Artykuł metodologiczny

Ocena liczebności synaps za pomocą elektrofizjologii patch-clamp całkowych

DOI:

10.3791/59461

⸱

23 kwietnia 2019

 , 
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół oceny funkcjonalnej wielości synaps za pomocą elektrofizjologii klamrów całokomórkowych w ostrych wycinkach mózgu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ośrodkowym układzie nerwowym, para neuronów często tworzy wiele kontaktów synaptycznych i/lub funkcjonalnych miejsc uwalniania neuroprzekaźników (mnogość synaptyczna). Mnogość synaps jest plastyczna i zmienia się w trakcie rozwoju i w różnych warunkach fizjologicznych, będąc ważnym wyznacznikiem skuteczności transmisji synaptycznej. W tym miejscu przedstawiamy eksperymenty mające na celu oszacowanie stopnia wielości synaps kończących się na danym neuronie postsynaptycznym za pomocą elektrofizjologii klamrów łatkowych całych komórek w ostrych wycinkach mózgu. W szczególności zapis cęgowy napięcia służy do porównania różnicy między amplitudą spontanicznych pobudzających prądów postsynaptycznych (sEPSC) a miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych (mEPSC). Teoria stojąca za tą metodą polega na tym, że aferentne wejścia, które wykazują wielokrotność, będą wykazywać duże, zależne od potencjału czynnościowego sEPSC ze względu na synchroniczne uwalnianie, które zachodzi przy każdym kontakcie synaptycznym. W przeciwieństwie do tego, uwalnianie niezależne od potencjału czynnościowego (które jest asynchroniczne) będzie generować mEPSC o mniejszej amplitudzie. W artykule przedstawiono zestaw eksperymentów i analiz mających na celu scharakteryzowanie istnienia wielości synaptycznej oraz omówiono wymagania i ograniczenia tej techniki. Technika ta może być zastosowana do zbadania, w jaki sposób różne interwencje behawioralne, farmakologiczne lub środowiskowe in vivo wpływają na organizację kontaktów synaptycznych w różnych obszarach mózgu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transmisja synaptyczna jest podstawowym mechanizmem komunikacji między neuronami, a co za tym idzie, funkcjonowania mózgu. Przekaźnictwo synaptyczne jest również labilne i może zmieniać swoją skuteczność w sposób zależny od aktywności, a także w odpowiedzi na sygnały modulacyjne1. W związku z tym badanie funkcji synaptycznych było kluczowym celem badań neurobiologicznych. Elektrofizjologia z klamrą krosową całych komórek jest wszechstronną techniką, która pozwala nam zrozumieć, poprzez opracowywanie projektów eksperymentalnych i analiz danych, dogłębne biofizyczne i molekularne mechanizmy transmisji synaptycznej. Powszechnie stosowanym podejściem, być może ze względu na prostotę techniki i koncepcji, jest pomiar miniaturowych pobudzających/hamujących prądów postsynaptycznych (mE/IPSC) w konfiguracji cęgów napięciowych2,3,4,5,6. Poszczególne mPSC reprezentują przepływ jonów przez postsynaptyczne receptory jonotropowe (np. receptory AMPA i GABAA) w odpowiedzi na wiązanie odpowiednich neuroprzekaźników uwalnianych z zakończenia presynaptycznego 7. Ponieważ zapis uzyskuje się w obecności bramkowanego napięciem tetrodotoksyny blokującej kanał N + (TTX), uwolnienie jest niezależne od potencjału czynnościowego i zwykle obejmuje pojedynczy pęcherzyk synaptyczny, który zawiera neuroprzekaźnik. Opierając się na tym założeniu, średnia amplituda mPSC jest szeroko stosowana jako przybliżone oszacowanie wielkości kwantowej, która reprezentuje liczbę i funkcjonalność receptorów postsynaptycznych przeciwstawnych do pojedynczego miejsca uwolnienia. Z drugiej strony, uważa się, że częstość występowania mPSC stanowi kombinację całkowitej liczby synaps kończących się na komórce postsynaptycznej i ich średniego prawdopodobieństwa uwolnienia. Jednak parametry te nie mierzą innej zmiennej - wielości synaps lub mnogości synaptycznej - co jest ważne dla skuteczności transmisji synaptycznej.

