Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Chemiczna inaktywacja cereblon ligazy ubikwityny E3 przez Homo-PROTAC na bazie pomalidomidu

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59472

⸱

15 maja 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University Hospital Ulm, 2Pharmaceutical Institute, Pharmaceutical Chemistry I, University of Bonn

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje syntezę i charakterystykę dwufunkcyjnego homo-PROTAC na bazie pomalidomidu jako nowatorskie podejście do indukowania ubikwitynacji i degradacji cereblonu ligazy ubikwityny E3 (CRBN), celu analogów talidomidu.

Streszczenie

Leki immunomodulujące (IMiDs) talidomid i jego analogi, lenalidomid i pomalidomid, wszystkie zatwierdzone przez FDA leki do leczenia szpiczaka mnogiego, wywołują ubikwitynację i degradację limfoidalnych czynników transkrypcyjnych Ikaros (IKZF1) i Aiolos (IKZF3) za pośrednictwem ligazy ubikwityny E3 w celu degradacji proteasomalnej. IMiD zostały ostatnio wykorzystane do generowania dwufunkcyjnych chimer ukierunkowanych na proteolizę (PROTAC) w celu ukierunkowania na inne białka w celu ubikwitynacji i degradacji proteasomalnej przez ligazę CRBN E3. Zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy homobifunkcyjne PROTAC na bazie pomalidomidu i przeanalizowaliśmy ich zdolność do indukowania samosterowanej ubikwitynacji i degradacji CRBN. W tym przypadku CRBN służy zarówno jako ligaza ubikwityny E3, jak i cel w tym samym czasie. Związek homo-PROTAC 8 rozkłada CRBN z dużą siłą działania przy minimalnym wpływie na IKZF1 i IKZF3. Inaktywacja CRBN przez związek 8 nie miała wpływu na żywotność komórek i proliferację różnych linii komórkowych szpiczaka mnogiego. Ten homo-PROTAC znosi działanie IMiD w komórkach szpiczaka mnogiego. Dlatego nasze homodimeryczne związki na bazie pomalidomidu mogą pomóc w identyfikacji endogennych substratów i funkcji fizjologicznych CRBN oraz w badaniu mechanizmu molekularnego IMiD.

Wprowadzenie

Leki immunomodulujące (IMiDs) talidomid i jego analogi, lenalidomid i pomalidomid, wszystkie zatwierdzone do leczenia szpiczaka mnogiego, wiążą się z ligazą ubikwityny E3 cereblon (CRBN), adaptorem substratu dla ligazy ubikwityny cullin4A-RING E3 (CRL4CRBN)1,2,3. Wiązanie IMiDs zwiększa powinowactwo CRL4CRBN do limfoidalnych czynników transkrypcyjnych Ikaros (IKZF1) i Aiolos (IKZF3), prowadząc do ich ubikwitynacji i degradacji (Rysunek 1)4,5,6,7,8. Ponieważ IKZF1 i IKZF3 są niezbędne dla komórek szpiczaka mnogiego, ich inaktywacja powoduje zahamowanie wzrostu. SALL4 został niedawno odkryty jako dodatkowy neosubstrat CRBN indukowany przez IMiD, który jest prawdopodobnie odpowiedzialny za teratogenność i tzw. katastrofę Contergan w latach 50. spowodowaną przez talidomid9,10. W przeciwieństwie do tego, kinaza kazeinowa 1α (CK1α) jest specyficznym dla lenalidomidu substratem CRBN, który jest zaangażowany w efekt terapeutyczny w zespole mielodysplastycznym z delecjami chromosomu 5q11.

Zdolność małych cząsteczek do celowania w określone białko w celu degradacji jest ekscytującą implikacją dla rozwoju nowoczesnych leków. Podczas gdy mechanizm działania talidomidu i jego analogów został odkryty po ich pierwszym zastosowaniu u ludzi, tak zwane Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) zostały zaprojektowane tak, aby były ukierunkowane na białko będące przedmiotem zainteresowania (POI) (Rysunek 2)12,13,14,15,16,17,18. PROTAC to heterobifunkcyjne cząsteczki, które składają się ze specyficznego liganda dla punktu POI, połączonego za pomocą łącznika z ligandem ligazy ubikwityny E3, takim jak CRBN lub von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20,21,22. PROTAC indukują tworzenie przejściowego kompleksu trójskładnikowego, kierując POI do ligazy ubikwityny E3, co powoduje jej ubikwitynację i degradację proteasomalną. Główną zaletą PROTAC w porównaniu z konwencjonalnymi inhibitorami jest to, że wystarczające jest wiązanie się z POI, a nie jego hamowanie, a zatem PROTAC mogą potencjalnie celować w znacznie szersze spektrum białek, w tym te, które zostały uznane za nieuleczalne, takie jak czynniki transkrypcyjne15. Ponadto cząsteczki chimeryczne działają katalitycznie i dlatego mają dużą moc. Po przeniesieniu ubikwityny do punktu POI kompleks trójskładnikowy dysocjuje i jest dostępny do tworzenia nowych kompleksów. W związku z tym bardzo niskie stężenia PROTAC są wystarczające do degradacji docelowego białka23.

