Zbieżna strategia generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z niereferencyjnych ostryg pacyficznych

Summary

Opisujemy strategię, jak używać próbek RNA z niepotwierdzonych próbek ostryg pacyficznych i oceniamy materiał genetyczny przez porównanie z publicznie dostępnymi danymi genomu w celu wygenerowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA.

Abstract

Dostęp do materiału biologicznego gatunków referencyjnych, które były wcześniej wykorzystywane w kluczowych eksperymentach, takich jak rozwój nowych linii komórkowych lub projekty sekwencjonowania genomu, są często trudne do zapewnienia dla dalszych badań lub stron trzecich ze względu na konsumpcyjny charakter próbek. Chociaż obecnie są szeroko rozpowszechnione na wybrzeżach Pacyfiku w Azji, Australii i Ameryce Północnej, poszczególne okazy ostryg pacyficznych są genetycznie dość zróżnicowane i dlatego nie nadają się bezpośrednio jako materiał wyjściowy dla bibliotek genów. W tym artykule demonstrujemy wykorzystanie niereferencyjnych próbek ostryg pacyficznych uzyskanych z regionalnych rynków owoców morza do generowania bibliotek cDNA. Biblioteki te zostały następnie porównane z publicznie dostępnym genomem ostryg, a najbliższa powiązana biblioteka została wybrana przy użyciu mitochondrialnych genów referencyjnych podjednostki I oksydazy cytochromu C (COX1) i dehydrogenazy NADH (ND). Przydatność wygenerowanej biblioteki cDNA wykazano również poprzez klonowanie i ekspresję dwóch genów kodujących enzymy dehydrogenazę kwasu glukuronowego UDP (UGD) i syntazę UDP-ksylozy (UXS), które są odpowiedzialne za biosyntezę UDP-ksylozy z UDP-glukozy.

Introduction

Pozyskanie żywego materiału biologicznego może być wyzwaniem ze względu na długie terminy dostaw, przedsiębiorcze uzasadnienie lub przepisy celne specyficzne dla danego kraju. Alternatywnie, wymagany materiał biologiczny może być również pobrany z fenotypowo identycznych próbek. Próbki te mogą się jednak znacznie różnić na poziomie genotypu, w związku z czym porównania z przechowywanymi cyfrowo genomami referencyjnymi tego samego gatunku są często trudne lub nawet daremne ze względu na niezgodność nowo pozyskanego materiału z istniejącymi metodami amplifikacji DNA. Sekwencjonowanie wysoce konserwatywnych genów poszczególnych próbek jest szeroko stosowanym i potężnym narzędziem do identyfikacji gatunków¹, takich jak konserwatywne geny mitochondrialne, które są często używane jako geny referencyjne do oceny jakości bibliotek cDNA^2,3,4,5,6. Podstawowym uzasadnieniem przedstawionej metody jest to, że wysoka zachowalność sekwencji genów mitochondrialnych w pojedynczych anonimowych próbkach ostryg w porównaniu z odpowiadającymi im sekwencjami genomu referencyjnego wskazuje, że inne geny mogą również wykazywać niski poziom rozbieżności, biorąc pod uwagę ogólnie szybsze tempo ewolucji mitochondrialnego DNA w stosunku do DNA jądrowego⁷, co pozwala na amplifikację i izolację szerokiego zakresu genów istotnych z naukowego i przemysłowego punktu widzenia poprzez proste wykorzystanie publicznie dostępnych danych sekwencjonowania jako punktu odniesienia.

Ogólnym celem opisanej tutaj metody jest przedstawienie zoptymalizowanego przepływu pracy do generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA ostryg, która może być użyta jako matryca DNA do klonowania genów ostryg. W sekwencjonowaniu wirtualnym sekwencjonowanie genomu de novo jest obchodzone; zamiast tego znana, przechowywana cyfrowo sekwencja referencyjna jest wykorzystywana bezpośrednio do wykorzystania lub zaprojektowania starterów do produkcji cDNA, które ostatecznie będą stanowić bibliotekę (lub zostaną dodane do wcześniej istniejącej). Celem jest stworzenie konwergentnej biblioteki cDNA, co oznacza, że podobieństwa między wygenerowanymi sekwencjami cDNA a sekwencją referencyjną można uszeregować od niskiej do wysokiej rozbieżności. Kluczową zaletą stosowania podjednostki 1 oksydazy cytochromu C (COX1) i dehydrogenazy NADH (ND) jako genów referencyjnych jest to, że nawet wysoce rozłączne geograficznie próbki ostryg mogą być profilowane ze względu na wysoką konserwację tych genów mitochondrialnych. Po sprawdzeniu podejścia za pomocą tych dobrze znanych markerów, demonstrujemy jego zastosowanie do dwóch kandydatów na enzymy, które biorą udział w biosyntezie nukleotydów cukrowych i mogą mieć znaczenie przemysłowe^8,9,10. Potencjał biotechnologiczny ostryg pacyficznych jest wciąż niezbadany. Dlatego uważamy, że ta zbieżna metoda przygotowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA będzie również odpowiednia dla niewyspecjalizowanych badaczy, którzy chcą wygenerować cDNA z tego odpowiedniego materiału biologicznego.

