Ten artykuł opisuje metodę przekształcenia taniej komercyjnej drukarki 3D w bakteryjną drukarkę 3D, która może ułatwić drukowanie wzorzystych biofilmów. Opisano wszystkie niezbędne aspekty przygotowania biodrukarki i biotuszu, a także metody weryfikacji w celu oceny powstawania biofilmów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Trójwymiarowe wzory biofilmów inżynieryjnych za pomocą biodrukarki zrób to sam
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Biofilmy to agregaty bakterii osadzone w samodzielnie wyprodukowanej matrycy zewnątrzkomórkowej o przestrzennym wzorze. Bakterie w biofilmie rozwijają zwiększoną oporność na antybiotyki, co stanowi potencjalne zagrożenie dla zdrowia, ale może być również korzystne w zastosowaniach środowiskowych, takich jak oczyszczanie wody pitnej. Dalszy rozwój terapii przeciwbakteryjnych i zastosowań inspirowanych biofilmem będzie wymagał opracowania powtarzalnych, możliwych do inżynierii metod tworzenia biofilmu. W ostatnim czasie opracowano nowatorską metodę przygotowania biofilmu przy użyciu zmodyfikowanej drukarki trójwymiarowej (3D) z tuszem bakteryjnym. W tym artykule opisano kroki niezbędne do zbudowania tej wydajnej, taniej biodrukarki 3D, która oferuje wiele zastosowań w przetwarzaniu materiałów indukowanych przez bakterie. Protokół rozpoczyna się od zaadaptowanej komercyjnej drukarki 3D, w której ekstruder został zastąpiony dozownikiem biotuszu podłączonym do systemu pompy strzykawkowej umożliwiającej kontrolowany, ciągły przepływ biotuszu. Aby opracować biotusz odpowiedni do drukowania biofilmów, zmodyfikowane bakterie Escherichia coli zawieszono w roztworze alginianu, tak aby zestalały się w kontakcie z powierzchnią zawierającą wapń. Włączenie substancji chemicznej induktora do podłoża drukarskiego napędza ekspresję białek biofilmu w wydrukowanym biotuszu. Metoda ta umożliwia druk 3D różnych wzorów przestrzennych złożonych z dyskretnych warstw drukowanych biofilmów. Takie kontrolowane przestrzennie biofilmy mogą służyć jako systemy modelowe i mogą znaleźć zastosowanie w wielu dziedzinach, które mają szeroki wpływ na społeczeństwo, w tym między innymi w zapobieganiu oporności na antybiotyki lub oczyszczaniu wody pitnej.
Wprowadzenie
Obecnie istnieje rosnąca potrzeba opracowania przyjaznych dla środowiska, zrównoważonych rozwiązań do produkcji materiałów o przestrzennym wzorze, ze względu na rosnącą liczbę rynków dla takich materiałów1. W artykule przedstawiono prostą, ekonomiczną metodę wytwarzania takich materiałów i dlatego oferuje szerokie spektrum przyszłych zastosowań. Przedstawiona metoda pozwala na trójwymiarowe (3D) drukowanie struktur o wzorze przestrzennym przy użyciu biotuszu zawierającego żywe bakterie. Bakterie pozostają żywe w wydrukowanych strukturach przez ponad tydzień, umożliwiając im wykonywanie naturalnych lub zmodyfikowanych czynności metabolicznych. Drukowane bakterie mogą w ten sposób wytwarzać i osadzać pożądane składniki w wydrukowanej strukturze, na przykład tworząc funkcjonalny usieciowany biofilm2.
Tradycyjne metody produkcji zaawansowanych materiałów wiążą się z wysokimi wydatkami energetycznymi (np. wysokimi temperaturami i/lub ciśnieniem) i mogą wytwarzać duże ilości odpadów chemicznych, często toksycznych substancji, które wymagają kosztownego utylizacji3,4. Natomiast wiele gatunków bakterii jest w stanie wytwarzać materiały, które można łatwo zastosować w różnych gałęziach przemysłu. Materiały te obejmują polimery, takie jak polihydroksyalkaniany (PHA)5 lub poli(glikolid-ko-laktyd) (PGLA)6, celuloza bakteryjna7, bakteryjne materiały betonowe8, kompozyty biomimetyczne9, kleje na bazie amyloidu10, lub przełączniki elektryczne na bazie biologii11, między innymi. Co więcej, produkcja przez bakterie cennych materiałów odbywa się zazwyczaj w temperaturach i ciśnieniach zbliżonych do otoczenia oraz w środowisku wodnym, bez konieczności stosowania lub wytwarzania toksycznych związków. Chociaż produkcja materiałów z wykorzystaniem bakterii została zademonstrowana w literaturze i pojawiły się już pewne zastosowania przemysłowe12,13, niezawodna metoda przestrzennego wzorowania takich materiałów pozostaje wyzwaniem.