Tutaj opisujemy syntezę homo-PROTAC (związek 8) sprzężony z pomalidomidem-pomalidomidem (związek 8), który rekrutuje CRBN do degradacji samego siebie24. CRBN ligazy ubikwityny E3 służy zarówno jako rekruter, jak i cel w tym samym czasie (Rysunek 3). Aby zweryfikować nasze dane, zsyntetyzowaliśmy również negatywną kontrolę wiązania (związek 9). Nasze dane potwierdzają, że nowo zsyntetyzowany homo-PROTAC jest specyficzny dla degradacji CRBN i ma tylko minimalny wpływ na inne białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie cząsteczek PROTAC

UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Kilka substancji chemicznych stosowanych w tych syntezach jest toksycznych i rakotwórczych. Prosimy o stosowanie wszystkich odpowiednich praktyk bezpieczeństwa i środków ochrony osobistej.

  1. Otrzymywanie N-(2,6-diokso-3-piperydylo)karbaminianu tert-butylu (związek 1)
    1. Dodać 1,1'-karbonylodimidazol (1,95 g, 12 mmol) i katalityczną ilość 4-(dimetyloamino)pirydyny (5 mg) do mieszaniny Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) w THF (50 ml) w 100 ml kolbie okrągłodennej z mieszadłem i wyposażonej w chłodnicę zwrotną. Podgrzewać pod chłodnicą zwrotną przez 10 godzin, mieszając, aż powstanie klarowny roztwór.
    2. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, dodać EtOAc (200 ml) i przenieść go do rozdzielacza. Umyj warstwę organicznąH2O(50 mL) i solanką (50 mL) i wysusz ją na Na2SO4.
    3. Przefiltrować roztwór przez krótką podkładkę z żelu krzemionkowego (5 cm średnicy i 5 cm wysokości) i wypłukać z dalszą objętością (200 ml) EtOAc.
    4. Odparować rozpuszczalnik i wysuszyć otrzymane bezbarwne ciało stałe w próżni.
  2. Preparat N-(1-metylo-2,6-diokso-3-piperydylo)karbaminianu tert-butylu (związek 2)
    1. Połączyć związek 1 (2,28 g, 10 mmol) ze zmielonym węglanem potasu (2,76 g, 20 mmol) i DMF (25 ml) w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml. Dodawać kroplami jodometan (1,42 g, 0,62 ml, 10 mmol) za pomocą strzykawki i wyposażyć kolbę w przebitą gumową przegrodę. Umieścić naczynie reakcyjne w kąpieli ultradźwiękowej na 2 godziny.
    2. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną EtOAc (100 ml) i przenieść ją do rozdzielacza. Przemyć warstwę organiczną 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 mL) i solanką (25 mL) i wysuszyć ją nad Na2SO4.
    3. Przefiltrować i odparować rozpuszczalnik. Oczyścić produkt metodą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym (6 cm średnicy kolumny i 20 cm wysokości) przy użyciu eteru naftowego/EtOAc (2:1).
  3. Preparat 2-(2,6-dioksopiperydyno-3-ylo)-4-fluoroisoindoliny-1,3-dionu (związek 3)
    1. Połączyć bezwodnik 3-fluoroftalowy (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimid 1 (1,14 g, 5 mmol) i roztwór octanu sodu (0,50 g, 6,0 mmol) w lodowatym kwasie octowym (20 ml) w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 ml z mieszadłem i wyposażonej w chłodnicę zwrotną. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 120 °C przez 6 godzin.
    2. Po schłodzeniu wlać fioletową mieszaninę naH2O(100 ml) i mieszać przez 10 min. Zebrać powstałe ciało stałe przez filtrację, przemyćH2O(3 × 5 ml) i eterem naftowym (3 × 5 ml) i wysuszyć w próżni.
  4. Preparat 4-fluoro-2-(1-metylo-2,6-dioksopirydyno-3-ylo)izoindoliny-1,3-dionu (związek 4)
    1. Połączyć bezwodnik 3-fluoroftalowy (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimid 2 (1,21 g, 5 mmol) i roztwór octanu sodu (0,50 g, 6,0 mmol) w lodowatym kwasie octowym (20 ml) w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml z mieszadłem i wyposażonej w chłodnicę zwrotną. Podgrzewać mieszaninę w temperaturze 120 °C przez 6 godzin.