Protocol

UWAGA: Przegląd schematu jest pokazany w Rysunek 1.

1. Pobieranie próbek

1. Zdobądź próbki ostryg. Ostrygi należy przechowywać na lodzie w okresie po zbiorach, podczas transportu oraz przed użyciem laboratoryjnym i przetwarzaniem w ciągu 4-7 dni po zakupie.
   UWAGA: Na potrzeby tego protokołu ostrygi zakupiono na Zhong Cai Wholesale Market w Nankinie (pochodzącym z Ningde, Fujian, Chiny i Lianyungang, Jiangsu, Chiny), Haijie Aquatic Product Company w Qingdao (pochodzącym z Qingdao, Shandong, Chiny), Jucheng Aquatic Product Company w Yantai (pochodzącym z Yantai, Shandong, Chiny) i Jinxiu Aquatic Product Company w Qingdao (pochodzącym z Qingdao, Shandong, Chiny)).

2. Izolacja RNA przez ekstrakcję tiocyjanianem guanidyny i fenolem

1. Przygotowanie próbki tkanki ostrygi
   1. Wyciąć około 100 mg jednorodnej tkanki miękkiej z przybliżonego środka geometrycznego każdej próbki ostrygi za pomocą wysterylizowanego skalpela i przenieść próbki do ciekłego azotu.
   2. Pozostałą część ostryg należy poddać eutanazji poprzez zamrożenie w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę i wyrzucić jako odpady biologiczne.
   3. Zmielić zamrożoną tkankę ostrygi na drobny proszek w moździerzu (200 ml) wypełnionym 50 ml ciekłego azotu.
   4. Odważyć 75 mg zamrożonej tkanki z każdej próbki do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wymieszać z 1 ml odczynnika do ekstrakcji tiocyjanianianu guanidyny. Odwirować próbkę w temperaturze 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut.
2. Przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodać 200 μl chloroformu i dokładnie wymieszać za pomocą mieszalnika wirowego przez 10-15 s, aż mieszanina zmieni kolor na mlecznobiały.
3. Odwirować przy 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut i ostrożnie przenieść górną warstwę wodną za pomocą pipety o pojemności 200 μl, nie naruszając interfazy, do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
4. Dodać 500 μl alkoholu izopropylowego i delikatnie wymieszać próbki przez odwrócenie, a następnie pozostawić próbki na 20 minut na lodzie. Wirować przy 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 8 minut i usunąć supernatant.
5. Zawiesić każdy z granulek w 1 ml 75% EtOH i odwirować przy 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Usunąć cały supernatant.
6. Powtórz krok 2.5 raz. Suszyć granulki przez 6 minut w temperaturze pokojowej. Nie suszyć dłużej; w przeciwnym razie rozpuszczenie osadu RNA w następnym kroku może być trudne.
7. Rozpuść wysuszony granulat RNA w 25 μl wody uzdatnionej DEPC (dietylopirowęglanem) i trzymaj probówkę na lodzie. Próbki RNA należy zużyć w ciągu 24 godzin.

3. Generowanie biblioteki cDNA przez odwrotną transkrypcję

1. Dla każdej próbki RNA przygotować mieszaninę reakcyjną przy użyciu komercyjnego systemu odwrotnej transkrypcji przy użyciu pipety o pojemności 10 μl: Dodać 4 μL roztworu MgCl₂, 2 μL 10x buforu reakcyjnego, 2 μL roztworu dNTP, 0,5 μL inhibitora RNazy, 0,7 μL odwrotnej transkryptazy AMV, 0,5 μL startera Oligo(dT) 15, 1 μl wyekstrahowanej próbki RNA i 9,3 μl_H2Odo probówki PCR o pojemności 300 μl.
2. Inkubować mieszaninę w termocyklerze PCR przez 60 minut w temperaturze 42 °C, a następnie zwiększać temperaturę do 95 °C przez 5 minut.
3. Wygenerowaną bibliotekę cDNA należy przechowywać do 12 miesięcy w temperaturze -20 °C.

