VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy VirWaTest, który jest prostą, niedrogą i przenośną metodą koncentracji i wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użycia.

Streszczenie

Wirusy wydzielane przez ludzi i zwierzęta mogą zanieczyszczać źródła wody i stanowić zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, gdy ta woda jest używana do picia, nawadniania żywności, mycia itp. Klasyczny wskaźnik bakterii kałowych nie zawsze sprawdza obecność patogenów wirusowych, dlatego wykrywanie patogenów wirusowych i wskaźników wirusowych jest istotne w celu przyjęcia środków ograniczających ryzyko, zwłaszcza w scenariuszach humanitarnych i na obszarach, na których często występują epidemie wirusów przenoszonych przez wodę.

Obecnie dostępnych jest kilka komercyjnych testów pozwalających na ilościowe określenie bakterii wskaźnikowych kału (FIB) w miejscu użycia. Jednak takie komercyjne testy nie są dostępne do wykrywania wirusów. Wykrycie wirusów w próbkach wody środowiskowej wymaga skoncentrowania kilku litrów w mniejszych objętościach. Co więcej, po skoncentrowaniu wykrywanie wirusów opiera się na metodach takich jak ekstrakcja kwasów nukleinowych i wykrywanie molekularne (np. testy oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy [PCR]) genomów wirusa.

Opisana tutaj metoda pozwala na koncentrację wirusów z 10 litrowych próbek wody, jak również ekstrakcję wirusowych kwasów nukleinowych w miejscu użycia, za pomocą prostego i przenośnego sprzętu. Pozwala to na badanie próbek wody w miejscu użycia pod kątem kilku wirusów i jest przydatne w scenariuszach humanitarnych, a także w każdym kontekście, w którym nie jest dostępne wyposażone laboratorium. Alternatywnie, metoda ta pozwala na zagęszczenie wirusów obecnych w próbkach wody i wysłanie koncentratu do laboratorium w temperaturze pokojowej w celu dalszej analizy.

Wprowadzenie

Podczas pierwszych faz każdej sytuacji humanitarnej, dostęp do czystej wody, urządzeń sanitarnych i higieny jest krytyczny dla przetrwania osób dotkniętych kryzysem. Dlatego monitorowanie jakości wody jest priorytetem, aby zapobiec epidemiom przenoszonym przez wodę. Powszechnie wiadomo, że zanieczyszczona woda jest często źródłem chorób, ale często trudno jest określić źródła epidemii wirusów, takich jak wirus zapalenia wątroby typu E (HEV), nawet przy dostępności konwencjonalnych metod laboratoryjnych. Kontrola jakości wody opiera się na kwantyfikacji FIB^1,2,3,4. Zostało jednak obszernie udokumentowane, że nie ma korelacji między brakiem FIB a obecnością wirusowych patogenów przenoszonych przez wodę, takich jak rotawirus (RoV), norowirus (NoV) lub HEV^5,6. W związku z tym stosowanie kryteriów jakości wody opartych na FIB może prowadzić do niedoszacowania zagrożeń związanych z obecnością patogenów wirusowych przenoszonych przez wodę. Nadzór nad wirusami wskaźnikowymi, takimi jak ludzkie adenowirusy (HAdV) lub określone patogeny, byłby pomocny w określeniu narażenia na patogeny wirusowe i identyfikacji potencjalnego źródła infekcji u ludzi^7,8,9^,10 oraz w walidacji skuteczności środków sanitarnych¹¹.

Do tej pory wykrywanie wirusów w tych scenariuszach polegało na wykwalifikowanym personelu i skomplikowanej logistyce. VirWaTest (virwatest.org) ma na celu opracowanie prostej, niedrogiej i przenośnej metody zagęszczania, a następnie wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użytkowania.

Koncentracja wirusa opiera się na zasadzie organicznej flokulacji 10 litrowych próbek wody, dzięki której wirusy są odzyskiwane w mniejszych ilościach^12,13. Kłaczki są zbierane i dodawane do buforu, który lizuje wirusy i zapobiega degradacji kwasów nukleinowych, gdy są przechowywane w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 2 tygodnie.