    2. Po schłodzeniu wlać fioletową mieszaninę naH2O(100 ml) i mieszać przez 10 min. Zebrać powstałe ciało stałe przez filtrację, przemyćH2O(3 × 5 ml) i eterem naftowym (3 × 5 ml) i wysuszyć w próżni.
  5. Preparat N-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,6-diokso-3-piperydylo)-1,3-diokso-izoindolin-4-ylo]amino]etoksy]etoksy]etylo]karbaminianu tert-butylu (związek 7)
    1. Napełnij 50 ml kolby okrągłodennej N-[2-[2-(2-aminoetoksy)etoksy]etylo]karbaminianem tert-butylu (5, 0,41 g, 1,65 mmol), związkiem 3 (0,41 g, 1,50 mmol), suchym DMF (10 ml) i DIPEA (0,39 g, 0,51 mL, 3,0 mmol). Wyposaż się w mieszadło i skraplacz zwrotny. Ogrzewać w atmosferze argonu w temperaturze 90 °C przez 10 godzin.
    2. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej wlać ciemnozieloną mieszaninę naH2O(100 ml) i ekstrahować za pomocą EtOAc (3 x 50 ml) w rozdzielaczu. Połączone warstwy organiczne przemyćH2O(50 ml) i solanką (50 ml), wysuszyć na Na2SO4, przefiltrować i zagęścić w próżni.
    3. Oczyszczać surowy produkt metodą chromatografii kolumnowej nad żelem krzemionkowym (3 cm średnicy kolumny i 60 cm wysokości) przy użyciu gradientu eteru naftowego/EtOAc (1:1 do 1:2).
  6. Przygotowanie homodimeru (związek 8)
    1. Połączyć łącznik α,ω-diaminy 6 (0,22 g, 0,22 ml, 1,50 mmol), DIPEA (1,05 mL, 6,00 mmol) i roztwór 3 (0,83 g, 3,00 mmol) w suchym DMSO (20 ml) w kolbie okrągłodennej o pojemności 50 ml z mieszadłem i wyposażonej w chłodnicę zwrotną. Ogrzewać w atmosferze argonu w temperaturze 90 °C przez 18 godzin.
    2. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej wlać ciemnozieloną mieszaninę naH2O(100 ml) i ekstrahować za pomocą EtOAc (3 x 50 ml) w rozdzielaczu. Połączone warstwy organiczne przemyćH2O(50 ml) i solanką (50 ml), wysuszyć na Na2SO4, przefiltrować i zagęścić w próżni.
    3. Oczyszczać surowy produkt metodą chromatografii kolumnowej nad żelem krzemionkowym (3 cm średnicy kolumny i 50 cm wysokości) przy użyciu gradientu eteru naftowego/EtOAc (1:2) do EtOAc.
  7. Przygotowanie heterodimeru (związek 9)
    1. Związek 7 rozpuścić (0,83 g, 1,65 mmol) w suchym CH2Cl2 (10 ml). Dodać kwas trifluorooctowy (10 ml) i mieszać żółtą mieszaninę w temperaturze 40 °C przez 2 godziny w zamkniętej kolbie okrągłodennej o pojemności 50 ml.
    2. Usunąć substancje lotne i odparować za pomocą CH2Cl2 (4 x 5 ml). Suszyć pozostałość w próżni przez 10 godzin.
    3. Ponownie rozpuścić materiał w suchym DMF (20 ml). Dodać związek 4 (0,44 g, 1,50 mmol) i DIPEA (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) i wyposażyć kolbę w chłodnicę zwrotną. Ogrzewać w atmosferze argonu w temperaturze 90 °C przez 10 godzin.
    4. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej wlać ciemnozieloną mieszaninę naH2O(100 ml) i ekstrahować za pomocą EtOAc (3 x 50 ml) w rozdzielaczu. Połączone warstwy organiczne przemyć nasyconym NaHCO3 (50 ml),H2O(50 ml), 10% KHSO4 (50 ml),H2O(50 ml) i solanką (50 ml), wysuszyć na Na2SO4, przefiltrować i zagęścić w próżni.
    5. Oczyszczać surowy produkt metodą chromatografii kolumnowej nad żelem krzemionkowym (3 cm średnicy kolumny i 50 cm wysokości) przy użyciu gradientu eteru naftowego/EtOAc (1:2) do EtOAc.
    6. Wyjaśnij i zweryfikuj strukturę cząsteczki (Rysunek 5A związek 8, związek 5B 9) za pomocą widm 1H NMR i 13C NMR w DMSO-d 6 na spektrometrze magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Sprawdzić, czy czystość obu związków jest wyższa niż 97%, za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS), stosując detekcję matrycy diodowej (DAD) przy 220–500 nm.

