Wielolocusowa analiza tandemowo-powtórzeniowa bakterii Yersinia ruckeri patogennej dla ryb metodą Multiplex PCR i elektroforezy kapilarnej

Summary

Prezentowany tutaj test wielomiejscowej analizy tandemowo-powtórzeniowej (MLVA) umożliwia niedrogie, solidne i przenośne genotypowanie w wysokiej rozdzielczości bakterii Yersinia ruckeri. Zaczynając od czystych kultur, test wykorzystuje multipleksową reakcję PCR i elektroforezę kapilarną w celu wytworzenia dziesięcioloci-loci profili MLVA do dalszych zastosowań.

Abstract

Yersinia ruckeri jest ważnym patogenem hodowlanych ryb łososiowatych na całym świecie, ale brakuje prostych narzędzi odpowiednich do badań epizootiologicznych (śledzenie infekcji itp.) tej bakterii. W związku z tym opracowano test wielomiejscowej analizy tandemowej liczby zmiennej (MLVA) jako łatwo dostępne i jednoznaczne narzędzie do genotypowania odzyskanych izolatów w wysokiej rozdzielczości. W przedstawionym tutaj teście MLVA DNA ekstrahuje się z hodowanych próbek Y. ruckeri poprzez gotowanie komórek bakteryjnych w wodzie, a następnie użycie supernatantu jako matrycy do PCR. Pary starterów ukierunkowane na dziesięć loci VNTR (Variant Twice) o zmiennej liczbie, przeplatane w całym genomie Y. ruckeri, są równomiernie rozmieszczone w dwóch pięciopaksowych reakcjach PCR przebiegających w identycznych warunkach cyklicznych. Startery do przodu są znakowane jednym z trzech barwników fluorescencyjnych. Po potwierdzeniu amplikonu za pomocą elektroforezy żelowej, produkty PCR rozcieńcza się i poddaje elektroforezie kapilarnej. Na podstawie otrzymanych profili elektroferogramu piki reprezentujące każde z loci VNTR są nazywane wielkością i wykorzystywane do obliczania liczby powtórzeń VNTR in silico. Uzyskane w ten sposób dziesięciocyfrowe profile MLVA są następnie wykorzystywane do generowania minimalnych drzew rozpinających, co umożliwia ocenę epizootiologiczną za pomocą analizy skupień. Wysoce przenośne dane wyjściowe, w postaci numerycznych profili MLVA, można szybko porównać między laboratoriami i umieścić w kontekście czasoprzestrzennym. Cała procedura, od hodowli kolonii do oceny epizootiologicznej, może zostać zakończona dla maksymalnie 48 izolatów Y. ruckeri w ciągu jednego dnia roboczego.

Introduction

Yersinia ruckeri, bakteria Gram-ujemna z rodziny Yersiniaceae, powoduje jersiniozę u hodowlanych ryb łososiowatych na całym świecie¹. Można go łatwo zdiagnozować u zakażonych ryb poprzez hodowlę na wielu rodzajach pożywek agarowych, ale do niedawna niewiele było wiadomo na temat struktury populacji i epizootiologii Y. ruckeri na całym świecie i w różnych siedliskach (gatunki żywicielskie itp.). Istniejące systemy serotypowania Y. ruckeri są niespójne, brakuje im wzajemnej kompatybilności i oferują niską rozdzielczość epidemiologiczną. Przeprowadzono pewne badania molekularne bakterii, wykorzystując takie techniki, jak typowanie sekwencji Multilocus (MLST), elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym (PFGE) lub analiza sekwencji całego genomu (WGS)^2,3,4,5. Jednak MLST nie zapewnia wystarczająco wysokiej rozdzielczości do rutynowego śledzenia infekcji, podczas gdy PFGE jest pracochłonny i daje wyniki, które nie są łatwe do przeniesienia między laboratoriami. Podczas gdy analiza WGS zapewniłaby niemal ostateczną rozdzielczość, ustanowienie i wdrożenie takich analiz wymagałoby wstępnych możliwości technicznych i bioinformatycznych, które pozostają jeszcze ograniczone do stosunkowo niewielkiej liczby laboratoriów.

