Artykuł metodologiczny

Obrazowanie napięcia integryny i siły komórkowej w rozdzielczości submikronowej za pomocą zintegrowanego czujnika napięcia

DOI:

10.3791/59476

⸱

25 kwietnia 2019

 ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Napięcie integryny odgrywa ważną rolę w różnych funkcjach komórki. Dzięki zintegrowanemu czujnikowi naprężenia, napięcie integryny jest kalibrowane z czułością pikoNewtona (pN) i obrazowane w rozdzielczości submikronowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Napięcie molekularne przenoszone przez wiązania integryna-ligand jest podstawowym sygnałem mechanicznym w szlaku integryny, który odgrywa znaczącą rolę w wielu funkcjach i zachowaniach komórek. Aby skalibrować i zobrazować naprężenie całkowania z wysoką czułością na siłę i rozdzielczością przestrzenną, opracowaliśmy integracyjny czujnik napięcia (ITS), fluorescencyjny czujnik napięcia oparty na DNA. ITS jest aktywowany do fluorescencji, jeśli utrzymuje napięcie molekularne, przekształcając w ten sposób siłę na sygnał fluorescencyjny na poziomie molekularnym. Próg napięcia dla aktywacji ITS jest przestrajany w zakresie 10–60 pN, który dobrze pokrywa dynamiczny zakres napięcia integryn w komórkach. Na podłożu szczepionym za pomocą ITS napięcie integryny przylegających komórek jest wizualizowane za pomocą fluorescencji i obrazowane w rozdzielczości submikronowej. ITS jest również kompatybilny z obrazowaniem strukturalnym komórek zarówno w żywych komórkach, jak i komórkach stałych. ITS został z powodzeniem zastosowany w badaniu skurczu płytek krwi i migracji komórek. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę syntezy i zastosowania ITS w badaniu siły komórkowej przenoszonej przez integrynę.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki polegają na integrynach, które przylegają i wywierają siły komórkowe na macierz zewnątrzkomórkową. Adhezja komórek za pośrednictwem integryn i przenoszenie siły mają kluczowe znaczenie dla rozprzestrzeniania się komórek1,2, migration3,4, and survival5,6,7. W dłuższej perspektywie sygnalizacja biomechaniczna integryny wpływa również na proliferację komórek8,9,10 i różnicowanie11,12. Naukowcy opracowali różne metody pomiaru i mapowania sił komórkowych przenoszonych przez integryny na granicy faz komórka-matryca. Metody te opierają się na podłożu elastycznym13, tablicy micropost14 lub mikroskopii sił atomowych (AFM)15,16. Metody podłoża sprężystego i mikrosłupków opierają się na odkształceniu substratów w celu zgłoszenia naprężeń komórkowych i mają ograniczenia pod względem rozdzielczości przestrzennej i wrażliwości na siłę. AFM ma wysoką czułość na siłę, ale nie może wykryć siły w wielu miejscach jednocześnie, co utrudnia mapowanie siły komórkowej przenoszonej przez integryny.

W ostatnich latach opracowano kilka technik do badania siły komórkowej na poziomie molekularnym. Zbiór czujników napięcia molekularnego opartych na glikolu polietylenowym17,18, peptyd z pajęczego jedwabiu19 i DNA20,21,22,23 zostały opracowane w celu wizualizacji i monitorowania napięcia przenoszonego przez białka molekularne. Wśród tych technik DNA zostało po raz pierwszy przyjęte jako materiał syntezy w uwięzi miernika napięcia (TGT), pękającym łączniku, który moduluje górną granicę napięć integryny w żywych komórkach22,24. Później technika transferu DNA i rezonansu fluorescencyjnego została połączona w celu stworzenia fluorescencyjnych czujników napięcia opartych na DNA spinki do włosów, najpierw przez grupę Chena23 i grupę Salaity20. Czujnik napięcia oparty na DNA spinki do włosów informuje o napięciu integryny w czasie rzeczywistym i został z powodzeniem zastosowany do badania szeregu funkcji komórkowych21. Następnie laboratorium Wanga połączyło TGT z parą wygaszaczy fluoroforu, aby zgłosić napięcie integryny. Ten czujnik nosi nazwę ITS25,26. ITS jest oparty na dwuniciowym DNA (dsDNA) i ma szerszy zakres dynamiki (10-60 pN) do kalibracji naprężenia integryny. W przeciwieństwie do czujników opartych na DNA typu hairpin, ITS nie raportuje siły komórkowej w czasie rzeczywistym, ale rejestruje wszystkie historyczne zdarzenia integrynowe jako ślad siły komórkowej; Ten proces akumulacji sygnału poprawia czułość obrazowania siły komórkowej, umożliwiając obrazowanie siły komórkowej nawet za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego niskiej jakości. Synteza ITS jest stosunkowo wygodniejsza, ponieważ powstaje w wyniku hybrydyzacji dwóch jednoniciowych DNA (ssDNA).

