Artykuł metodologiczny

Synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów

DOI:

10.3791/59440

⸱

16 kwietnia 2019

 , 
1Materials Science and Engineering Program, University of California, San Diego, 2Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demonstrujemy syntezę fuzogennych porowatych nanocząsteczek krzemu do skutecznego dostarczania oligonukleotydów in vitro i in vivo. Porowate nanocząstki krzemu są ładowane siRNA w celu utworzenia rdzenia, który jest pokryty fuzogenicznymi lipidami poprzez wytłaczanie w celu utworzenia powłoki. Uwzględniono ugrupowanie celowe, funkcjonalizację i charakterystykę cząstek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wraz z pojawieniem się terapii genowej, rozwój skutecznego systemu dostarczania ładunku nukleotydów in vivo stał się równolegle ważny. Fusogeniczne porowate nanocząstki krzemu (F-pSiNPs) wykazały ostatnio wysoką skuteczność wyciszania genów in vivo ze względu na wysoką zdolność ładowania oligonukleotydów i unikalny szlak wychwytu komórkowego, który pozwala uniknąć endocytozy. Synteza F-pSiNPs jest procesem wieloetapowym, który obejmuje: (1) ładowanie i uszczelnianie ładunków oligonukleotydowych w porach krzemu; (2) jednoczesne powlekanie i wymiarowanie fuzogennych lipidów wokół porowatych rdzeni krzemowych; oraz (3) koniugacja peptydów celujących i płukanie w celu usunięcia nadmiaru oligonukleotydów, resztek krzemu i peptydu. Jednorodność wielkości cząstki charakteryzuje się dynamicznym rozpraszaniem światła, a jej strukturę rdzeń-powłoka można zweryfikować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Wychwyt fuzogeniczny jest weryfikowany przez załadowanie barwnika lipofilowego, nadchloranu 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny (DiI), do fuzogennej dwuwarstwy lipidowej i poddanie go komórkom in vitro w celu obserwacji barwienia błony plazmatycznej w porównaniu z lokalizacjami endocytarnymi. Skuteczność celowania i wyciszania genów in vivo została wcześniej określona ilościowo w mysim modelu zapalenia płuc Staphylococcus aureus, w którym oczekuje się, że peptyd celujący pomoże F-pSiNPs zadomowić się w miejscu infekcji. Poza zastosowaniem w zakażeniu S. aureus, system F-pSiNP może być stosowany do dostarczania dowolnego oligonukleotydu do terapii genowej wielu chorób, w tym infekcji wirusowych, nowotworów i chorób autoimmunologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia genowa moduluje specyficzną ekspresję genów, aby uzyskać wynik terapeutyczny. Odkryto i zbadano liczne narzędzia do modulacji genów, w tym interferencję kwasu rybonukleinowego (RNAi) za pomocą oligonukleotydów (np. krótkiego interferującego RNA (siRNA)1,2, microRNA (miRNA)3,4), plazmidy DNA5,6, nukleazy (np. palec cynkowy, TALENS)7,8 oraz systemy CRISPR/Cas99,10. Chociaż mechanizm działania każdego narzędzia jest inny, wszystkie narzędzia muszą dotrzeć do cytoplazmy komórki lub jądra, aby były aktywne. W związku z tym, chociaż udowodniono, że narzędzia te wywołują znaczący wpływ na modulowanie ekspresji genów in vitro, skuteczność in vivo cierpi z powodu przeszkód zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych. Ze względu na fakt, że narzędzia są pochodzenia biologicznego, w naszym ciele istnieje wiele enzymów i systemów klirensowych, które mają zdolność degradacji lub usuwania obcych cząsteczek11. Nawet w przypadku, gdy narzędzia dotrą do komórki docelowej, cierpią na endocytozę; Tryb wychwytu komórkowego, który zamyka i więzi narzędzia w kwaśnych pęcherzykach przypominających żołądek, które degradują lub wydalają narzędzia z komórki. W rzeczywistości badania wykazały, że nanocząstki lipidowe są endocytozowane przez makropinocytozę, z której około 70% siRNA jest egzocytozowane z komórek w ciągu 24 godzin od wchłonięcia12,13. Większość pozostałego siRNA jest degradowana przez szlak lizosomalny i ostatecznie tylko 1-2% siRNA, które początkowo dostaje się do komórki z nanocząstkami, osiąga endosomalną ucieczkę, aby potencjalnie przejść RNAi13,14.