Multi-locus Analiza tandemowo-liczbowa (MLVA) reprezentuje proste i łatwo dostępne narzędzie do typowania molekularnego, które oferuje rozdzielczość genetyczną w niektórych przypadkach prawie równą tej z analizy WGS^6,7. Technika ta opiera się na zmienności liczby powtórzeń w wybranych loci tandem-repeat (VNTR) o zmiennej liczbie, co skutkuje danymi wyjściowymi, które są wysoce transportowalne, co ułatwia porównanie profilowanych izolatów z internetowymi bazami danych i między laboratoriami. Chociaż MLST pozostaje złotym standardem w epidemiologicznym typowaniu wielu patogenów bakteryjnych, coraz większa liczba badań wskazuje na znacznie większą moc dyskryminacyjną MLVA^8,9,10. Opublikowano również kilka protokołów dotyczących bakterii chorobotwórczych dla ryb, takich jak Francisella noatunensis, Edwardsiella piscicida i Renibacterium salmoninarum^11,12,13.

Przedstawiony tutaj protokół MLVA z dziesięcioma loci, który niedawno stał się podstawą do obszernego badania populacji Y. ruckeri¹⁴, obejmuje ekstrakcję DNA z kolonii hodowanych w agarze, multipleksowy PCR i elektroforezę kapilarną (CE), a następnie dalsze zastosowania in silico. Dla każdego badanego izolatu równolegle w identycznych warunkach przeprowadza się dwa multipleksowe PCR, oba zawierające pięć fluorescencyjnie znakowanych par starterów (6FAM, NED lub VIC), z których każda celuje w poszczególne regiony VNTR. Po weryfikacji amplikonów PCR za pomocą elektroforezy żelowej (GE), produkty PCR są rozcieńczane przed analizą CE, a piki reprezentujące odpowiednie loci VNTR są wywoływane pod względem wielkości na podstawie otrzymanych plików elektroferogramów. Wraz ze wzorami specyficznymi dla locus uwzględniającymi niewielkie, specyficzne dla sekwencji rozbieżności we wzorcach migracji CE, wywołania rozmiaru VNTR CE są następnie wykorzystywane do obliczania liczby powtórzeń VNTR, które są łączone w dziesięciocyfrowe profile MLVA. Są one wykorzystywane jako dane wejściowe do ocen epizootiologicznych (np. poprzez analizę skupień na diagramach minimalnego drzewa rozpinającego (MST)).

Protocol

UWAGA: Dla całego protokołu zaleca się sterylne przeprowadzanie wszystkich procedur w laboratorium mokrym przy użyciu fartuchów laboratoryjnych, jednorazowych rękawiczek oraz sterylnych odczynników i sprzętu. Zaleca się również przygotowanie reakcji PCR w oddzielnym pomieszczeniu (pre-PCR), które nie jest używane do amplifikacji PCR i/lub obchodzenia się z produktami PCR (post-PCR). Przechowuj wszystkie odczynniki zgodnie z zaleceniami producenta. Więcej informacji na temat używanych odczynników, sprzętu i oprogramowania można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla bakterii i ekstrakcja genomowego DNA

1. Wysiewaj czyste kultury Y. ruckeri na dowolnym odpowiednim typie agaru (autorzy użyli 5% agatora z krwi bydlęcej) i inkubuj w temperaturze 22 °C przez 1-2 dni lub 15 °C przez 3-4 dni.
2. Z każdej płytki agarowej wybrać pojedynczą reprezentatywną kolonię z pętlą inokulacyjną i przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml zawierających 50 μl ultraoczyszczonej wody. Zawiesić, krótko wirować i inkubować przez 7 minut na bloku grzewczym w temperaturze 100 °C.
3. Wirować przy 16 000 x g przez 3 minuty i za pomocą pipety ostrożnie przenieść supernatant do pustej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przejść do następnego etapu, używając supernatantu jako matrycy DNA lub przechowywać w temperaturze -20 °C do tego czasu.

2. Konfiguracja Multiplex PCR i warunki cykliczne

UWAGA: Każda reakcja multipleksowego PCR (dwie na każdy izolat Y. ruckeri) powinna zawierać 12,5 μL 2x Multiplex PCR Plus master mix, 0,1 do 0,2 μM każdej odpowiedniej pary starterów (Tabela 1) i 3 μL matrycy DNA, dostosowanej do końcowej objętości reakcji 25 μL przez dodanie wody wolnej od RNaz. Staraj się ograniczyć do minimum ekspozycję na światło znakowanych fluorescencyjnie starterów przednich (np. poprzez owinięcie ich probówek do przechowywania folią aluminiową).

