Stosowanie konsekwentnych perturbacji przypominających masaż na cielętach myszy i monitorowanie wynikających z nich zmian ciśnienia śródmięśniowego

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokoły do przykładania zdefiniowanych obciążeń mechanicznych do cieląt myszy i monitorowania towarzyszących im zmian ciśnienia domięśniowego. Opracowane przez nas systemy eksperymentalne mogą być przydatne do badania mechanizmu stojącego za korzystnym wpływem ćwiczeń fizycznych i masażu.

Streszczenie

Masaż jest ogólnie uznawany za korzystny w łagodzeniu bólu i stanów zapalnych. Chociaż wcześniejsze badania wykazały przeciwzapalne działanie masażu na mięśnie szkieletowe, mechanizmy molekularne stojące za tym są słabo poznane. Niedawno opracowaliśmy proste urządzenie do stosowania lokalnej kompresji cyklicznej (LCC), które może generować domięśniowe fale ciśnienia o różnych amplitudach. Za pomocą tego urządzenia wykazaliśmy, że LCC moduluje odpowiedzi zapalne makrofagów in situ i łagodzi zanik mięśni wywołany unieruchomieniem. W tym miejscu opisujemy protokoły optymalizacji i zastosowania LCC jako interwencji podobnej do masażu przeciwko indukowanemu unieruchomieniem zapaleniu i atrofii mięśni szkieletowych tylnych kończyn myszy. Opracowany przez nas protokół może być przydatny do badania mechanizmu leżącego u podstaw korzystnych efektów ćwiczeń fizycznych i masażu. Nasz system eksperymentalny stanowi prototyp podejścia analitycznego w celu wyjaśnienia mechanicznej regulacji homeostazy mięśni, chociaż konieczne są dalsze prace rozwojowe w celu przeprowadzenia bardziej kompleksowych badań.

Wprowadzenie

Masaż jest powszechnie uznawany za korzystny zarówno dla uśmierzania bólu, jak i poprawy sprawności fizycznej zarówno wśród sportowców wyczynowych, jak i nie-sportowców^1,2. W rzeczywistości wcześniejsze badania wykazały, że masaż tłumi miejscowe stany zapalne³ i przyspiesza regenerację po uszkodzeniu mięśni po wysiłku^4,5. Mechanizmy molekularne leżące u podstaw korzystnego działania masażu pozostają w dużej mierze nieznane.

Jedna z trudności związanych z mechanistycznym badaniem masażu dotyczy powtarzalności eksperymentalnych technik, za pomocą których testowane są interwencje podobne do masażu. W poprzednich badaniach eksperymentalne procedury, które naśladują masaż, polegają głównie na stosowaniu interwencji fizycznych przy użyciu części ciała praktykujących, takich jak dłonie i palce^6,7,8. To sprawia, że trudno jest dokładnie odtworzyć ich wielkość, częstotliwość, czas trwania i tryb.

Wiele urządzeń zostało opracowanych do przykładania zdefiniowanych obciążeń mechanicznych do tkanek docelowych. Na przykład Zeng i in. opracowali system pneumatyczny do mechanicznego obciążania tylnych kończyn szczurów wzdłuż wzdłuż⁹, a Wang i in. opracowali urządzenie mechatroniczne, które może nakładać obciążenia mechaniczne podobne do masażu na tylne kończyny szczurów i królików z kontrolą sprzężenia zwrotnego w czasie rzeczywistym¹⁰. W porównaniu z nimi, nasz lokalny system cyklicznej kompresji (LCC) jest znacznie prostszy i wymaga znacznie niższych kosztów budowy. Niemniej jednak możemy odtworzyć zmiany ciśnienia śródmięśniowego, które powstają podczas łagodnego skurczu mięśni. Korzystając z tego urządzenia, udało nam się wykazać, że mechaniczne interwencje podobne do masażu modulują lokalną dynamikę płynu śródmiąższowego i łagodzą atrofię mięśni wywołaną unieruchomieniem¹¹.