Metoda ekstrakcji kwasów nukleinowych opiera się na użyciu cząstek magnetycznych, do których kwasy nukleinowe są adsorbowane. Można je przenieść z jednego bufora płuczącego do drugiego, a na koniec do buforu elucyjnego za pomocą pipety magnetycznej, do której przyczepiają się cząstki. Otrzymane zawiesiny wirusowych kwasów nukleinowych można wysłać do laboratorium referencyjnego, gdzie można przeprowadzić detekcję przy użyciu metod molekularnych opartych na PCR. Dla każdej ekstrakcji kwasu nukleinowego badane są dwie różne wielkości, aby wykluczyć inhibicję enzymatyczną pochodzącą z próbki. Alternatywnie, przy minimalnej dostępności sprzętu, testy PCR można przeprowadzić w miejscu użytkowania. Cały proces został zaprojektowany tak, aby można go było przeprowadzić niezależnie od źródła zasilania (ilustracja 1).

Ilościowy test PCR do wykrywania HAdV, wydalanego przez ludzi i znajdującego się w próbkach ścieków w wysokich stężeniach, został przystosowany do przeprowadzenia w miejscu użycia. HAdV są stosowane jako wskaźniki wirusa ludzkiego kału. PCR do oznaczania ilościowego bakteriofaga MS2 został również dostosowany, ponieważ MS2 jest używany w VirWaTest jako kontrola procesu. Metodę można dostosować do wykrywania dowolnego wirusa, który Cię interesuje.

Po opracowaniu, metoda VirWaTest została zastosowana przez użytkowników w dwóch różnych ustawieniach w Republice Afryki Środkowej (RCA) i Ekwadorze, dostarczając informacji zwrotnych na temat zastosowania protokołu w rzeczywistych sytuacjach.

O naszej wiedzy, jest to pierwsza procedura, która pozwala na koncentrację i wykrywanie wirusów w miejscu użytkowania, niezależnie od jakiegokolwiek zasilania, dużego sprzętu i warunków zamrażania/chłodzenia. Zaleca się pobranie dwóch powtórzeń każdej próbki wody w celu uzyskania wiarygodnych wyników.

Protokół

1. Przygotowanie i pakowanie

UWAGA: Materiały/sprzęt do pakowania są wymienione w Tabeli 1. Używać rękawic do obchodzenia się z odczynnikami wymaganymi do kontroli procesu, odczynnikami stężającymi, odczynnikami do ekstrakcji kwasów nukleinowych i odczynnikami do wykrywania. Nosić okulary ochronne, aby obchodzić się z odczynnikami wymaganymi do ekstrakcji kwasów nukleinowych.