ITS to 18-parzysty dsDNA sprzężony z biotyną, fluoroforem, wygaszaczem (Black Hole Quencher 2 [BHQ2])27, oraz cyklicznym peptydem kwasu arginyloglilasparanowego (RGD)28 jako ligand peptydu integryny (Rysunek 1). Dolna nić jest sprzężona z fluoroforem (Cy3 jest używany w tym manuskrypcie, podczas gdy inne barwniki, takie jak seria Cy5 lub Alexa, również udowodniły w naszym laboratorium) i znacznikiem biotyny, za pomocą którego ITS jest unieruchamiany na podłożu przez wiązanie biotyna-awidyna. Górna nić jest sprzężona z peptydem RGD i wygaszaczem czarnej, który wygasza Cy3 z około 98% skutecznością wygaszania26,27. Zgodnie z protokołem przedstawionym w tym artykule, gęstość powłoki ITS na podłożu wynosi około 1 100μm2. Jest to gęstość, którą wcześniej skalibrowaliśmy dla 18 pz biotynylowanego dsDNA pokrytego na substracie funkcjonalizowanym neutrAvidin, postępując zgodnie z tym samym protokołem powlekania29. Gdy komórki przylegają do podłoża pokrytego ITS, integryna wiąże ITS poprzez RGD i przenosi napięcie do ITS. ITS ma określoną tolerancję na rozciąganie (Ttol), która jest zdefiniowana jako próg napięcia, który mechanicznie oddziela dsDNA ITS w ciągu 2 s22. Jego pęknięcie przez napięcie integryny prowadzi do oddzielenia wygaszacza od barwnika, który następnie wydziela fluorescencję. W rezultacie niewidoczne napięcie integryny jest przekształcane w sygnał fluorescencyjny, a siła komórkowa może być mapowana przez obrazowanie fluorescencyjne.

Aby zademonstrować zastosowanie ITS, używamy tutaj keratocytów ryb, powszechnie używanego modelu komórkowego do badania migracji komórek30,31,32, komórka CHO-K1, powszechnie używana nieruchoma linia komórkowa, oraz fibroblast NIH 3T3. Przeprowadza się również koobrazowanie napięcia integryn i struktur komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC, 8-16-8333-I) Uniwersytetu Stanowego Iowa.