4. Amplifikacja i oczyszczanie genów mitochondrialnych

1. Przygotować mieszaninę do PCR za pomocą pipety o pojemności 10 μl. Dodać 0,25 μl (1,25 U) polimerazy DNA o wysokiej wierności, 2 μl roztworu dNTP (2,5 mM każdego dNTP), 0,5 μl startera COX1 lub ND forward (100 μM), 0,5 μl odpowiedniego startera odwrotnego COX1 lub ND (100 μM), 1 μl biblioteki cDNA, 5 μl 5x roztworu buforowego i 16 μl destylowanego_H2Odo 300 μ L Probówka do PCR.
2. Przeprowadzić amplifikację PCR, stosując następujące parametry: Po wstępnym etapie denaturacji w temperaturze 95 °C (czas trwania 5 min), 35 cyklach reakcji PCR składających się z etapu wyżarzania w temperaturze 55 °C (30 s), etapu wydłużania w temperaturze 72 °C (2 min) i etapu denaturacji w temperaturze 95 °C (30 s), należy wykonać jeden końcowy etap wydłużania przez 5 minut w temperaturze 72 °C.
3. Użyć 5 μl produktu PCR, aby zweryfikować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym jakość otrzymanego produktu PCR. Obserwuj amplifikowany gen COX1 lub ND jako pojedyncze prążek odpowiednio w 759 lub 748 parach zasad.
4. Oczyść pozostałą część produktu PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR.
   1. Dodać 100 μl roztworu "PCR-A" (bufor wiążący DNA, który zawiera wysokie stężenia soli chaotropowych11) do próbki. Krótko zmieszaj, aby wymieszać zawartość.
   2. Umieścić kolumnę oczyszczającą w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Odpipetować mieszaninę reakcyjną opisaną w ppkt 4.4.1. do kolumny. Wirować przy 14 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
   3. Wyrzucić filtrat z probówki wirówkowej. Umieścić kolumnę z powrotem w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml, dodać 700 μl roztworu "W2" do kolumny i odwirować przy 14 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej ("W2" jest roztworem płuczącym zawierającym wysokie stężenie etanolu w celu usunięcia pozostałości soli chaotropowych z kolumny oczyszczającej).
   4. Odrzucić filtrat i umieścić kolumnę z powrotem w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Dodać 400 μl roztworu "W2" do kolumny i odwirować przy 14 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
   5. Podgrzej 1 ml wody dejonizowanej do temperatury 65 °C w metalowym podgrzewaczu. Przenieść kolumnę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odpipetować 25 μl gorącej, wstępnie podgrzanej wody dejonizowanej o temperaturze 65 °C do środka białej membrany kolumny. Pozwól membranie moczyć się przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
   6. Wirować przy 14 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wyrzucić kolumnę.
5. Oczyszczony produkt PCR należy przechowywać do 12 miesięcy w temperaturze -20 °C.

5. Sekwencjonowanie i porównywanie genów mitochondrialnych

1. Wyślij oczyszczone próbki PCR z kroku 4.5 do sekwencjonowania Sangera przy użyciu odpowiednich starterów COX1 lub ND forward jako starterów sekwencjonowania. Opcjonalnie startery odwrotne COX1 lub ND mogą być również używane do sekwencjonowania dwukierunkowego.
2. Po pobraniu wyników sekwencjonowania porównaj sekwencje z sekwencją genomu referencyjnego szczepu ostryg pacyficznych (identyfikator taksonomii NCBI: 29159) za pomocą narzędzia online NCBI Nucleotide BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov) (Rysunek 2 i Rysunek 3).