Ten artykuł demonstruje prostą metodę przekształcenia taniej komercyjnej drukarki 3D w bakteryjną drukarkę 3D. Protokół pokazuje, jak przygotować biotusz zawierający i podtrzymujący żywe bakterie, a także jak przygotować podłoża, na których można wykonać druk 3D. Ta metoda jest odpowiednia do stosowania z różnymi naturalnymi i zmodyfikowanymi szczepami bakterii zdolnymi do wytwarzania materiałów. Bakterie te mogą być rozmieszczone przestrzennie w strukturze wydrukowanej w 3D i nadal kontynuować swoją aktywność metaboliczną, co spowoduje przestrzenny rozkład pożądanych materiałów wytwarzanych przez bakterie.
Ta metoda drukowania umożliwia addytywne wytwarzanie biofilmów, agregatów bakterii otoczonych samodzielnie wyprodukowaną macierzą zewnątrzkomórkową. Biofilmy to heterogeniczne sieci 3D, w których białka, polimery, komórki bakteryjne, tlen i składniki odżywcze są ustrukturyzowane przestrzennie14. Bakterie w postaci biofilmu wykazują zwiększoną oporność na antybiotyki i wytrzymałość strukturalną, co utrudnia ich wyeliminowanie z powierzchni, w tym cewników medycznych i implantów. Kluczem do właściwości biofilmu, a zarazem największym wyzwaniem dla badań nad biofilmem, wydaje się być niejednorodność biofilmów15,16,17. Produkcja przestrzennie kontrolowanych modelowych biofilmów jest szczególnie interesująca, ponieważ pozwoliłaby na odtworzenie lub dostrojenie wzorców przestrzennych składników biofilmu, pomagając w zrozumieniu stabilnego osadzania się biofilmów na praktycznie każdej powierzchni w przyrodzie.
Ten artykuł przedstawia metodę produkcji biofilmów za pomocą wydrukowanych w 3D hydrożeli zawierających zmodyfikowane bakterie E. coli, które wytwarzają białka biofilmu w obecności induktora, a także metody weryfikacji tworzenia biofilmu2. Głównymi składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej tych biofilmów są włókna amyloidowe kędzierzawych 18, które zawierają samoorganizujące się białka CsgA. Kiedy zmodyfikowane bakterie E. coli są indukowane do ekspresji białek CsgA, tworzą stabilny biofilm modelowy, który chroni komórki przed wypłukaniem z powierzchni druku. Taki wydrukowany w 3D biofilm może być kontrolowany przestrzennie i może służyć jako użyteczne narzędzie badawcze do badania wieloskalowej mechaniki strukturalno-funkcjonalnej biofilmu lub materiomiki19. Te zindywidualizowane biofilmy pomogą w zrozumieniu zasad tworzenia biofilmu i jego właściwości mechanicznych, umożliwiając między innymi dalsze badania nad mechanizmami oporności na antybiotyki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Konwersja komercyjnej drukarki 3D na biodrukarkę 3D
- Wyjmij ekstruder i grzałkę komercyjnej drukarki 3D (Tabela materiałów) z ramy drukarki i odłącz okablowanie sterujące tymi elementami od głównej płytki drukowanej (Rysunek 1A). Ponieważ czujnik kontrolujący temperaturę roboczą drukarki musi być funkcjonalny, aby komunikować się z oprogramowaniem drukarki, należy usunąć z oprogramowania drukowania algorytm, który opóźnia drukowanie do momentu osiągnięcia temperatury roboczej.
