Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59463

⸱

11 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy VirWaTest, który jest prostą, niedrogą i przenośną metodą koncentracji i wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użycia.

Streszczenie

Wirusy wydzielane przez ludzi i zwierzęta mogą zanieczyszczać źródła wody i stanowić zagrożenie dla zdrowia ludzkiego, gdy ta woda jest używana do picia, nawadniania żywności, mycia itp. Klasyczny wskaźnik bakterii kałowych nie zawsze sprawdza obecność patogenów wirusowych, dlatego wykrywanie patogenów wirusowych i wskaźników wirusowych jest istotne w celu przyjęcia środków ograniczających ryzyko, zwłaszcza w scenariuszach humanitarnych i na obszarach, na których często występują epidemie wirusów przenoszonych przez wodę.

Obecnie dostępnych jest kilka komercyjnych testów pozwalających na ilościowe określenie bakterii wskaźnikowych kału (FIB) w miejscu użycia. Jednak takie komercyjne testy nie są dostępne do wykrywania wirusów. Wykrycie wirusów w próbkach wody środowiskowej wymaga skoncentrowania kilku litrów w mniejszych objętościach. Co więcej, po skoncentrowaniu wykrywanie wirusów opiera się na metodach takich jak ekstrakcja kwasów nukleinowych i wykrywanie molekularne (np. testy oparte na reakcji łańcuchowej polimerazy [PCR]) genomów wirusa.

Opisana tutaj metoda pozwala na koncentrację wirusów z 10 litrowych próbek wody, jak również ekstrakcję wirusowych kwasów nukleinowych w miejscu użycia, za pomocą prostego i przenośnego sprzętu. Pozwala to na badanie próbek wody w miejscu użycia pod kątem kilku wirusów i jest przydatne w scenariuszach humanitarnych, a także w każdym kontekście, w którym nie jest dostępne wyposażone laboratorium. Alternatywnie, metoda ta pozwala na zagęszczenie wirusów obecnych w próbkach wody i wysłanie koncentratu do laboratorium w temperaturze pokojowej w celu dalszej analizy.

Wprowadzenie

Podczas pierwszych faz każdej sytuacji humanitarnej, dostęp do czystej wody, urządzeń sanitarnych i higieny jest krytyczny dla przetrwania osób dotkniętych kryzysem. Dlatego monitorowanie jakości wody jest priorytetem, aby zapobiec epidemiom przenoszonym przez wodę. Powszechnie wiadomo, że zanieczyszczona woda jest często źródłem chorób, ale często trudno jest określić źródła epidemii wirusów, takich jak wirus zapalenia wątroby typu E (HEV), nawet przy dostępności konwencjonalnych metod laboratoryjnych. Kontrola jakości wody opiera się na kwantyfikacji FIB1,2,3,4. Zostało jednak obszernie udokumentowane, że nie ma korelacji między brakiem FIB a obecnością wirusowych patogenów przenoszonych przez wodę, takich jak rotawirus (RoV), norowirus (NoV) lub HEV5,6. W związku z tym stosowanie kryteriów jakości wody opartych na FIB może prowadzić do niedoszacowania zagrożeń związanych z obecnością patogenów wirusowych przenoszonych przez wodę. Nadzór nad wirusami wskaźnikowymi, takimi jak ludzkie adenowirusy (HAdV) lub określone patogeny, byłby pomocny w określeniu narażenia na patogeny wirusowe i identyfikacji potencjalnego źródła infekcji u ludzi7,8,9,10 oraz w walidacji skuteczności środków sanitarnych11.

Do tej pory wykrywanie wirusów w tych scenariuszach polegało na wykwalifikowanym personelu i skomplikowanej logistyce. VirWaTest (virwatest.org) ma na celu opracowanie prostej, niedrogiej i przenośnej metody zagęszczania, a następnie wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użytkowania.

Koncentracja wirusa opiera się na zasadzie organicznej flokulacji 10 litrowych próbek wody, dzięki której wirusy są odzyskiwane w mniejszych ilościach12,13. Kłaczki są zbierane i dodawane do buforu, który lizuje wirusy i zapobiega degradacji kwasów nukleinowych, gdy są przechowywane w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 2 tygodnie.