Niedawno opracowaliśmy fuzogeniczne porowate nanocząstki krzemu (F-pSiNPs), które mają rdzeń naładowany siRNA, składający się z porowatych nanocząsteczek krzemu, oraz fuzogeniczną powłokę lipidową15. F-pSiNP mają trzy główne zalety w porównaniu z innymi konwencjonalnymi systemami dostarczania oligonukleotydów: (1) fuzogenna powłoka lipidowa, która umożliwia cząstkom ominięcie endocytozy i dostarczenie całego ładunku bezpośrednio do cytoplazmy komórki (w porównaniu z 1-2% osiągniętym przez cząstki endocytozowane13,14) (Rysunek 1); (2) wysokie obciążenie masowe siRNA w pSiNPs (>20% wag. w porównaniu do 1-15% wag. przez konwencjonalne systemy)15, które szybko ulegają degradacji w cytoplazmie (gdy cząstki rdzenia zrzucają powłokę lipidową poprzez wychwyt fuzogenny) w celu uwolnienia siRNA; oraz (3) ukierunkowanie koniugacji peptydów w celu selektywnego naprowadzania na pożądane typy komórek in vivo.  

System F-pSiNP wykazał znaczącą skuteczność wyciszania genów (>95% in vitro; >80% in vivo) i późniejszy efekt terapeutyczny w śmiertelnym mysim modelu >S. aureus pneumonia; którego wyniki zostały opublikowane wcześniej15. Jednak złożona struktura systemu F-pSiNP wymaga delikatnego obchodzenia się z nim i precyzyjnej optymalizacji w celu wygenerowania jednolitych i stabilnych nanocząstek. W związku z tym celem tej pracy jest przedstawienie dokładnego protokołu, a także strategii optymalizacyjnych w zakresie syntezy, funkcjonalizacji i charakterystyki F-pSiNPs, które mają być stosowane w ukierunkowanym dostarczaniu siRNA w celu uzyskania silnego efektu wyciszania genów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza porowatych nanocząstek krzemu (pSINPs)

UWAGA: Zawsze zachowuj ostrożność podczas pracy z kwasem fluorowodorowym (HF). Postępuj zgodnie ze wszystkimi instrukcjami bezpieczeństwa zgodnie z kartą charakterystyki (SDS), obchodź się z wszelkimi chemikaliami zawierającymi HF w dygestoriach i noś odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE; podwójne rękawice z rękawicami butylowymi na zewnątrz, fartuch butylowy z fartuchem laboratoryjnym pod spodem, osłona twarzy z okularami ochronnymi pod spodem). Wszystkie uniwersytety i laboratoria badawczo-rozwojowe wymagają specjalnego szkolenia w zakresie bezpieczeństwa HF przed użyciem. Nie próbuj pracować z HF bez uprzedniej zgody lokalnego koordynatora ds. bezpieczeństwa w laboratorium, ponieważ wymagane są dodatkowe środki bezpieczeństwa, które nie zostały tutaj opisane.

