Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zaawansowany mysi model niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby w połączeniu z cukrzycą typu 2

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59470

⸱

26 kwietnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Endocrinology & Metabolism Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 2Berlin Institute of Health (BIH), 3Berlin-Brandenburg Center for Regenerative Therapies (BCRT), Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 4DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), 5Institute of Medical Immunology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, 6Julius Wolff Institute (JWI) and Center for Musculoskeletal Surgery, Charité - Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Germany, corporate member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano prosty i niezawodny model gryzoni indukowany dietą dla niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH), osiągnięty dzięki trzymaniu zwierząt bez SPF i podawaniu specyficznej diety wysokotłuszczowej. Opisujemy identyfikację podzbiorów komórek odpornościowych wątroby i tkanki tłuszczowej w celu podsumowania ludzkich warunków immunologicznych poprzez wystawienie myszy na zarazki środowiskowe.

Streszczenie

Otyłość jest związana z przewlekłym stanem zapalnym o niskim stopniu nasilenia i insulinoopornością, przyczyniając się do coraz częstszego występowania przewlekłych chorób metabolicznych, takich jak cukrzyca typu 2 i niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH). Ostatnie badania wykazały, że prozapalne komórki odpornościowe infiltrują otyłą, przerośniętą tkankę tłuszczową i wątrobę. Biorąc pod uwagę rosnące znaczenie komórek odpornościowych w kontekście homeostazy metabolicznej, istnieje pilna potrzeba ilościowego określenia i scharakteryzowania ich modyfikacji podczas rozwoju cukrzycy typu 2 i NASH. Jednak modele zwierzęce, które indukują cechy patofizjologiczne typowe dla ludzkiego NASH, są rzadkie.

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych wyizolowanych z wątroby i tkanki tłuszczowej w niezawodnym mysim modelu NASH, ustalonym przez trzymanie myszy na diecie wysokotłuszczowej (HFD) w warunkach niespecyficznych wolnych od patogenów (SPF) bez bariery przez co najmniej siedem tygodni. Pokazujemy postępowanie z myszami w warunkach bez SPF, trawienie tkanek i identyfikację makrofagów, komórek NK (natural killer), komórek dendrytycznych, podzbiorów limfocytów B i T za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawiono reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej myszy SPF HFD i myszy bez SPF. Aby uzyskać wiarygodne i możliwe do zinterpretowania dane, kluczowymi elementami są zastosowanie przeciwciał, dokładne i precyzyjne metody trawienia tkanek oraz prawidłowe bramkowanie w eksperymentach z cytometrią przepływową.

Interwencja mająca na celu przywrócenie fizjologicznej ekspozycji na antygen u myszy poprzez trzymanie ich w warunkach nie-SPF i niespecyficzną ekspozycję na antygeny mikrobiologiczne może dostarczyć odpowiedniego narzędzia do badania związku między zmianami immunologicznymi, otyłością wywołaną dietą i powiązanymi długoterminowymi powikłaniami.

Wprowadzenie

Otyłość jest zaburzeniem wieloczynnikowym i głównym czynnikiem ryzyka rozwoju chorób serca, udaru mózgu, niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH), cukrzycy typu 2 (T2D) i niektórych rodzajów raka. Częstość występowania otyłości gwałtownie rośnie na całym świecie. Obecnie 2,1 miliarda ludzi - prawie 30% światowej populacji - jest albo otyłych, albo ma nadwagę1. Insulinooporność związana z otyłością może prowadzić do cukrzycy typu 2, gdy wyczerpane komórki beta wysp trzustkowych nie są w stanie zrekompensować zwiększonego zapotrzebowania na insulinę do utrzymania homeostazy glukozy2.