Na podstawie kwantowej teorii transmisji synaptycznej7,8,9, siła danego połączenia między parą neuronów zależy od trzech czynników: liczby funkcjonalnych synaps (N), postsynaptycznej odpowiedzi na uwolnienie pojedynczego pęcherzyka synaptycznego (wielkość kwantowa; Q) i prawdopodobieństwo uwolnienia neuroprzekaźników (Pr). Wielość synaptyczna jest równoważna N. Rozwój wielości synaptycznej lub przycinanie synaps multiplikatywnych jest plastyczny w trakcie rozwoju i w różnych stanach chorobowych3,4,6,10. Z tego powodu scharakteryzowanie wielości synaps ma ważne implikacje dla zrozumienia skuteczności transmisji synaptycznej w zdrowiu i chorobie. Techniki, takie jak mikroskopia elektronowa, mogą zidentyfikować strukturalne dowody wielości synaptycznej poprzez wykrycie wielu kontaktów synaptycznych pochodzących z tego samego aksonu do tego samego neuronu postsynaptycznego11,12,13,14. Jednak te strukturalnie zidentyfikowane multisynapsy mogą być funkcjonalnie ciche15,16. Precyzyjne badanie funkcjonalne N wymaga technicznie trudnych podejść elektrofizjologicznych, takich jak sparowane zapisy całych komórek, które mogą określić, czy dane połączenie ma wiele funkcjonalnych miejsc uwalniania, oraz podejścia oparte na minimalnej stymulacji, które mają na celu rekrutację pojedynczego przypuszczalnego aksonu.

W tym protokole opisujemy prostą metodę szacowania wielości synaptycznej, przyjmując metodę pierwotnie opracowaną przez Hsia et al2. Technika ta polega na pomiarze spontanicznych PSC (sPSC) i mPSC za pomocą elektrofizjologii klamrów krosowych całych komórek, co pozwala nam oszacować stopień mnogości synaptycznej we wszystkich wejściach do danego neuronu. Zgodnie z wcześniejszą definicją, mnogość synaptyczna odzwierciedla liczbę synaps między danym neuronem pre- i postsynaptycznym. Jeśli wiele synaps jest rekrutowanych synchronicznie przez potencjał czynnościowy, istnieje duże prawdopodobieństwo sumowania czasowego poszczególnych (tj. kwantowych) PSC, generując PSC o większej amplitudzie. W zapisach mPSC (w których potencjały czynnościowe są blokowane przez TTX), prawdopodobieństwo sumowania czasowego poszczególnych (niesynchronicznych) mPSC jest niskie. Korzystając z tego rozumowania, mnogość synaps można oszacować, porównując amplitudę sPSC (z uwalnianiem zależnym od potencjału czynnościowego) z amplitudą mPSC.