1. Dla każdego z dwóch testów multipleksowej reakcji PCR (tabela 1) należy przygotować mieszaniny wzorcowe zgodnie z opisem powyżej (bez matrycy DNA) zgodnie z liczbą próbek oraz jedną kontrolą dodatnią i jedną ujemną. Dodatkowo pozostaw 10% nadwyżki objętości. Wiruj przygotowany mistrz delikatnie miesza się z niską prędkością.
2. Rozprowadzić 22 μl każdej mieszanki głównej oddzielnie do indywidualnych studzienek na paskach lub płytkach PCR, odpowiednio do liczby próbek, i dodać 3 μl matrycy do każdej studzienki (do kontroli dodatniej i ujemnej należy użyć odpowiednio DNA ze zweryfikowanego szczepu Y. ruckeri i ultraoczyszczonej wody). Uszczelnić i krótko odwirować.
3. Wszystkie próbki należy uruchomić na termocyklerze PCR z następującym programem: (i) 5 minut w temperaturze 95 °C, (ii) 30 cykli po 0,5 minuty w temperaturze 95 °C, 1,5 minuty w temperaturze 60 °C i 1 minuty w temperaturze 72 °C oraz (iii) 60 minut w temperaturze 68 °C, a następnie schłodzenie do 4 °C w nieskończoność. Program zostanie zrealizowany w mniej niż 3 godziny.

3. Potwierdzenie amplikonu PCR za pomocą elektroforezy żelowej

1. Zgodnie z zaleceniami producenta należy przygotować objętość 1,5% (w/v) żelu agarozowego w 1x buforze tris-boran-EDTA (TBE) odpowiednią do liczby badanych reakcji PCR. Przed odlewaniem dodać 5 μl barwnika fluorescencyjnego kwasu nukleinowego na 50 μl roztworu żelu i wymieszać. Do odlewania należy używać tacek i grzebieni, pozostawiając odpowiednią liczbę dołków wolnych na drabinki referencyjne DNA.
2. Po związaniu zanurz żel w 1x buforze TBE w systemie GE. Wymieszać 5 μl produktu PCR z 2 μl barwnika ładującego i przenieść do dołków żelowych. Dodaj 5 μl drabinki DNA do pustych studzienek w celach informacyjnych.
3. Uruchom żel pod napięciem 110 V na 15 cm przez około 1 godzinę i użyj systemu obrazowania/wizualizacji żelu na bazie UV, aby zweryfikować obecność wielu (do pięciu) prążków reprezentujących amplikony PCR (patrz przykład w Rysunek 1). Wyrzuć żel. Przejdź do następnego kroku lub przechowuj pozostałe produkty PCR w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki.

4. Konfiguracja i warunki działania elektroforezy kapilarnej

1. Po potwierdzeniu amplikonów PCR, produkty PCR rozcieńczyć w stosunku 1:10 (v/v) w oczyszczonej wodzie. Zamknąć, wymieszać i krótko odwirować.
2. Pracując w dygestorio, przygotować objętość mieszanki wzorcowej składającej się z 9 μl formamidu i 0,5 μl wzorca wielkości na produkt PCR (pozostawić 10% nadwyżki objętości). Krótko przemieszać i rozprowadzić 9,5 μl do studzienek na płytce odpowiedniej dla dostępnego systemu CE, przed dodaniem 0,5 μl rozcieńczonego produktu PCR. Zamknąć, wymieszać i krótko odwirować.
   ostrożność: Obchodź się ostrożnie. Mieszanie formamidu z wodą powoduje powstawanie kwasu mrówkowego, który jest toksyczny.
3. Za pomocą termocyklera PCR denaturować próbki w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie schładzać do 4 °C w nieskończoność. Odwirować na krótko i załadować płytkę do skalibrowanego systemu CE zgodnie z instrukcjami producenta.
4. Przeprowadzić analizę fragmentów CE przy użyciu odczynników odpowiednich dla wybranej aparatury i następujących ustawień: 60 °C; 5 s iniekcji przy napięciu 1,6 kV (32 V na cm); 32 minuty czasu pracy przy napięciu 15 kV (300 V na cm). Analiza fragmentów CE 24 dołków na 24-kapilarnym (50 cm) trwa zwykle około 50 minut.