Tkanka tłuszczowa składa się z różnych typów komórek, w tym adipocytów, komórek śródbłonka, fibroblastów i komórek odpornościowych. Podczas postępu otyłości zmiany w liczbie i aktywności komórek odpornościowych mogą prowadzić do stanu zapalnego przerostowej tkanki tłuszczowej o niskim stopniu nasilenia3,4. W szczególności stwierdzono, że nadmierne spożycie energii, któremu towarzyszy przewlekle podwyższony poziom glukozy we krwi, trójglicerydów i wolnych kwasów tłuszczowych, prowadzi do niedotlenienia adipocytów, stresu retikulum endoplazmatycznego, upośledzenia funkcji mitochondriów i zwiększonego wydzielania cytokin, co skutkuje aktywacją prozapalnych komórek odpornościowych tkanki tłuszczowej5,6. Wcześniejsze badania koncentrowały się głównie na odporności wrodzonej, ale ostatnio adaptacyjne komórki odpornościowe (limfocyty T i B) stały się ważnymi regulatorami homeostazy glukozy. Posiadają funkcje zapalne (w tym limfocyty T CD8+, limfocyty Th1 i B) lub przede wszystkim funkcje regulacyjne (w tym limfocyty T regulatorowe (Treg), komórki Th2) i mogą zarówno nasilać, jak i chronić przed insulinoopornością7,8,9.

Ponadto, zaproponowano kilka mechanizmów wyjaśniających, w jaki sposób otyłość zwiększa stłuszczeniowe zapalenie wątroby, w tym zwiększoną produkcję cytokin przez tkankę tłuszczową10. NASH, postępująca postać niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby i główne obciążenie zdrowotne w krajach rozwiniętych, histologicznie charakteryzuje się balonowatymi hepatocytami, nagromadzeniem lipidów, zwłóknieniem i zapaleniem okołokomórkowym i może przekształcić się w marskość wątroby, schyłkową niewydolność wątroby lub raka wątrobowokomórkowego. Wiadomo, że kilka schematów (na przykład dieta z niedoborem metioniny i choliny11) indukuje patologię wątroby podobną do NASH w modelach zwierzęcych innych niż ludzie, ale większość z tych podejść nie podsumowuje ludzkich stanów NASH i jego konsekwencji metabolicznych, ponieważ albo wymagają specyficznego nokautu genów, niefizjologicznych manipulacji dietetycznych, albo nie mają insulinooporności typowej dla ludzkiego NASH. Co więcej, nasze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw chorób metabolicznych opiera się obecnie na eksperymentach przeprowadzonych na myszach laboratoryjnych trzymanych w standardowych warunkach wolnych od patogenów (SPF). Te bariery są wyjątkowo higieniczne i nie uwzględniają różnorodności mikrobiologicznej, z jaką muszą się zetknąć ludzie, co może tłumaczyć trudności w procesie tłumaczenia badań na zwierzętach na podejścia kliniczne12,13,14.

Aby zbadać różne podzbiory komórek odpornościowych w tkance tłuszczowej i wątrobie podczas rozwoju insulinooporności i NASH w zaawansowanym modelu mysim odtwarzającym ludzkie warunki immunologiczne, myszy były trzymane w indywidualnych klatkach w warunkach półsterylnych bez bariery. Myszy trzymane w warunkach ekspozycji na antygen rozwinęły patologię wątroby podobną do NASH już po 15 tygodniach karmienia dietą wysokotłuszczową (HFD)13. W porównaniu z myszami SPF w tym samym wieku, rozwinęło się u nich stłuszczenie makropęcherzykowe, naciek wątroby i aktywacja komórek odpornościowych.

Ten manuskrypt opisuje solidną analizę cytometrii przepływowej w celu zdefiniowania i zliczenia podzbiorów komórek odpornościowych z mysiej tkanki tłuszczowej i wątroby w modelu NASH. Analiza cytometrii przepływowej pozwala na jednoczesne wykrycie wielu parametrów pojedynczych komórek, w przeciwieństwie do podejść RT-PCR lub immunohistochemicznych.

Podsumowując, nasze badanie oferuje mysi model krótkoterminowego HFD do badania rozwoju insulinooporności i NASH oraz podstawowych mechanizmów, które również wykazują wierność ludzkiej kondycji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health oraz Ustawą o dobrostanie zwierząt pod nadzorem naszego instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt. Protokoły z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi Charité Berlin w Niemczech i zostały zatwierdzone przez Landesamt für Gesundheit und Soziales i są zgodne z wytycznymi ARRIVE.