1. Synteza integracyjnego czujnika napięcia

  1. Dostosuj i zamów ssDNA (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Sekwencje ssDNA są następujące. Górne pasmo to /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2/. Dolne pasma są następujące.
    12 punktów TEMATYCZNYCH: /5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/
    23 pN ITS: /5Cy3/GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT/ CCC
    33 pN ITS: /5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/ CCT CCC
    43 pN ITS: /5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
    54 pN ITS: /5Biosg//iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
    Tutaj /5ThioMC6-D/ reprezentuje modyfikator tiolu C6 S-S (disiarczek) na końcu 5'. /3BHQ_2/ reprezentuje Czarną Dziurę Quencher 2 na końcu 3'. /3Bio/, /5Biosg/ i /iBiodT/ to biotynylacja odpowiednio na końcu 3', końcu 5' i na tyminie wewnętrznego DNA. /iCy3/ reprezentuje Cy3 wstawiony do wewnętrznego szkieletu ssDNA. Kody te są używane przez konkretnego dostawcę komercyjnego użytego w tym przypadku i mogą być inne w innych firmach DNA.
  2. Sprzężony peptyd RGD z wygaszaczem SH-ssDNA.
    UWAGA: Stosowane odczynniki to sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 4-(N-maleimimetylo)cykloheksano-1-karboksylan sulfosukcynimidylu (sulfo-SMCC), peptyd RGD i chlorowodorek tris-(2-karboksyetylo)fosfiny, znany również jako TCEP-HCl.
    1. Zdeteksować modyfikator tiolowy na górnej nici DNA za pomocą roztworu TCEP.
      UWAGA: DNA modyfikowane tiolem zamówione ze źródła komercyjnego są wysyłane w postaci utlenionej, z atomami siarki chronionymi wiązaniem dwusiarczkowym, które należy zredukować przed koniugacją RGD-DNA. TCEP to bezwonny odczynnik redukcyjny stosowany do deprotekcji tiolu.
      1. Rozpuścić 14,3 mg TCEP-HCl w 300 μl wody. Dostosuj pH roztworu TCEP do ~7,2–7,4 za pomocą 1 M roztworu NaOH (około 150 μL), używając bibułek do testów pH. Dodaj czystą wodę, aby uzyskać końcową objętość 0,5 ml. Końcowe stężenie TCEP wynosi 100 mM.
        UWAGA: Zaleca się, aby roztwór TCEP był świeży za każdym razem w celu deprotekcji tiolu DNA. Unikaj przechowywania roztworu TCEP przez długi czas.
      2. Do roztworu TCEP dodać 100 μl 0,5 M roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 400 μl wody.
      3. Dodać 10 μl roztworu TCEP+EDTA do 20 μl 1 mM tiol-DNA-BHQ2 w PBS. Pozwól roztworowi reagować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
        UWAGA: Wiązanie dwusiarczkowe konjugacji modyfikatora 5' tiolu C6 S-S w tym ssDNA zostanie rozszczepione przez TCEP, pozostawiając grupę tiolową gotową do reakcji z maleimidem w następnych krokach. TCEP nie zakłóca następującej reakcji tiol-maleimid; w związku z tym nie jest konieczna pasywacja TCEP po tym kroku.
    2. Sprzężony RGD-NH2 z sulfo-SMCC.
      1. Rozpuścić 5 mg RGD-NH2 w 100 μl PBS do uzyskania 11 mM RGD-NH2.
      2. Dodać 200 μl czystej wody do probówki z 2 mg sulfo-SMCC (wstępnie odmierzonej przez dostawcę). Rozbić ciało stałe sulfo-SMCC końcówką pipety i jednocześnie energicznie pipetować, aby ułatwić rozpuszczenie SMCC w wodzie. Stężenie sulfo-SMCC wyniesie 23 mM.
        UWAGA: Ponieważ ester NHS w sulfo-SMCC podlega hydrolizie i ma żywotność kilka minut, ten etap rozpuszczania powinien zostać zakończony w ciągu 1 minuty, aby uniknąć nadmiernej utraty estru NHS w wyniku hydrolizy. Do rozpuszczenia sulfo-SMCC należy użyć czystej wody, ponieważ jego rozpuszczalność w PBS lub innych jest słaba.
      3. Dodać 40 μl roztworu sulfo-SMCC do 100 μl roztworuRGD-NH2 i inkubować przez 20 min.
        UWAGA: Ester NHS w sulfo-SMCC będzie reagował z grupą aminową w RGD-NH2, tworząc wiązanie amidowe, które łączy RGD i sulfo-SMCC.