Metoda ekstrakcji kwasów nukleinowych opiera się na użyciu cząstek magnetycznych, do których kwasy nukleinowe są adsorbowane. Można je przenieść z jednego bufora płuczącego do drugiego, a na koniec do buforu elucyjnego za pomocą pipety magnetycznej, do której przyczepiają się cząstki. Otrzymane zawiesiny wirusowych kwasów nukleinowych można wysłać do laboratorium referencyjnego, gdzie można przeprowadzić detekcję przy użyciu metod molekularnych opartych na PCR. Dla każdej ekstrakcji kwasu nukleinowego badane są dwie różne wielkości, aby wykluczyć inhibicję enzymatyczną pochodzącą z próbki. Alternatywnie, przy minimalnej dostępności sprzętu, testy PCR można przeprowadzić w miejscu użytkowania. Cały proces został zaprojektowany tak, aby można go było przeprowadzić niezależnie od źródła zasilania (ilustracja 1).

Ilościowy test PCR do wykrywania HAdV, wydalanego przez ludzi i znajdującego się w próbkach ścieków w wysokich stężeniach, został przystosowany do przeprowadzenia w miejscu użycia. HAdV są stosowane jako wskaźniki wirusa ludzkiego kału. PCR do oznaczania ilościowego bakteriofaga MS2 został również dostosowany, ponieważ MS2 jest używany w VirWaTest jako kontrola procesu. Metodę można dostosować do wykrywania dowolnego wirusa, który Cię interesuje.

Po opracowaniu, metoda VirWaTest została zastosowana przez użytkowników w dwóch różnych ustawieniach w Republice Afryki Środkowej (RCA) i Ekwadorze, dostarczając informacji zwrotnych na temat zastosowania protokołu w rzeczywistych sytuacjach.

O naszej wiedzy, jest to pierwsza procedura, która pozwala na koncentrację i wykrywanie wirusów w miejscu użytkowania, niezależnie od jakiegokolwiek zasilania, dużego sprzętu i warunków zamrażania/chłodzenia. Zaleca się pobranie dwóch powtórzeń każdej próbki wody w celu uzyskania wiarygodnych wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie i pakowanie

UWAGA: Materiały/sprzęt do pakowania są wymienione w Tabeli 1. Używać rękawic do obchodzenia się z odczynnikami wymaganymi do kontroli procesu, odczynnikami stężającymi, odczynnikami do ekstrakcji kwasów nukleinowych i odczynnikami do wykrywania. Nosić okulary ochronne, aby obchodzić się z odczynnikami wymaganymi do ekstrakcji kwasów nukleinowych.