2. Walidacja funkcjonalna cząsteczek PROTAC

  1. Analiza Western blot degradacji CRBN przez PROTAC
    UWAGA: Wpływ związku 8 i związku 9 na poziom białka CRBN przetestowano za pomocą analizy western blot. Ponadto można również potwierdzić wpływ na poziomy IKZF1 i IKZF3 (Rysunek 6).
    1. Przygotowanie próbki
      1. Rozpuścić związki 8 i 9, lenalidomid (Len), pomalidomid (Pom), MG132 i MLN-4924 w DMSO w stężeniu 10 mM, podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
      2. Zasiać 1 x 106 komórek MM1S na płytce 6-dołkowej z 2,5 ml pożywki i traktować komórki 100 nM lub 1 μM związkiem 8 lub 9 przez 24 godziny.
      3. Zebrać komórki po obróbce i odwirować w temperaturze 700 x g, 5 min, 4 °C. Przemyć osad komórkowy zimnym 1x PBS w celu usunięcia pozostałej pożywki, odwirować przy 700 x g, 5 min, 4 °C i odrzucić supernatant. Powtórz ten krok raz.
      4. Lizować komórki w buforze do lizy (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glicerol, 1x koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy) przez 10 minut na lodzie, wirować przy 320 x g przez 10 minut, 4 °C. Zebrać supernatant i oznaczyć stężenie białka za pomocą testu białkowego kwasu bicinchoninowego (test BCA) zgodnie z protokołem producenta.
      5. Denaturować białka (15–30 μg/próbkę) za pomocą 1x buforu ładującego LDS (5% 2-merkaptoetanolu) i gotować 10 minut w temperaturze 75 °C.
    2. STRONA SDS
      1. Utrwal kanapkę z żelem 10% żel separujący [4 ml 3x bufor żelowy (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS), pH 8,45), 4 ml akrylamidu 30%, 2,52 ml glicerolu 50%, 1,395 ml H2O, 75 μl 11% nadsiarczanu amonu (APS) i 9,75 μl TEMED] i 4% żelu do układania w stos [1,992 ml 3x bufor żelowy, 0,792 ml 30% akrylamidu, 3,168 mlH2O, 36 μl 11% APS i 6 μl TEMED] w zespole do montażu elektrod. Usuń grzebienie, przepłucz studzienki buforem katodowym (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS) i załaduj próbki.
      2. Napełnij zbiornik buforem anodowym (100 mM Tris/HCl, pH 8,9). Załadować próbkę białka z kroku 2.1.1.4 i uruchomić SDS-PAGE przy napięciu 70 V, 20 min, a następnie 115 V, 150 min przy stałym napięciu.
    3. Immunoblotting i wykrywanie CRBN, IKZF1 i IKZF3
      1. Aktywuj membranę PVDF (0,45 μm) w 100% metanolu przez 1 min. Wyrównaj membranę i żel separujący w 1x buforze transferowym [10x bufor transferowy (192 mM glicyna, 25 mM Tris-zasada/HCl, 900 mL H2O), 20% metanol, 0,1% SDS, pH 8,3].
      2. Kasetę bibułkową należy zmontować zgodnie z protokołem producenta. Przenieś żel pod ciśnieniem 180 mA przez 90 min.
      3. Płukać membranę 3x w 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Membrana blokowa w 5% beztłuszczowym mleku w proszku (NFDM), TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Pierz membranę 3x w 1X TBS-T przez 5-10 min każdy w temperaturze pokojowej.
      4. Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko CRBN (1:500 w 5% BSA, TBS-T) z delikatnym wstrząsaniem w temperaturze 4 °C, przez noc.
      5. Pierz membranę 3x w 1X TBS-T przez 5-10 min każdy w temperaturze pokojowej. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym anty-mysim (1:10 000 w 5% NFDM, TBS-T) lub anty-króliczym (1:5 000 w 5% NFDM, TBS-T) sprzężonym z peroksydazą chrzanową HRP (1 h w temperaturze pokojowej).