    3. Sprzężony RGD-SMCC z wygaszaczem SH-ssDNA.
      1. Wymieszać roztwory przygotowane w krokach 1.2.1 i 1.2.2 i inkubować mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przenieść roztwór do lodówki nastawionej na 4 °C i pozostawić do dalszej reakcji przez noc. Tiol sprzężony z górną nicią DNA będzie reagował z maleimidem na sulfo-SMCC, tworząc grupę tioeterową, która łączy RGD z górną nicią DNA.
    4. Wykonaj wytrącanie etanolu w celu oczyszczenia wygaszacza RGD-ssDNA z nieprzereagowanych sulfo-SMCC, RGD i TCEP.
      1. Schłodzić 10 ml 100% etanolu w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 minut.
      2. Zmieszać 3 M roztwór NaCl, roztwór DNA i schłodzony etanol w stosunku objętościowym 1:10:25. Zmieszany płyn należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez 30 minut lub do momentu wytrącenia się DNA.
      3. Odwirować ciecz o sile 10 000 x g przez 30 minut. Wyrzucić supernatant.
      4. Dodaj PBS do osadu DNA. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrometru.
    5. (Opcjonalnie) Wykonaj elektroforezę DNA, aby uzyskać wyższą czystość RGD-ssDNA.
      UWAGA: Dzięki powyższemu protokołowi około 70%-90% ssDNA zostanie sprzężone z RGD. Jeśli pożądana jest wyższa czystość, można również przeprowadzić elektroforezę DNA w celu oddzielenia sprzężonego DNA od niesprzężonego DNA.
      1. Zmontuj pionowy system elektroforezy.
      2. Przygotuj 10% roztwór żelu poliakrylamidowego, mieszając 50 ml czystej wody, 20 ml 40% żelu akrylamidowego, 8 ml 10x buforu tris-boran-EDTA (TBE) i 800 μl 10% nadsiarczanu amonu (APS).
      3. Dodać 80 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do roztworu żelu. Wlej roztwór do szklanej komory systemu elektroforezy. Włóż grzebień z pojedynczą studzienką, aby utworzyć zagłębienie na wierzchu żelu. Odczekaj 10 minut, aż żel zostanie usieciowany.
      4. Wymieszać roztwór DNA ze 100% glicerolem w stosunku objętościowym 1:1. Wyjmij grzebień i dobrze załaduj roztwór DNA do żelu.
      5. Uruchom żel pod napięciem 200 V. Obserwuj dwie prążki DNA, w których opóźniony jest sprzężonym DNA.
      6. Odetnij żelową opaskę ze sprzężonym DNA i pokrój ją w kostkę na małe kawałki.
      7. Zbierz pokrojony w kostkę żel do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml z filtrami. Dodać 500 μl PBS do każdej probówki.
      8. Umieść żel nasączony PBS w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej na 1 dzień. DNA dyfunduje z kawałków żelu do PBS.
      9. Zebrać roztwór DNA, odwirowując probówki o sile 1 000 x g przez 2 minuty.
      10. Wykonaj kolejną rundę wytrącania etanolu (krok 1.2.4) w celu zebrania DNA.
  3. Zsyntetyzuj ITS poprzez hybrydyzację RGD-ssDNA-wygaszacz i barwnik-ssDNA-biotyna.
    1. Wymieszać roztwory górnej i dolnej nici DNA w stosunku molowym 1,1:1. Przechowywać mieszaninę w temperaturze 4 °C przez noc, aby wytworzyć ITS przez hybrydyzację DNA.
      UWAGA: Do hybrydyzacji DNA stosuje się stosunek molowy 1,1:1 zamiast 1:1. Nadmierne wygaszanie RGD-ssDNA jest stosowane, aby zapewnić, że cała biotyna barwnika ssDNA będzie hybrydyzować z gaszącym RGD-ssDNA. Wygaszacz RGD-ssDNA bez hybrydyzacji zostanie zmyty podczas powlekania powierzchni, co nie wpłynie na jakość powłoki powierzchniowej ITS.
    2. Roztwór ITS należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.
      UWAGA: Bufor magazynowy to PBS, a stężenie w magazynie powinno zwykle wynosić powyżej 10 μM. W przypadku regularnego stosowania, roztwór ITS może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni bez zauważalnego pogorszenia jakości.

2. Przygotowanie powierzchni ITS poprzez unieruchomienie ITS na płytkach Petriego ze szklanym dnem

UWAGA: Używane odczynniki to biotynylowana albumina surowicy bydlęcej (BSA-biotyna), białko awidyny i ITS. Schłodzić wszystkie odczynniki i bufor PBS do temperatury około 0 °C na lodzie za pomocą wiadra na lód.

  1. Załadować 200 μl 0,1 mg/ml BSA-biotyny do PBS do studzienki na szklanej szalce Petriego (o średnicy 29 mm, z dołkiem 14 mm). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w lodówce. Biotyna BSA jest fizycznie adsorbowana na powierzchni szkła.
  2. Odessać roztwór ze studzienki za pomocą pipety i dodać 200 μl PBS z powrotem do studzienki, aby umyć powierzchnię. Powtórz to 3 razy, aby zakończyć pranie.
  3. Inkubować 200 μl 50 μg/ml białka awidyny w studzience przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć 3x PBS. Po tym etapie białko awidyny wiąże się z BSA-biotyną i zostaje unieruchomione na powierzchni szkła.
  4. Inkubować 200 μL 0,1 μM ITS w studzience przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Umyć naczynie 3x z PBS. Pozostaw PBS w studzience do momentu posiewu komórek. Po tym etapie ITS ze znacznikiem biotyny wiąże się z białkiem awidyny i zostaje unieruchomiony na powierzchni.
    UWAGA: Jednym ze środków ostrożności mających kluczowe znaczenie dla jakości i jednorodności powłoki ITS podczas unieruchomienia ITS jest to, aby nigdy nie dopuścić do wyschnięcia powierzchni szalki Petriego. Utrzymywanie wszystkich odczynników i PBS w temperaturze 4 °C lub około 0 °C na lodzie za pomocą wiadra na lód pomaga zmniejszyć szybkość parowania wody podczas etapów mycia, gdy PBS jest pobierany ze studni.

3. Poszycie komórek na powierzchniach ITS

  1. Kultura keratocytów rybnych.
    UWAGA: Tutaj jako przykład używana jest złota rybka (Carassius auratus), ale inne gatunki ryb również mogą się sprawdzić.
    1. Zerwij kawałek rybiej łuski z ryby pęsetą z płaską końcówką. Delikatnie dociśnij wagę do dołka szalki Petriego ze szklanym dnem, tak aby wewnętrzna strona skali stykała się ze szkłem. Poczekaj ~30 s, aż rybia łuska dobrze przylega do szklanej powierzchni naczynia.
    2. Dodaj 1 ml zmodyfikowanego kompletnego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), aby całkowicie pokryć łuskę ryby. Szalkę Petriego należy przechowywać w ciemnym i wilgotnym pudełku przez 6–48 godzin w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: IMDM complete medium zawiera 79% IMDM + 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 1% penicyliny. Nie jest potrzebny dodatkowy zapas tlenu ani CO2 . W pudełku można pozostawić kilka rolek bibułki nasączonej wodą, aby utrzymać wysoką wilgotność w pudełku. Keratocyty ryb po kilku godzinach wydostaną się z rybiej łuski jako arkusz komórek. Można to zaobserwować za pomocą mikroskopu kultur tkankowych. Komórki są na ogół żywotne po 48 godzinach.
  2. Odłącz i ułóż płytki komórek keratocytów na powierzchni ITS.
    1. Usunąć pożywkę z szalki Petriego, na której hodowano rybią łuskę. Umyj studzienkę 1x roztworem oddzielającym komórki i dodaj roztwór odłączający, aby przykryć rybią łuskę i inkubować przez 3 min.
      UWAGA: Przepis na roztwór EDTA odłączający komórki jest następujący: 100 ml 10x Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) + 10 ml 1 M HEPES (pH 7,6) + 10 ml 7,5% wodorowęglanu sodu + 2,4 ml 500 mM EDTA +1 l H2O. pH jest dostosowane do 7,4.
    2. Odessać cały roztwór do odłączania komórek i dodać kompletne podłoże IMDM. Rozproszyć keratocyty przez delikatne pipetowanie. Dostosuj gęstość roztworu komórkowego do pożądanego poziomu (1 x 104–1 x 105/ml). Umieść komórki na powierzchni ITS (przygotowanej zgodnie z sekcją 2). Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed obrazowaniem.
      UWAGA: Liczenie komórek można przeprowadzić za pomocą hemocytometru po odłączeniu komórek roztworem odłączającym. Gęstość posiewu komórek jest stosunkowo niska, dzięki czemu keratocyty mają dużą powierzchnię do migracji.
  3. Umieść ogniwa CHO-K1 i ogniwa NIH 3T3 na powierzchni ITS.
    UWAGA: Pożywką dla komórek CHO-K1 jest 89% F12 Hama + 10% FBS + 1% penicyliny. Pożywką dla komórek NIH 3T3 jest 89% zmodyfikowana pożywka Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco + 10% surowicy bydlęcej cielęcej (CBS) + 1% penicyliny. Warunki hodowli wynoszą 37 °C i 5% CO2 .
    1. Hodowla komórek CHO-K1 lub komórek NIH 3T3 do 80%-100% konfluencji na szalce Petriego (lub kolbie hodowlanej).
    2. Podgrzać roztwór oddzielający komórki i pożywkę do hodowli do 37 °C.
    3. Usunąć wszystkie pożywki hodowlane z szalki Petriego za pomocą pipety. Umyj komórki 1x roztworem odłączającym komórki. Przykryj komórki roztworem oddzielającym i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    4. Rozproszyć komórki przez pipetowanie. Zebrać roztwór komórkowy i odwirować go przy 300 x g przez 3 minuty.
    5. Odessać supernatant i dodać całe podłoże lub pożywkę bez surowicy.
    6. Dostosuj gęstość roztworu komórkowego do żądanego poziomu (1 x 105 – 1 x 106/ml). Umieść komórki na powierzchniach ITS (przygotowanych zgodnie z sekcją 2). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1–2 godziny przed obrazowaniem lub 30 minut przed nagraniem wideo.

