobierz po jednym krążku z tego samego liścia dla każdego rodzaju obróbki elicytorem.
      UWAGA: Pobieraj liście w pełni rozwinięte, od trzeciego do piątego od góry rozety, o zbliżonej wielkości i wieku, aby ograniczyć zmienność. Jeśli to możliwe, przed regeneracją nocną przetnij krążki liściowe na pół za pomocą żyletki, co zwiększy powierzchnię wystawioną na działanie roztworu elicytora23.
    2. Pozostaw do regeneracji przez noc w temperaturze pokojowej, aby zapobiec interferencji ROS produkowanych w wyniku uszkodzeń powstałych podczas pobierania krążków liściowych. Przykryj płytki pokrywką, aby zapobiec parowaniu.
  3. Przeprowadzenie obróbki elicytorem i pomiar produkcji ROS.
    1. Zaprogramuj czytnik płytek przed dodaniem roztworu reakcyjnego, co skróci czas między inicjacją wyrzutu ROS a pierwszymi zarejestrowanymi pomiarami. Użyj odpowiedniego oprogramowania komercyjnego do danego czytnika płytek. W naszym przypadku (patrz Spis treści), kliknij Settings i wybierz kartridż LUM96 oraz typ odczytu Kinetic. Kliknij kategorię Read Area i przeciągnij, aby zaznaczyć podzbiór dołków lub całą płytkę do odczytu. W zakładce PMT and Optics ustaw czas integracji na 1 000 ms. W zakładce Timing ustaw całkowity czas pomiaru (Total Run Time) na 40-60 min oraz odstęp (Interval) na 2 min.
    2. Usuń wodę z każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej.
      UWAGA: Nie przebijaj krążków liściowych, ponieważ może to spowodować stres związany z uszkodzeniem tkanki i doprowadzić do bardziej zmiennych wyników produkcji ROS.
    3. Przygotuj roztwór reakcyjny zawierający 100 μM luminolu, 10 μg/mL HRP oraz pożądane stężenie elicytora (np. elf18 w stężeniach 1 nM, 10 nM, 100 nM lub 1 000 nM) w sterylnej ddH2O, stosując 10 mL roztworu na jedną płytkę 96-dołkową.
      UWAGA: Liofilizowane peptydy rozpuść w sterylnej H2O w probówkach o niskim wiązaniu (low-binding), aby przygotować roztwór zapasowy 10 mM, zamroź gwałtownie w ciekłym N2 i przechowuj w -80 °C. Przed użyciem rozcieńcz roztwory zapasowe w sterylnej H2O, aby uzyskać roztwór roboczy 100 μM i przechowuj go w -20 °C.
    4. Użyj pipety wielokanałowej, aby nanieść 100 μL mieszaniny reakcyjnej do każdego dołka, dodając roztwór do wszystkich krążków liściowych poddanych tej samej obróbce w tym samym czasie22. Dla każdego genotypu uwzględnij reakcję kontrolną (bez elicytora), aby ocenić bazowy poziom ROS w przypadku braku stymulacji. Natychmiast zmierz emisję światła dla wszystkich długości fal w widmie widzialnym za pomocą czytnika mikropłytek.
      UWAGA: Przygotuj i aplikuj roztwór reakcyjny przy słabym oświetleniu, ponieważ luminol i HRP są odczynnikami światłoczułymi. Odczynniki przechowuj w lodzie lub w -20°C, chyba że są używane.
    5. Mierz emisję światła z czasem integracji 1 000 ms w odstępach 2-minutowych przez okres 40-60 min w czytniku mikropłytek, aby zarejestrować dynamiczny wyrzut oksydacyjny (Rycina 1D).
      UWAGA: Użyj dłuższego czasu integracji, aby zwiększyć czułość testu11, upewniając się jednocześnie, że wszystkie próbki na płytce 96-dołkowej mogą zostać zmierzone w obrębie jednego odstępu.