1. Sterowanie procesami
   1. Przygotować podstawową kulturę bakteriofagów MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) zawierającą 1 x^{10 10} PFU/ml w laboratorium, postępując zgodnie z procedurą ISO 10705-1:1995¹⁴.
   2. Następnie podamy 10 μl zawiesiny na probówkę zawierającą 1 x 10⁸ PFU do probówek o pojemności 10 ml i pozwól wodzie odparować w temperaturze 37 °C. Użyć jednej probówki na próbkę wody.
   3. Dodatkowo należy przygotować jedną probówkę zawierającą 10 ml sterylnej wody destylowanej na pobraną próbkę.
2. Odczynniki do zatężania
   1. W przypadku wstępnie flokulowanego roztworu mleka odtłuszczonego (PSM) należy użyć następujących ilości w celu zagęszczenia pięciu 10 l próbek wody.
      1. Przygotuj plastikową tubkę zawierającą 5 g odtłuszczonego mleka.
      2. Przygotuj plastikową torbę z zamkiem błyskawicznym zawierającą 16,66 g soli morskich.
      3. Przygotuj plastikową butelkę zawierającą 500 ml wody destylowanej.
   2. Przygotować odczynniki wymagane do dostosowania pH. Poniższe ilości należy zastosować w celu dostosowania pH PSM i pięciu próbek wody o objętości 10 l.
      1. Dodaj 5 g 1-hydratu kwasu cytrynowego do plastikowej tubki o pojemności 10 ml.
         UWAGA: Kwas cytrynowy powoduje poważne podrażnienie w kontakcie z oczami. W takim przypadku należy ostrożnie płukać oko wodą przez kilka minut. Jeśli podrażnienie nie ustąpi, zasięgnij porady lekarza.
      2. Wlej 2 g wodorotlenku sodu do plastikowej probówki o pojemności 10 ml.
         UWAGA: Wodorotlenek sodu może powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. W przypadku połknięcia wypłukać usta. Nie wywoływać wymiotów. W przypadku kontaktu z oczami należy ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Następnie zasięgnij porady lekarza.
      3. Wlej 25 ml sterylnej wody destylowanej do plastikowego pojemnika.
      4. Wlej 50 ml sterylnej wody destylowanej do plastikowego pojemnika.
   3. Przygotować saszetkę do kondycjonowania próbki używaną do flokulacji, roztwór konserwujący używany do konserwacji kwasów nukleinowych oraz saszetkę neutralizującą do neutralizacji wyrzuconej wody i materiałów. Na każde 10 l próbki wody, która ma być poddana badaniu, należy stosować następujące ilości.
      1. Włóż 15 g soli morskich i 8 g 1-hydratu kwasu cytrynowego do plastikowej torebki z zamkiem błyskawicznym na saszetkę kondycjonującą.
      2. Dodaj 2 ml buforu do lizy (tabela materiałów) i 0,3 ml środka konserwującego kwasy nukleinowe (tabela materiałów) do probówki o pojemności 5 ml.
         UWAGA: Bufor do lizy zawiera tiocyjanian guanidyny i Triton X-100. Kontakt z kwasem uwalnia toksyczny gaz, który jest szkodliwy w przypadku połknięcia, wdychania lub kontaktu ze skórą. W przypadku połknięcia wypłukać usta. Nie wywoływać wymiotów. Jeśli dojdzie do kontaktu ze skórą, umyj ją dużą ilością wody. Następnie zasięgnij porady lekarza. Środek konserwujący kwasy nukleinowe powoduje podrażnienie skóry i oczu i jest szkodliwy w przypadku połknięcia. W przypadku kontaktu ze skórą lub oczami płukać dużą ilością wody przez kilka minut. W każdym razie, zwłaszcza w przypadku połknięcia i złego samopoczucia, należy zasięgnąć porady lekarza.
      3. Wsyp 40 g proszku do prania w czterech plastikowych torebkach z zamkiem błyskawicznym.