6. Zastosowanie biblioteki cDNA do klonowania genów MgUGD i MgUXS

1. Amplifikować i oczyszczać geny MgUGD i MgUXS przy użyciu odpowiednich starterów do przodu i do tyłu MgUGD i MgUXS metodą PCR, wykonując kroki 4.1-4.4.
2. Przenieść 2 μl buforu wytrawiającego (10x zagęszczonego) i 6 μl wody dejonizowanej do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 10 μl oczyszczonych produktów MgUGD lub MgUXS PCR razem z endonukleazami restrykcyjnymi Nde I i Xho I (po 1 μl, 20 j.). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
3. Przygotuj wstępnie strawiony wektor pET-30a: Przenieś 500 ng wektora pET-30a do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i uzupełnij objętość do 16 μl za pomocą wody dejonizowanej. Dodać 2 μl buforu wytrawiającego (10x zagęszczonego) razem z endonukleazami restrykcyjnymi Nde I i Xho I (po 1 μL, 20 U).
   1. Po inkubacji mieszaniny w temperaturze 37 °C przez 3 godziny, dodać 1 μl fosfatazy alkalicznej (1 j.) i inkubować w temperaturze 37 °C przez dodatkową godzinę. Dezaktywować fosfatazę alkaliczną przez ogrzewanie w temperaturze 75 °C przez 10 minut w podgrzewaczu z metalowego bloku.
4. Przenieść 4 μl strawionych produktów DNA MgUGD lub MgUXS do świeżych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i dodać 4 μl strawionego wektora pET-30a. Dodać 1 μl buforu ligacyjnego (10x), 1 μl ligazy T4 (3 j.) i inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 22 °C przez 3 godziny.
5. Przekształć elektrokompetentne komórki E. coli Mach1 przez elektroporację przy użyciu produktów ligacji. Rozprowadzić przekształcone komórki na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
6. Sprawdź kolonie pod kątem pożądanej insercji przez sekwencjonowanie Sangera przy użyciu specyficznego dla plazmidu promotora T7 i starterów terminatora. Przygotuj plazmidy ze zwalidowanych klonów bakteryjnych.

7. Testy ekspresji i aktywności MgUGD i MgUXS

1. Przekształć kompetentne komórki E. coli BL21 (DE3) z plazmidami zawierającymi geny MgUGD i MgUXS i rozprowadź transformowane komórki na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg / ml kanamycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
2. Hoduj pojedynczą kolonię w podłożu 5 ml LB z 50 μg/ml kanamycyny przez noc. Przenieść kulturę do pożywki LB o pojemności 400 ml i ciągle wstrząsać z prędkością 200 obr./min w temperaturze 37 °C, aż gęstość optyczna przy długości fali 600 nm (OD₆₀₀) osiągnie absorpcję około 0,5.
   1. Zmniejszyć temperaturę inkubacji do 20 °C i dodać 400 μl izopropylu β-D-tiogalaktopiranozydu (stężenie 1 M). Indukować ekspresję rekombinowanych białek przez 3 godziny.
3. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 500 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić granulki w 10 ml buforu do lizy (100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 1% Triton X-100, 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF), pH 8,0).
4. Rozbijać komórki za pomocą sonikacji przez 20 minut (40 cykli włączania/wyłączania o amplitudzie 20 μm przez 15 s w temperaturze 4 °C). Wirować przy 14 000 x g w temperaturze 4°C przez 20 minut i zebrać supernatant do testu aktywności.
5. Przeprowadzić test aktywności MgUGD przez inkubację 2 μl lizatu komórkowego z 2 μl UDP-glukozy (10 mM), 4 μl NAD⁺ (10 mM), 4 μl MgCl₂ (10 mM), 2 μl buforu Tris/HCl (500 mM, pH 7,5) i 6 μl dejonizowanego_H2Ow nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
6. Przeprowadzić test aktywności MgUXS przez inkubację 2 μl lizatu komórkowego z 2 μl kwasu UDP-glukuronowego (10 mM), 2 μl buforu Tris/HCl (500 mM, pH 7,5) i 14 μl dejonizowanego_H2Ow nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
7. Stłumić reakcje w krokach 7.5 i 7.6, dodając do każdej mieszaniny 20 μl metanolu i 40 μl chloroformu. Po wirowaniu mieszanin próbek należy odwirować przy 14 000 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C i zebrać górną warstwę wodną każdej probówki.
8. Analizować produkty reakcji za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF w trybie jonizacji ujemnej w zakresie m/z od 500-700. Zmieszać 1 μl mieszaniny próbek z 1 μl matrycy próbki kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (1% m/v w 50% wodnym roztworze acetonitrylu). Obserwuj oczekiwane wartości m/z na poziomie 579 i 535 odpowiednio dla kwasu glukuronowego UDP i UDP-ksylozy (Rysunek 4).