  4. Interpretacja danych.
    1. Dla każdego genotypu użyj arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć średnią liczbę fotonów i błąd standardowy dla każdego punktu czasowego, a następnie przedstaw produkcję ROS jako funkcję czasu na wykresie rozrzutu.
      Wzór na średnią liczbę fotonów, metoda obliczeniowa, równania do analizy badań nad fotosyntezą.
      Gdzie t = poszczególny punkt czasowy
    2. Alternatywnie zsumuj liczbę fotonów dla każdego krążka liściowego i przedstaw średnią z tych wartości dla każdego genotypu za pomocą wykresu słupkowego z słupkami błędu standardowego lub wykresu pudełkowego.
      Równanie skumulowanej liczby fotonów Σ(liczba fotonów krążków liściowych), analiza pomiaru fotonów.

2. Test hamowania wzrostu siewek

  1. Sterylizacja nasion i wysiew na płytki z pożywką Murashige i Skooga (MS).
    1. Przygotować sterylną pożywkę MS o połowie stężenia (0.5x) (2.16 g/L) zawierającą 0.8% agaru [w/v]. Wlać pożywkę do płytek (90 x 15 mm) w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Zsterylizować około 100 nasion w probówce do mikrocentryfugi, przemywając je 1 mL 70% etanolu przez 2 min, a następnie usunąć ciecz za pomocą aspiratora. Dodać 1 mL 40% roztworu wybielacza i delikatnie kołysać przez 17 min w temperaturze pokojowej. Usunąć wybielacz aspiratorem i przemyć trzy razy w 1 mL sterylnej wody przez 5 min. Zawiesić ponownie w 1 mL sterylnego 0.1% agaru.
      UWAGA: Alternatywnie można zastosować protokół sterylizacji nasion chlorem gazowym24.
    3. Wysiać około 100 nasion na genotyp na płytkach z agarem MS za pomocą pipety i uszczelnić taśmą micropore w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
      UWAGA: Należy unikać sadzenia nasion zbyt blisko siebie, ponieważ utrudni to późniejsze przesadzanie siewek.
    4. Przeprowadzić stratyfikację nasion, umieszczając płytki w temperaturze 4 °C (bez światła) przez 3-4 dni w celu synchronizacji kiełkowania (Rysunek 2A).
  2. Przesadzanie siewek do płytek 48-dołkowych zawierających peptydy elicytorów odporności.
    1. Po stratyfikacji przenieść płytki w miejsce oświetlone w warunkach krótkiego dnia (22 °C, 10 h światła, natężenie światła 150 μE/m2/s oraz wilgotność względna 65-70%) na 3-4 dni, aby umożliwić kiełkowanie.
    2. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotować rozcieńczenia peptydów elicytorów (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM i 1,000 nM) w sterylnej płynnej pożywce 0.5x MS zawierającej 1% sacharozy [w/v], używając 25 mL pożywki MS na każdą płytkę 48-dołkową. Przygotować płytki, pipetując 500 µL płynnej pożywki MS lub pożywki MS zawierającej peptydy do każdego dołka. Jeśli jest dostępny, użyć pipetora wielokanałowego w celu przyspieszenia przygotowania płytek.
      UWAGA: Dla każdego genotypu należy hodować siewki na pożywce MS bez elicytora, aby uwzględnić wszelkie naturalne różnice we wzroście siewek.
    3. Za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie przesadzić jedną siewkę o tym samym rozmiarze i wieku do każdego dołka, dbając o to, aby nie uszkodzić siewki ani nie przerwać korzenia i aby korzeń był zanurzony w pożywce. Dla każdego genotypu przesadzić minimum 6-8 siewek do każdego rozcieńczenia peptydu (Rysunek 2B).
      UWAGA: Przesadzać siewki w 4. dniu po kiełkowaniu, ponieważ krótkie korzenie są łatwiejsze w manipulacji, a starsze siewki mogą dawać mniej optymalne wyniki.