5. Wywoływanie rozmiaru VNTR, obliczanie liczby powtórzeń i profilowanie MLVA

UWAGA: Krok 5.1 opisuje Y. ruckeri VNTR CE size wywołując z plików elektroferogramu, używając specjalnego oprogramowania wymienionego w Tabeli Materiałów. Zapoznaj się z instrukcją oprogramowania, aby uzyskać dodatkowe informacje i rozwiązywać problemy. Aby korzystać z innego oprogramowania, zapoznaj się z odpowiednimi instrukcjami.

1. Importuj pliki wyników CE (po dwa na izolat Y. ruckeri). Ustaw Metodę analizy na Domyślna domyślna mikrosatelita i wybierz odpowiedni wybór produktu w obszarze Rozmiar Standard, przed naciśnięciem przycisku Analizuj. Sprawdź poprawność identyfikacji fragmentów o standardowym rozmiarze za pomocą edytora dopasowania rozmiaru i popraw wszelkie widocznie błędne alokacje.
   1. Po wybraniu próbki (próbek) do odczytania, naciśnij przycisk Wyświetl wykresy i naciśnij Ctrl+A, aby włączyć widok tabeli rozmiarów. Będąc w górnym panelu, przytrzymaj Ctrl i kliknij pięć szczytów reprezentujących amplikony VNTR (w razie potrzeby użyj narzędzia do powiększania).
      nuta: Dla każdego z produktów multiplex PCR elektroferogram pokaże pięć pików rozmieszczonych wśród trzech zastosowanych barwników (patrz znakowanie barwnikiem 5' starterów forward w tabeli 1 i dwa przykłady w Rysunek 2).
   2. Naciśnij Ctrl+G, aby przefiltrować tabelę rozmiarów, pokazującą tylko charakterystykę pięciu wyróżnionych pików, i zarejestrować wywołania rozmiaru CE dla każdego locus VNTR (z odniesieniem do tabeli 1) dla dalszej aplikacji.
2. Aby uwzględnić tendencyjne wzorce ruchliwości amplikonów podczas CE, należy obliczyć dokładną liczbę powtórzeń VNTR zgodnie ze wzorem podanym poniżej, wykorzystując wywołania wielkości VNTR CE wraz ze zmiennymi specyficznymi dla locus (patrz Tabela 1). Aby zwiększyć wydajność, zaleca się zautomatyzowanie tego procesu (np. za pomocą szablonu arkusza kalkulacyjnego).
   
3. Okrągłe obliczone powtórzenia VNTR odliczają do najbliższej liczby całkowitej i łączą się w dziesięciocyfrowe ciągi, z których każdy reprezentuje profil MLVA pojedynczego izolatu Y. ruckeri.

6. Minimalna analiza skupień drzewa rozpinającego danych MLVA

UWAGA: Krok 6 opisuje tworzenie diagramów MST z danych MLVA Y. ruckeri, przy użyciu specjalnego oprogramowania wymienionego w Tabeli Materiałów. Zapoznaj się z instrukcją oprogramowania, aby uzyskać dodatkowe informacje i rozwiązywać problemy. Aby korzystać z innego oprogramowania, zapoznaj się z odpowiednimi instrukcjami.