- Podłączyć końcówkę pipety (końcówka 200 μl) za pomocą silikonowej rurki (średnica wewnętrzna 1 mm) do strzykawki o pojemności 5 ml umieszczonej w pompie strzykawkowej. Zamontuj końcówkę pipety na głowicy ekstrudera drukarki 3D jako zamiennik oryginalnej wytłaczarki (Rysunek 1B).
- Jeśli będzie używany więcej niż jeden rodzaj biotuszu, zamontuj dodatkowe systemy przewodów i końcówki do pipet do drukarki.
2. Przygotowanie podłoża do druku 3D
- Dodać 4 ml 5 M roztworu CaCl2 do 400 ml 1% w/v agaru rozpuszczonego w podłożu bulionowym Luria-Bertani (LB), uzupełnionego odpowiednimi antybiotykami i induktorami (tutaj 34 μg/ml chloramfenikolu i 0,5% ramnozy).
- Dozować 20 ml roztworu LB-agar do każdej szalki Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm. Suszyć 30 minut w temperaturze pokojowej z półotwartą pokrywą.
UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, przechowując te podłoża do drukowania w temperaturze 4 °C przez okres do kilku dni.
3. Przygotowanie biotuszu
- Przygotuj roztwór alginianu sodu (3% w/v) i podgrzej trzykrotnie do temperatury wrzenia, aby wysterylizować roztwór. Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
- Hodować bakterie E. coli MG1655 PRO ΔcsgA ompR234 (E. coli ΔcsgA) przenoszące plazmidy pSB1C3-zielone białko fluorescencyjne (GFP) (konstytutywna ekspresja GFP)2 lub pSB1C3-GFP-CsgA (konstytutywna ekspresja GFP, ekspresja CsgA indukowana ramnozą) przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min w 50 ml pożywki LB zawierającej 34 μg/ml chloramfenikolu i 0,5% ramnozy.
- Odwirować hodowlę komórkową przez 5 minut przy 3,220 x g w celu osadzenia bakterii. Usunąć supernatant.
- Ponownie zawiesić osad bakteryjny w 10 ml pożywki LB i dodać 10 ml alginianu sodu (3% w/v).
4. 3D proces drukowania
- Zainstaluj i otwórz oprogramowanie do drukowania 3D (Tabela materiałów) na komputerze. Podłącz drukarkę 3D do komputera. Przesuń głowicę drukującą do pozycji wyjściowej, klikając przycisk home dla osi X, Y i Z.
- Dla każdego wydruku należy umieścić przygotowane podłoże drukarskie w określonym miejscu na stole drukarskim.
- Skalibruj wysokość głowicy drukującej w osi Z.
- Podnieś głowicę drukującą na wysokość 22 mm pod kontrolą ręczną, aby nie kolidowała z krawędzią szalki Petriego podczas przesuwania do żądanej pozycji. Umieść głowicę drukującą nad płytą i przesuń ją w dół, aż końcówka pipety zetknie się z powierzchnią drukowania. Przypisz tę pozycję osi Z jako Z1 (wysokość powierzchni drukowania).
- Podnieś głowicę drukującą i przesuń ją poza obszar płyty za pomocą ręcznego sterowania w osiach X, Y i Z. Jeśli odległość robocza między głowicą drukującą a powierzchnią płyty jest zdefiniowana jako Z2, wprowadź Z1 + Z2 do programu drukowania jako wartość Z podczas drukowania.
- Zaprogramuj kształt wydruku za pomocą samodzielnie opracowanej metody określania współrzędnych punkt po punkcie, zgodnie z żądaną trajektorią.
- Jeśli żądana trajektoria jest linią prostą, zdefiniuj tylko punkt początkowy i końcowy. Uwzględnienie dodatkowych punktów na zakrzywionych liniach spowoduje gładsze krzywe. Przesuwaj głowicę drukującą ręcznie do każdego punktu po kolei i zapisuj współrzędne tych punktów w kolejności. Wprowadź wszystkie te współrzędne, a także prędkość ruchu głowicy drukującej dla każdego drukowanego segmentu do edytora G-code.