  1. Sterowanie procesami
    1. Przygotować podstawową kulturę bakteriofagów MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) zawierającą 1 x10 10 PFU/ml w laboratorium, postępując zgodnie z procedurą ISO 10705-1:199514.
    2. Następnie podamy 10 μl zawiesiny na probówkę zawierającą 1 x 108 PFU do probówek o pojemności 10 ml i pozwól wodzie odparować w temperaturze 37 °C. Użyć jednej probówki na próbkę wody.
    3. Dodatkowo należy przygotować jedną probówkę zawierającą 10 ml sterylnej wody destylowanej na pobraną próbkę.
  2. Odczynniki do zatężania
    1. W przypadku wstępnie flokulowanego roztworu mleka odtłuszczonego (PSM) należy użyć następujących ilości w celu zagęszczenia pięciu 10 l próbek wody.
      1. Przygotuj plastikową tubkę zawierającą 5 g odtłuszczonego mleka.
      2. Przygotuj plastikową torbę z zamkiem błyskawicznym zawierającą 16,66 g soli morskich.
      3. Przygotuj plastikową butelkę zawierającą 500 ml wody destylowanej.
    2. Przygotować odczynniki wymagane do dostosowania pH. Poniższe ilości należy zastosować w celu dostosowania pH PSM i pięciu próbek wody o objętości 10 l.
      1. Dodaj 5 g 1-hydratu kwasu cytrynowego do plastikowej tubki o pojemności 10 ml.
        UWAGA: Kwas cytrynowy powoduje poważne podrażnienie w kontakcie z oczami. W takim przypadku należy ostrożnie płukać oko wodą przez kilka minut. Jeśli podrażnienie nie ustąpi, zasięgnij porady lekarza.
      2. Wlej 2 g wodorotlenku sodu do plastikowej probówki o pojemności 10 ml.
        UWAGA: Wodorotlenek sodu może powodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. W przypadku połknięcia wypłukać usta. Nie wywoływać wymiotów. W przypadku kontaktu z oczami należy ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Następnie zasięgnij porady lekarza.
      3. Wlej 25 ml sterylnej wody destylowanej do plastikowego pojemnika.
      4. Wlej 50 ml sterylnej wody destylowanej do plastikowego pojemnika.
    3. Przygotować saszetkę do kondycjonowania próbki używaną do flokulacji, roztwór konserwujący używany do konserwacji kwasów nukleinowych oraz saszetkę neutralizującą do neutralizacji wyrzuconej wody i materiałów. Na każde 10 l próbki wody, która ma być poddana badaniu, należy stosować następujące ilości.
      1. Włóż 15 g soli morskich i 8 g 1-hydratu kwasu cytrynowego do plastikowej torebki z zamkiem błyskawicznym na saszetkę kondycjonującą.
      2. Dodaj 2 ml buforu do lizy (tabela materiałów) i 0,3 ml środka konserwującego kwasy nukleinowe (tabela materiałów) do probówki o pojemności 5 ml.
        UWAGA: Bufor do lizy zawiera tiocyjanian guanidyny i Triton X-100. Kontakt z kwasem uwalnia toksyczny gaz, który jest szkodliwy w przypadku połknięcia, wdychania lub kontaktu ze skórą. W przypadku połknięcia wypłukać usta. Nie wywoływać wymiotów. Jeśli dojdzie do kontaktu ze skórą, umyj ją dużą ilością wody. Następnie zasięgnij porady lekarza. Środek konserwujący kwasy nukleinowe powoduje podrażnienie skóry i oczu i jest szkodliwy w przypadku połknięcia. W przypadku kontaktu ze skórą lub oczami płukać dużą ilością wody przez kilka minut. W każdym razie, zwłaszcza w przypadku połknięcia i złego samopoczucia, należy zasięgnąć porady lekarza.
      3. Wsyp 40 g proszku do prania w czterech plastikowych torebkach z zamkiem błyskawicznym.