1. Zwierzęcy model stłuszczeniowego zapalenia wątroby wywołany dietą

  1. Przenieś myszy (C57Bl/6J, samce) do pomieszczeń bez SPF w wieku 4 tygodni i wystawiaj je w sposób ciągły na działanie szerokiej gamy patogenów/antygenów środowiskowych. Należy zagwarantować narażenie poprzez codzienne obchodzenie się ze zwierzętami laboratoryjnymi, ponieważ w ten sposób antygeny są rozprowadzane drogą powietrzną.
  2. Utrzymuj myszy (C57Bl/6J, samiec, 12 tygodni) w otwartych systemach klatkowych z konwencjonalnymi filtrami w cyklu 12 h: 12 h światła/ciemności w temperaturze 22 °C. Nie napromieniać ani nie autoklawować eksperymentalnej diety i ściółki. Wejdź do pomieszczenia dla zwierząt bez maski lub siatki na włosy. Otwórz drzwi między pomieszczeniami dla zwierząt. Nie używaj prysznica powietrznego.
  3. Zagwarantowanie codziennego obchodzenia się ze zwierzętami laboratoryjnymi i regularne przełączanie pomieszczeń, aby antygeny były rozprowadzane drogą powietrzną. Uzupełnienie brudnych pomieszczeń codzienną niespecyficzną ekspozycją mikrobiologiczną na antygeny pochodzące z ściółki ssaków zwierząt laboratoryjnych trzymanych w pomieszczeniach obok myszy laboratoryjnych.
  4. Zmierz proporcje limfocytów T CD4+ i CD8+ pamięci efektorowej CD44-CD62L- we krwi i śledzionie za pomocą cytometrii przepływowej (zgodnie z opisem w refefence13).
    nuta: W związku z tym zdefiniowaliśmy wzrost o 20% limfocytów T CD8 + pamięci efektorowej z limfocytów T CD8 + jako dowód wystarczającej ekspozycji na drobnoustroje.
  5. Rozpocznij HFD (60 kJ% z tłuszczu, 19 kJ% z białek i 21 kJ% z węglowodanów i ad libitum spożycie wody o 6% zawartości sacharozy z pięciotygodniowymi samcami myszy C57Bl/6J przez 7-15 tygodni. HFD powinien zawierać 60% kJ z tłuszczu (jak opisano powyżej) w celu wywołania rozwoju insulinooporności w trakcie trwania eksperymentu.
    nuta: Należy przeprowadzić barwienie hematoksyliną i znaleźć cechy histologiczne, takie jak balonowanie hepatocytów, ciała Mallory'ego Denk, naciek komórek odpornościowych i stłuszczenie makropęcherzyków, aby wykazać patologię wątroby podobną do NASH (jak pokazano w reference13).

2. Przygotowanie odczynników i roztworów

  1. Przygotować 70% etanol, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, bez wapnia i magnezu) uzupełnioną 0,5% BSA i buforem do lizy ACK (chlorek amonu-potasu).
  2. Bufor do barwienia
    1. Rozpuścić 10 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS) w 500 ml PBS, aby uzyskać 2% FCS PBS. Przed użyciem umieść bufor barwiący na lodzie.
    2. Przechowywać roztwór w plastikowej butelce w temperaturze 4 °C.
  3. Roztwór kolagenazy do trawienia tkanki tłuszczowej
    1. Rozpuścić 2,5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 500 ml PBS, aby uzyskać 0,5% BSA/PBS.
    2. Rozpuścić 74,5 g CaCl2 w 10 ml 0,5% BSA/PBS w celu uzyskania 10 mM roztworu CaCl2.
    3. Dodać 1 mg kolagenazy typu II (patrz tabela materiałów) do każdego ml 0,5% masy ciała za pomocą 10 mM CaCl2 PBS.
    4. Przygotować 3 ml roztworu trawiącego kolagenazę na g próbki tkanki tłuszczowej. Przygotuj świeży roztwór kolagenazy do każdej izolacji.
  4. Roztwór kolagenazy do trawienia tkanek wątroby
    1. Rozpuść 2,5 g BSA w 500 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS), aby uzyskać 0,5% BSA HBSS.
    2. Dodać 10 ml FCS do 500 ml 0,5% BSA/HBSS, aby uzyskać 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
    3. Dodać 0,5 mg kolagenazy typu IV (patrz Tabela Materiałów) do każdego ml 2% FCS 0,5% BSA/HBSS.
    4. Dodać 0,02 mg DNazy na ml 2% roztworu kolagenazy FCS 0,5% BSA/HBSS.
    5. Przygotować 13 ml roztworu do trawienia kolagenazy na próbkę tkanki wątroby.
    6. Przygotuj świeży roztwór kolagenazy do każdej izolacji.