Results

Rysunek 1 pokazuje schematyczny przegląd opisanej metody przygotowania biblioteki konwergentnych cDNA pochodzących od osobników ostryg pacyficznych. Rysunek 2 pokazuje sekwencje genów COX1 i ND daleko spokrewnionego okazu ostryg z dużą rozbieżnością od sekwencji genów COX1 i ND materiału referencyjnego. Rysunek 3 pokazuje sekwencje genów COX1 i ND blisko spokrewnionego okazu ostryg z małą rozbieżnością od sekwencji genów COX1 i ND materiału r...

Discussion

Przedstawiony protokół pozwala na identyfikację genetyczną niereferencyjnych okazów ostryg o podobnym fenotypie pochodzących z regionalnych targów owoców morza poprzez porównanie genów COX1 i ND z publicznie dostępną bazą danych genomu DNA ostryg. Znaczenie tej metody polega na jej prostocie, ponieważ do oceny wirtualnej biblioteki cDNA potrzebna jest tylko jedna reakcja PCR. Dwa konserwatywne mitochondrialne geny COX1 i ND amplifikowano z biblioteki cDNA, która została wygenerowana przez odwrotną transkrypcję ekstraktów...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
1% Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	*Możliwe alternatywne dystrybutory:
kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy	Alfa Aesar	490-79-9	*Możliwe alternatywne dystrybutory
acetonitryl	Merck	75-05-8	*Możliwe alternatywne dystrybutory:
Agaroza dla biologia molekularna	Biowest Chemicals	111860	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Ampicilin	Solarbio	69-52-3	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Chloroform	Lingfeng, Szanghaj	67-66-3	*Możliwe alternatywne dystrybutory
DEPC woda Thermo	Scientific	R0601
Etanol	Jinhuada, Kanton	64-17-5	*Możliwe alternatywne dystrybutory:
odczynnik tiocyjanianowo-fenolowy Guanidinium	Odczynnik Invitrogen	15596018	TRIzol
Imidazole	Energy Chemical	288-32-4	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Alkohol izopropylowy	Nanjing Odczynnik chemiczny	67-63-0	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Izopropyl β- D-tiogalaktopiranozyd	Solarbio	367-93-1	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Kanamycin	Solarbio	25389-94-0	*Możliwe alternatywne dystrybutory
LB Agar	Thermo Fisher	22700025	*Możliwe alternatywne dystrybutory
LB Broth	Thermo Fisher	10855021	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Metanol	Jinhuada, Kanton	67-56-1	*Możliwe alternatywne dystrybutory
MgCl2 hexahydrate	Xilong Huagong	7791-18-6	*Możliwe alternatywne dystrybutory
NaCl	Xilong Huagong	7647-14-5	*Możliwe alternatywne dystrybutory
NAD+	Due Biotech	53-84-9	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Fluorek fenylo-metylosulfonylu	Macklin	329-98-6	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Tris	Solarbio	77-86-1	*Możliwe alternatywne dystrybutory
UDP-glucose	Wuhu Nuowei Chemicals	28053-08-9	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Kwas glukuronowy UDP	SIGMA	63700-19-6	*Możliwe
alternatywne dystrybutoryNarzędzia/Przyrządy:
spektrometr masowy MALDI-TOF	Bruker	Autoflex	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Grzejnik z metalowym blokiem	Long Yang Scientific Instruments	Wytrząsarka termiczna HB20	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Termocykler PCR	Hema	9600	*Możliwe
alternatywne dystrybutory< silny> enzym i zestawy: < / strong>
10 razy; Bufor do podwiązywania	Thermo Scientific	B69	*Alternatywne dystrybutory możliwe
5 i razy; Bufor PrimeSTAR	Takara	9158A
Fosfataza alkaliczna	ThermoFisher FastAP	EF0654	*Możliwe alternatywne dystrybutory:
COX forward primer	Genscript	ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG
COX reverse primer	Genscript	ACTTGACCAAAAAACATAAGACATG
Cutsmart Buffer	NEB	B7204S	*Alternatywny możliwe dystrybutory
dNTP mix	Invitrogen	18427088
MgUGD forward primer	Genscript	ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT
MgUGD reverse primer	Genscript	ACTCGAGACTCTGTGAGGGGGTGGAG
MgUXS forward primer	Genscript	CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAACACC
MgUXS reverse primer	Genscript	ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT
ND forward primer	Genscript	ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT
ND reverse primer	Genscript	ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC
PCR Cleanup Kit	AxyGen	AP-PCR-250	*Możliwe alternatywne dystrybutory
pET-30a(+) vector	Merck Millipore	69909