Aby zbadać istnienie mnogości, opisujemy cztery eksperymenty i ich analizy na przykładzie glutaminergicznego EPSC. Jednak to samo podejście można zastosować do szybkiej transmisji GABA-ergicznej/glicynergicznej (IPSC). Poniżej znajduje się krótkie uzasadnienie każdego eksperymentu. Po pierwsze, jak wyjaśniono powyżej, mnogość synaps można oszacować, porównując amplitudę sEPSC z mEPSC. Istnieją dwa wymagania dotyczące tego podejścia; 1) aksony presynaptyczne muszą wystrzelić wystarczającą liczbę potencjałów czynnościowych podczas rejestracji, oraz 2) Pr musi być wysoki, aby wiele synaps uwalniało neuroprzekaźnik po nadejściu potencjału czynnościowego. Aby spełnić te wymagania, sEPSC są najpierw rejestrowane w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym o niskiej zawartościCa2+ (aCSF), a następnie rejestrowane w obecności niskiego stężenia antagonisty kanału K +, 4-aminopirydyny (4-AP) w celu zwiększenia potencjału czynnościowego wyzwalania iP r. Następnie wyzwalanie potencjału czynnościowego jest blokowane przez TTX i Pr zmniejszane przez bramkowany napięciem bloker kanałów Ca2+ Cd2+. Amplituda sEPSC (z 4AP) jest porównywana z amplitudą mEPSC (z 4AP, TTX i Cd2+). W drugim eksperymencie Ca2+ jest zastępowany przez równomolowy Sr2+ w aCSF w celu desynchronizacji uwalniania pęcherzyków. Ponieważ Ca2+ jest wymagany do synchronicznego uwalniania pęcherzyków, zastąpienie Sr2+ powinno wyeliminować sEPSC o dużej amplitudzie, które wskazują na mnogość. Po trzecie, mechanistycznie rzecz biorąc, mnogość może wynikać albo z wielu kontaktów synaptycznych z tym samym neuronem postsynaptycznym, albo z uwolnienia wielopęcherzykowego (tj. wielu pęcherzyków uwolnionych w ramach jednego kontaktu synaptycznego)17,18. Aby rozróżnić te dwa typy wielości, w trzecim eksperymencie wykorzystano nisko powinowactwo, szybko dysocjujący konkurencyjnego antagonistę receptorów AMPA, γ-D-glutamyloglicynę (γ-DGG)17,18 w celu określenia, czy duże sEPSC są wynikiem czasowego sumowania niezależnych synaps, czy też uwalniania wielopęcherzykowego działającego na nakładającą się populację receptorów postsynaptycznych. Jeśli zdarzenia o dużej amplitudzie wynikają z uwolnienia wielopęcherzykowego, γ-DGG będzie mniej skuteczny w hamowaniu większych w porównaniu z mniejszymi sEPSC, podczas gdy duże sEPSC, które powstają w wyniku czasowego sumowania wielu kontaktów synaptycznych, będą podobnie dotknięte γ-DGG. W czwartym eksperymencie zastosowano bardziej fizjologiczną metodę w celu zwiększenia wyzwalania potencjału czynnościowego, a mianowicie aferentną stymulację synaptyczną. Wybuchy aktywności synaptycznej mogą przejściowo zwiększać/ułatwiać spontaniczne wyzwolenie potencjału czynnościowego i prawdopodobieństwo uwolnienia stymulowanych aferentów. Dlatego takie podejście pozwala wielości manifestować się w bardziej fizjologiczny sposób.

Poniższy protokół opisuje metodę przeprowadzania tych eksperymentów na tkance podwzgórza myszy. W szczególności stosuje się neurony hormonu uwalniającego kortykotropinę (CRH) jądra przykomorowego podwzgórza (PVN). Opisujemy procedury przeprowadzania elektrofizjologii z klamrą krosową całych komórek i wyjaśniamy konkretne eksperymenty do testowania wielości synaptycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzane przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Zachodniego Ontario zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (AUP#2014-031).

1. Rozwiązania

  1. Roztwór do krojenia
    1. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem roztworu do krojenia.
    2. Przygotować wcześniej 20-krotny roztwór podstawowy i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    3. Aby uzyskać 1x roztwór do krojenia, rozpuść NaHCO3, glukozę i sacharozę w ddH2O i dodaj 20x bulion. Upewnij się, że osmolarność mieści się w przedziale 315-320 mOsm i przechowuj roztwór nie dłużej niż 1 tydzień w temperaturze 4 °C.
    4. Napełnij dwie zlewki 100 ml roztworu do krojenia i przykryj je parafilmem. Schłodzić roztwór w zamrażarce, aż roztwór częściowo zamarznie (około 20 minut w zamrażarce w temperaturze -80 °C). Za pomocą rurki dyspersyjnej gazu, bąbelkować obie zlewki roztworu do krojenia z 95% O2/5% CO2 przez 20 minut na lodzie.
Rozdział
Stężenia roztworu (mM)
KrojenieNormalny aCSFNiska zawartość Ca2+ aCSFSr+ aCSFPipeta/Wewnętrzna
Zawartość NaClRozdział 87126 Rozdział 126126 Rozdział 126126 Rozdział 126-
KclRozdział 2.5Rozdział 2.5Rozdział 2.5Rozdział 2.58
CaCl20,5Rozdział 2.50,5--
SrCl2---Rozdział 2.5-
MgCl271,5Rozdział 2.51,5cyfra arabska
NaH2PO4Wydanie orzeczenia 1,25Wydanie orzeczenia 1,25Wydanie orzeczenia 1,25Wydanie orzeczenia 1,25-
NaHCO325262626-
glukoza25101010-
sacharoza75----
K-glukonian----Rozdział 116
Na-glukonian----12
HEPESY----10
K2-EGTA----1
Protokół K2ATP----4
Na3GTP----0,3

Tabela 1: Skład różnych rozwiązań.