3. Generowanie zawieszeń jednokomórkowych

  1. Trawienie tkanki tłuszczowej
    1. Eutanazja myszy za pomocą znieczulenia izofluranem, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Spryskaj klatkę piersiową 70% etanolem. Ostrożnie wykonaj 5-6 cm centralne nacięcie przez powłokę i ścianę brzucha na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową i serce.
      nuta: Nie uszkadzaj leżących poniżej narządów i trzymaj końcówki nożyczek w górze.
    2. Wstrzyknąć co najmniej 10 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej w wierzchołek lewej komory za pomocą igły 26 G.
      nuta: Pomyślną perfuzję odnotowuje się poprzez blanszowanie wątroby.
    3. Otwórz jamę otrzewnej nożyczkami i wytnij okołodomięśniowe poduszeczki tłuszczowe z każdej strony cienkimi zakrzywionymi nożyczkami. Wypreparuj tkanki gonad cienkimi zakrzywionymi nożyczkami i zważ tkankę tłuszczową.
    4. Przeprowadzić mechaniczną dysocjację za pomocą nożyczek i pociąć tkankę tłuszczową na drobne kawałki na szalce Petriego w temperaturze 4 °C. Przenieść tkankę tłuszczową do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i przepłukać szalkę Petriego 1 ml 0,5% BSA/PBS.
    5. Dodać 3 ml roztworu do trawienia tkanki tłuszczowej (przygotowanego w kroku 2.3) na gram tkanki tłuszczowej. Inkubować roztwór tkanki tłuszczowej w temperaturze 37 °C przez 20 minut pod delikatnym wstrząsaniem (200 obr./min).
    6. Dodaj 5 ml 0,5% BSA/PBS na gram tkanki tłuszczowej i umieść na lodzie. Roztwór należy kilkakrotnie rozcierać pipetą serologiczną o pojemności 10 ml i przepuszczać przez sitko (100 μm) za pomocą tłoka.
    7. Wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Usunąć pływającą frakcję adipocytów przez pipetowanie. Zawiesić osad komórkowy (frakcja naczyniowa zrębu) w 1 ml buforu do lizy ACK (patrz tabela materiałów). Dodać 10 ml 2% FCS PBS.
    9. Wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 250 μl 2% FCS PBS.
    11. Policz liczbę żywotnych komórek na hemocytometrze za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego.
  2. Trawienie tkanek wątroby
    1. Wątrobę należy przechowywać w stożkowej probówce wirówkowej wypełnionej PBS i transportować na lodzie.
    2. Przeprowadzić dysocjację mechaniczną za pomocą strzykawek na szalce Petriego w temperaturze 4 °C. Wypreparowaną tkankę wątroby umieścić w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml ciepłego roztworu do trawienia wątroby. Opłucz szalkę Petriego 3 ml roztworu do trawienia wątroby.
    3. Inkubować roztwór tkanki wątroby w temperaturze 37 °C przez 20 minut pod delikatnym wstrząsaniem (200 obr./min).
    4. Dodaj 20 ml HBSS. Roztwór należy kilkakrotnie rozcierać pipetą serologiczną o pojemności 10 ml i przepuszczać przez sitko (100 μm) za pomocą tłoka.
    5. Wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 ml HBSS.
    6. Wirować przy 30 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej w celu usunięcia matrycy hepatocytów. Wyrzuć osad komórkowy.
    7. Odwirować supernatant przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 10 ml 33% roztworu pożywki o niskim gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w HBSS, a następnie odwirować (800 x g; 30 min; temperatura pokojowa; bez hamulca).
    8. Zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy ACK i inkubować przez 4 minuty w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 10 ml HBSS.
      nuta: Aby odrzucić supernatant, należy bardzo ostrożnie odessać supernatant z interfazą (hepatocytami) za pomocą pipety transferowej (w miarę możliwości bez przyjmowania osadu z komórkami odpornościowymi i erytrocytami).
    9. Przepuścić komórki przez sitko o pojemności 30 μm w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i zawiesić komórki w 250 μl 2% FCS PBS.
    10. Policz liczbę żywotnych komórek na hemocytometrze za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego.