  1. Przygotowanie roztworów trawiących
    1. Aby przygotować roztwór HF w proporcji 3:1 do wytrawiania (stosowany w krokach 1.3 i 1.4), napełnij plastikowy cylinder z podziałką 30 ml wodnego 48% HF i 10 ml absolutnego etanolu (EtOH). Roztwór musi być zawarty w tworzywach sztucznych o dużej gęstości (np. HDPE), ponieważ HF rozpuszcza szkło.
    2. Aby przygotować roztwór HF w stosunku 1:29 do startu (użyty w kroku 1.5), napełnij plastikowy cylinder z podziałką 1 ml wodnego 48% HF i 29 ml absolutnego etanolu. Roztwór musi być zawarty w tworzywach sztucznych o dużej gęstości (np. HDPE), ponieważ HF rozpuszcza szkło.
    3. Przygotować 1 M roztwór KOH w 10% EtOH w celu nadmiernego rozpuszczenia pSi (użyte w krokach 1.3 i 1.5).
  2. Ustawianie komórki etch
    1. W teflonowej komórce wytrawiającej z dołkiem wytrawiającym 8,6cm2 (powierzchnia jest obliczana poprzez pomiar średnicy powierzchni krzemu dostępnej do wytrawienia w O-ringu i obliczenie powierzchni przez A = πr2), umieść w porządku malejącym (Rysunek 2a): (1) górna część ogniwa teflonowego; (2) O-ring; (3) ćwiartkę płytki krzemowej monokryształu (1 0 0) o orientacji p++ pociętej na ćwiartki (przy użyciu frezu diamentowego); (4) folia aluminiowa; oraz (5) podstawa ogniwa teflonowego ze delikatnie dokręconymi, aby zapobiec wyciekom.
    2. Napełnij studzienkę EtOH. Weź chusteczkę i włóż ją w szczelinę między górną częścią ogniwa teflonowego a podstawą. Jeśli chusteczka wyschnie po wyjęciu, komórka wytrawiania jest zapieczętowana. Jeśli jest mokre, ogniwo przecieka i dokręć dalej, aż zostaną uszczelnione.
  3. Elektropolerowanie płytki krzemowej
    1. Przenieś zmontowaną komórkę wytrawiania do dygestorium.
    2. Napełnij studzienkę 10 ml roztworu HF w proporcji 3:1.
    3. Podłącz przewód dodatni do folii aluminiowej (elektrody) z ogniwa wytrawiającego i podłącz przewód ujemny do cewki platynowej (przeciwelektrody) zanurzonej w roztworze HF 3:1 ogniwa wytrawiającego, aby zakończyć obwód (Rysunek 2b).
    4. Uruchom prąd stały o natężeniu 50 mA cm-2 przez 60 s. Po zakończeniu wytrawiania wyjmij ogniwo z obwodu i ostrożnie wypłucz HF 3:1 za pomocą strzykawki. Spłucz EtOH trzy razy.
    5. Rozpuścić wytrawioną warstwę, powoli napełniając studzienkę 10 ml 1 M KOH. Poczekaj, aż bulgotanie ustąpi.
    6. Wypłucz KOH trzykrotnie wodą, a następnie trzykrotnie EtOH
      7. .
  4. Elektrochemiczne wytrawianie porowatych warstw w płytce krzemowej
    1. Uruchom prąd przemienny o przebiegu prostokątnym, o niższej gęstości prądu 50 mA/cm2 przez 0,6 s i wysokiej gęstości prądu 400 mA/cm2 przez 0,36 s powtarzane przez 500 cykli.
    2. Po zakończeniu wytrawiania wyjmij ogniwo z obwodu i ostrożnie wypłucz HF 3:1 za pomocą strzykawki. Spłucz EtOH trzy razy.
  5. Odnoszenie porowatej warstwy z płytki krzemowej
    1. Napełnij studzienkę 10 ml roztworu HF w stosunku 1:29.
    2. Uruchom stałą 3,7 mA/cm2 przez 250 s. Po zakończeniu wytrawiania wyjmij ogniwo z obwodu. Warstwa pSi może mieć widoczne zmarszczki wskazujące na oderwanie się od krystalicznej płytki krzemowej. Delikatnie wypłukać roztwór HF w stosunku 1:29 i trzykrotnie spłukać EtOH, a następnie trzykrotnie wodą.
    3. Za pomocą końcówki pipety mocno rozerwij obwód warstwy pSi, aby całkowicie oderwać. Za pomocą EtOH zebrać fragmenty (wióry) pSi z teflonowej komórki wytrawiania do łodzi wagowej. Przenieś chipsy do szklanej fiolki. Chipy pSi mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej w EtOH przez ponad 6 miesięcy.
    4. Rozpuść pozostały porowaty krzem na płytce, powoli napełniając studzienkę 10 ml 1 M KOH. Poczekaj, aż bulgotanie ustąpi.
    5. Wypłucz KOH trzykrotnie wodą, a następnie trzykrotnie EtOH
      6. .
    6. Powtarzaj kroki 1.3-1.5, aż cała grubość wafla zostanie wytrawiona.
  6. Sonikacja warstw porowatych do tworzenia nanocząstek
    1. Zastąpić rozpuszczalnik szklanej fiolki zawierającej wiórki pSi z EtOH na 2 ml wody demineralizowanej.
    2. Mocno zamknij nakrętkę i uszczelnij za pomocą parafilmu.
    3. Umieść szklaną fiolkę w kąpieli sonikatora i zawieś tak, aby objętość wiórów pSi była całkowicie zanurzona pod powierzchnią.
    4. Sonicuj przez 12 godzin przy 35 kHz i mocy RF 48W. Aby zapobiec znacznej utracie wody podczas sonikacji, należy umieścić kolbę miarową wypełnioną wodą, odwróconą tak, aby otwór kolby dotykał powierzchni łaźni wodnej.
    5. Umieść szklaną fiolkę na płaskiej powierzchni na 1 godzinę, aby większe cząstki mogły osiąść na dnie. Zebrać supernatant za pomocą pipety; zawiesina zawiera pSiNP o długości fali poniżej 100 nm.