Tutaj opisujemy szczegóły naszego urządzenia i protokołu, które mogą pomóc w zbadaniu molekularnych mechanizmów stojących za pozytywnymi efektami ćwiczeń i masaży. Schemat protokołu przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Centrum Rehabilitacji dla Osób Niepełnosprawnych.

1. Unieruchomienie obustronnych tylnych kończyn myszy

UWAGA: Samce myszy C57BL/6 były wykorzystywane do eksperymentów w wieku 11 - 12 tygodni po aklimatyzacji przez co najmniej 7 dni.

1. Odpowiednio znieczulić mysz za pomocą pentobarbitalu sodu (50 mg/kg i.p.). Upewnij się, że myszy nie reagują na szczypanie palca tylnej kończyny.
   UWAGA: Procedurę unieruchomienia należy przeprowadzić w godzinach od 10 do 19, aby zminimalizować możliwy wpływ na aktywność żywieniową myszy.
2. Przyłóż taśmy chirurgiczne do obustronnych kończyn tylnych myszy ułożonych w pozycji leżącej z wyprostowanymi stawami kolanowymi i stawami skokowymi zgiętymi podeszwowo
.
3. Umieść drut aluminiowy (patrz Tabela Materiałów) na tułowiu na poziomie kręgosłupa L4-5 i zwiń drut w konfiguracji spiralnej wokół tylnych kończyn z odstępami 5 mm między każdym zwojem warstwy spirali (Rysunek 1A). Upewnij się, że nie zwijasz drutu zbyt mocno i nie zakłócaj miejscowego przepływu krwi.
4. Aby zminimalizować możliwość ucieczki z okablowania, należy unieruchomić stawy biodrowe w pozycji odwodzenia pod kątem 90° poprzez ręczną regulację konfiguracji drutu aluminiowego.
5. Umieść myszy z powrotem w ich pierwotnych klatkach. 3 godziny później upewnij się, że dojdą do siebie po znieczuleniu i mają dostęp do jedzenia i wody jak zwykle.
6. Dom: 3 - 6 unieruchomionych myszy w klatce, jak przed unieruchomieniem.

2. Pomiar ciśnienia śródmięśniowego mięśni brzuchatych łydek myszy

UWAGA: Kilka różnych wag jednostek cylindrycznych (36 g, 66 g i 200 g) zostało przetestowanych w eksperymentach monitorowania ciśnienia w połączeniu z LCC. Pomiar ten został przeprowadzony oddzielnie od eksperymentów mających na celu analizę zapalenia i atrofii mięśni (więcej szczegółów w krokach 3 - 5), tj. myszy poddane pomiarowi ciśnienia nie były wykorzystywane do analiz histologicznych.

1. Ponieważ pomiar ciśnienia obejmuje bardziej inwazyjne procedury (np. nacięcie skóry i wkłucie igły) w porównaniu z okablowaniem kończyn tylnych i LCC, należy użyć mieszaniny trzech środków znieczulających (medetomidyna 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg i butorfanol 5,0 mg/kg, i.p.). Upewnij się, że myszy nie reagują na szczypanie palca tylnej kończyny.
2. Połóż mysz w pozycji leżącej, wykonaj 2-milimetrowe nacięcie skalpelem na tylnej łydce po depilacji golarką elektryczną i półsterylizacji powierzchni skóry 70% bawełną chłonną nasączoną etanolem i chlorheksydyną.
3. Wprowadzić igłę o sile 20 G do mięśnia brzuchatego łydki pod kątem rozwartym (150° – 170°) do powierzchni skóry.
4. Używając plastikowej osłonki igły jako prowadnicy, umieść czujnik telemetru ciśnienia krwi (patrz Tabela materiałów) w środkowej części mięśnia brzuchatego łydki, a następnie zdejmij osłonkę z mięśnia.
5. Po zszyciu skóry nylonowym szwem 4-0, nałóż LCC z kilkoma różnymi ciężarami jednostek cylindrycznych na cielę u myszy (patrz krok 3, aby uzyskać więcej informacji) i monitoruj ciśnienie śródmięśniowe za pomocą oprogramowania do analizy sygnałów biologicznych (patrz Tabela materiałów).
6. Umieść myszy z powrotem w ich pierwotnych klatkach. 3 godziny później upewnij się, że dojdą do siebie po znieczuleniu/znieczuleniu i mają dostęp do jedzenia i wody jak zwykle.