1. Utwórz nową bazę danych i zdecyduj się na aktywację wtyczki MLVA.
2. Zaimportuj profile i metadane MLVA Y. ruckeri, wybierając dane typu znaku, a następnie Importuj pola i znaki (dalszy podwybór w zależności od formatu przechowywania). Po wyświetleniu monitu określ reguły importu zgodnie z zawartością pliku importu: W kolumnie Typ miejsca docelowego sklasyfikuj liczbę powtórzeń VNTR jako wartość znaku: VNTR, a różne metadane jako Informacje o wpisie: pole informacji o wpisie.
   nuta: Dla porównania i kontekstu możliwe jest również zaimportowanie całego opublikowanego zbioru danych (open access) wraz z oryginalnym artykułem wykorzystującym obecny protokół MLVA¹⁴. Profile MLVA i metadane dotyczące różnorodnej kolekcji izolatów Y. ruckeri (n = 484) zbadanych w tym badaniu są dostępne w materiałach uzupełniających (tabele S1 i S2) pod następującym linkiem: https://aem.asm.org/content/84/16/e00730-18/figures-only#fig-data-additional-files
3. W panelu Typ eksperymentu otwórz wpis VNTR i ustaw minimalne i maksymalne wartości dla każdego locus VNTR odpowiednio na 0 i 100. W obszarze Ustawienia ogólne ustaw liczbę cyfr dziesiętnych na 0 i wybierz pozycję Liczby w obszarze Typ danych. Zaznacz, aby traktować nieobecne wartości jako zero.
4. Wybierz zaimportowane próbki przeznaczone do analizy skupień MST i kliknij przycisk Utwórz nowe porównanie (w panelu Porównanie).
   1. Jeśli jest to potrzebne do wizualnej prezentacji MST, przydziel próbki do kolorowych grup (np. zgodnie z określoną cechą metadanych), korzystając z różnych opcji dostępnych w panelu Grupy.
      nuta: Grupy można również tworzyć/zmieniać retrospektywnie, po wykonaniu poniższych kroków.
   2. Wybierz pozycję Zaawansowana analiza skupień... i MST dla danych podzielonych na kategorie, aby wygenerować diagram MST na podstawie wybranych próbek.
   3. Dalej modyfikuj wizualną prezentację MST zgodnie z preferencjami (np. dodając parametry partycjonowania, etykietowanie węzłów/gałęzi, linków krzyżowych, legend itp.). Zobacz przykład w Rysunek 3.
      nuta: Próg partycjonowania klastra (kompleksu klonalnego) dla ≤4/10 nieidentycznych loci VNTR, oprócz ukrywania połączeń rozgałęzień reprezentujących >5/10 nieidentycznych loci VNTR, był wcześniej stosowany do analizy skupień MST na podstawie danych MLVA wygenerowanych przy użyciu tego protokołu¹⁴. Pod warunkiem, że zaimportowano wyżej wymieniony zestaw danych 484 profili MLVA Y. ruckeri, próbki te można również uwzględnić w analizie skupień MST (jak opisano powyżej), aby zapewnić kontekst globalny i historyczny. Ułatwi to m.in. identyfikację wszelkich próbek związanych z wcześniej opisanymi kompleksami klonalnymi, a także tych reprezentujących nieopisane jeszcze linie. W zależności od dostępnych metadanych, wynikowy diagram MST może być analizowany na różne sposoby, np. w celu odkrycia ewentualnych wzorców grupowania związanych z określonymi cechami (geografia, gospodarz, czas itp.).
   4. W razie potrzeby wyeksportuj sfinalizowany plik MST w żądanym formacie, korzystając z opcji Eksportuj obraz.

Results

Po opisanym tutaj multipleksowym PCR, typowy obraz GE weryfikujący obecność wielu amplikonów z każdej reakcji PCR jest pokazany w Rysunek 1. Dalsza analiza fragmentów CE przeprowadzona na zweryfikowanych produktach PCR, dla każdego badanego izolatu Y. ruckeri, zaowocuje dwoma plikami elektroferogramowymi używanymi do wywoływania wielkości odpowiednich loci VNTR (Rysunek 2). Z analizy 484 różnych izolatów Y. ruckeri nie zaobserwowano nakładania się zakresu wielkości amplikonów między loci VNTR znakowanymi tym samym barwnikiem w tej samej reakcji multipleksowej (Tabela 1)¹⁴. Każdy z pików elektroforetycznych można zatem jednoznacznie zidentyfikować za pomocą koloru.

Po zaimportowaniu profili MLVA i odpowiednich metadanych do preferowanego oprogramowania, diagramy MST mogą być konstruowane zgodnie z opisem w celu zbadania wszelkich wzorców epidemiologicznych interesujących w materiale. Zapoznaj się z odpowiednimi instrukcjami, aby uzyskać informacje o dodatkowych opcjach dostępnych w danym oprogramowaniu. Na przykład, Rysunek 3 przedstawia porównanie przez MST profili MLVA dla izolatów Y. ruckeri odzyskanych z ryb związanych z pięcioma różnymi hodowlami łososia w Norwegii.