2. Przygotowanie fuzogennego filmu lipidowego

  1. Przygotowanie podstawowych roztworów lipidów
    1. W dygestorium wytworzyć zapas lipidów 10 mg/ml poprzez uwodnienie lipidów DMPC, DSPE-PEG-MAL i DOTAP w chloroformie. Te roztwory podstawowe mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy w szczelnym zamknięciu parafilmu.
  2. Wytwarzanie fuzogennego filmu lipidowego
    UWAGA: Kompozycja fuzogenna składa się z lipidów, DMPC, DSPE-PEG i DOTAP, o stosunku molowym odpowiednio 76,2:3,8:20 i 96,2:3,8:0.
    1. W szklanej fiolce wymieszać 72,55 μl DMPC, 15,16 μl DSPE-PEG i 19,63 μl DOTAP przez pipetowanie.
    2. Opcjonalnie: W celu znakowania fluorescencyjnego powłoki lipidowej należy dodatkowo dodać 20 μl DiI rozpuszczonego w EtOH o stężeniu 1 mg/ml.
    3. Umieścić fiolkę w dygestorium z luźnym wieczkiem, aby chloroform mógł odparować przez noc. Wysuszony film będzie mętną, twardą, żelową substancją na dnie fiolki.

3. Ładowanie i uszczelnianie siRNA w pSiNPs

  1. Przygotowanie materiału załadowczego chlorku wapnia
    1. Rozpuścić 1,11 g CaCl2 w 10 ml wody wolnej od RNAse, aby uzyskać 2 M roztwór CaCl2.
    2. Odwirować roztwór o stężeniu > 10 000 x g przez 1 minutę, aby osadzić agregaty i zebrać supernatant za pomocą pipety. Alternatywnie przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 μm.
  2. Przygotowanie materiału załadowczego siRNA
    1. Uwodnić lub rozcieńczyć siRNA do 150 μM w wodzie wolnej od RNAzy. Roztwór podstawowy można podzielić na porcje i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 dni, pod warunkiem, że nie jest on poddawany częstym cyklom zamrażania i rozmrażania.
  3. Ładowanie siRNA w pSiNPs chlorkiem wapnia
    1. Przygotuj lodowatą kąpiel sonikacyjną.
    2. W ciągu 15 minut ultradźwięków delikatnie odpipetować 150 μL siRNA i 700 μL 2 M CaCl2 do 150 μL pSiNP. Upewnij się, że pokrywa probówki mikrowirówki jest otwarta w celu wytworzenia gazu.
    3. Wyjmij probówkę zawierającą 1 ml pSiNP pokrytych wapniem z siRNA z sonikatora.

4. Powlekanie pSiNPs naładowanych siRNA fuzogenicznymi lipidami

  1. Przygotowanie zestawu do wytłaczania liposomów
    1. Napełnij szeroką zlewkę wodą DI. Namocz 1 membranę poliwęglanową (pory 200 nm) i 4 wsporniki filtrów, unosząc je na powierzchni wody. Zmontuj zestaw do wytłaczania liposomów, postępując zgodnie z instrukcjami producenta
  2. Nawilżanie filmu lipidowego za pomocą pSiNps obciążonych siRNA
    1. Uwodnić wysuszony film lipidowy w szklanej fiolce za pomocą 1 ml wypełnionych siRNA pSiNP pokrytych wapniem, otrzymanych z kroku 3.3.3. Pipetować do momentu, aż wszystkie warstwy lipidów oderwą się od dna fiolki i zmieszają się w mętny, jednorodny roztwór.
    2. Umieścić mieszadło magnetyczne w szklanej fiolce i umieścić fiolkę na płycie grzejnej, aby podgrzać cząstki do 40 °C (lub wystarczająco wysoko powyżej temperatury przemiany fazowej lipidów, aby utrzymać lipidy w bardziej płynnej fazie ciekłokrystalicznej), jednocześnie mieszając magnetycznie roztwór przez 20 minut.
  3. Wytłaczanie powlekanych lipidem pSiNP w celu kontroli wielkości
    1. Odessać 1 ml roztworu pSiNP-siRNA pokrytego lipidami do strzykawki do wytłaczania. Włożyć pustą strzykawkę po jednej stronie ekstrudera, a napełnioną strzykawkę po drugiej stronie.
    2. Rozpocznij wytłaczanie, powoli wciskając tłok, aby przepchnąć cząstki z jednej strzykawki przez membranę poliwęglanową i do drugiej. Powtórz 20 razy. Jeśli tłok jest zablokowany, filtr i membrana mogą być zatkane. Zdemontuj ekstruder i wymień membranę oraz wsporniki filtrów. Jeśli problem będzie się powtarzał, rozcieńczyć cząsteczki, aż zatkanie będzie możliwe do opanowania.
    3. Zbierz wytłaczane cząstki do probówki mikrowirówkowej.