- Zarówno przed, jak i po wydrukowaniu podnieś głowicę drukującą na odległość wyższą niż krawędź płyty (20 mm) i wysuń ją bezpośrednio z obszaru płyty. Zapisz ten program jako plik G-code i załaduj go bezpośrednio do wykorzystania w kolejnych wydrukach, jednocześnie ponownie mierząc wysokość osi Z dla każdego nowego podłoża drukarskiego.
UWAGA: Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z przykładowym kodem G do drukowania kwadratu. - Załaduj wstępnie zaprogramowany plik G-code. Otwórz edytor G-code w oprogramowaniu i zaprogramuj polecenia do drukowania żądanego kształtu. W każdym wierszu poleceń można zmienić położenie głowicy drukującej w osi X, Y i/lub Z. Wprowadź wartość Z podczas wszystkich etapów drukowania jako Z1 + Z2 (wysokość powierzchni drukowania + odległość robocza).
UWAGA: Prędkość ruchu jest również regulowana; 9 000 mm/min to odpowiednia wartość dla typowych szybkości drukowania. - Załaduj płynny biotusz do strzykawki (strzykawek) i zamontuj je w pompie strzykawkowej (strzykawkach) biodrukarki 3D.
- Wydrukuj biotusz na podłożu drukarskim, klikając przycisk Drukuj.
- Podczas drukowania kontroluj ruch głowicy drukującej całkowicie za pomocą oprogramowania. Ręcznie uruchom pompę strzykawkową, zanim głowica drukująca zetknie się z powierzchnią drukowania.
UWAGA: Koordynacja pompy strzykawkowej i drukarki jest określana empirycznie w zależności od prędkości wytłaczania, prędkości, z jaką głowica drukująca przesuwa się do pierwszego punktu drukowania, oraz początkowej pozycji głowicy drukującej. Jeśli początkowa pozycja głowicy drukującej wynosi 20 mm, przy prędkości głowicy drukującej 9 000 mm/min i prędkości wytłaczania 0,1 ml/h, należy uruchomić pompę strzykawkową natychmiast po rozpoczęciu drukowania. Jeśli prędkość wytłaczania zostanie zmieniona z 0,1 ml/h na 0,3 ml/h, odczekaj 2-3 s, aby uruchomić pompę strzykawkową po rozpoczęciu drukowania. - Zatrzymaj pompę strzykawkową, gdy tylko głowica drukująca dotrze do ostatniego punktu drukowania. Zatrzymaj pompę strzykawkową, zanim głowica drukująca podniesie się pod koniec procesu drukowania, w przeciwnym razie nadmiar biotuszu spadnie na podłoże drukowania i zmniejszy rozdzielczość drukowania.
- W przypadku budowy struktur 3D kontroluj wszystkie ruchy głowicy drukującej w edytorze G-code. Wpisz wysokość drukowania pierwszej warstwy. Zwiększ wartość Z w kodzie G o 0,2 milimetra dla drugiej warstwy, aby zwiększyć wysokość drukowania. Następnie zwiększ wartość Z o 0,1 milimetra podczas przechodzenia do wyższej warstwy. Nie przesuwaj płyty podczas procesu drukowania.
- Aby zmierzyć szerokość i wysokość wydrukowanego hydrożelu, użyj stalowej linijki umieszczonej pod próbką lub obok niej.
5. Uprawa i testowanie skuteczności produkcji biofilmu przez E. coli
- Wydrukowane próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 3-6 dni, aby umożliwić wytworzenie składników biofilmu (włókien kędzierzawych). Zobrazuj płyty za pomocą aparatu fotograficznego lub skanera fluorescencyjnego.
