Zbieżna strategia generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z niereferencyjnych ostryg pacyficznych

Yong  M. Lyu; Yu  Q. Li; Hui  B. Song; Juan Guo; Ting Wang; Li Liu; Gabriel Yedid; Josef Voglmeir

doi:10.3791/59462

Method Article

Zbieżna strategia generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z niereferencyjnych ostryg pacyficznych

DOI:

10.3791/59462

⸱

June 13th, 2019

Yong M. Lyu¹ , Yu Q. Li¹ , Hui B. Song¹ , Juan Guo¹ , Ting Wang¹ , Li Liu¹ , Gabriel Yedid² , Josef Voglmeir¹

¹Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, ²College of Life Science, Nanjing Agricultural University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy strategię, jak używać próbek RNA z niepotwierdzonych próbek ostryg pacyficznych i oceniamy materiał genetyczny przez porównanie z publicznie dostępnymi danymi genomu w celu wygenerowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostęp do materiału biologicznego gatunków referencyjnych, które były wcześniej wykorzystywane w kluczowych eksperymentach, takich jak rozwój nowych linii komórkowych lub projekty sekwencjonowania genomu, są często trudne do zapewnienia dla dalszych badań lub stron trzecich ze względu na konsumpcyjny charakter próbek. Chociaż obecnie są szeroko rozpowszechnione na wybrzeżach Pacyfiku w Azji, Australii i Ameryce Północnej, poszczególne okazy ostryg pacyficznych są genetycznie dość zróżnicowane i dlatego nie nadają się bezpośrednio jako materiał wyjściowy dla bibliotek genów. W tym artykule demonstrujemy wykorzystanie niereferencyjnych próbek ostryg pacyficznych uzyskanych z regionalnych rynków owoców morza do generowania bibliotek cDNA. Biblioteki te zostały następnie porównane z publicznie dostępnym genomem ostryg, a najbliższa powiązana biblioteka została wybrana przy użyciu mitochondrialnych genów referencyjnych podjednostki I oksydazy cytochromu C (COX1) i dehydrogenazy NADH (ND). Przydatność wygenerowanej biblioteki cDNA wykazano również poprzez klonowanie i ekspresję dwóch genów kodujących enzymy dehydrogenazę kwasu glukuronowego UDP (UGD) i syntazę UDP-ksylozy (UXS), które są odpowiedzialne za biosyntezę UDP-ksylozy z UDP-glukozy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozyskanie żywego materiału biologicznego może być wyzwaniem ze względu na długie terminy dostaw, przedsiębiorcze uzasadnienie lub przepisy celne specyficzne dla danego kraju. Alternatywnie, wymagany materiał biologiczny może być również pobrany z fenotypowo identycznych próbek. Próbki te mogą się jednak znacznie różnić na poziomie genotypu, w związku z czym porównania z przechowywanymi cyfrowo genomami referencyjnymi tego samego gatunku są często trudne lub nawet daremne ze względu na niezgodność nowo pozyskanego materiału z istniejącymi metodami amplifikacji DNA. Sekwencjonowanie wysoce konserwatywnych genów poszczególnych próbek jest szeroko stosowanym i potężnym n....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Przegląd schematu jest pokazany w Rysunek 1.