4. Barwienie powierzchni

  1. Przygotować mieszaninę przeciwciał dla podzbiorów limfocytów T (Panel 1) i wrodzonych komórek odpornościowych (Panel 2), jak opisano w Tabeli 1 i Tabeli 2. Objętości są zoptymalizowane dla jednej próbki (100 μl) pod kątem stężeń przeciwciał.
    nuta: Limfocyty i wrodzone komórki odpornościowe wykazują różnice w autofluorescencji i powinny być analizowane oddzielnie.
  2. Użyj do 3 x 106 komórek w 100 μl w probówce z polistyrenu FACS do barwienia powierzchni. Aby zablokować receptory Fc, dodać 10 μl przeciwciała anty-CD16/CD32 (rozcieńczonego w stosunku 1:100) i inkubować przez 10 minut na lodzie. Użyj niebarwionej próbki kontroli ujemnej, aby dostosować rozproszenie boczne (SSC) i rozproszenie do przodu (FSC) w celu określenia lokalizacji ujemnej populacji komórek.
  3. Wykonać wir i dodać odpowiednią objętość mieszaniny przeciwciał dla Panelu 1 i Panelu 2. Do każdej próbki dodać 1 μl barwnika żywotności, aby umożliwić rozróżnienie żywych i martwych komórek. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.
  4. Przemyć dwa razy 2 ml 2% FCS PBS i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Zawiesić osad komórkowy w 300 μl 2% FCS PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy FACS.
    nuta: Przed rozpoczęciem pomiaru przepuść komórki przez sitko o średnicy 30 μm do polistyrenowej rurki FACS i wiruj. Cytometrię przepływową przeprowadzono na znakowanych komórkach przechowywanych w 2% FCS PBS w temperaturze 4 °C przez 1-3 godziny. Komórki należy przeanalizować tak szybko, jak to możliwe, aby uzyskać optymalne wyniki.