      6. Pierz membranę 2x w 1X TBS-T przez 5-10 min każdy w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwa razy z 1x TBS.
      7. Inkubować membranę przez 2 minuty z roztworem substratu HRP zgodnie z protokołami producenta i wykryć chemiluminescencję w urządzeniu do wykrywania chemiluminescencji.
      8. Pierz membranę 1x w 1X TBS przez 5-10 min każdy w temperaturze pokojowej. W celu uwolnienia przeciwciał należy zawiesić błonę paskową w dostępnym w handlu buforze do oddzielania na 15 minut. Pierz membranę 3x w 1X TBS przez 5-10 min w temperaturze pokojowej.
      9. Błonę ponownie zablokować w 5% beztłuszczowym mleku w proszku, TBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyj membranę 3x w 1x TBS-T przez 5-10 minut każdy w temperaturze pokojowej i ponownie sonduj za pomocą IKZF1, IKZF3 lub tubuliny zgodnie z krokiem 2.1.3.4.
  2. Eksperymenty konkursowe z MG132, MLN4942 lub pomalidomidem
    UWAGA: Aby potwierdzić, czy CRBN ulega degradacji poprzez szlak ubikwityna-proteasom, przeprowadziliśmy eksperymenty konkursowe z inhibitorem proteasomu MG132 i inhibitorem enzymu aktywującego neddylację (NAE) MLN4942 (Figura 7).
    1. Wysiewaj 1 x 10 komórek6 MM1S na dołek w płytce 6-dołkowej. Wstępnie potraktuj komórki 10 μM MG132, 10 μM MLN4942 lub lenalidomidem (100x) i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    2. Dodać 100 nM związku 8 przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    3. Pobrać komórki pod kątem western blot zgodnie z krokiem 2.1.1.
  3. Testy żywotności komórek w liniach komórkowych szpiczaka mnogiego
    UWAGA: Ten test służy do badania wpływu na żywotność komórek i dodatkowo antagonizowania wpływu IMiDs na komórki szpiczaka mnogiego poprzez wstępne traktowanie komórek związkiem 8 (Rysunek 8, Rysunek 9A, B).
    1. Wysiew: 5 x 104 komórek MM1S na studzienkę na 96-dołkowej płytce w biologicznych triplikatach do oznaczania żywotności. W przypadku analizy western blot należy wysiać 1 x 106 komórek MM1S na studzienkę na płytce 6-dołkowej w trójkach biologicznych.
    2. Potraktuj komórki DMSO lub 100 nM, 1 μM lub 10 μM związku 8, związku 9 lub pomalidomidu i inkubuj przez 24 godziny, 48 godzin lub 96 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . W przypadku eksperymentów ratunkowych należy traktować komórki związkiem 100 nM 8 przez 3 godziny, przed lub po dodaniu 1 μM pomalidomidu i inkubować przez 96 godzin.
    3. Zmierz luminescencję 96-dołkowej płytki za pomocą testu żywotności komórek luminescencyjnych, zgodnie z protokołem producenta na czytniku płytek lub zbierz komórki z płytki 6-dołkowej do analizy western blot.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy opisaliśmy projektowanie, syntezę oraz ocenę biologiczną homodimerycznego PROTAC-u opartego na pomalidomidzie do degradacji białka CRBN. Nasz PROTAC oddziałuje jednocześnie z dwiema cząsteczkami CRBN i tworzy kompleksy trójskładnikowe, które indukują autoubi Kwitylację i degradację proteasomalną CRBN, wywierając jedynie minimalny wpływ na indukowane pomalidomidem neo-substraty IKZF1 lub IKZF3.