4. Obrazowanie, nagrywanie wideo i mapowanie naprężeń całkowania w czasie rzeczywistym

  1. Obrazowanie napięcia integryn w żywych komórkach w czasie quasi-rzeczywistym
    1. Inkubować keratocyty na powierzchni ITS (przygotowane zgodnie z sekcją 2) przez 30 minut w temperaturze pokojowej lub inkubować komórki CHO-K1 lub komórki NIH 3T3 przez 1 godzinę na powierzchni ITS w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    2. Zamontuj szalkę Petriego na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Wykonaj obrazowanie siły komórkowej z czasem ekspozycji 1 s. Powiększenie wynosi 40x lub 100x.
    3. Zrób film z obrazami ITS z interwałem klatek 20 s dla keratocytów lub 1-2 min dla komórek CHO-K1 lub komórek NIH 3T3.
    4. Użyj MATLAB lub innego narzędzia do analizy obrazu, aby odjąć poprzednią klatkę wideo ITS od bieżącej klatki, aby obliczyć sygnał ITS nowo wyprodukowany w ostatnim interwale klatek. Nowo wytworzony sygnał ITS reprezentuje napięcie integryny wygenerowane w ostatnim interwale ramki, raportując w ten sposób siłę komórkową w sposób quasi-rzeczywisty.
  2. Koobrazowanie napięcia integryny i struktury komórkowej w komórkach barwionych immunologicznie
    1. Po kroku 3.2.2 lub kroku 3.3.6 wykonaj barwienie immunologiczne, aby oznaczyć docelowe białka strukturalne.
      UWAGA: Używaj różnych barwników, aby uniknąć przesłuchów fluorescencyjnych między obrazowaniem napięcia integryny a obrazowaniem strukturalnym komórki. W tym manuskrypcie fluorofor Cy5 został użyty do falloidyny, a Alexa 488 została użyta do barwienia winkuliny. Stężenie zarówno przeciwciała pierwszorzędowego, jak i drugorzędowego wynosi 2,5 μg/ml. Stężenie falloidyny wynosi 1,5 jednostki/μl.
    2. Wykonaj obrazowanie kanałów wielofluorescencyjnych, aby uzyskać zarówno mapę napięcia integryny, jak i obrazowanie strukturalne komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki ITS udało się uchwycić mapę napięcia integryny keratocytów ryb. Pokazuje to, że keratocyt migruje i generuje napięcie integryny na dwóch torach sił (Rysunek 2A). Rozdzielczość mapy sił została skalibrowana na 0,4 μm (Rysunek 2B). Wysokie napięcie integryny koncentruje się na tylnym brzegu (Rysunek 3A). ITS pokazuje również różne specyficzne wzorce różnych komórek. Nieruchoma komórka, NIH-3T3, tworzy specyficzny wzór napięc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ITS jest wysoce dostępną, ale potężną techniką mapowania sił komórkowych zarówno pod względem syntezy, jak i zastosowania. Gdy wszystkie materiały są gotowe, ITS można zsyntetyzować w ciągu 1 dnia. Podczas eksperymentów potrzebne są tylko trzy etapy powlekania powierzchni przed posiewem komórek. Ostatnio jeszcze bardziej uprościliśmy procedurę powlekania do jednego etapu, bezpośrednio łącząc ITS z albuminą surowicy bydlęcej, co umożliwia bezpośrednią fizyczną adsorpcję ITS na powierzchniach szklanych lub polistyrenowych<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez fundusz startowy zapewniony przez Uniwersytet Stanowy Iowa oraz Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych (R35GM128747).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BSA-biotynaSigma-AldrichA8549
NeutravidinThermo Fisher Scientific31000
StreptavidinThermo Fisher Scientific434301
górna nić DNAZintegrowane technologie DNANie dotyczyZaprojektowany przez klienta. Sekwencja DNA jest pokazana w sekcji PROTOCOL
dolna nić DNAIntegrated DNA TechnologiesN/Azaprojektowana przez klienta. Sekwencje DNA są pokazane w sekcji PROTOKÓŁ.
sulfo-SMCCThermo Fisher ScientificA39268
Peptyd cykliczny RGD z grupą aminowąPeptydy InternationalPCI-3696-PI
IMDMATCC‎
FBSATCC302020
Penicylinagibco15140122
TCEPSigma-AldrichC4706
200 uL szalka PetriegoCellvisD29-14-1.5-N
SpektrometrNanoDrop 2000Thermo ScientificN/A
SE410 Wysoka pionowa jednostka do elektroforezy białek chłodzona powietrzemHoeferSE410-15-1.5Urządzenie do elektroporezy
Linia komórkowa CHO-K1ATCCCCL-61
Linia komórkowa NIH/3T3ATCCCRL-1658
Przeciwciało anty-winkulinoweEMD Millipore90227Pierwotne przeciwciało do barwienia immunologicznego winkuliny
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Superklonalne przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488InvitrogenA28175Przeciwciało wtórne do barwienia immunologicznego winkuliny
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogenA22287
Eclipse TiNikonN/A
62996227 mikroskop

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  3. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074(2011).
  4. Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
  5. Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
  6. Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
  7. Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
  8. Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430(2016).
  9. Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
  10. Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
  11. Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
  12. Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
  13. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  14. Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
  15. Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  16. Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
  17. Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
  18. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969(2010).
  19. Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  20. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167(2014).
  21. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  22. Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
  23. Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
  24. Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959(2016).
  25. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  26. Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
  27. Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
  28. Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
  29. Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  30. Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
  31. Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
  32. Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
  33. Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002(2018).
  34. Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
  35. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
  36. Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
  37. de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
  38. Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920(2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Czujnik oparty na DNAmikroskopia fluorescencyjnaobrazowanie siwi zania integryna ligandoddzia ywanie si y i strukturymigracja keratocyt w

Powiązane artykuły