5. Kompensacja, akwizycja i bramkowanie cytometrii przepływowej

  1. Uruchomić niebarwioną próbkę kontroli ujemnej, aby ustawić FSC i SSC oraz dostosować napięcia cytometru przepływowego w celu wykrycia populacji leukocytów i rozróżnienia między szczątkami a żywymi komórkami. Wykluczenie zanieczyszczeń i martwych komórek.
    nuta: Żywotność zawiesin komórkowych z wątroby może być niższa niż żywotność zawiesin komórkowych z okołogonadalnej tkanki tłuszczowej ze względu na dodatkowy etap separacji gęstości.
  2. Uruchamianie pojedynczych barwionych próbek kontrolnych w celu kompensacji wielobarwnej.
    nuta: Kulki wychwytujące przeciwciała mogą być również używane do dostosowania do nakładania się widma, jeśli liczba komórek w populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania jest zbyt niska, aby można było to skompensować za pomocą komórek. Aby wykryć możliwe sygnały autofluorescencji komórek, fluorescencja minus jeden (FMO) zaleca się kontrole dla każdego przeciwciała, ale nie były one stosowane w tym protokole.
  3. Rozpocznij pomiar, zbierz odpowiednią liczbę zdarzeń (co najmniej 50 000 zdarzeń) i zapisz dane eksperymentalne.
  4. Eksportuj pliki danych FCS do analizy i ustaw strategię bramkowania. Bramka na leukocytach CD45 + w celu identyfikacji kolejnych populacji komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisany protokół umożliwia charakterystykę markerów powierzchniowych komórek odporności wrodzonej i nabytej wyizolowanych z tkanki tłuszczowej perigonadalnej oraz wątroby myszy w modelu NASH indukowanego dietą. W modelu tym NASH indukowano poprzez podawanie HFD oraz sacharozy (6%) w wodzie pitnej przez okres od 7 do 15 tygodni u myszy C57Bl/6J, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami13. Co istotne, myszy były utrzymywane w warunkach półsterylnych, a tym samym eksponowane na antygeny środowiskowe pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stłuszczeniowe zapalenie wątroby ma silny związek z nieprawidłowościami metabolicznymi, takimi jak otyłość, insulinooporność i dyslipidemia15. Liczne badania wskazują, że zapalenie tkanki tłuszczowej może napędzać patogenezę cukrzycy typu 2, w tym zmieniony poziom komórek zarówno wrodzonego, jak i nabytego układu odpornościowego 4,5,16,17. Ponadto stwierdzono, że otyłość...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Anke Jurisch, Dianie Woellner, dr Kathrin Witte i Cornelii Heckmann za pomoc w procedurach eksperymentalnych oraz Benjaminowi Tiburzy z Biolegend za pomocne komentarze na temat strategii bramkowania. J.S. był wspierany przez Helmholtz Grant (ICEMED). Badanie to było wspierane przez granty z Zakładu Badań Klinicznych Berlińskiego Instytutu Zdrowia (BIH), "BCRT-grant" niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych oraz Fundacji Einsteina. K.S.-B. oraz H.-D.V. są finansowane przez FOR2165.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100 &mikro; M Sitka komórkowe Falcon352340
1 ml BD   
Igły 26 G x 5/8 BD 
Szalki Petriego 35 mm Sokół353001
40 & mikro; M Sitka komórkowe Bufor352340
ACK GIBCOA1049201
Alexa Fluor 700 anty-mysi CD45Biolegend 103127AB_493714 (BioLegend Cat. Nr 103127)
Oprogramowanie analityczne FlowJo 10.0.8
APC anty-mysie przeciwciało CD11cBiolegend 117309AB_313778 (BioLegend Cat. Nr 117309)
Przeciwciało anty-mysie APC KLRG1 (MAFA)Biolegend 138411AB_10645509 (BioLegend Cat. Nr 138411)
BV421 przeciwciało anty-mysie CD127 Biolegend 135023AB_10897948 (BioLegend Cat. Nr 135023)
BV421 przeciwciało przeciw myszom F4/80Biolegend 123131AB_10901171 (BioLegend Cat. Nr 123131)
BV605 anty-mysie przeciwciało CD279 (PD-1)Biolegend 135219AB_11125371 (BioLegend Cat. Nr 135219)
BV605 przeciwciało anty-mysie NK-1.1 Biolegend 108739AB_2562273 (BioLegend Cat. Nr 108739)
BV650 przeciwciało anty-mysie/ludzkie CD11b Biolegend 101239AB_11125575 (BioLegend Cat. Nr 101239)
BV711 przeciwciało anty-mysie/ludzkie B220Biolegend 103255AB_2563491 (BioLegend Cat. Nr 103255)
BV785 przeciwciało anty-mysie CD8a Biolegend 100749AB_11218801 (BioLegend Cat. Nr 100749)
Myszy C57Bl/6J, samiec, 5 tygodni Forschungseinrichtungen fü r experimentelle Medizin (FEM)
CaCl2 Charité - Universitä tsmedizin BerlinA119.1 
Sprawdzona klasa kolagenazy NB 4G SERVA 
Collagenase Typ I Worthington 
Stożkowa probówka wirówkowa 15mL Falcon352096
Stożkowa probówka wirówkowa 50 mL Falcon352070
DNAse   Sigma-Aldrich 
Surowica bydlęca płodu BiochromS0115
Filtr 30µ m Komórka 
FITC Przeciwciało anty-mysie CD3 Biolegend 100203AB_312660 (BioLegend Cat. Nr 100203)
Cytometria przepływowa BD-LSR Fortessa 
Kleszcze Sigma-Aldrich F4142-1EA
HBSS Bioanalityczne GmBH Numer katalogowy: 085021-0500 
Dieta wysokotłuszczowa SSNIFE15741– 34 60 kJ% z tłuszczu, 19  kJ% z białek i 21  kJ% z
węglowodanów mikro nożyczki preparacyjne Sigma-Aldrich S3146używany do celów preparacyjnych 
PE przeciwciało anty-mysie CD25 Biolegend 101903AB_312846 (BioLegend Cat. Nr 101903)
PE/Cy7 Przeciwciało anty-mysie CD62LBiolegend 104417AB_313102 (BioLegend Cat. Nr 104417)
PE/Cy7 Mysie przeciwciało I-A/I-E (MHCII)Biolegend 107629AB_2290801 (BioLegend Cat. Nr 107629)
PE/Dazzle 594 przeciwciało anty-mysie CD4Biolegend 100565AB_2563684 (BioLegend Cat. Nr 100565)
Rozwiązanie Percoll BiochromL6115
PerCP/Cy5.5 przeciwciało anty-mysie CD44Biolegend 103031AB_2076206 (BioLegend Cat. Nr 103031)
PerCP/Cy5.5 przeciwciało anty-mysie Gr-1Biolegend 108427AB_893561 (BioLegend Cat. Nr 108427)
Sola fizjologiczna buforowana fosforanami Gibco12559069
Rurki okrągłodenne z nasadką sitową do komórekSTEMCELL Technologies 38030
TruStain fcX anti-mouse CD16/32Biolegend 101301AB_312800 (BioLegend Cat. Nr 101301)
Trypan Blue Sigma-Aldrich T6146
Zestaw do naprawy żywotności Zombie NIR Biolegend 423105plama wiadolności 
Strzykawka 309659305115 do lizy Falcon Oprogramowanie 11427513LS0041974716728001400422316