5. Koniugacja peptydów docelowych

  1. Sprzęgnięcie peptydu celującego z powłoką lipidową
    1. Przygotować bulion peptydowy o stężeniu peptydu 1 mg/ml w wodzie wolnej od RNAzy.
    2. Do probówki mikrowirówki zawierającej fuzogeniczne pSiNP pokryte lipidami dodać 100 μl wywaru peptydowego o stężeniu 1 mg/ml i delikatnie odpipetować. Utrzymuj rurkę statycznie w temperaturze pokojowej przez 20 minut (alternatywnie > 2 godziny w temperaturze 4 °C).
    3. W celu usunięcia nadmiaru peptydu lub siRNA i innych substancji pomocniczych, przemyć w filtrze odśrodkowym o sile 30 kDa, wirując z prędkością 5 000 x g w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Odwirować jeszcze dwukrotnie z 1 ml PBS w tym samym ustawieniu.
    4. Zawiesić końcowe fuzogenne pSiNP pokryte peptydem w PBS w żądanym stężeniu. Cząstki można teraz podzielić na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu przechowywania przez co najmniej 30 dni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udana synteza fuzogennych pSiNPs powinna dać jednorodny, lekko nieprzezroczysty roztwór (Rysunek 3a). Brak optymalizacji stosunku i stężenia pSiNPs : siRNA : CaCl2 może prowadzić do agregacji po załadowaniu (Rysunek 3b). Ponieważ cząstki są wytłaczane przez membrany o długości 200 nm, średnia średnica hydrodynamiczna fuzogennych pSiNP mierzona przez DLS powinna wynosić około 200 nm, a średni potencjał zeta około +7 mV, jak pokaz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Syntezę porowatych nanocząstek krzemu przedstawiono na rysunku 5. Krytycznym etapem syntezy fuzogennych pSiNPs jest etap ładowania (etap 3). Jeśli fuzogenne nanocząstki agregują się po syntezie (rysunek 3), przyczyna może być następująca: (1) materiał wyjściowy chlorku wapnia nie został przygotowany jednorodnie, dlatego należy dokładnie przestrzegać lub rafinować etap 3.1.2; lub (2) stosunek pSiNP : siRNA : CaCl2 lub stężenie jednego lub więcej z trze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MJS jest naukowym założycielem Spinnaker Biosciences, Inc. i posiada udziały w spółce. Chociaż dotacja ta została zidentyfikowana w celu zarządzania konfliktem interesów w oparciu o ogólny zakres projektu i jego potencjalne korzyści dla Spinnaker Biosciences, Inc., wyniki badań zawarte w tej konkretnej publikacji niekoniecznie muszą odnosić się do interesów Spinnaker Biosciences. Inc. Warunki tej umowy zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego zgodnie z jego zasadami dotyczącymi konfliktu interesów. Inni autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest wspierana przez National Institutes of Health poprzez kontrakt # R01 AI132413-01.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dimyrystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC)Avanti Polar Lipids850345PProszek
1,2-dioleoilo-3-trimetyloamonowo-propan (sól chlorkowa) (DOTAP)Avanti Polar Lipids890890PProszek
1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[maleimid(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa) (DSPE-PEG(2000) Maleimid)Avanti Polar Lipids880126PProszek
Folia aluminiowaVWR International, LLC12175-001
Chlorek wapnia (CaCl2)SpectrumC1977Bezwodny, granulki
ChloroformFisher ScientificC6061
KomputerDellDimension 9200Dopuszczalny
jest dowolny komputer z gniazdem karty PCIDil Stain (nadchloran 1,1'-dioctadecylo-3,3,3',3'-tetrametyloindokarbocyjaniny ("DiI"; DiIC18(3)))LifeTechnologiesD3911
Etanol (EtOH)UCSD Sklep111200 Proof
Kwas hydroflurynowy (HF)VWR International, LLCMK264008 Czystość: 48%
Miernik źródłowy Keithley 2651aPrzykładowy program Keithley2651A
LabVIEWNational Instrumentsdostępny pod adresem:
http://sailorgroup.ucsd.edu/sofware/ LysoTracker Green DND-26Thermo Fisher ScientificL7526
Zestaw do wytłaczania liposomów z blokiem grzewczymAvanti Polar Lipids610000