    4. Uszczelnić płytki taśmą micropore i przenieść z powrotem w miejsce oświetlone w standardowych warunkach krótkiego dnia (22 °C, 10 h światła, natężenie światła 150 μE/m2/s oraz wilgotność względna 65-70%). Pozostawić siewki do wzrostu na 8-12 dni.
  3. Wyznaczenie procentowego zahamowania wzrostu.
    1. Ostrożnie usunąć siewki z płytek 48-dołkowych i osuszyć, przykładając je do ręcznika papierowego. Zważyć siewki na wadze analitycznej i zapisać wartości. Jeśli jest dostępna, użyć wagi analitycznej z wyjściem USB, aby zapisywać wartości masy świeżej w arkuszu kalkulacyjnym. Przed ważeniem siewek wykonać zdjęcie, aby wizualnie przedstawić zahamowanie wzrostu (Rysunek 2C).
    2. Obliczyć procentowe zahamowanie wzrostu siewek traktowanych elicytorem w porównaniu do siewek hodowanych tylko na pożywce MS (Rysunek 2D) w następujący sposób:
      Wzór na procentowe zahamowanie wzrostu, stosunek masy siewki traktowanej do kontrolnej, równanie.
    3. Przedstawić dane na wykresie słupkowym z słupkami błędu standardowego lub na wykresie pudełkowym, aby lepiej zobrazować wariancję międzyeksperymentalną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rośliny mutantów cpk28-119,25 oraz bak1-517,18 zostały wykorzystane do zademonstrowania oczekiwanych wyników dla genotypów z odpowiednio wysoką i niską odpowiedzią immunologiczną w testach wyrzutu oksydacyjnego oraz SGI w stosunku do kontrolnego tła typu dzikiego (Col-0). W celu oceny efektów zależnych od dawki zastosowano 10-krotny szereg rozcieńczeń pep...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano dwie metody oznaczania odpowiedzi immunologicznych wyzwalanych wzorcem u Arabidopsis, oferując ilościowe podejścia do oceny wyniku immunologicznego bez użycia specjalistycznego sprzętu. W połączeniu, ROS i SGI wyzwalane wzorcem mogą być wykorzystywane do oceny odpowiednio wczesnych i późnych reakcji na percepcję drobnoustrojów.

Głównym ograniczeniem testu wybuchu oksydacyjnego jest zmienność. Z powodów, które nie są do końca zrozumiałe, bezwzględne RLU często różnią...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Praca w naszym laboratorium jest finansowana przez Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader's Fund, oraz Queen's University. KS i IS są wspierane przez tandemowe stypendia dla absolwentów Ontario i stypendia dla absolwentów NSERC Canada dla studentów studiów magisterskich (CGS-M).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20-20-20 NawózProd dla roślin10529Wymieszaj 1 g/l w wodzie i stosuj na rośliny co 2 tygodnie dla optymalnego wzrostu.
Dziurkacz do biopsji 4 mmMedical Mart232-33-34-PMożna również użyć zestawu świdrów korkowych o powierzchni 0,125 cm^2.
48-dołkowe sterylne płytki z pokrywkąSigma-AldrichCLS3548
Waga analityczna z osłoną robocząVWRVWR-225ACDo testów inicjacji wzrostu można użyć dowolnej standardowej wagi analitycznej, jednak optymalne jest bezpośrednie wyjście komputerowe.
Pipeta wielokanałowa BioHit mLine Mechanical 12 (30-300 uL)Sartorius725240Można użyć dowolnej pipety wielokanałowej, a w razie potrzeby także pipety pojedynczej.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)EZ Biolabcp7211Przechowuj 10 mM peptydu podstawowego w temperaturze -80C w probówkach o niskiej zawartości białka. Po rozmrożeniu przechowywać 100 uM zapasu roboczego w temperaturze -20C.
KleszczeFisher Scientific22-327379
Peroksydaza chrzanowaSigma-AldrichP6782Rozpuścić w czystej wodzie. Przechowywać w temperaturze -20C i z dala od światła.
LuminolSigma-AldrichA8511rozpuszcza się w DMSO. Przechowywać w temperaturze -20C i z dala od światła.