        UWAGA: Detergent w proszku działa drażniąco na oczy. Jeśli dojdzie do kontaktu z oczami, płukać dużą ilością wody przez kilka minut. Jeśli podrażnienie utrzymuje się lub po połknięciu, należy zasięgnąć porady lekarza.
  3. Odczynniki do ekstrakcji kwasów nukleinowych
    1. Umieść 50 μl cząstek magnetycznych (tabela materiałów) i 1 ml etanolu 96% w probówce o pojemności 5 ml, która stanowi bufor wiążący.
      UWAGA: Bufor cząstek magnetycznych zawiera azydek sodu, który w kontakcie z kwasami lub jonami metali ciężkich tworzy toksyczny gaz i jest toksyczny w przypadku spożycia lub kontaktu ze skórą. W przypadku spożycia lub kontaktu ze skórą przepłukać usta lub skórę dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza. Etanol jest wysoce łatwopalną cieczą i parą i powoduje poważne podrażnienie oczu. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, iskier i innych źródeł zapłonu. W przypadku kontaktu ze skórą lub oczami spłukać dużą ilością wody. W przypadku spożycia dużej ilości wody i/lub w przypadku wdychania należy wyjść na zewnątrz na świeże powietrze. W każdym przypadku należy zasięgnąć porady lekarza.
    2. Dodaj 500 μl, 600 μl i 200 μl płuczących odpowiednio 1, 2 i 3 (tabela materiałów) do trzech probówek o pojemności 2 ml.
      UWAGA: myjące zawierają tiocyjanian guanidyny i chlorek guanidyny, które są szkodliwe w przypadku wdychania lub połknięcia i podrażniają skórę i oczy. W kontakcie z kwasami uwalnia się bardzo toksyczny gaz. Jeśli wejdą w kontakt ze skórą lub oczami, spłucz je dużą ilością wody. W przypadku połknięcia przepłukać usta dużą ilością wody. Nie wywoływać wymiotów. Zawsze zasięgnij porady lekarza.
    3. Dodać 120 μl buforu elucyjnego (tabela materiałów) do probówki o pojemności 0,5 ml.
  4. Odczynniki do wykrywania HAdV i MS2
    UWAGA: Dwie różne reakcje ekstrakcji kwasów nukleinowych mogą być analizowane jednocześnie w każdym teście PCR, jeśli używany jest termocykler 8-dołkowy. Do wszystkich testów PCR należy przygotować wodę z biologii molekularnej podzieloną na porcje do probówek o pojemności 1,5 ml.
    1. Detekcja HAdV
      1. Przygotować mieszaninę zawierającą 10 μl 22,5 μM AdF startera doprowadzającego do przodu, 10 μl 22,5 μM AdR startera odwrotnego i 5 μl sondy 11,25 μM AdP (Tabela 2).
      2. Dodać 2,5 μl mieszanki do probówek od 1 do 8 pasków probówki. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, zamknij rurki i chroń je przed światłem.
      3. Przetnij pasek, dzieląc go na dwa paski: rurki 1-5 i rurki 6-8.
      4. Przygotować seryjne rozcieńczenie zawiesin DNA zawierających sekwencję nukleotydową amplifikowanego regionu HAdV. Wysuszyć na powietrzu 1 μl zawiesin zawierających 1 x 105, 1 x 107 i 1 x 109 GC/ml do probówek 6-8,
        UWAGA: Probówki zawierające startery, sondę i wysuszone na powietrzu zawiesiny należy chronić przed światłem.
    2. Wykrywanie MS2
      1. Przygotować mieszaninę zawierającą 10 μl 25 μM startera do przodu pecson-2F, 10 μl 25 μM startera odwrotnego pecson-2R i 2,5 μl sondy 25 μM PecP-2 (tabela 2).
      2. Dodać 2,25 μl mieszanki do probówek od 1 do 8 paska probówki. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, zamknij rurki i chroń je przed światłem.
      3. Przetnij pasek, dzieląc go na dwa paski: rurki 1-5 i rurki 6-8.
      4. Postępuj jak w kroku 1.4.1.4, ale zamiast tego użyj standardowego zawieszenia przeznaczonego dla MS2.