         UWAGA: Detergent w proszku działa drażniąco na oczy. Jeśli dojdzie do kontaktu z oczami, płukać dużą ilością wody przez kilka minut. Jeśli podrażnienie utrzymuje się lub po połknięciu, należy zasięgnąć porady lekarza.
3. Odczynniki do ekstrakcji kwasów nukleinowych
   1. Umieść 50 μl cząstek magnetycznych (tabela materiałów) i 1 ml etanolu 96% w probówce o pojemności 5 ml, która stanowi bufor wiążący.
      UWAGA: Bufor cząstek magnetycznych zawiera azydek sodu, który w kontakcie z kwasami lub jonami metali ciężkich tworzy toksyczny gaz i jest toksyczny w przypadku spożycia lub kontaktu ze skórą. W przypadku spożycia lub kontaktu ze skórą przepłukać usta lub skórę dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza. Etanol jest wysoce łatwopalną cieczą i parą i powoduje poważne podrażnienie oczu. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskier i innych źródeł zapłonu. W przypadku kontaktu ze skórą lub oczami spłukać dużą ilością wody. W przypadku spożycia dużej ilości wody i/lub w przypadku wdychania należy wyjść na zewnątrz na świeże powietrze. W każdym przypadku należy zasięgnąć porady lekarza.
   2. Dodaj 500 μl, 600 μl i 200 μl płuczących odpowiednio 1, 2 i 3 (tabela materiałów) do trzech probówek o pojemności 2 ml.
      UWAGA: myjące zawierają tiocyjanian guanidyny i chlorek guanidyny, które są szkodliwe w przypadku wdychania lub połknięcia i podrażniają skórę i oczy. W kontakcie z kwasami uwalnia się bardzo toksyczny gaz. Jeśli wejdą w kontakt ze skórą lub oczami, spłucz je dużą ilością wody. W przypadku połknięcia przepłukać usta dużą ilością wody. Nie wywoływać wymiotów. Zawsze zasięgnij porady lekarza.
   3. Dodać 120 μl buforu elucyjnego (tabela materiałów) do probówki o pojemności 0,5 ml.
4. Odczynniki do wykrywania HAdV i MS2
   UWAGA: Dwie różne reakcje ekstrakcji kwasów nukleinowych mogą być analizowane jednocześnie w każdym teście PCR, jeśli używany jest termocykler 8-dołkowy. Do wszystkich testów PCR należy przygotować wodę z biologii molekularnej podzieloną na porcje do probówek o pojemności 1,5 ml.
   1. Detekcja HAdV
      1. Przygotować mieszaninę zawierającą 10 μl 22,5 μM AdF startera doprowadzającego do przodu, 10 μl 22,5 μM AdR startera odwrotnego i 5 μl sondy 11,25 μM AdP (Tabela 2).
      2. Dodać 2,5 μl mieszanki do probówek od 1 do 8 pasków probówki. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, zamknij rurki i chroń je przed światłem.
      3. Przetnij pasek, dzieląc go na dwa paski: rurki 1-5 i rurki 6-8.
      4. Przygotować seryjne rozcieńczenie zawiesin DNA zawierających sekwencję nukleotydową amplifikowanego regionu HAdV. Wysuszyć na powietrzu 1 μl zawiesin zawierających 1 x 10⁵, 1 x 10⁷ i 1 x 10⁹ GC/ml do probówek 6-8,
         UWAGA: Probówki zawierające startery, sondę i wysuszone na powietrzu zawiesiny należy chronić przed światłem.
   2. Wykrywanie MS2
      1. Przygotować mieszaninę zawierającą 10 μl 25 μM startera do przodu pecson-2F, 10 μl 25 μM startera odwrotnego pecson-2R i 2,5 μl sondy 25 μM PecP-2 (tabela 2).
      2. Dodać 2,25 μl mieszanki do probówek od 1 do 8 paska probówki. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, zamknij rurki i chroń je przed światłem.
      3. Przetnij pasek, dzieląc go na dwa paski: rurki 1-5 i rurki 6-8.
      4. Postępuj jak w kroku 1.4.1.4, ale zamiast tego użyj standardowego zawieszenia przeznaczonego dla MS2.