Murisage and Skoog Basal SaltsCedarlane LabsMSP09-100LTPrzechowywać w temperaturze 4C.
GlebaSunGrow HorticultureSunshine Mix #1Inne rodzaje gleby mogą być również wykorzystywane do uprawy Arabidopsis. Wymieszaj z wodą podczas napełniania doniczek.
Wielomodowy czytnik mikropłytek SpectraMax Paradigm z modułem LUMUrządzenia molekularneProszę poprosić o wycenęDo tych testów można użyć dowolnego czytnika płytek zdolnego do wykrywania luminescencji.
SacharozaSigma-AldrichS0389-1KGPrzechowywać w temperaturze pokojowej.
Białe płytki 96-dołkowe z polistyrenuFisher Scientific07-200-589

Bibliografia

  1. Couto, D. E., Zipfel, C. Regulation of pattern recognition receptor signalling in plants. Nature Reviews Immunology. 16, 537-552 (2016).
  2. Boller, T., Felix, G. A Renaissance of Elicitors: Perception of Microbe-Associated Molecular Patterns and Danger Signals by Pattern-Recognition Receptors. Annual Review of Plant Biology. 60, 379-406 (2009).
  3. Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 56 (8), 1472-1480 (2012).
  4. Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD during Plant Immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
  5. Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).
  6. Doke, N. Involvement of superoxide anion generation in the hypersensitive response of potato tuber tissues to infection with an incompatible race of Phytophthora infestans and to the hyphal wall components. Physiological Plant Pathology. 23 (3), 345-357 (1983).
  7. Bindschedler, L. V., et al. Peroxidase-dependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance. The Plant Journal. 47 (6), 851-863 (2006).
  8. Keppler, L. D. Active Oxygen Production During a Bacteria-Induced Hypersensitive Reaction in Tobacco Suspension Cells. Phytopathology. 110 (3), 759-763 (1989).
  9. Wrzaczek, M., Brosché, M., Kangasjärvi, J. ROS signaling loops - production, perception, regulation. Current Opinion in Plant Biology. 16 (5), 575-582 (2013).
  10. Warm, E., Laties, G. G. Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminol. Phytochemistry. 21 (4), 827-831 (1982).
  11. Trujillo, M. Analysis of the lmmunity-Related Oxidative Bursts by a Luminol-Based Assay. Methods in Molecular Biology. 1398, 323-329 (2016).
  12. Nühse, T. S., Bottrill, A. R., Jones, A. M. E., Peck, S. C. Quantitative phosphoproteomic analysis of plasma membrane proteins reveals regulatory mechanisms of plant innate immune responses. The Plant Journal. 51 (5), 931-940 (2007).
  13. Belkhadir, Y., Yang, L., Hetzel, J., Dangl, J. L., Chory, J. The growth-defense pivot: Crisis management in plants mediated by LRR-RK surface receptors. Trends in Biochemical Sciences. 39 (10), 447-456 (2014).
  14. Gómez-Gómez, L., Felix, G., Boller, T. A single locus determines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 18 (3), 277-284 (1999).
  15. Zipfel, C., et al. Perception of the Bacterial PAMP EF-Tu by the Receptor EFR Restricts Agrobacterium-Mediated Transformation. Cell. 125 (4), 749-760 (2006).
  16. Krol, E., et al. Perception of the Arabidopsis danger signal peptide 1 involves the pattern recognition receptor AtPEPR1 and its close homologue AtPEPR2. Journal of Biological Chemistry. 285 (18), 13471-13479 (2010).
  17. Schwessinger, B., et al. Phosphorylation-dependent differential regulation of plant growth, cell death, and innate immunity by the regulatory receptor-like kinase BAK1. PLoS Genetics. 7 (4), e1002046(2011).
  18. Roux, M., et al. The Arabidopsis Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases BAK1/SERK3 and BKK1/SERK4 Are Required for Innate Immunity to Hemibiotrophic and Biotrophic Pathogens. The Plant Cell. 23 (6), 2440-2455 (2011).