Spójne rozmiary powtórzeń dziesięciu loci VNTR, jak również ich stabilność in vitro i in vivo, zostały wcześniej zweryfikowane w pierwotnym badaniu opartym na tym protokole¹⁴. Krótko mówiąc, dokonano tego za pomocą sekwencjonowania Sangera (wielkość powtórzeń) oraz typowania MLVA wielu izolatów po sekwencyjnych pasażach (in vitro) i z wnętrza poszczególnych ognisk choroby (in vivo). Ponadto zbadano stabilność środowiskową loci w czasie, typując wiele izolatów "szczepów domowych" odzyskanych w ciągu kilku lat z uporczywie zakażonych miejsc produkcji łososia atlantyckiego w stale zakażonych wodach słodkich.

Rysunek 1: Elektroforeza żelowa sprawdzająca obecność wielu produktów PCR. Obraz potwierdza obecność wielu amplikonów PCR we wszystkich 12 liniach zawierających próbki, przy czym pierwsza linia reprezentuje użytą drabinę DNA. Wskazano rozmiary wybranych fragmentów drabiny, podobnie jak przynależność testu PCR i szczepu (patrz tabela S1 w Gulla et al. 2018¹⁴) każdego pasa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Elektroferogramy pokazujące piki odpowiadające amplikonom VNTR. Nazwy różnych loci VNTR są wskazane za pomocą etykiet barwników (VIC = zielony; NED =; 6FAM = niebieski) w nawiasach. Dwa elektroferogramy (test PCR 1 góra; Test PCR 2 na dole) pochodzą z typowania pojedynczego izolatu Y. ruckeri. Pomarańczowe szczyty (barwnik LIZ) reprezentują zastosowany standard wielkości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykład minimalnego drzewa rozpinającego do oceny epidemiologicznej. Diagram opiera się na profilach MLVA z izolatów Y. ruckeri odzyskanych z łososia atlantyckiego w pięciu różnych norweskich gospodarstwach (1-5; patrz legenda), w których występują nawracające ogniska jeryznozji. Można zaobserwować wyraźną tendencję do grupowania związaną z pochodzeniem z gospodarstwa. Linki krzyżowe pokazują wszystkie możliwe połączenia obejmujące ≤1/10 nieidentycznych loci VNTR (patrz legenda). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Elektroferogram wizualizujący zacinanie się i rozszczepione szczyty. W tym przypadku oba występują jednocześnie, co nie zawsze ma miejsce. Dłuższy i wyższy szczyt, reprezentujący locus YR1070 VNTR, można łatwo odróżnić. Wyświetlacz jest powiększony i pokazuje tylko niebieskie piki barwnika. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Charakterystyka locus VNTR. Istotne cechy dziesięciu regionów VNTR Y. ruckeri objętych niniejszym protokołem MLVA.

Discussion

Oba przedstawione tutaj multipleksowe PCR wydawały się stosunkowo wytrzymałe w obliczu niskiej jakości matrycowego DNA, ale mimo to czasami obserwowano brak amplifikacji PCR przy użyciu matryc o wyjątkowo wysokich stężeniach DNA. Problemy te można było łatwo rozwiązać, rozcieńczając szablony przed PCR. Mogą być również stosowane inne metody ekstrakcji DNA niż zastosowana tutaj (np. zestawy komercyjne).

Chociaż oczekuje się, że z każdej reakcji multipleksowej PCR oczekuje się pięciu amplikonów, nie zawsze należy oczekiwać pięciu wizualnie rozróżnialnych prążków od GE, ponieważ niektóre (inaczej oznakowane) loci VNTR w tej samej reakcji mają nakładające się zakresy rozmiarów. Ostateczny czas wydłużenia PCR wynoszący 60 minut może zostać skrócony w razie potrzeby, ale prawdopodobnie spowoduje to zwiększone występowanie rozszczepionych pików w kolejnych elektroferogramach CE (patrz poniżej). W szczególności, ponieważ celem etapu GE jest wyłącznie jakościowa weryfikacja amplikonów PCR, czas działania, napięcie i/lub receptura żelu mogą być dostosowywane zgodnie z preferencjami. Jeżeli GE zaobserwuje szczególnie słabe prążki, może być wskazane zmniejszenie współczynnika rozcieńczenia tych próbek przed CE.