Bibliografia

  1. Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: A systematic review and meta-analysis. BMC Public Health. 9, 88(2009).
  2. Prentki, M. Islet β cell failure in type. J Clin Invest. 116 (7), 1802-1812 (2006).
  3. Shoelson, S. E., Lee, J., Goldfine, A. B. Inflammation and insulin resistance. Journal of Clinical Investigation. 116 (7), 1793-1801 (2006).
  4. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840(2006).
  5. Exley, M. A., Hand, L., O'Shea, D., Lynch, L. Interplay between the immune system and adipose tissue in obesity. Journal of Endocrinology. 223 (2), R41-R48 (2014).
  6. Ferrante, A. W. Macrophages, fat, and the emergence of immunometabolism. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 4992-4993 (2013).
  7. Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610(2011).
  8. Onodera, T., et al. Adipose tissue macrophages induce PPARγ-high FOXP3(+) regulatory T cells. Scientific Reports. 5, (2015).
  9. Lackey, D. E., Olefsky, J. M. Regulation of metabolism by the innate immune system. Nature Reviews Endocrinology. 12, 15(2015).
  10. Calle, E. E., Kaaks, R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and proposed mechanisms. Nature Reviews Cancer. 4, 579(2004).
  11. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Digestive Diseases and Sciences. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  12. Beura, L. K., et al. Recapitulating adult human immune traits in laboratory mice by normalizing environment. Nature. 532 (7600), 512-516 (2016).
  13. Sbierski-Kind, J., et al. Distinct Housing Conditions Reveal a Major Impact of Adaptive Immunity on the Course of Obesity-Induced Type 2 Diabetes. Frontiers in Immunology. 9 (1069), (2018).
  14. Japp, A. S., et al. Wild immunology assessed by multidimensional mass cytometry. Cytometry Part A. 91 (1), 85-95 (2017).
  15. Benedict, M., Zhang, X. Non-alcoholic fatty liver disease: An expanded review. World Journal of Hepatology. 9 (16), 715-732 (2017).
  16. McNelis, J. C., Olefsky, J. M. Macrophages, Immunity, and Metabolic Disease. Immunity. 41 (1), 36-48 (2014).
  17. Ferrante, A. W. The Immune Cells in Adipose Tissue. Diabetes, Obesity & Metabolism. 15, 34-38 (2013).
  18. Bertola, A., et al. Hepatic expression patterns of inflammatory and immune response genes associated with obesity and NASH in morbidly obese patients. PloS One. 5 (10), e13577(2010).
  19. Turnbaugh, P. J., Bäckhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-Induced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome. Cell Host & Microbe. 3 (4), 213-223 (2008).
  20. Singh, R. K., et al. Influence of diet on the gut microbiome and implications for human health. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 73(2017).
  21. Müller, V. M., et al. Gut barrier impairment by high-fat diet in mice depends on housing conditions. Molecular Nutrition & Food Research. 60 (4), 897-908 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Myszy na diecie wysokotłuszczowejwarunki non-SPFfrakcja naczyniowo-stromalnaanaliza cytometrycznaprotokół trawienia tkanekizolacja komórek odpornościowychtkanka tłuszczowa wątrobystrategia bramkowania
Zaawansowany mysi model niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby w połączeniu z cukrzycą typu 2
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.