2. Stężenie wirusa

UWAGA: Używaj rękawiczek przez cały czas podczas pobierania próbek, przygotowywania odczynników, flokulacji, zbierania kłaczków i procedur usuwania odpadów. Podczas procedury przygotowania odczynnika należy nosić okulary ochronne.

  1. Pobieranie próbek
    1. Pobrać próbkę wody o objętości 10 l do wiadra z płaskim dnem i pokrywką. Zebrać co najmniej dwie kontrpróby dla każdej próbki.
      UWAGA: Ważne jest, aby używać przezroczystych wiader do wizualizacji pelletu. Jeśli próbka wody zawiera zawieszony materiał (np. piasek, glony), pozwól mu osiadać, a następnie zbierz supernatant wodny do nowego wiadra.
    2. Zarejestruj pobraną objętość, a także miejsce i datę pobrania dla każdej próbki wody.
    3. Umieść mieszadło magnetyczne podłączone do akumulatora pod wspornikiem wiadra i umieść wiadro zawierające próbkę wody na jego wsporniku.
      UWAGA: Poszukaj płaskiej powierzchni w świeżym miejscu i trzymaj wiadra zawierające próbki wody z dala od bezpośredniego światła słonecznego.
  2. Przygotowanie odczynników
    1. Odczynniki do regulacji pH
      1. Wlej kwas cytrynowy w proszku i granulki wodorotlenku sodu do garnków zawierających odpowiednio 25 i 50 ml wody destylowanej.
      2. Delikatnie wstrząsać ręką, aż kwas cytrynowy i wodorotlenek sodu całkowicie się rozpuszczą.
        UWAGA: Nie zalewaj wodą granulek wodorotlenku sodu. Zamiast tego wlej granulki wodorotlenku sodu do wody.
    2. Mleko odtłuszczone wstępnie flokulowane
      1. Umieść stojący worek na mieszadle magnetycznym i wlej do niego 500 ml wody destylowanej. Wrzuć magnes mieszający do torby i włącz mieszadło magnetyczne.
      2. Wlej zawartość saszetki z solą morską i rurki z odtłuszczonym mlekiem do stojącej torebki i mieszaj przez 5 minut na średnich obrotach, aby je rozpuścić.
      3. Dodaj 3 ml kwasu cytrynowego do roztworu PSM za pomocą pipety Pasteura, aby upewnić się, że pH mieści się w przedziale od 3,4 do 3,6. Zmierz pH roztworu PSM za pomocą pasków wskaźnikowych pH. Dodaj mniejsze ilości kwasu cytrynowego i wodorotlenku sodu, gdy pH zbliży się do 3,5.
      4. Wyłącz mieszadło magnetyczne i upewnij się, że kłaczki są widoczne. Użyj latarki, aby pomóc w wizualizacji kłaczków.
  3. flokulacja
    1. Wrzuć magnes mieszający do wody, ustaw mieszadło magnetyczne na maksymalną prędkość i włącz je. Upewnij się, że magnes mieszający zaczyna się obracać.
    2. Dodaj 10 ml wody destylowanej do probówki kontrolnej procesu. Odwróć probówkę kilka razy, aby ponownie nawodnić zapas wirusa i wlej roztwór do wody.
    3. Wsypać zawartość jednej saszetki z kondycjonowaniem próbki do wody i mieszać przez 5 minut.
    4. Zmierzyć pH próbki wody za pomocą pasków wskaźnikowych pH. Dodaj kilka kropli kwasu cytrynowego lub wodorotlenku sodu do próbki wody, aby upewnić się, że pH mieści się w przedziale od 3,4 do 3,6. Dodaj mniejsze ilości kwasu cytrynowego i wodorotlenku sodu, gdy pH zbliży się do 3,5.
    5. Dodać 100 ml roztworu PSM za pomocą pojemnika o pojemności 100 ml.
    6. Zamknij wiadro pokrywką, ustaw mieszadło magnetyczne na minimalną prędkość i pozostaw mieszanie wody na 8 godzin.
    7. Wyłącz mieszadło magnetyczne i pozwól wodzie pozostać nieruchomo przez co najmniej 5 godzin, aby kłaczki mogły się uspokoić.
  4. Kolekcja Kłaczków
    1. Zbuduj system syfonowy składający się z kontrolera pipet, dwóch pipet i plastikowej rurki do zasysania supernatantu wody do odprowadzania wody na kłaczki.
      1. Podłącz pipetę z taśmą o pojemności 10 ml do kontrolera pipety. Następnie przymocuj końcówkę pipety do plastikowej rurki.
      2. Wyjmij filtr z pipety z otwartą końcówką o pojemności 10 ml za pomocą pęsety i przymocuj pipetę do plastikowej rurki.
    2. Postaw puste wiadro na podłodze.
    3. Zanurz końcówkę pipety z otwartą końcówką w wodzie. Upewnij się, że trzymasz go blisko powierzchni wody, aby nie naruszyć kłaczków. Zassać supernatant wodny tak długo, aż dotrze do pipety z końcówką taśmy.
    4. Chwyć plastikową rurkę za koniec przymocowany do pipety z taśmą i odłącz ją od pipety.
    5. Umieść probówkę w pustym wiadrze. Zwolnij ciśnienie na rurce, aby woda mogła spłynąć do pustego wiadra.
    6. Ściśnij plastikową rurkę, aby zatrzymać przepływ wody, gdy poziom wody ma dotrzeć do magnesu mieszającego, i odsuń pipetę od wiadra.
    7. Potrząśnij wiadrem, aby ponownie zawiesić kłaczki i wlej je do plastikowej torebki o pojemności 500 ml. Pozwól kłaczkom osiąść jeszcze przez 1 godzinę.
    8. Ostrożnie odessać supernatant wodny za pomocą pipety o pojemności 50 ml i ręcznego sterownika pipet, unikając naruszania kłaczków.
    9. Odessać kłaczki za pomocą pipety o pojemności 100 ml i przenieść je do 50 ml wyskalowanej probówki wirówkowej. Zanotuj końcową objętość koncentratu próbki i przenieś 1 ml jej 1 ml do probówki o pojemności 5 ml zawierającej roztwór konserwujący, używając pipety Pasteura.
      UWAGA: Ważne jest, aby probówka wirówkowa była wyskalowana, aby można było jak najdokładniej zmierzyć i zarejestrować końcową objętość zagęszczonej próbki.
    10. Wykonaj ekstrakcję kwasu nukleinowego w terenie. Alternatywnie, roztwór konserwujący zawierający wirusy należy przechowywać w temperaturze do 15 °C przez okres do 15 dni lub wysłać go do laboratorium referencyjnego w celu dalszej analizy.
  5. Utylizacja odpadów i ponowne wykorzystanie materiałów
    1. Dodać zawartość saszetki ze środkiem neutralizującym do wiadra zawierającego wylaną wodę. Wymieszaj wodę, a następnie pozostaw ją nieruchomą na 30 minut.
    2. Oczyszczoną wodę należy utylizować jako odpady ogólne.
    3. Umieść pipety i plastikową rurkę w wiadrze. Napełnij wiadro wodą i wlej zawartość jednej saszetki ze środkiem neutralizującym.
    4. Myj je przez co najmniej 30 minut, aby je wysterylizować i spłucz je dużą ilością czystej wody, aby usunąć pozostały środek neutralizujący.

3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

UWAGA: Używaj rękawiczek i zawsze noś okulary ochronne podczas procedury ekstrakcji kwasów nukleinowych.