Podczas gdy opisany tutaj protokół CE został uruchomiony na konkretnym komercyjnym aparacie do elektroforezy kapilarnej (patrz Tabela materiałów), różne systemy CE mogą mieć różne wymagania dotyczące próbek, co z kolei może skłonić do pewnych modyfikacji protokołu. Zapoznaj się z instrukcją odpowiedniego producenta systemu CE, aby uzyskać instrukcje dotyczące odpowiednich odczynników/sprzętu, kalibracji itp. do analizy fragmentów. Istnieje również możliwość, że tendencyjne wzorce ruchliwości amplikonów obserwowane podczas CE mogą się względnie różnić w zależności od systemów CE i/lub maszyn, jak to zostało wcześniej udokumentowane dla innych protokołów MLVA^15,16. Jeśli wystąpi w stopniu, w którym wpłynie to na końcową (zaokrągloną) liczbę powtórzeń VNTR, oznacza to, że zmienne specyficzne dla locus s i i (Tabela 1), używane do określania liczby powtórzeń VNTR, muszą zostać ponownie skalibrowane. Obejmuje to regresję liniową na wykresach porównujących dokładne rozmiary sekwencji z wywołaniami o rozmiarze CE, zgodnie z opisem Gulla i in. 2018¹⁴.

Rozszczepione piki i piki jąkania, oba dobrze znane artefakty w typie¹⁷ MLVA opartym na CE, można zaobserwować na elektroferogramach podczas wywoływania rozmiaru (Figura 4). Podczas gdy piki jąkania powinny być ignorowane, dłuższy pik powinien być konsekwentnie wybierany do dalszych zastosowań w przypadku podzielonych pików oddzielonych pojedynczą parą zasad. Co więcej, nieobecne piki wskazujące na brak określonych loci VNTR są rzadkie, ale mogą wystąpić, w takim przypadku należy przypisać powtórzoną liczbę "0". Jeżeli kultura wyjściowa, z której ekstrahuje się DNA, nie jest czysta (tj. zawiera więcej niż jeden podtyp Y. ruckeri ), po CE można zaobserwować wiele wysokich pików odpowiadających różnym allelom tego samego locus/loci. Wtórne hodowle muszą być następnie przeprowadzone z pojedynczych kolonii przed ekstrakcją nowego DNA w celu ponownego typowania.

Jak stwierdzono w protokole, matryca DNA do PCR powinna być domyślnie ekstrahowana z czystych kultur Y. ruckeri. Jednak w kilku przypadkach próbki płynu jajowego, które dały wynik pozytywny na obecność Y. ruckeri metodą qPCR (wartości Ct < 27) zostały z powodzeniem wpisane do MLVA bezpośrednio, bez uprzedniej hodowli, przy użyciu zwiększonej ilości genomowego DNA (wyekstrahowanego za pomocą komercyjnego zestawu) jako matrycy. Chociaż podejście to nie zostało dokładnie przetestowane ani zweryfikowane, wskazuje na potencjał tego testu MLVA do badania złożonych matryc biologicznych zawierających DNA z szeregu różnych organizmów oprócz Y. ruckeri.

Cała przedstawiona tutaj procedura typowania MLVA, od ekstrakcji DNA do oceny epizootiologicznej, może zostać zakończona w ciągu jednego dnia roboczego. Jednak liczba badanych próbek jest w subliniowej zależności od czasu wymaganego do ekstrakcji DNA, PCR i CE, a zatem metoda jest znacznie bardziej efektywna czasowo w przypadku jednoczesnego badania wielu próbek. Jest tak jednak w przypadku większości metod laboratoryjnych, a jako narzędzie do epidemiologicznego podtypowania Y. ruckeri, połączenie wysokiej rozdzielczości, prostoty i przenośności sprawia, że ten test MLVA jest lepszy od wcześniej opublikowanych protokołów ^4,5. Wykorzystano go również do weryfikacji ograniczonego znaczenia epidemiologicznego serotypowania Y. ruckeri ¹⁴.