  1. aCSF (do odzyskiwania i konserwacji plasterków)
    1. Skład aCSF znajduje się w tabeli 1.
    2. Przygotować wcześniej 20-krotny roztwór podstawowy i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    3. W przypadku 1x aCSF rozpuść NaHCO3 i glukozę w ddH2O i dodaj 20x bulion. Upewnij się, że osmolarność mieści się w zakresie 298-300 mOsm. Roztwór należy zużyć w ciągu 1 dnia.
  2. aCSF (niski poziom Ca2+ do nagrywania)
    1. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem niskiego Ca2+ aCSF.
    2. Przygotować wcześniej 20-krotny roztwór podstawowy i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    3. Aby uzyskać 1x niski poziom Ca2 + aCSF, rozpuść NaHCO3 i glukozę w ddH2O i dodaj 20x (wolne od CaCl2 i MgCl2) zapasy, CaCl2 i MgCl2 do określonych stężeń. Upewnij się, że osmolarność mieści się w przedziale 298-300. Roztwór należy zużyć w ciągu 1 dnia.
  3. aCSF (Sr2+ do nagrywania)
    1. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem Sr2+ aCSF.
    2. Przygotować wcześniej 20-krotny roztwór podstawowy i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    3. Dla 1x Sr2+ aCSF rozpuścićNaHCO3 i glukozę w ddH2O i dodać 20x (wolne od CaCl2 i MgCl2) zapasy, SrCl2 i MgCl2 do określonych stężeń. Upewnij się, że osmolarność mieści się w przedziale 298-300. Roztwór należy zużyć w ciągu 1 dnia.
  4. Rozwiązanie wewnętrzne
    1. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem roztworu wewnętrznego na bazie K-glukonianu.
    2. Aby przygotować 20 ml roztworu wewnętrznego, dodaj 15 ml wody klasy biologii molekularnej do probówki o pojemności 50 ml. Kolejne kroki wykonuj na lodzie.
    3. Przygotuj następujące roztwory z wyprzedzeniem do 1 M stężeń podstawowych w wodzie klasy biologii molekularnej. Dodać (w ml): 2,32 K-glukonianu, 0,24 Na-glukonianu, 0,20 HEPES, 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0,04 MgCl2 do probówki o pojemności 50 ml.
    4. Dodać 100 μL 0,3 M Na3GTP.
    5. Odważyć 44,08 mg K2ATP w probówce mikrowirówki o pojemności 2 ml i dodać 1 ml wody klasy biologii molekularnej, a następnie dodać do probówki o pojemności 50 ml.
    6. Dostosować pH do 7,2-7,4 za pomocą 1 M KOH. Upewnij się, że osmolarność mieści się w zakresie 283-289 mOsm.