  1. Obsługa pipety magnetycznej
    1. Zapoznaj się z działaniem pipety magnetycznej przed wykonaniem ekstrakcji.
  2. Ekstrakcja kwasów nukleinowych
    1. Ułóż probówki zawierające odczynniki potrzebne do ekstrakcji w stojaku, od lewej do prawej: bufor wiążący, płuczące i bufor elucyjny. Ustaw odpowiednią liczbę probówek w zależności od liczby analizowanych próbek lub kontrprób.
    2. Przenieść 1 ml koncentratu próbki do probówki zawierającej bufor wiążący, używając jednorazowej pipety Pasteura. Odwróć probówkę 8x do 10x, aby homogenizować roztwór.
    3. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 minut, ciągle mieszając, używając orbitalu zasilanego energią słoneczną lub ręcznie.
    4. Zbierz cząstki magnetyczne za pomocą pipety magnetycznej i czystej końcówki, którą można ponownie wykorzystać do trzech myjących.
    5. Uwolnij cząstki magnetyczne do probówki zawierającej 500 μl buforu płuczącego 1. Umyj je, delikatnie potrząsając roztworem końcówką przez 30 s i zbierz.
    6. Przenieść cząstki magnetyczne do probówki zawierającej 600 μl buforu płuczącego 2. Umyj je, delikatnie potrząsając roztworem końcówką przez 30 s i zbierz.
    7. Przenieść cząstki magnetyczne do probówki zawierającej 200 μl buforu płuczącego 3. Umyj je, delikatnie potrząsając roztworem końcówką przez 30 s i zbierz.
    8. Uwolnij cząstki magnetyczne do probówki zawierającej bufor elucyjny i wyrzuć końcówkę.
    9. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 5 minut, ciągle mieszając, używając zasilanego energią słoneczną orbitala.
      UWAGA: Mieszanie cząstek magnetycznych w buforze elucyjnym jest kluczowym krokiem. W przypadku braku orbitalu, w czasie inkubacji należy mieszać ręcznie w sposób ciągły.
    10. Wymień końcówkę pipety magnetycznej na nową i zbierz cząstki magnetyczne z buforu elucyjnego. Upewnij się, że całkowicie usunąłeś cząstki magnetyczne z buforu elucyjnego, ponieważ mogą one zakłócać metody wykrywania molekularnego.
    11. Wyrzuć końcówkę z przyczepionymi do niej cząstkami. Przystąpić do analizy PCR, wysłać bufor elucyjny do laboratorium referencyjnego lub przechowywać bufor elucyjny w temperaturze 4 °C do dalszej analizy.

4. Wykrywanie wirusów za pomocą zasilanego bateryjnie ośmiorurkowego termocyklera czasu rzeczywistego

UWAGA: Używaj rękawiczek i zawsze noś okulary ochronne podczas procedury wykrywania kwasów nukleinowych. Podczas wykonywania nowego eksperymentu PCR należy wymienić rękawice na nowe, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.

  1. Ilościowy PCR HAdV
    1. Dodaj 14 μl wody wolnej od nukleaz do probówek 2, 4 i 5.
    2. Dodaj 4 μl mieszanki PCR do probówek 1-5.
    3. Dodać 14 μl ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbki A do probówki 1 i 14 μl z próbki B do probówki 3.
    4. Dodać 2 μl wyekstrahowanych kwasów nukleinowych z próbki A do probówki 2 i 2 μl z próbki B do probówki 4. Zamknij pasek z pięcioma rurkami.
    5. Dodaj 14 μl wody wolnej od nukleaz do probówek 6, 7 i 8.
    6. Dodaj 4 μl tej mieszanki do probówek 6, 7 i 8 i zamknij je.
    7. Umieść oba paski w termocyklerze i wybierz odpowiedni przebieg (Tabela 3).
    8. Wyrzuć rurkę z wodą i przechowuj wyekstrahowany kwas nukleinowy w zamrażarce, jeśli to możliwe, lub, jeśli nie, w świeżym miejscu chronionym przed światłem na wypadek konieczności przeprowadzenia drugiego testu.
    9. Wyczyść mikropipety, stojak, materiał roboczy i cały materiał za pomocą środka czyszczącego z kwasami nukleinowymi i wyrzuć plastikową torbę zawierającą zużytą końcówkę, rękawice i probówki.
      UWAGA: Środek do usuwania kwasów nukleinowych jest bardzo łatwopalną cieczą i parą. Nie wdychać rozpylonej mgiełki i unikać kontaktu płynu z oczami lub skórą. W przeciwnym razie natychmiast spłucz dużą ilością wody i zasięgnij porady lekarza.
    10. Zbierz wyniki i przeanalizuj uzyskane dane.
  2. Ilościowy PCR MS2
    1. Dodaj 14 μl wody wolnej od nukleaz do probówek 2, 4 i 5.
    2. Dodać 4 μl mieszanki PCR i 0,5 μl enzymu odwrotnej transkryptazy do probówek 1-5.
    3. Dodać 14 μl ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbki A do probówki 1 i 14 μl z próbki B do probówki 3.
    4. Dodać 1 μl wyekstrahowanych kwasów nukleinowych z próbki A do probówki 2 i 1 μl z próbki B do probówki 4. Zamknij pasek z pięcioma rurkami.
    5. Dodaj 15,5 μl wody wolnej od nukleaz do probówek 5, 6, 7 i 8 i zamknij je.
    6. Dodać 4 μl mieszanki PCR i 0,5 μl enzymu odwrotnej transkryptazy do probówek 6, 7 i 8.
    7. Umieść oba paski w termocyklerze i wybierz odpowiedni przebieg (Tabela 3).
    8. Postępuj zgodnie z opisem w krokach od 4.1.8 do 4.1.10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowanie metody