Microcon-30kDa Odśrodkowy Jednostka filtrującaEMD MilliporeMRCF0R030
O-ringChemGlassCG-305-220
Sola fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher Scientific10010-049
Cewka platynowaVWR International, LLCAA10285-BU
Wodorotlenek potasu (KOH)Fisher ScientificP250-3
WafelkrzemowySiltronixna zamówienie
niestandardowe siRNADharmaconna zamówienieIRF5, sense 5'-dTdT-CUG CAG AGA AUA ACC CUG A-dTdT-3' i antysensowne 5'-dTdT UCA GGG UUA UUC GCA G dTdT-3'
SonicatorVWR International, LLC97043-960
Peptyd celujący (CRV)CPC ScientificSekwencja zamówień niestandardowychCRVLRSGSC; wytwarzany cyklicznie przez wiązanie dwusiarczkowe między łańcuchami bocznymi dwóch reszt cysteiny Ogniwo
teflonoweInterface Performance Materials, Inc.Na zamówienie
UltraPure Woda destylowana wolna od DNaz/RNaz Thermo Fisher 10977015
Naukowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ryther, R. C. C., Flynt, A. S., Phillips Iii, J. A., Patton, J. G. siRNA therapeutics: big potential from small RNAs. Gene Therapy. 12, 5(2004).
  2. Scherman, D., Rousseau, A., Bigey, P., Escriou, V. Genetic pharmacology: progresses in siRNA delivery and therapeutic applications. Gene Therapy. 24, 151(2017).
  3. Broderick, J. A., Zamore, P. D. MicroRNA therapeutics. Gene Therapy. 18, 1104(2011).
  4. Geisler, A., Fechner, H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World Journal of Experimental Medicine. 6 (2), 37-54 (2016).
  5. Williams, P. D., Kingston, P. A. Plasmid-mediated gene therapy for cardiovascular disease. Cardiovascular Research. 91 (4), 565-576 (2011).
  6. Ferreira, G. N. M., Monteiro, G. A., Prazeres, D. M. F., Cabral, J. M. S. Downstream processing of plasmid DNA for gene therapy and DNA vaccine applications. Trends in Biotechnology. 18 (9), 380-388 (2000).
  7. Shim, G., et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacologica Sinica. 38, 738(2017).
  8. Carlson, D. F., Fahrenkrug, S. C., Hackett, P. B. Targeting DNA With Fingers and TALENs. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, (2012).
  9. Dai, W. -J., et al. CRISPR-Cas9 for in vivo Gene Therapy: Promise and Hurdles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e349(2016).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911(2018).
  11. Houseley, J., Tollervey, D. The Many Pathways of RNA Degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
  12. Sahay, G., et al. Efficiency of siRNA delivery by lipid nanoparticles is limited by endocytic recycling. Nature Biotechnology. 31 (7), 653-658 (2013).
  13. Wang, Y., Huang, L. A window onto siRNA delivery. Nature Biotechnology. 31 (7), 611-612 (2013).
  14. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  15. Kim, B., et al. Immunogene therapy with fusogenic nanoparticles modulates macrophage response to Staphylococcus aureus. Nature Communications. 9 (1), 1969(2018).
  16. Zhang, X., et al. Targeted Disruption of G0/G1 Switch Gene 2 Enhances Adipose Lipolysis, Alters Hepatic Energy Balance, and Alleviates High-Fat Diet–Induced Liver Steatosis. Diabetes. 63 (3), 934-946 (2014).
  17. Schlosser, K., Taha, M., Deng, Y., Stewart, D. J. Systemic delivery of MicroRNA mimics with polyethylenimine elevates pulmonary microRNA levels, but lacks pulmonary selectivity. Pulmonary Circulation. 8 (1), 2045893217750613(2018).
  18. Komarov, A. P., et al. Functional genetics-directed identification of novel pharmacological inhibitors of FAS- and TNF-dependent apoptosis that protect mice from acute liver failure. Cell Death & Disease. 7, e2145(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dynamiczne rozpraszanie wiat atransmisyjna mikroskopia elektronowaekstruzja liposom wmikroskopia konfokalnakonjugacja peptyd wadowanie siRNApomiar potencja u zetarednica hydrodynamiczna

Powiązane artykuły