2. Przygotowanie plastra

  1. Przygotowywanie narzędzi
    1. Dodać 200 ml aCSF do komory odzysku (zbudowanej ze zlewki o pojemności 250 ml z 4 studzienkami i siatką) i umieścić komorę odzysku w łaźni wodnej (35 °C).
    2. Przykryj komorę folią parafinową i stale bąbelkuj aCSF 95% O2/5% CO2 za pomocą szklanej rurki dyspersyjnej przez co najmniej 20 minut.
    3. Przygotuj się do sekcji, ustawiając narzędzia (skalpel, cienkie nożyczki pod kątem, kleszcze, drobny pędzel, plastikowa łyżka).
    4. Napełnij strzykawkę o pojemności 60 ml około 15 ml lodowatego roztworu do krojenia z kroku 1.1.4.
    5. Przygotuj platformę preparacyjną, umieszczając bibułę filtracyjną na pokrywie płytki studzienki.
    6. Przygotuj komorę krojenia, umieszczając ją w tacce na lód i napełniając tackę lodem.
    7. Ustaw wibratom, zabezpieczając jednorazowe ostrze w uchwycie ostrza.
    8. Wykonaj pipetę transferową, łamiąc końcówkę pipety Pasteura i umieszczając gumową gruszkę na złamanym końcu.
  2. Sekcja mózgu myszy
    1. Znieczulenie zwierzęcia należy umieścić w komorze nasyconej 4% izofluranem, aż do braku odruchów rdzeniowych.
    2. Odetnij głowę zwierzęcia za pomocą gilotyny i szybko usuń mózg.
      1. Wykonaj nacięcie linii środkowej za pomocą ostrza skalpela nr 22 od rostralnego do ogonowego.
      2. Obudź bocznie skórę głowy z każdej strony głowy.
      3. Użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć czaszkę z jednej strony od ogona do rostralu (w tym z boku kości czołowych), uważając, aby nie uszkodzić mózgu.
      4. Użyj kleszczy, aby podnieść fragment czaszki z mózgu i szybko schłodzić mózg 15 ml lodowatego roztworu do krojenia za pomocą strzykawki z kroku 2.1.4.
      5. Wyjmij mózg z czaszki.
      6. Umieścić mózg w jednej ze zlewek wypełnionych lodowatym roztworem do krojenia (z kroku 1.1.4) z pęcherzykami 95% O2/5% CO2 .
  3. Przygotuj plastry podwzgórza myszy
    1. Zablokuj mózg dla pożądanego obszaru mózgu i kąta cięcia (np. W przypadku wycinków koronalnego podwzgórza odetnij tkankę rostralną do skrzyżowania wzrokowego i ogonową do mostu za pomocą ostrza i upewnij się, że blok ogonowy ma płaską powierzchnię prostopadłą do podstawy mózgu).
    2. Za pomocą wyciętego kawałka bibuły filtracyjnej podnieś mózg od przedniej strony i przyklej tylną stronę do płytki mocującej za pomocą kleju błyskawicznego.
    3. Szybko umieść płytkę mocującą w komorze krojenia i napełnij komorę roztworem do krojenia z drugiej zlewki w kroku 1.1.4.
    4. Zabezpiecz komorę krojenia i tackę na lód na wibratomie.
    5. Określ obszar krojenia (przed i z tyłu mózgu) i rozpocznij krojenie plastrów koronalnych o grubości 250 μm. Zalecane parametry: prędkość 0,10 mm/s, amplituda 2 mm.
    6. Przytnij plastry do odpowiedniego rozmiaru dla pożądanego obszaru mózgu.
    7. Odzyskaj plastry w temperaturze 35 °C przez 30-45 minut. Następnie wyjmij komorę odzyskiwania z kąpieli rozgrzewającej i pozwól plastrom zregenerować się w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 30 minut. Trzymaj plastry w temperaturze pokojowej przez resztę dnia i kontynuuj ciągłe bąbelkowanie kąpieli 95% O2/5% CO2 .

3. Nagrywanie krosowania całej komórki

  1. Wyciągnij pipety z plastrem
    1. Korzystając z parametrów sugerowanych przez instrukcję obsługi ściągacza do pipet, należy wyciągnąć pipety krosowe z grubościennego szkła do oporu 3-5 MΩ.
    2. Za pomocą mikrostrzykawki (dostępnej w ofercie lub domowej roboty) napełnij końcówkę pipety przefiltrowanym roztworem wewnętrznym. Aby zrobić mikrostrzykawkę, spal końcówkę strzykawki o pojemności 1 ml i pozwól, aby końcówka opadła, tworząc długą, cienką końcówkę.
  2. Uzyskaj konfigurację całej komórki
    1. Umieść pipetę rejestrującą tuż nad plasterkiem i zrównoważ prąd pipety w trybie cęgów napięcia. Zastosuj lekkie nadciśnienie w pipecie i zablokuj kurek.
    2. Wybierz zdrową komórkę z nienaruszoną błoną i zbliż się do komórki za pomocą pipety. Nadciśnienie powinno powodować niewielkie zaburzenie w tkance (tj. powolną falę w tkance przy wejściu).
    3. Powoli zbliżaj pipetę do celi, wykonując ruchy ukośne, aż pipeta utworzy małe wgłębienie na powierzchni komórki.
    4. Zwolnij blokadę nadciśnienia. Ogniwo zacznie tworzyć uszczelnienie, a rezystancja wzrośnie powyżej 1 GΩ. W zacisku napięciowym utrzymuj ogniwo na poziomie -68 mV.
    5. Lekko odciągnij od ogniwa po przekątnej, aby usunąć nadmierne ciśnienie z ogniwa.
    6. Kompensacja pojemności pipet szybkich i wolnych.
    7. Zastosuj krótkie odsysanie przez rurkę podłączoną do uchwytu pipety, aby przebić się przez kuwetę i uzyskać konfigurację całej komórki.
    8. Przełącz na tryb Cell w oknie testu membranowego w oprogramowaniu do akwizycji i analizy danych elektrofizjologicznych (np. Clampex).
    9. Przed każdym zapisem cęgów napięcia należy wykonać test membrany przy użyciu tego samego oprogramowania i zapisać odpowiednie parametry w książce laboratoryjnej (rezystancja membrany, rezystancja dostępu i pojemność).
    10. Utrzymuj temperaturę kąpieli rejestrującej na poziomie 27–30 °C, a natężenie przepływu na poziomie 1,5–2,0 ml/min do kolejnych eksperymentów.