  19. Monaghan, J., et al. The calcium-dependent protein kinase CPK28 buffers plant immunity and regulates BIK1 turnover. Cell Host and Microbe. 16 (5), 605-615 (2014).
  20. Wang, J., et al. A Regulatory Module Controlling Homeostasis of a Plant Immune Kinase. Molecular Cell. 69 (3), 493-504 (2018).
  21. Mott, G. A., et al. Genomic screens identify a new phytobacterial microbe-associated molecular pattern and the cognate Arabidopsis receptor-like kinase that mediates its immune elicitation. Genome Biology. 17, 98(2016).
  22. Sang, Y., Macho, A. P. Analysis of PAMP-Triggered ROS Burst in Plant Immunity. Methods in Molecular Biology. 1578, 143-153 (2017).
  23. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Methods. 10 (1), 6(2014).
  24. Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. Journal of Visualized Experiments. 128, (2017).
  25. Matschi, S., Werner, S., Schulze, W. X., Legen, J., Hilger, H. H., Romeis, T. Function of calcium-dependent protein kinase CPK28 of Arabidopsis thaliana in plant stem elongation and vascular development. The Plant Journal. 73 (6), 883-896 (2013).
  26. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. The Plant Journal. 18 (3), 265-276 (2002).
  27. Kunze, G., Zipfel, C., Robatzek, S., Niehaus, K., Boller, T., Felix, G. The N Terminus of Bacterial Elongation Factor Tu Elicits Innate Immunity in Arabidopsis Plants. The Plant Cell. 16 (12), 3496-3507 (2004).
  28. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature. 428 (6984), 764-767 (2004).
  29. Mur, L. A. J., Kenton, P., Draper, J. In planta measurements of oxidative bursts elicited by avirulent and virulent bacterial pathogens suggests that H2O2 is insufficient to elicit cell death in tobacco. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 548-561 (2005).
  30. Kobayashi, M., et al. Calcium-dependent protein kinases regulate the production of reactive oxygen species by potato NADPH oxidase. The Plant Cell. 19 (3), 1065-1080 (2007).
  31. Yoshioka, H., et al. Induction of Plant gp91 phox Homolog by Fungal Cell Wall, Arachidonic Acid, and Salicylic Acid in Potato. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 725-736 (2001).
  32. Klauser, D., Flury, P., Boller, T., Bartels, S. Several MAMPs, including chitin fragments, enhance AtPep-triggered oxidative burst independently of wounding. Plant Signaling and Behavior. 8 (9), e25346(2013).
  33. El Gueddari, N. E., Rauchhaus, U., Moerschbacher, B. M., Deising, H. B. Developmentally regulated conversion of surface-exposed chitin to chitosan in cell walls of plant pathogenic fungi. New Phytologist. 156 (1), 103-112 (2002).
  34. Daiber, A., et al. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radical Research. 38 (3), 259-269 (2004).
  35. Bauer, Z., Gómez-Gómez, L., Boller, T., Felix, G. Sensitivity of Different Ecotypes and Mutants of Arabidopsis thaliana toward the Bacterial Elicitor Flagellin Correlates with the Presence of Receptor-binding Sites. Journal of Biological Chemistry. 276 (49), 45669-45676 (2001).
  36. Vetter, M. M., et al. Flagellin perception varies quantitatively in arabidopsis thaliana and its relatives. Molecular Biology and Evolution. 29 (6), 1655-1667 (2012).
  37. Chinchilla, D. The Arabidopsis Receptor Kinase FLS2 Binds flg22 and Determines the Specificity of Flagellin Perception. The Plant Cell. 18 (2), 465-476 (2006).
  38. Lloyd, S. R., Schoonbeek, H., Trick, M., Zipfel, C., Ridout, C. J. Methods to Study PAMP-Triggered Immunity in Brassica Species. Molecular Plant-Microbe Interactions. 27 (3), 286-295 (2014).