2. Stężenie wirusa

UWAGA: Używaj rękawiczek przez cały czas podczas pobierania próbek, przygotowywania odczynników, flokulacji, zbierania kłaczków i procedur usuwania odpadów. Podczas procedury przygotowania odczynnika należy nosić okulary ochronne.

1. Pobieranie próbek
   1. Pobrać próbkę wody o objętości 10 l do wiadra z płaskim dnem i pokrywką. Zebrać co najmniej dwie kontrpróby dla każdej próbki.
      UWAGA: Ważne jest, aby używać przezroczystych wiader do wizualizacji pelletu. Jeśli próbka wody zawiera zawieszony materiał (np. piasek, glony), pozwól mu osiadać, a następnie zbierz supernatant wodny do nowego wiadra.
   2. Zarejestruj pobraną objętość, a także miejsce i datę pobrania dla każdej próbki wody.
   3. Umieść mieszadło magnetyczne podłączone do akumulatora pod wspornikiem wiadra i umieść wiadro zawierające próbkę wody na jego wsporniku.
      UWAGA: Poszukaj płaskiej powierzchni w świeżym miejscu i trzymaj wiadra zawierające próbki wody z dala od bezpośredniego światła słonecznego.
2. Przygotowanie odczynników
   1. Odczynniki do regulacji pH
      1. Wlej kwas cytrynowy w proszku i granulki wodorotlenku sodu do garnków zawierających odpowiednio 25 i 50 ml wody destylowanej.
      2. Delikatnie wstrząsać ręką, aż kwas cytrynowy i wodorotlenek sodu całkowicie się rozpuszczą.
         UWAGA: Nie zalewaj wodą granulek wodorotlenku sodu. Zamiast tego wlej granulki wodorotlenku sodu do wody.
   2. Mleko odtłuszczone wstępnie flokulowane
      1. Umieść stojący worek na mieszadle magnetycznym i wlej do niego 500 ml wody destylowanej. Wrzuć magnes mieszający do torby i włącz mieszadło magnetyczne.
      2. Wlej zawartość saszetki z solą morską i rurki z odtłuszczonym mlekiem do stojącej torebki i mieszaj przez 5 minut na średnich obrotach, aby je rozpuścić.
      3. Dodaj 3 ml kwasu cytrynowego do roztworu PSM za pomocą pipety Pasteura, aby upewnić się, że pH mieści się w przedziale od 3,4 do 3,6. Zmierz pH roztworu PSM za pomocą pasków wskaźnikowych pH. Dodaj mniejsze ilości kwasu cytrynowego i wodorotlenku sodu, gdy pH zbliży się do 3,5.
      4. Wyłącz mieszadło magnetyczne i upewnij się, że kłaczki są widoczne. Użyj latarki, aby pomóc w wizualizacji kłaczków.
3. flokulacja
   1. Wrzuć magnes mieszający do wody, ustaw mieszadło magnetyczne na maksymalną prędkość i włącz je. Upewnij się, że magnes mieszający zaczyna się obracać.
   2. Dodaj 10 ml wody destylowanej do probówki kontrolnej procesu. Odwróć probówkę kilka razy, aby ponownie nawodnić zapas wirusa i wlej roztwór do wody.
   3. Wsypać zawartość jednej saszetki z kondycjonowaniem próbki do wody i mieszać przez 5 minut.
   4. Zmierzyć pH próbki wody za pomocą pasków wskaźnikowych pH. Dodaj kilka kropli kwasu cytrynowego lub wodorotlenku sodu do próbki wody, aby upewnić się, że pH mieści się w przedziale od 3,4 do 3,6. Dodaj mniejsze ilości kwasu cytrynowego i wodorotlenku sodu, gdy pH zbliży się do 3,5.
   5. Dodać 100 ml roztworu PSM za pomocą pojemnika o pojemności 100 ml.
   6. Zamknij wiadro pokrywką, ustaw mieszadło magnetyczne na minimalną prędkość i pozostaw mieszanie wody na 8 godzin.
   7. Wyłącz mieszadło magnetyczne i pozwól wodzie pozostać nieruchomo przez co najmniej 5 godzin, aby kłaczki mogły się uspokoić.
4. Kolekcja Kłaczków
   1. Zbuduj system syfonowy składający się z kontrolera pipet, dwóch pipet i plastikowej rurki do zasysania supernatantu wody do odprowadzania wody na kłaczki.
      1. Podłącz pipetę z taśmą o pojemności 10 ml do kontrolera pipety. Następnie przymocuj końcówkę pipety do plastikowej rurki.
      2. Wyjmij filtr z pipety z otwartą końcówką o pojemności 10 ml za pomocą pęsety i przymocuj pipetę do plastikowej rurki.
   2. Postaw puste wiadro na podłodze.
   3. Zanurz końcówkę pipety z otwartą końcówką w wodzie. Upewnij się, że trzymasz go blisko powierzchni wody, aby nie naruszyć kłaczków. Zassać supernatant wodny tak długo, aż dotrze do pipety z końcówką taśmy.
   4. Chwyć plastikową rurkę za koniec przymocowany do pipety z taśmą i odłącz ją od pipety.
   5. Umieść probówkę w pustym wiadrze. Zwolnij ciśnienie na rurce, aby woda mogła spłynąć do pustego wiadra.
   6. Ściśnij plastikową rurkę, aby zatrzymać przepływ wody, gdy poziom wody ma dotrzeć do magnesu mieszającego, i odsuń pipetę od wiadra.
   7. Potrząśnij wiadrem, aby ponownie zawiesić kłaczki i wlej je do plastikowej torebki o pojemności 500 ml. Pozwól kłaczkom osiąść jeszcze przez 1 godzinę.
   8. Ostrożnie odessać supernatant wodny za pomocą pipety o pojemności 50 ml i ręcznego sterownika pipet, unikając naruszania kłaczków.
   9. Odessać kłaczki za pomocą pipety o pojemności 100 ml i przenieść je do 50 ml wyskalowanej probówki wirówkowej. Zanotuj końcową objętość koncentratu próbki i przenieś 1 ml jej 1 ml do probówki o pojemności 5 ml zawierającej roztwór konserwujący, używając pipety Pasteura.
      UWAGA: Ważne jest, aby probówka wirówkowa była wyskalowana, aby można było jak najdokładniej zmierzyć i zarejestrować końcową objętość zagęszczonej próbki.
   10. Wykonaj ekstrakcję kwasu nukleinowego w terenie. Alternatywnie, roztwór konserwujący zawierający wirusy należy przechowywać w temperaturze do 15 °C przez okres do 15 dni lub wysłać go do laboratorium referencyjnego w celu dalszej analizy.
5. Utylizacja odpadów i ponowne wykorzystanie materiałów
   1. Dodać zawartość saszetki ze środkiem neutralizującym do wiadra zawierającego wylaną wodę. Wymieszaj wodę, a następnie pozostaw ją nieruchomą na 30 minut.
   2. Oczyszczoną wodę należy utylizować jako odpady ogólne.
   3. Umieść pipety i plastikową rurkę w wiadrze. Napełnij wiadro wodą i wlej zawartość jednej saszetki ze środkiem neutralizującym.
   4. Myj je przez co najmniej 30 minut, aby je wysterylizować i spłucz je dużą ilością czystej wody, aby usunąć pozostały środek neutralizujący.