4. Eksperymenty z wielością

  1. Eksperyment 1: szacowanie liczebności za pomocą 4-AP
    1. W zacisku napięciowym utrzymuj ogniwo na poziomie -68 mV. Korzystając z tego samego oprogramowania, zapisz sEPSC podczas perfuzji kąpieli z niskim Ca2+ aCSF. Zapisuj przez co najmniej 5 minut po rozpoczęciu konfiguracji całej komórki, aby zapewnić stabilny zapis linii podstawowej, ponieważ aktywność synaptyczna może być wysoka wkrótce po przebiciu błony.
    2. Za pomocą mikropipety dodać 4-AP do aCSF i zastosować w kąpieli 30 μM 4-AP. Rejestrować sEPSC przez co najmniej 10 minut, aby uzyskać pełny efekt leku.
    3. Dodaj 0,5 μM TTX i 10 μM Cd2+ do aCSF za pomocą 4-AP i rejestruj mEPSC przez co najmniej 10 minut.
    4. Do analizy offline należy wykorzystać ostatnią 1 minutę linii bazowej bezpośrednio przed zastosowaniem 4-AP (w niskim Ca2+ aCSF), 10 minutę aplikacji 4-AP i 10 minutę aplikacji TTX.
  2. Eksperyment 2: desynchronizacja uwalniania pęcherzyków za pomocą Sr2+
    1. Podczas perfuzji kąpieli z normalnym Ca2+ aCSF (takim samym jak w kąpieli aCSF) rejestruj sEPSC przez co najmniej 5 minut.
    2. Przełącz się z normalnego Ca2+ aCSF i rozpocznij perfuzję Sr2+ aCSF (od kroku 1.4) i zapisz sEPSC.
    3. W przypadku analizy offline, aby określić, czy sEPSC o dużej amplitudzie są spowodowane synchronicznym uwalnianiem pęcherzyków, porównaj ostatnią 1 minutę linii podstawowej (w normie aCSF) z 10. minutą aplikacji Sr2+ aCSF.
  3. Eksperyment 3: test na uwolnienie wielopęcherzykowe za pomocą γ-DGG
    1. W niskim Ca2+ aCSF rejestruj sEPSC przez co najmniej 5 minut.
    2. Dodać 30 μM 4-AP do aCSF przez system perfuzyjny. Zapisuj sEPSC przez co najmniej 10 minut.
    3. Dodać 200 μM γ-DGG do aCSF za pomocą 4-AP i rejestrować sEPSC przez co najmniej 10 minut.
    4. W ramach eksperymentu kontrolnego w oddzielnej komórce wykonaj kroki 1-3, ale zastosuj niskie stężenie (125 nM) DNQX zamiast γ-DGG.
    5. W przypadku analizy offline przeanalizuj ostatnią minutę każdej aplikacji leku.
  4. Eksperyment 4: Stymulowanie wejść aferentnych w celu zwiększenia wyzwalania potencjału czynnościowego.
    1. Nagrywaj sEPSC w normalnym Ca2+ aCSF.
    2. Stymulować aferenty za pomocą monopolarnej elektrody szklanej wypełnionej płynem CSF z częstotliwością 20 Hz przez 2 sekundy i powtórzyć 10 razy z odstępem między impulsami wynoszącym 20 sekund.
    3. Do analizy użyj 5,000 ms przed pierwszym bodźcem jako punktu odniesienia i porównaj z 10-300 ms po ostatnim bodźcu, a następnie weź średnią zmianę amplitudy i częstotliwości w 10 próbach.

5. Analiza

  1. Analizuj sEPSC i mEPSC za pomocą programu, który wykrywa i analizuje prądy synaptyczne (np. oprogramowanie Mini Analysis).
    1. Korzystając z tego oprogramowania, użyj sugerowanych parametrów wykrywania receptora AMPA EPSC (lub EPSC receptora GABA w przypadku rejestrowania prądów hamujących).
    2. Użyj funkcji analizy non-stop, aby wykryć EPSC w nagraniu.
    3. Ręcznie skanuj każde nagranie, aby upewnić się, że program dokładnie wykrywa każde zdarzenie (np. upewnij się, że zdarzenia nie są pomijane lub liczone dwukrotnie).
    4. Wyeksportuj dane zdarzenia, kopiując je do schowka i wklejając do oprogramowania do zarządzania danymi (np. Excel)
    5. Należy obliczyć średnią częstotliwość i/lub amplitudę dla każdego leczenia farmakologicznego i przeprowadzić odpowiednie analizy statystyczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższy protokół opisuje metodę wykorzystania elektrofizjologii klamer całokomórkowych do zbadania stopnia mnogości synaptycznej, na przykładzie neuronów podwzgórza myszy. Ta technika przygotowania plastrów powinna dać zdrowe, żywotne komórki, które nie mają spuchniętej błony lub jądra (ryc. 1). Każdy krok w protokole jest ważny dla zdrowia tkanki i jakości nagrań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z ważnych warunków udanego eksperymentu elektrofizjologii z zaciskiem krosowym jest uzyskanie zdrowych plasterków/komórek. Opisany przez nas protokół jest zoptymalizowany pod kątem wycinków podwzgórza, które zawierają neurony PVN. Inne obszary mózgu mogą wymagać zmodyfikowanych roztworów i metod krojenia 21,22,23,24. W przypadku nagrywania bardzo ważne jest, aby akceptować tylko stabilne...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.S. otrzymał stypendium dla absolwentów Ontario. W.I. otrzymał stypendium dla nowych badaczy od Mental Health Research Canada. Prace te są wspierane przez granty operacyjne dla W.I. z Kanadyjskiej Rady ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (06106-2015 RGPIN) oraz Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (PJT 148707).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlBD309659
10 ostrzyFisher Scientific/inne35698
22 ostrzaVWR/inne21909-626
22 μ Filtry strzykawkowe MMilipore09-719-000
Adson forecepsHarvard Instruments72-8547
Ostre nożyczki kątoweHarvard Instruments72-8437
ClampexMolecular DevicespClamp 10
Ostrze z podwójną krawędziąVWR74-0002
Bibuła filtracyjnaSigma/inne1001090
Drobny pędzelFisher/różne15-183-35/różne
Rurka dyspersyjnagazu VWRLG-8680-120
IsofluraneFresenius Kabi/inneM60303
Krazy klejróżneróżne
Mini analizaSynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor IncModel 5600
ParafilmSigmaPM-996
Pipeta PasteuraMiernik pH VWR14672-200
Mettler ToledoFE20-ATC
Gruszka VWR82024-550
Rękojeść skalpela nr 3Harvard Instruments72-8350
Rękojeść skalpela nr 4Harvard Instruments72-8356
Ostrze jednoostrzoweVWR55411-050
Krajalnica VibratomeSystem
MilliporeMilli-Q Academic A10
Pokrywa płytki studziennejFisher/różne07-201-590/różne
Chemikalia/odczynniki
Sondy molekularne
CaCl2*2H2OSigmaC7902
CdCl2sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
glukozaSigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-glukonianSigmaG4500
MgCl2*6H2OSigmaM2670
Klasa biologii molekularnej wodaSigmaW4502-1L
Na3GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
Na-glukonianSigmaS2054
NaH2PO4Sigma71504
NaHCO3SigmaS6014
PikrotoksynasigmaP1675
SrClSigma255521
sacharozaBioshopSUC507.1
TTXAlamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1
oczyszczania wody Leica VT1200S 4-AP Sigma 275875 BAPTA B1204