Dzięki kompleksowemu badaniu populacyjnemu opartemu na MLVA obejmującemu 484 izolaty Y. ruckeri odzyskane z różnych czasoprzestrzennych źródeł i siedlisk (ryby żywicielskie, środowisko itp.), nasza wiedza na temat epizootiologii i struktury populacji tego ważnego patogenu ryb znacznie się zwiększyła¹⁴. Typowanie MLVA umożliwiło śledzenie klonów rozprzestrzeniających się antropogenicznie przez dziesięciolecia, przypuszczalnie poprzez transport ryb, a także identyfikację lokalnie ograniczonych szczepów. Co więcej, podczas gdy niektóre kompleksy klonalne bakterii mogły być wyraźnie związane z chorobą u konkretnych ryb gospodarzy (odpowiednio pstrąg tęczowy i łosoś atlantycki), inne zostały odzyskane tylko ze źródeł środowiskowych i/lub klinicznie niedotkniętych próbek ryb. Możliwość zastosowania metody nie ogranicza się zatem wyłącznie do śledzenia zakażeń, ponieważ może ona również dostarczyć informacji o potencjalnym znaczeniu, np. dla opracowania szczepionki, oceny ryzyka i utrzymania krajowej bioasekuracji. Jest on obecnie aktywnie wykorzystywany w Norweskim Instytucie Weterynaryjnym jako narzędzie do badania diagnoz Y. ruckeri w norweskiej akwakulturze.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
22° C/15° Inkubator C	Zgodnie z preferencjami.	Podkład
5', 10K PMOL, odsolony, suchy	Thermo Fisher Scientific	450007	sekwencje i oznakowanie w tabeli 1. Przygotuj robocze elementy w buforze TE.
Agaroza, uniwersalna, peqGOLD	VWR	732-2789P/732-2788	Stosowana podczas elektroforezy żelowej.
Analizator genetyczny Avant 3500xL	Thermo Fisher Scientific	A30469	Służy do analizy fragmentów elektroforezy kapilarnej.
Moduły BioNumerics7	Matematyka stosowana	NA	Służy do generowania minimalnych drzew rozpinających na podstawie danych MLVA.
Wirówka(y)	Zgodnie z preferencjami.	NA
DNA Oligo, 25N, odsolone, suche	Thermo Fisher Scientific	A15612	w tabeli 1. Przygotuj robocze elementy w buforze TE.
DNA Gel Loading Dye (6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611	Barwnik ładujący stosowany podczas elektroforezy żelowej.
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 ml	Eppendorf	30120086	Probówki wirówkowe używane podczas ekstrakcji DNA.
Zamrażarka	według preferencji.	Dygestoria NA
	Preferowane.	NA
System elektroforezy żelowej	Zgodnie z preferencjami.	NA
GelRed Nucleic Acid Stain, 10 000X w wodzie	Biotium	41003	Fluorescencyjny barwnik kwasu nukleinowego stosowany podczas elektroforezy żelowej.
Oprogramowanie GeneMapper 5	Thermo Fisher Scientific	4475073	Służy do odczytu elektroferogramów z elektroforezy kapilarnej.
GeneRuler 50 bp DNA Ladder, gotowa do użycia	Thermo Fisher Scientific	SM0373	stosowana podczas elektroforezy żelowej.
GeneScan 600 LIZ Rozmiar barwnika Standard v2.0	Thermo Fisher Scientific	4408399	Wzorzec wielkości stosowany podczas elektroforezy kapilarnej.
Blok grzewczy	Zgodnie z preferencjami.	NA
Hi-Di Formamid	Thermo Fisher Scientific	4311320/4440753	Dejonizowany formamid stosowany podczas elektroforezy kapilarnej. Przygotuj płyny robocze.
Woda Milli-Q	NA	NA	Oczyszczona woda używana podczas PCR i elektroforezy kapilarnej. Standardowa receptura; produkowane we własnym zakresie.
Multipleks PCR  Plus  Zestaw	Qiagen	206151/206152
Termocykler PCR	Preferowany.	Polimer NA
POP-7 do analizatorów genetycznych 3500 Dx/3500xL Dx	Thermo Fisher Scientific	A26077/4393713/4393709	Matryca separacyjna stosowana podczas elektroforezy kapilarnej.
Czysta kultura Yersinia ruckeri	NA	NA	Np. kriokonserwowana lub świeża.
Woda wolna od RNaz	Qiagen	NA	In: Multiplex PCR  Plus  Zestaw
Tris-borate-EDTA (TBE)  bufor	NA	NA	Standardowa receptura; wyprodukowany we własnym zakresie.
Trypsyna agar sojowy/agar z krwią bydlęcą	NA	NA Standardowa	receptura; produkowana we własnym zakresie.
System obrazowania/wizualizacji żelu na bazie UV	Zgodnie z preferencjami.	NA
Vortexer	Zgodnie z preferencjami.	nie