Z serii wcześnie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Konstrukcja takich homo-PROTAC, jak opisana tutaj dla CRBN, opiera się na specyficznym powinowactwie pomalidomidu do CRBN, które zostało z powodzeniem wykorzystane w wielu heterobifunkcyjnych PROTAC i doprowadziło do opracowania PROTAC 8 jako wysoce selektywnego degradera CRBN. Specyficzność naszej cząsteczki została już potwierdzona analizami proteomicznymi24. W przypadku nokautu o podłożu genetycznym wykluczenie i walidacja skutków ubocznych jest trudne i czasochłonne. Ponadto n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują potencjalnego finansowego konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (Program Emmy-Noether Kr-3886/2-1 i SFB-1074 dla J.K.; FOR2372 do M.G.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,1'-karbonylodimidazolTCI chemikaliaC0119
2,2&-(Etylenodioksy)-bis(etyloamina)Sigma-Aldrich385506Związek 6
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250
3-Bezwodnik fluoroftalowy, 98 %AlfaAesar A12275
4-dimetyloaminopirydyna, 99 %Acros148270250Toksyczny
akryloamidstammlö śpiewany/ Bisakryloamid (30%/0,8%)Carl Roth3029.1
Aiolos (D1C1E)mAB Sygnalizacja komórkowa15103S
Przeciwciało anty-CRBN wytwarzane w królikuSigmaHPA045910
Przeciwciało anty-królicze IgG sprzężone z HRPSigma7074S
Nadsiarczan amonuRoth9592.2
Boc-Gln-OHTCI chemikaliaB1649
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA7906-100G
Test żywotności komórek luminescencyjnych CellTiter-GloPromegaG7571
ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
DMF, bezwodny, 99,8 %Acros348435000Extra Dry na sicie molekularnym
DMSO, bezwodny, 99,7 %Acros348445000Extra Dry over Molecular Site
GlycineSigma-Aldrich15523-1L-R Kozia
anty-mysia (sprzężona z HRP)Santa Cruz biotechnologysc-2005
Halt Proteaza & Inhibitor fosfatazy Jednorazowy koktajl (100X)Thermo Scientific1861280
Ikaros (D6N9Y) Sygnalizacja komórek Mab14859S Membrana
transferowa ImmobilonP (0,45&mikro; m)MerckIPVH000010
Jodometan, 99Sigma-AldrichI8507Wysoce toksyczny
metanolSigma-Aldrich32213-2,5L
Mg132SelleckchemS2619
Mini Trans-Blot elektroforetyczne ogniwo transferoweBio-Rad1703930
Mini-PROTEAN Tetra Pionowe ogniwodo elektroforezyBio-Rad1658004
MLN4942biomol (kajman)Cay15217-1
Monoklonalne przeciwciało anty-&alfa;-tubulinowe wytwarzane u myszy (B512)SigmaT5168
N-etylodiizopropyloamina, 99Alfa AesarA11801
Beztłuszczowe mleko w proszkuPanReac AppliChemA0830,0500
Nunc F96 MicroWell Biały Płyta polistyrenowaThermo Scientific136101
NuPAGE LDS Bufor do próbek (4X)Thermo ScientificNP0008
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Scientific23225
PomalidomidSelleckchemS1567
RestoreTM Western Blot Stripping BufferThermo Scientific46430
sód siarczan dodecyluCarl Roth183.1
Chlorek soduSigma-AldrichA9539-500g
TEMEDCarl Roth2367.3
N-[2-[2-(2-aminoetoksy)etoksy]etylo]karbaminian tert-butyluSigma-Aldrich89761Związek 5
TricinCarl Roth6977.4
Baza TrizmaSigma-AldrichT1503-1kg
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ml
WesternBright ECL sprayAdvanstaK-12049-D50
% %

Bibliografia

  1. Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
  2. Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
  3. Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
  4. Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
  5. Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742(2014).
  6. Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
  7. Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
  8. Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
  9. Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
  10. Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
  11. Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
  12. Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
  13. Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
  14. Schneekloth, J. S. Jr, et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
  15. Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247(2018).
  16. Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
  17. Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
  18. Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
  19. Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830(2017).
  20. Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  21. Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
  22. Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
  23. Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
  24. Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
  25. Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
  26. Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
  27. Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
  28. Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
  29. Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
  30. Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
  31. Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
  32. Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
  33. Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
  34. Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
  35. Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Degradacja cereblonuPROTAC-i oparte na pomalidomidziezwiązek Homo-PROTAC 8inaktywacja CRBNanaliza Western blottest żywotności komórekkomórki szpiczaka mnogiegodegradacja IKZF1 i IKZF3inhibicja proteasomówpotwierdzenie struktury NMR
Chemiczna inaktywacja cereblon ligazy ubikwityny E3 przez Homo-PROTAC na bazie pomalidomidu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.