Niniejsza procedura została opracowana w Laboratorium Wirusów Zanieczyszczających Wodę i Żywność we współpracy z GenIUL i Oxfam Intermón. Składa się ona z trzech różnych etapów. Pierwszy z nich, koncentracja cząstek wirusowych, stanowi adaptację metody flokulacji mlekiem odtłuszczonym, opisanej wcześniej12,17,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda VirWaTest umożliwia zagęszczenie wirusów i ekstrakcję kwasów nukleinowych z próbek wody w miejscu użytkowania przez niedoświadczonych użytkowników. Jest to niedrogi, szybki i prosty protokół. Zagęszczenie opiera się na zasadzie organicznej flokulacji przy użyciu mleka odtłuszczonego, dzięki której warunki niskiego pH i wysokiej przewodności powodują, że białka mleka odtłuszczonego agregują się w kłaczki, w których adsorbują się wirusy. Gdy kłaczki opadną, łatwo je zebrać, co pozwala na zagęszczenie 10 l wody, podc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

VirWaTest był projektem badawczym finansowanym przez program HIF (Humanitarian Innovation Funds) ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance). Autorzy dziękują zespołom WASH, które uprzejmie współpracowały przy tym badaniu. Analiza próbek w Ekwadorze została sfinansowana przez Oxfam Ecuador i Dirección de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas jest stypendystą Serra-Hunter na Uniwersytecie w Barcelonie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5x HOT FIREPol Sonda qPCR Mix Plus (ROX)Solis BioDyne08-14-00001Zawiera 5x sonda HOT FIREPol firmy Solis Biodyne qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 reakcji
Paski z 8 mikroprobówkami z nasadkamidD Biolab840637niskoprofilowy, cienkościenny, przystosowany do ilościowego i jakościowego PCR
Baterie i zasilacze do mieszadła magnetycznegoGenIUL900011674Zawiera zasilanie samochodu 12V adapter
Wspornik łyżkiGenIUL900011648Aluminiowy wspornik
Wiadro, 10 LCater4You10LTRPolipropylen, Zabezpieczenie przed manipulacją, Przezroczysty kolor
Probówka wirówkowa, 50 mlLabBoxCTSP-E50-050Polipropylen, sterylny, z podziałką, z osłoną
Kwas cytrynowy 1-hydrat, 500 gPanReac AppliChem1410181211czysty, klasa farmaceutyczna, 1 kilogram
Przezroczysta butelka PETLabBoxFPET-500-088Przezroczysty kolor, PET, nakrętka nie jest dołączona
Mleko odtłuszczone Difco, 500 gBecton Dickinson232100Dehydrated
DNA/RNA Shield, 250 mLZymo ResearchR1100-250Pożywka do konserwacji DNA/RNA, 250 ml
Easy9 Kontroler pipetLabBoxEAS9-001-0010,3 μ m filtr, Pipety od 0,1 do 100 mL, Autoklawowalny silikonowy uchwyt na pipety
Eppendorf Tube, 0,5 mlEppendorf0030121023polipropylen, Bezpiecznik Eppendorf
Probówka, 2 mlEppendorf0030120094polipropylen, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mLdD Biolab999542polipropylen, sterylny, stopniowany
etanol 96% v/v, 1 lPanreac AppliChem361085-1611UV, IR  i HPLC
LabBoxFORS-007-002Cienkie, zakrzywione końcówki, L=120 mm
Mieszadło magnetyczneGenIUL900017000Marker bateryjny
dD Biolab929203, bardzo cienka końcówka, wodoodporny, szybkoschnący, do plastiku i szkła
Micro Rota-Rack do mikroprobówekdD Biolab377824 moduły, dł. x szer. x wys. = 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Real-Time PCR CyclerCoyote Biosciences, ChinyMini-8Portable, Współpracuje z zasilaczami 12 V lub bateriami zewnętrznymi, Dwa kanały, Pojemność na 8 probówek
NucliSens Lysis BufferBiomerieux200292Odczynniki do 48 izolacji, Przechowywać w temperaturze otoczenia
Pipeta serologiczna z otwartą końcówką, 10 mlDeltalab900136NSterylna, pakowana pojedynczo (papier/plastik)
nakrętka PE PP28LabBoxTP28-004-020do butelek PET
Pasek wskaźnika pHLabBoxWSPH-001-001Zakres pH od 2,8 do pH 4,4, 50 pasków w opakowaniu