3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

UWAGA: Używaj rękawiczek i zawsze noś okulary ochronne podczas procedury ekstrakcji kwasów nukleinowych.

1. Obsługa pipety magnetycznej
   1. Zapoznaj się z działaniem pipety magnetycznej przed wykonaniem ekstrakcji.
2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych
   1. Ułóż probówki zawierające odczynniki potrzebne do ekstrakcji w stojaku, od lewej do prawej: bufor wiążący, płuczące i bufor elucyjny. Ustaw odpowiednią liczbę probówek w zależności od liczby analizowanych próbek lub kontrprób.
   2. Przenieść 1 ml koncentratu próbki do probówki zawierającej bufor wiążący, używając jednorazowej pipety Pasteura. Odwróć probówkę 8x do 10x, aby homogenizować roztwór.
   3. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 minut, ciągle mieszając, używając orbitalu zasilanego energią słoneczną lub ręcznie.
   4. Zbierz cząstki magnetyczne za pomocą pipety magnetycznej i czystej końcówki, którą można ponownie wykorzystać do trzech myjących.
   5. Uwolnij cząstki magnetyczne do probówki zawierającej 500 μl buforu płuczącego 1. Umyj je, delikatnie potrząsając roztworem końcówką przez 30 s i zbierz.
   6. Przenieść cząstki magnetyczne do probówki zawierającej 600 μl buforu płuczącego 2. Umyj je, delikatnie potrząsając roztworem końcówką przez 30 s i zbierz.
   7. Przenieść cząstki magnetyczne do probówki zawierającej 200 μl buforu płuczącego 3. Umyj je, delikatnie potrząsając roztworem końcówką przez 30 s i zbierz.
   8. Uwolnij cząstki magnetyczne do probówki zawierającej bufor elucyjny i wyrzuć końcówkę.
   9. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 minut, ciągle mieszając, używając zasilanego energią słoneczną orbitala.
      UWAGA: Mieszanie cząstek magnetycznych w buforze elucyjnym jest kluczowym krokiem. W przypadku braku orbitalu, w czasie inkubacji należy mieszać ręcznie w sposób ciągły.
   10. Wymień końcówkę pipety magnetycznej na nową i zbierz cząstki magnetyczne z buforu elucyjnego. Upewnij się, że całkowicie usunąłeś cząstki magnetyczne z buforu elucyjnego, ponieważ mogą one zakłócać metody wykrywania molekularnego.
   11. Wyrzuć końcówkę z przyczepionymi do niej cząstkami. Przystąpić do analizy PCR, wysłać bufor elucyjny do laboratorium referencyjnego lub przechowywać bufor elucyjny w temperaturze 4 °C do dalszej analizy.

4. Wykrywanie wirusów za pomocą zasilanego bateryjnie ośmiorurkowego termocyklera czasu rzeczywistego

UWAGA: Używaj rękawiczek i zawsze noś okulary ochronne podczas procedury wykrywania kwasów nukleinowych. Podczas wykonywania nowego eksperymentu PCR należy wymienić rękawice na nowe, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.

1. Ilościowy PCR HAdV
   1. Dodaj 14 μl wody wolnej od nukleaz do probówek 2, 4 i 5.
   2. Dodaj 4 μl mieszanki PCR do probówek 1-5.
   3. Dodać 14 μl ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbki A do probówki 1 i 14 μl z próbki B do probówki 3.
   4. Dodać 2 μl wyekstrahowanych kwasów nukleinowych z próbki A do probówki 2 i 2 μl z próbki B do probówki 4. Zamknij pasek z pięcioma rurkami.
   5. Dodaj 14 μl wody wolnej od nukleaz do probówek 6, 7 i 8.
   6. Dodaj 4 μl tej mieszanki do probówek 6, 7 i 8 i zamknij je.
   7. Umieść oba paski w termocyklerze i wybierz odpowiedni przebieg (Tabela 3).
   8. Wyrzuć rurkę z wodą i przechowuj wyekstrahowany kwas nukleinowy w zamrażarce, jeśli to możliwe, lub, jeśli nie, w świeżym miejscu chronionym przed światłem na wypadek konieczności przeprowadzenia drugiego testu.
   9. Wyczyść mikropipety, stojak, materiał roboczy i cały materiał za pomocą środka czyszczącego z kwasami nukleinowymi i wyrzuć plastikową torbę zawierającą zużytą końcówkę, rękawice i probówki.
      UWAGA: Środek do usuwania kwasów nukleinowych jest bardzo łatwopalną cieczą i parą. Nie wdychać rozpylonej mgiełki i unikać kontaktu płynu z oczami lub skórą. W przeciwnym razie natychmiast spłucz dużą ilością wody i zasięgnij porady lekarza.
   10. Zbierz wyniki i przeanalizuj uzyskane dane.
2. Ilościowy PCR MS2
   1. Dodaj 14 μl wody wolnej od nukleaz do probówek 2, 4 i 5.
   2. Dodać 4 μl mieszanki PCR i 0,5 μl enzymu odwrotnej transkryptazy do probówek 1-5.
   3. Dodać 14 μl ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbki A do probówki 1 i 14 μl z próbki B do probówki 3.
   4. Dodać 1 μl wyekstrahowanych kwasów nukleinowych z próbki A do probówki 2 i 1 μl z próbki B do probówki 4. Zamknij pasek z pięcioma rurkami.
   5. Dodaj 15,5 μl wody wolnej od nukleaz do probówek 5, 6, 7 i 8 i zamknij je.
   6. Dodać 4 μl mieszanki PCR i 0,5 μl enzymu odwrotnej transkryptazy do probówek 6, 7 i 8.
   7. Umieść oba paski w termocyklerze i wybierz odpowiedni przebieg (Tabela 3).
   8. Postępuj zgodnie z opisem w krokach od 4.1.8 do 4.1.10.

Wyniki

Opracowanie metody

Ta procedura została opracowana w Laboratorium Wirusów, Zanieczyszczeń Wody i Żywności we współpracy GenIUL i Oxfam Intermón. Składa się z trzech różnych etapów. Pierwsza, stężenie cząstek wirusa, jest adaptacją opisanej wcześniej metody flokulacji mleka odtłuszczonego^12,17,18. Pierwotna metoda zosta...

Dyskusja

Metoda VirWaTest umożliwia zagęszczenie wirusów i ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbek wody w miejscu użytkowania przez niedoświadczonych użytkowników. Jest to niedrogi, szybki i prosty protokół. Zagęszczenie opiera się na zasadzie organicznej flokulacji przy użyciu mleka odtłuszczonego, dzięki której warunki niskiego pH i wysokiej przewodności powodują, że białka mleka odtłuszczonego agregują się w kłaczki, w których adsorbują się wirusy. Gdy kłaczki opadną, łatwo je zebrać, co pozwala na zagęszczenie 10 l wody, podc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5x HOT FIREPol Sonda qPCR Mix Plus (ROX)	Solis BioDyne	08-14-00001	Zawiera 5x sonda HOT FIREPol firmy Solis Biodyne qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 reakcji
Paski z 8 mikroprobówkami z nasadkami	dD Biolab	840637	niskoprofilowy, cienkościenny, przystosowany do ilościowego i jakościowego PCR
Baterie i zasilacze do mieszadła magnetycznego	GenIUL	900011674	Zawiera zasilanie samochodu 12V adapter
Wspornik łyżki	GenIUL	900011648	Aluminiowy wspornik
Wiadro, 10 L	Cater4You	10LTR	Polipropylen, Zabezpieczenie przed manipulacją, Przezroczysty kolor
Probówka wirówkowa, 50 ml	LabBox	CTSP-E50-050	Polipropylen, sterylny, z podziałką, z osłoną
Kwas cytrynowy 1-hydrat, 500 g	PanReac AppliChem	1410181211	czysty, klasa farmaceutyczna, 1 kilogram
Przezroczysta butelka PET	LabBox	FPET-500-088	Przezroczysty kolor, PET, nakrętka nie jest dołączona
Mleko odtłuszczone Difco, 500 g	Becton Dickinson	232100	Dehydrated
DNA/RNA Shield, 250 mL	Zymo Research	R1100-250	Pożywka do konserwacji DNA/RNA, 250 ml
Easy9 Kontroler pipet	LabBox	EAS9-001-001	0,3 μ m filtr, Pipety od 0,1 do 100 mL, Autoklawowalny silikonowy uchwyt na pipety
Eppendorf Tube, 0,5 ml	Eppendorf	0030121023	polipropylen, Bezpiecznik Eppendorf
Probówka, 2 ml	Eppendorf	0030120094	polipropylen, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mL	dD Biolab	999542	polipropylen, sterylny, stopniowany
etanol 96% v/v, 1 l	Panreac AppliChem	361085-1611	UV, IR  i HPLC
	LabBox	FORS-007-002	Cienkie, zakrzywione końcówki, L=120 mm
Mieszadło magnetyczne	GenIUL	900017000	Marker bateryjny
	dD Biolab	929203	, bardzo cienka końcówka, wodoodporny, szybkoschnący, do plastiku i szkła
Micro Rota-Rack do mikroprobówek	dD Biolab	37782	4 moduły, dł. x szer. x wys. = 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Real-Time PCR Cycler	Coyote Biosciences, Chiny	Mini-8	Portable, Współpracuje z zasilaczami 12 V lub bateriami zewnętrznymi, Dwa kanały, Pojemność na 8 probówek
NucliSens Lysis Buffer	Biomerieux	200292	Odczynniki do 48 izolacji, Przechowywać w temperaturze otoczenia
Pipeta serologiczna z otwartą końcówką, 10 ml	Deltalab	900136N	Sterylna, pakowana pojedynczo (papier/plastik)
nakrętka PE PP28	LabBox	TP28-004-020	do butelek PET
Pasek wskaźnika pH	LabBox	WSPH-001-001	Zakres pH od 2,8 do pH 4,4, 50 pasków w opakowaniu
Plastikowa probówka	Quimikals	300913	zawiera nasadkę
Pipeta z polietylenu Pasteura	LabBox	PIPP-003-500	z podziałką, całkowita objętość 7 ml, Niesterylna
kolba polipropylenowa z nakrętką, 150 ml	Deltalab	409726	Zakrętka, sterylna, z podziałką do 100 ml
Polipropylenowa kolba z nakrętką, 60 ml	Deltalab	409526G	Zakrętka, sterylna, z podziałką do 50 ml
Detergent w proszku	-		zwykłe mydło w proszku do prania ubrań
zasilające do mieszadła magnetycznego	GenIUL	900011692	Połączenie między bateriami a mieszadłami
magnetycznymi QuickPick Narzędzie magnetyczne	BioNobile	24001	Ręczne narzędzie do cząstek magnetycznych
Końcówki QuickPick w pudełku	BioNobile	24296	Bez RNaz, autoklawowane, 96 jednostek
QuickPick XL gDNA Cząsteczki magnetyczne	BioNobile	SN51100	3,2 ml
Sole morskie	Sigma-Aldrich	S9883-500G	Sztuczna mieszanina soli bardzo przypominająca skład rozpuszczonych soli wody oceanicznej
Rurka silikonowa	LabBox	SILT-006-005	Rolka 5 metrów, wewnętrzna  ø x Zewnętrzna  ø= 6 x 10 mm
Granulki wodorotlenku sodu, 98,5 - 100,5%	VWR Chemicals	28244295	Granulki, 1 kg
Solarna platforma obrotowa	SOL-EXPERT Group	70020	Płyta akrylowa, 10 obr./min, obsługuje do 300 gramów
Zestaw 1-etapowej sondy SOLIScript	Solis BioDyne	08-57-00250	Zawiera 5x jednoetapową mieszankę sond Solis Biodyne (qPCR Mix) i 40x jednoetapową mieszankę SOLIScript (enzym odwrotnej transkryptazy), 250 reakcji
SPEEDTOOLS Zestaw do ekstrakcji wirusa RNA	BioTools	21.141-4197	Zawiera bufor BAW firmy BioTools (bufor płuczący 1), bufor BAV3 (bufor płuczący 2 i 3) oraz bufor BRE (bufor elucyjny).
SpinBar Octhaedral Stirring Magnet	dD Biolab	045926	Pivot Ring, L x  ø = 38 x 8 mm,
Niebieska pipeta serologiczna z taśmą, 10 ml	Deltalab	PN10E1	Sterylna, pakowana pojedynczo (papier/plastik)
Pipeta serologiczna z taśmą, 50 ml	Deltalab	900043	sterylna, pakowana pojedynczo (papier/plastik)
Termi-DNA-Tor - Zmywacz	kwasów nukleinowychBioTools	22001-4291	Środek do usuwania kwasów nukleinowych, bakterii, grzybów i mykoplazm z materiału i powierzchni, 450 ml
wodnego odczynnika do biologii molekularnej, 1L	Sigma-Aldrich	W4502-1L	bez nukleaz i proteazy, 0,1 μ m
Filtrowana torba Whirl-Pak, 540 ml	Deltalab	200361	Stabilna dolna
torba z zamkiem błyskawicznym	LabBox	BZIP-080-100	Polietylen, dł. x szer. = 120 x 80 mm