  39. Clarke, C., Vinatzer, B. Characterizing the Immune-Eliciting Activity of Putative Microbe-Associated Molecular Patterns in Tomato. Methods in Molecular Biology. 1578, 249-261 (2017).
  40. Gimenez-Ibanez, S., Hann, D. R., Chang, J. H., Segonzac, C., Boller, T., Rathjen, J. P. Differential Suppression of Nicotiana benthamiana Innate Immune Responses by Transiently Expressed Pseudomonas syringae Type III Effectors. Frontiers in Plant Science. 9, 688(2018).
  41. Wei, Y., et al. The Ralstonia solanacearum csp22 peptide, but not flagellin-derived peptides, is perceived by plants from the Solanaceae family. Plant Biotechnology Journal. 16 (7), 1349-1362 (2018).
  42. Melcher, R. L. J., Moerschbacher, B. M. An improved microtiter plate assay to monitor the oxidative burst in monocot and dicot plant cell suspension cultures. Plant Methods. 12, 5(2016).
  43. Perraki, A., et al. Phosphocode-dependent functional dichotomy of a common co-receptor in plant signalling. Nature. 561 (7722), 248-252 (2018).
  44. Yamaguchi, K., Kawasaki, T. Chitin-Triggered MAPK Activation and ROS Generation in Rice Suspension-Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 1578, 309-316 (2017).
  45. Ortmann, I., Conrath, U., Moerschbacher, B. M. Exopolysaccharides of Pantoea agglomerans have different priming and eliciting activities in suspension-cultured cells of monocots and dicots. FEBS Letters. 580 (18), 4491-4494 (2006).
  46. Ortmann, I., Sumowski, G., Bauknecht, H., Moerschbacher, B. M. Establishment of a reliable protocol for the quantification of an oxidative burst in suspension-cultured wheat cells upon elicitation. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (5), 227-232 (2004).
  47. Dos Santos, A. L. W., El Gueddari, N. E., Trombotto, S., Moerschbacher, B. M. Partially acetylated chitosan oligo- and polymers induce an oxidative burst in suspension cultured cells of the gymnosperm Araucaria angustifolia. Biomacromolecules. 9 (12), 3411-3415 (2008).
  48. Bressendorff, S., Rasmussen, M., Petersen, M., Mundy, J. Chitin-Induced Responses in the Moss Physcomitrella patens. Methods in Molecular Biology. , 317-324 (2017).
  49. Lloyd, S. R., Ridout, C. J., Schoonbeek, H. Methods to Quantify PAMP-Triggered Oxidative Burst, MAP Kinase Phosphorylation, Gene Expression, and Lignification in Brassicas. Methods in Molecular Biology. 1578, 325-335 (2017).
  50. Gómez-Gómez, L., Boller, T. FLS2: An LRR Receptor-like Kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidopsis. Molecular Cell. 5 (6), 1003-1011 (2000).
  51. Li, J., et al. Specific ER quality control components required for biogenesis of the plant innate immune receptor EFR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15973-15978 (2009).
  52. Lu, X., et al. Uncoupling of sustained MAMP receptor signaling from early outputs in an Arabidopsis endoplasmic reticulum glucosidase II allele. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (52), 22522-22527 (2009).
  53. Nekrasov, V., et al. Control of the pattern-recognition receptor EFR by an ER protein complex in plant immunity. EMBO Journal. 28 (21), 3428-3438 (2009).
  54. Boutrot, F., et al. Direct transcriptional control of the Arabidopsis immune receptor FLS2 by the ethylene-dependent transcription factors EIN3 and EIL1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (32), 14502-14507 (2010).
  55. Kadota, Y., et al. Direct Regulation of the NADPH Oxidase RBOHD by the PRR-Associated Kinase BIK1 during Plant Immunity. Molecular Cell. 54 (1), 43-55 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test wyrzutu tlenowegotest oparty na luminolutraktowanie elicytoremczytnik mikrop ytekwaga analitycznatesty kinaz MAPindukowana patogenem ekspresja gen wtesty infekcji
Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.