1. Pobieranie próbek

Zdobądź próbki ostryg. Ostrygi należy przechowywać na lodzie w okresie po zbiorach, podczas transportu oraz przed użyciem laboratoryjnym i przetwarzaniem w ciągu 4-7 dni po zakupie.
UWAGA: Na potrzeby tego protokołu ostrygi zakupiono na Zhong Cai Wholesale Market w Nankinie (pochodzącym z Ningde, Fujian, Chiny i Lianyungang, Jiangsu, Chiny), Haijie Aquatic Product Company w Qingdao (pochodzącym z Qingdao, Shandong, Chiny), Jucheng Aquatic Product Company w Yantai (pochodzącym z Yantai, Shandong, Chiny) i Jinxiu Aquatic P....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 pokazuje schematyczny przegląd opisanej metody przygotowania biblioteki konwergentnych cDNA pochodzących od osobników ostryg pacyficznych. Rysunek 2 pokazuje sekwencje genów COX1 i ND daleko spokrewnionego okazu ostryg z dużą rozbieżnością od sekwencji genów COX1 i ND materiału referencyjnego. Rysunek 3 pokazuje sekwencje genów COX1 i ND blisko spokrewnionego okazu ostryg z małą rozbieżnością od sekwencji genów COX1 i ND materiału r.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony protokół pozwala na identyfikację genetyczną niereferencyjnych okazów ostryg o podobnym fenotypie pochodzących z regionalnych targów owoców morza poprzez porównanie genów COX1 i ND z publicznie dostępną bazą danych genomu DNA ostryg. Znaczenie tej metody polega na jej prostocie, ponieważ do oceny wirtualnej biblioteki cDNA potrzebna jest tylko jedna reakcja PCR. Dwa konserwatywne mitochondrialne geny COX1 i ND amplifikowano z biblioteki cDNA, która została wygenerowana przez odwrotną transkrypcję ekstraktów.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (granty o numerach 31471703, A0201300537 i 31671854 dla J.V. i L.L., granty o numerze 31470435 dla G.Y.) oraz Plan 100 Zagranicznych Talentów (grant numer JSB2014012 dla J.V.).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals:
1% Triton X-100	Solarbio	9002-93-1	*Możliwe alternatywne dystrybutory:
kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy	Alfa Aesar	490-79-9	*Możliwe alternatywne dystrybutory
acetonitryl	Merck	75-05-8	*Możliwe alternatywne dystrybutory:
Agaroza dla biologia molekularna	Biowest Chemicals	111860	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Ampicilin	Solarbio	69-52-3	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Chloroform	Lingfeng, Szanghaj	67-66-3	*Możliwe alternatywne dystrybutory
DEPC woda Thermo	Scientific	R0601
Etanol	Jinhuada, Kanton	64-17-5	*Możliwe alternatywne dystrybutory:
odczynnik tiocyjanianowo-fenolowy Guanidinium	Odczynnik Invitrogen	15596018	TRIzol
Imidazole	Energy Chemical	288-32-4	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Alkohol izopropylowy	Nanjing Odczynnik chemiczny	67-63-0	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Izopropyl β- D-tiogalaktopiranozyd	Solarbio	367-93-1	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Kanamycin	Solarbio	25389-94-0	*Możliwe alternatywne dystrybutory
LB Agar	Thermo Fisher	22700025	*Możliwe alternatywne dystrybutory
LB Broth	Thermo Fisher	10855021	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Metanol	Jinhuada, Kanton	67-56-1	*Możliwe alternatywne dystrybutory
MgCl₂ hexahydrate	Xilong Huagong	7791-18-6	*Możliwe alternatywne dystrybutory
NaCl	Xilong Huagong	7647-14-5	*Możliwe alternatywne dystrybutory
NAD⁺	Due Biotech	53-84-9	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Fluorek fenylo-metylosulfonylu	Macklin	329-98-6	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Tris	Solarbio	77-86-1	*Możliwe alternatywne dystrybutory
UDP-glucose	Wuhu Nuowei Chemicals	28053-08-9	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Kwas glukuronowy UDP	SIGMA	63700-19-6	*Możliwe
alternatywne dystrybutoryNarzędzia/Przyrządy:
spektrometr masowy MALDI-TOF	Bruker	Autoflex	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Grzejnik z metalowym blokiem	Long Yang Scientific Instruments	Wytrząsarka termiczna HB20	*Możliwe alternatywne dystrybutory
Termocykler PCR	Hema	9600	*Możliwe
alternatywne dystrybutory< silny> enzym i zestawy: < / strong>
10 razy; Bufor do podwiązywania	Thermo Scientific	B69	*Alternatywne dystrybutory możliwe
5 i razy; Bufor PrimeSTAR	Takara	9158A
Fosfataza alkaliczna	ThermoFisher FastAP	EF0654	*Możliwe alternatywne dystrybutory:
COX forward primer	Genscript	ATGTCAACAAATCATTTAGACATTG
COX reverse primer	Genscript	ACTTGACCAAAAAACATAAGACATG
Cutsmart Buffer	NEB	B7204S	*Alternatywny możliwe dystrybutory
dNTP mix	Invitrogen	18427088
MgUGD forward primer	Genscript	ACATATGACCCTGTCCAAGATCTGTTGT
MgUGD reverse primer	Genscript	ACTCGAGACTCTGTGAGGGGGTGGAG
MgUXS forward primer	Genscript	CCATATGGCAGAATCCTCACAATCAACACC
MgUXS reverse primer	Genscript	ACTCGAGCACATTTTTGAATTTGCAGACGT
ND forward primer	Genscript	ATGAGATGGCAATTATTTTTTAAT
ND reverse primer	Genscript	ATGTATTTTGGAAAAATCTCCAC
PCR Cleanup Kit	AxyGen	AP-PCR-250	*Możliwe alternatywne dystrybutory
pET-30a(+) vector	Merck Millipore	69909

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Blaxter, M. L. The promise of a DNA taxonomy. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359 (1444), 669-679 (2004).
Wen, J., et al. Species identification of drie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Zbieżna strategia generowania wirtualnie zsekwencjonowanej biblioteki cDNA z niereferencyjnych ostryg pacyficznych

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles