Method Article

Ocena liczebności synaps za pomocą elektrofizjologii patch-clamp całkowych

DOI:

10.3791/59461

⸱

April 23rd, 2019

 , 
1Neuroscience Program, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 2Robarts Research Institute, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół oceny funkcjonalnej wielości synaps za pomocą elektrofizjologii klamrów całokomórkowych w ostrych wycinkach mózgu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ośrodkowym układzie nerwowym, para neuronów często tworzy wiele kontaktów synaptycznych i/lub funkcjonalnych miejsc uwalniania neuroprzekaźników (mnogość synaptyczna). Mnogość synaps jest plastyczna i zmienia się w trakcie rozwoju i w różnych warunkach fizjologicznych, będąc ważnym wyznacznikiem skuteczności transmisji synaptycznej. W tym miejscu przedstawiamy eksperymenty mające na celu oszacowanie stopnia wielości synaps kończących się na danym neuronie postsynaptycznym za pomocą elektrofizjologii klamrów łatkowych całych komórek w ostrych wycinkach mózgu. W szczególności zapis cęgowy napięcia służy do porównania różnicy między amplitudą spontanicznych pobudzających prądów postsynaptycznych (sEPSC) a miniaturowych pobudzających prądów postsynaptycznych (mEPSC). Teoria stojąca za tą metodą polega na tym, że aferentne wejścia, które wykazują wielokrotność, będą wykazywać duże, zależne od potencjału czynnościowego sEPSC ze względu na synchroniczne uwalnianie, które zachodzi przy każdym kontakcie synaptycznym. W przeciwieństwie do tego, uwalnianie niezależne od potencjału czynnościowego (które jest asynchroniczne) będzie generować mEPSC o mniejszej amplitudzie. W artykule przedstawiono zestaw eksperymentów i analiz mających na celu scharakteryzowanie istnienia wielości synaptycznej oraz omówiono wymagania i ograniczenia tej techniki. Technika ta może być zastosowana do zbadania, w jaki sposób różne interwencje behawioralne, farmakologiczne lub środowiskowe in vivo wpływają na organizację kontaktów synaptycznych w różnych obszarach mózgu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transmisja synaptyczna jest podstawowym mechanizmem komunikacji między neuronami, a co za tym idzie, funkcjonowania mózgu. Przekaźnictwo synaptyczne jest również labilne i może zmieniać swoją skuteczność w sposób zależny od aktywności, a także w odpowiedzi na sygnały modulacyjne1. W związku z tym badanie funkcji synaptycznych było kluczowym celem badań neurobiologicznych. Elektrofizjologia z klamrą krosową całych komórek jest wszechstronną techniką, która pozwala nam zrozumieć, poprzez opracowywanie projektów eksperymentalnych i analiz danych, dogłębne biofizyczne i molekularne mechanizmy transmisji synaptycznej. Powszechnie stosowanym podejści....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzane przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Zachodniego Ontario zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (AUP#2014-031).

1. Rozwiązania

  1. Roztwór do krojenia
    1. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się ze składem roztworu do krojenia.
    2. Przygotować wcześniej 20-krotny roztwór podstawowy i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    3. Aby uzyskać 1x roztwór do krojenia, rozpuść NaHCO3, glukozę i sacharozę w ddH2O i dodaj 20x bulion. Upewnij się, że os....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższy protokół opisuje metodę wykorzystania elektrofizjologii klamer całokomórkowych do zbadania stopnia mnogości synaptycznej, na przykładzie neuronów podwzgórza myszy. Ta technika przygotowania plastrów powinna dać zdrowe, żywotne komórki, które nie mają spuchniętej błony lub jądra (ryc. 1). Każdy krok w protokole jest ważny dla zdrowia tkanki i jakości nagrań.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z ważnych warunków udanego eksperymentu elektrofizjologii z zaciskiem krosowym jest uzyskanie zdrowych plasterków/komórek. Opisany przez nas protokół jest zoptymalizowany pod kątem wycinków podwzgórza, które zawierają neurony PVN. Inne obszary mózgu mogą wymagać zmodyfikowanych roztworów i metod krojenia 21,22,23,24. W przypadku nagrywania bardzo ważne jest, aby akceptować tylko stabilne.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.S. otrzymał stypendium dla absolwentów Ontario. W.I. otrzymał stypendium dla nowych badaczy od Mental Health Research Canada. Prace te są wspierane przez granty operacyjne dla W.I. z Kanadyjskiej Rady ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (06106-2015 RGPIN) oraz Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (PJT 148707).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Strzykawka 1 mlBD309659
10 ostrzyFisher Scientific/inne35698
22 ostrzaVWR/inne21909-626
22 μ Filtry strzykawkowe MMilipore09-719-000
Adson forecepsHarvard Instruments72-8547
Ostre nożyczki kątoweHarvard Instruments72-8437
ClampexMolecular DevicespClamp 10
Ostrze z podwójną krawędziąVWR74-0002
Bibuła filtracyjnaSigma/inne1001090
Drobny pędzelFisher/różne15-183-35/różne
Rurka dyspersyjnagazu VWRLG-8680-120
IsofluraneFresenius Kabi/inneM60303
Krazy klejróżneróżne
Mini analizaSynaptosoftMiniAnalysis 6
OsmomoterWescor IncModel 5600
ParafilmSigmaPM-996
Pipeta PasteuraMiernik pH VWR14672-200
Mettler ToledoFE20-ATC
Gruszka VWR82024-550
Rękojeść skalpela nr 3Harvard Instruments72-8350
Rękojeść skalpela nr 4Harvard Instruments72-8356
Ostrze jednoostrzoweVWR55411-050
Krajalnica VibratomeSystem
MilliporeMilli-Q Academic A10
Pokrywa płytki studziennejFisher/różne07-201-590/różne
Chemikalia/odczynniki
Sondy molekularne
CaCl2*2H2OSigmaC7902
CdCl2sigma202908
DNQXTocris189
EGTASigmaE3889
glukozaSigmaG5767
HEPESSigmaH3375
K2-ATPSigmaA8937
KClSigmaP9333
K-glukonianSigmaG4500
MgCl2*6H2OSigmaM2670
Klasa biologii molekularnej wodaSigmaW4502-1L
Na3GTPSigmaG8877
NaClBioshopSOD001.1
Na-glukonianSigmaS2054
NaH2PO4Sigma71504
NaHCO3SigmaS6014
PikrotoksynasigmaP1675
SrClSigma255521
sacharozaBioshopSUC507.1
TTXAlamone LabsT-550
yDGGTocris6729-55-1
oczyszczania wody Leica VT1200S 4-AP Sigma 275875 BAPTA B1204

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abbott, L. F., Nelson, S. B. Synaptic plasticity: taming the beast. Nature Neuroscience. 3 (Supp), 1178-1183 (2000).
  2. Hsia, A. Y., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Development of Excitatory Circuitry in the Hippocampus. Journal of Neurophysiology. 79 (4), 2013-2024 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Synaptic MultiplicityWhole cell Patch clampSpontaneous EPSCsMiniature EPSCsAction Potential dependent ReleaseTTX Cadmium BlockadeStrontium ACSF ApplicationGamma DGG Antagonist TestAfferent Stimulation ProtocolAccess Resistance Monitoring

Related Articles