Plastikowa probówkaQuimikals300913zawiera nasadkę
Pipeta z polietylenu PasteuraLabBoxPIPP-003-500z podziałką, całkowita objętość 7 ml, Niesterylna
kolba polipropylenowa z nakrętką, 150 mlDeltalab409726Zakrętka, sterylna, z podziałką do 100 ml
Polipropylenowa kolba z nakrętką, 60 mlDeltalab409526GZakrętka, sterylna, z podziałką do 50 ml
Detergent w proszku-zwykłe mydło w proszku do prania ubrań
zasilające do mieszadła magnetycznegoGenIUL900011692Połączenie między bateriami a mieszadłami
magnetycznymi QuickPick Narzędzie magnetyczneBioNobile24001Ręczne narzędzie do cząstek magnetycznych
Końcówki QuickPick w pudełkuBioNobile24296Bez RNaz, autoklawowane, 96 jednostek
QuickPick XL gDNA Cząsteczki magnetyczneBioNobileSN511003,2 ml
Sole morskieSigma-AldrichS9883-500GSztuczna mieszanina soli bardzo przypominająca skład rozpuszczonych soli wody oceanicznej
Rurka silikonowaLabBoxSILT-006-005Rolka 5 metrów, wewnętrzna  ø x Zewnętrzna  ø= 6 x 10 mm
Granulki wodorotlenku sodu, 98,5 - 100,5%VWR Chemicals28244295Granulki, 1 kg
Solarna platforma obrotowaSOL-EXPERT Group70020Płyta akrylowa, 10 obr./min, obsługuje do 300 gramów
Zestaw 1-etapowej sondy SOLIScriptSolis BioDyne08-57-00250Zawiera 5x jednoetapową mieszankę sond Solis Biodyne (qPCR Mix) i 40x jednoetapową mieszankę SOLIScript (enzym odwrotnej transkryptazy), 250 reakcji
SPEEDTOOLS Zestaw do ekstrakcji wirusa RNABioTools21.141-4197Zawiera bufor BAW firmy BioTools (bufor płuczący 1), bufor BAV3 (bufor płuczący 2 i 3) oraz bufor BRE (bufor elucyjny).
SpinBar Octhaedral Stirring MagnetdD Biolab045926Pivot Ring, L x  ø = 38 x 8 mm,
Niebieska pipeta serologiczna z taśmą, 10 mlDeltalabPN10E1Sterylna, pakowana pojedynczo (papier/plastik)
Pipeta serologiczna z taśmą, 50 mlDeltalab900043sterylna, pakowana pojedynczo (papier/plastik)
Termi-DNA-Tor - Zmywaczkwasów nukleinowychBioTools22001-4291Środek do usuwania kwasów nukleinowych, bakterii, grzybów i mykoplazm z materiału i powierzchni, 450 ml
wodnego odczynnika do biologii molekularnej, 1LSigma-AldrichW4502-1Lbez nukleaz i proteazy, 0,1 μ m
Filtrowana torba Whirl-Pak, 540 mlDeltalab200361Stabilna dolna
torba z zamkiem błyskawicznymLabBoxBZIP-080-100Polietylen, dł. x szer. = 120 x 80 mm
Pęseta laboratoryjna

Bibliografia

  1. The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
  2. Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
  3. World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
  4. World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
  5. Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
  6. Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
  7. Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
  8. Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
  9. Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
  10. Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
  11. Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
  12. Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
  13. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
  14. International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
  15. Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
  16. Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
  17. Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
  18. Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).
  19. Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie wirusówKoncentracja wirusowaEkstrakcja kwasów nukleinowychMetoda VirWaTestCząstki magnetyczneTesty PCRLudzkie adenowirusyKontrola MS2
VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.