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).
  3. Zhan, Y., et al. Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior. Nature neuroscience. 17 (3), 400-406 (2014).
  4. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science (New York, N.Y). 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  5. Schrader, L. A., Tasker, J. G. Presynaptic Modulation by Metabotropic Glutamate Receptors of Excitatory and Inhibitory Synaptic Inputs to Hypothalamic Magnocellular Neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (2), 527(1997).
  6. Salter, E. W., Sunstrum, J. K., Matovic, S., Inoue, W. Chronic stress dampens excitatory synaptic gain in the paraventricular nucleus of the hypothalamus. The Journal of Physiology. 596 (17), 4157-4172 (2018).
  7. Redman, S. Quantal analysis of synaptic potentials in neurons of the central nervous system. Physiological Reviews. 70 (1), 165-198 (1990).
  8. Del Castillo, J., Katz, B. Quantal components of the end-plate potential. The Journal of physiology. 124 (3), 560-573 (1954).
  9. Stevens, C. F. Quantal release of neurotransmitter and long-term potentiation. Cell. 72 Suppl, 55-63 (1993).
  10. Deger, M., Helias, M., Rotter, S., Diesmann, M. Spike-timing dependence of structural plasticity explains cooperative synapse formation in the neocortex. PLoS computational biology. 8 (9), e1002689(2012).
  11. van den Pol, A. N., Wuarin, J. P., Dudek, F. E. Glutamate, the dominant excitatory transmitter in neuroendocrine regulation. Science (New York, N.Y). 250 (4985), 1276-1278 (1990).
  12. Miklós, I. H., Kovács, K. J. Reorganization of synaptic inputs to the hypothalamic paraventricular nucleus during chronic psychogenic stress in rats. Biological Psychiatry. 71 (4), 301-308 (2012).
  13. Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science (New York, N.Y.). 213 (4510), 898-901 (1981).
  14. Tracey, D. J., Walmsley, B. Synaptic input from identified muscle afferents to neurones of the dorsal spinocerebellar tract in the cat. The Journal of physiology. 350, 599-614 (1984).
  15. Lin, J. W., Faber, D. S. Synaptic transmission mediated by single club endings on the goldfish Mauthner cell. II. Plasticity of excitatory postsynaptic potentials. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 8 (4), 1313-1325 (1988).
  16. Atwood, H. L., Tse, F. W. Changes in binomial parameters of quantal release at crustacean motor axon terminals during presynaptic inhibition. The Journal of physiology. 402, 177-193 (1988).
  17. Li, G. L., Keen, E., Andor-Ardó, D., Hudspeth, A. J., von Gersdorff, H. The unitary event underlying multiquantal EPSCs at a hair cell’s ribbon synapse. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (23), 7558-7568 (2009).
  18. Wadiche, J. I., Jahr, C. E. Multivesicular release at climbing fiber-Purkinje cell synapses. Neuron. 32 (2), 301-313 (2001).
  19. Oliet, S. H., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Bidirectional control of quantal size by synaptic activity in the hippocampus. Science (New York, N.Y.). 271 (5253), 1294-1297 (1996).
  20. Inoue, W., et al. Noradrenaline is a stress-associated metaplastic signal at GABA synapses. Nature Neuroscience. 16 (5), 605-612 (2013).
  21. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute Brain Slice Methods for Adult and Aging Animals: Application of Targeted Patch Clamp Analysis and Optogenetics. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 1183-242 (2014).
  22. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  23. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of neuroscience methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  24. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. Journal of neuroscience methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  25. Gunn, B. G., et al. Dysfunctional astrocytic and synaptic regulation of hypothalamic glutamatergic transmission in a mouse model of early-life adversity: relevance to neurosteroids and programming of the stress response. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19534-19554 (2013).
  26. Su, H., Alroy, G., Kirson, E. D., Yaari, Y. Extracellular calcium modulates persistent sodium current-dependent burst-firing in hippocampal pyramidal neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (12), 4173-4182 (2001).
  27. Frankenhaeuser, B., Hodgkin, A. L. The action of calcium on the electrical properties of squid axons. The Journal of physiology. 137 (2), 218-244 (1957).
  28. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A Comparison of Different Slicing Planes in Preservation of Major Hippocampal Pathway Fibers in the Mouse. Frontiers in neuroanatomy. 11, 107(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Synaptic MultiplicityWhole cell Patch clampSpontaneous EPSCsMiniature EPSCsAction Potential dependent ReleaseTTX Cadmium BlockadeStrontium ACSF ApplicationGamma DGG Antagonist TestAfferent Stimulation ProtocolAccess Resistance Monitoring

Powiązane artykuły