3. Lokalna cykliczna kompresja (LCC) na cielętach myszy

1. Z wyjątkiem pomiaru ciśnienia domięśniowego i eutanazji (tj. zwichnięcia szyjki macicy), do znieczulenia należy stosować pentobarbital sodu (50 mg/kg i.p.).
2. Odłącz mysz od przewodów kończyn tylnych i połóż ją w pozycji leżącej z wyprostowanymi stawami kolanowymi i stawami skokowymi zgiętymi podeszwowo tak, aby łydki były skierowane do góry. Nie mocuj tylnych kończyn myszy na scenie.
3. Nałóż LCC na cielę, przesuwając pionowo cylindryczną jednostkę masy (Rysunek 1B) pokrytą poduszką (Rysunek 1C) przy 1 Hz przez 30 minut dziennie, 7 dni.
4. Po każdym ataku codziennego LCC ponownie podłącz tylne kończyny myszy.

4. Analiza immunohistochemiczna mięśnia brzuchatego łydki

1. Poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w odpowiednim znieczuleniu/analgezji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie mieszaniny trzech środków znieczulających (medetomidyna 0,75 mg/kg, midazolam 4,0 mg/kg i butorfanol 5,0 mg/kg).
2. Po depilacji tylnej powierzchni łydki należy wykonać nacięcie skóry i wypreparować mięśnie brzuchatego łydki, oddzielając je od kości piszczelowo-strzałkowej za pomocą nożyczek chirurgicznych i szybko zamrozić je w roztworze mieszanki o optymalnej temperaturze cięcia.
3. Za pomocą kriostatu przygotuj próbki kriosekcji mięśni brzuchatego łydki na szkiełkach podstawowych. Próbki należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
4. Wyjmij z zamrażarki próbki kriosekcji brzuchatego łydki do analizy i odwadnij je przez suszenie na powietrzu w temperaturze pokojowej.
5. Użyj pisaka blokującego płyny, aby narysować obszar, który zawiera wszystkie kriosekcje na szkiełku. Okrąg zapobiegnie spływaniu roztworów ze zjeżdżalni.
6. Unikać wysuszania próbek, umieszczając szkiełka podstawowe w tacy, w której tworzy się wilgotne środowisko, z papierowej szmatki nasączonej wodą.
7. Stosować 100 μl buforu blokującego (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) zawierająca 0,25% kazeiny, białko nośnikowe i 0,015 M azydek sodu) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
8. Przepłukać szkiełka dwukrotnie, inkubując z PBS-T (PBS zawierającym 0,1% monolaurynianu polioksyetylenosorbitolu (patrz tabela materiałów) przez 5 minut.
9. Na każdą próbkę nałożyć 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego PBS, przykryć tackę pokrywką i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.
10. Umyj 3 razy PBS-T (5 minut na każde pranie).
11. Na każdą próbkę nałożyć 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego PBS i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Do barwienia antylamininą należy użyć przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z Alexa Fluor 568. W przypadku przeciwciał anty-F4/80, anty-MCP-1 i anty-TNF-α należy użyć przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z Alexa Fluor 568 lub 488.
12. Umyj 3 razy PBS-T (5 minut na każde pranie).
13. Na każdą próbkę nanieść 100 μl roztworu DAPI rozcieńczonego PBS-T i inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
14. Umyj 3 razy PBS-T (5 min na każdy).
15. Połączyć próbki z podłożem montażowym i przykryć je szkiełkami nakrywkowymi.

5. Analiza histomorfometryczna brzuchatego łydki

1. Umieścić szkiełka z próbkami w mikroskopie fluorescencyjnym (patrz tabela materiałów) i oglądać próbki za pomocą obiektywu 20× z odpowiednimi filtrami (DAPI-B, 360/40 nm dla wzbudzenia i 460/50 nm dla emisji; GFP-B, 470/40 nm dla wzbudzenia i 535/50 nm dla emisji; FRITC, 540/25 nm dla wzbudzenia i 605/55 nm dla emisji.
2. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu (patrz tabela materiałów), zmierz pole przekroju poprzecznego (CSA) każdego włókna mięśniowego i policz liczbę komórek F4/80-, MCP-1- i TNF-α-dodatnich.
   UWAGA: Określ CSA każdego włókna mięśniowego, śledząc wewnętrzny margines błony podstawnej uwidocznionej za pomocą barwienia immunologicznego anty-lamininy-2.

Wyniki

Zgodnie z naszymi poprzednimi obserwacjami¹², CSA włókien mięśniowych brzuchatego łydki zostały znacznie zmniejszone przez unieruchomienie kończyn tylnych (Rysunek 2A,B). Co więcej, nasza analiza barwienia immunofluorescencyjnego wykazała, że komórki wykazujące ekspresję MCP-1 i TNF-α, które odgrywają kluczową rolę w regulacji procesów zapalnych^13,14, znacznie wzrosły w tkankach mięśniowych brzuchatych ...

Dyskusja

Opisaliśmy metodę stosowania bodźca mechanicznego przypominającego masaż, który ma działanie przeciwzapalne. Nasz system ma następujące zalety, nawet w porównaniu z tymi, o których mówiono wcześniej. Po pierwsze, wcześniejsze badania nie określały ilościowo przyłożonych sił mechanicznych² lub określały ich wielkości na podstawie pomiaru na powierzchni ciała, ale nie wewnątrz tkanek¹⁰. Natomiast ciśnienie śródmięśniowe mierzyliśmy za pomocą telemetru ciśnienia krwi. Po drugi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Drut aluminiowy	DAISO JAPAN	B028	Drut aluminiowy służy do unikania ucieczki przed ograniczeniem przez drut
Telemetr ciśnienia krwi	Millar	SPR-671	Telemetr ciśnienia krwi służy do pomiaru ciśnienia śródmięśniowego.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	DAPI to sonda fluorescencyjna, która jest powszechnie stosowana do barwienia DNA w mikroskopii fluorescencyjnej.
Kozioł anty-królik Alexa Fluor 488 (stosunek rozcieńczenia, 1:500)	Przeciwciało Invitrogen	A11034	do barwienia immunohistochemicznego.
Kozioł anty-szczur Alexa Fluor 568 (Stosunek rozcieńczenia, 1:500))	Invitrogen	A11077	Przeciwciało do barwienia immunohistochemicznego.
Oprogramowanie do		analizy obrazu
LabChart8	ADInstrumens		Oprogramowanie analityczne do pozyskiwania sygnałów biologicznych.
Prolong gold	Thermo Fisher Scientific	P36930	Prolong gold służy do mocowania poplamionych próbek.
Protein Block Serum-Free	Dako	X090930-2	Do blokowania niespecyficznego barwienia tła w procedurach immunohistochemicznych.
Przeciwciało monoklonalne anty-laminina-2 u szczura (stosunek rozcieńczenia, 1:1000)	Przeciwciało Sigma Aldrich	L0663	do barwienia immunohistochemicznego.
Szczurze przeciwciało monoklonalne anty-F4 / 80 (stosunek rozcieńczenia, 1:500)	Przeciwciało Abcam	ab6640	do barwienia immunohistochemicznego.
Królicze przeciwciało poliklonalne anty-MCP-1 (stosunek rozcieńczenia, 1:1000)	Abcam	ab25124	Przeciwciało do barwienia immunohistochemicznego.
Królicze przeciwciało poliklonalne anty-TNF-i alfa (stosunek rozcieńczenia, 1:1000)	Abcam	ab66579	Przeciwciało do barwienia immunohistochemicznego.
Taśma chirurgiczna	3M Japan	1530EP-0	Taśma chirurgiczna służy do ograniczania ruchów stawów.