- Aby rozpuścić matrycę alginianową, dodać 20 ml 0,5 M roztworu cytrynianu sodu (pH = 7 dostosowane za pomocą NaOH) do podłoży drukarskich i inkubować przez 2 godziny z prędkością 30 obr./min, wytrząsając w temperaturze pokojowej. Wyrzuć płyn i ponownie zobrazuj płytki, aby porównać je z obrazami płytek przed obróbką cytrynianem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Pierwszym krokiem w celu pomyślnego druku 3D biofilmu jest przekształcenie komercyjnej drukarki 3D w biodrukarkę. Konwersja ta polega na usunięciu z drukarki ekstrudera i grzałki, przeznaczonych do druku tuszem polimerowym, i zastąpieniu ich komponentami odpowiednimi do druku biotuszem zawierającym żywe bakterie (Rysunek 1A). Ekstruder zastępuje się końcówką pipety (lub końcówkami, jeśli w procesie druku zostanie użytych wiele biotuszów) przymocowaną do syste...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół drukowania 3D zmodyfikowanych biofilmów składa się z dwóch krytycznych etapów. Pierwszym z nich jest przygotowanie powierzchni drukowania agaru, która jest najbardziej krytycznym czynnikiem dla uzyskania określonej rozdzielczości druku. Ważne jest, aby upewnić się, że powierzchnia drukowania jest płaska, a końcówka pipety na głowicy drukującej znajduje się na odpowiedniej wysokości od powierzchni. Jeśli powierzchnia nie jest płaska, odległość robocza zmieni się podczas procesu drukowania. Jeś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została wsparta grantem AOARD (No. FA2386-18-1-4059), Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO/OCW) w ramach programu Frontiers of Nanoscience oraz programu Advanced Materials NWO-NSFC (nr 729.001.016). Autorzy dziękują za laboratoryjną pomoc Ramona van der Valka i Rolanda Kieffera.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Drukarka 3D | CoLiDo | 3D-P Kit Oprogramowanie | |
| do druku 3D | CoLiDo | Print-Rite ColiDo Repetier-Host v2.0.1 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040 | |
| CaCl2 dihydrat | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Wirówka | Eppendorf | 5810 R | |
| Chloramfenikol | Sigma-Aldrich | 3886.1 | |
| LB bulion w proszku | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Wytrząsarka orbitalna | VWR | 89032-092 | Model 3500 |
| szalka Petriego | VWR | 25384-326 | 150 x 15 mm |
| Rhamnose | Sigma-Aldrich | 83650 | |
| Rurka silikonowa | VWR | DENE 3100103/25 | |
| Pompa strzykawkowa | ProSense B.V. | NE-300 | |
| Alginian sodu | Sigma-Aldrich | W201502 | |
| Monozasadowy cytrynian sodu | Sigma-Aldrich | 71498 | |
| Wodorotlenek sodu | VWR | 28244.295 |
Bibliografia
- Tibbitt, M. W., Rodell, C. B., Burdick, J. A., Anseth, K. S. Progress in material design for biomedical applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14444-14451 (2015).
- Schmieden, D. T., et al. Printing of Patterned, Engineered E. coli Biofilms with a Low-Cost 3D Printer. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1328-1337 (2018).
- Mao, L. B., et al. Synthetic nacre by predesigned matrix-directed mineralization. Science. 354 (6308), 107-110 (2016).
- Gao, H. L., et al. Mass production of bulk artificial nacre with excellent mechanical properties. Nature Communications. 8 (1), 287(2017).
- Poirier, Y., Nawrath, C., Somerville, C. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Family of Biodegradable Plastics and Elastomers, in Bacteria and Plants. Nature Biotechnology. 13, 142-150 (1995).
- Choi, S. Y., et al. One-step fermentative production of poly(lactate-co-glycolate) from carbohydrates in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 34 (4), 435-440 (2016).
- Mohammadi, P., Toivonen, M. S., Ikkala, O., Wagermaier, W., Linder, M. B. Aligning cellulose nanofibril dispersions for tougher fibers. Scientific Reports. 7 (1), 11860(2017).
- Jonkers, H. M. Bacteria-based self-healing concrete. Heron. 56 (1/2), (2011).
- Schmieden, D. T., Meyer, A. S., Aubin-Tam, M. E. Using bacteria to make improved, nacre-inspired materials. MRS Advances. 1 (8), 559-564 (2016).
- Zhong, C., et al. Strong underwater adhesives made by self-assembling multi-protein nanofibres. Nature Nanotechnology. 9 (10), 858-866 (2014).
- Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature Materials. 13 (5), 515-523 (2014).
- Gatenholm, P., Klemm, D. Bacterial Nanocellulose as a Renewable Material for Biomedical Applications. MRS Bulletin. 35, 208-213 (2010).
- Rodriguez-Carmona, E., Villaverde, A. Nanostructured bacterial materials for innovative medicines. Trends in Microbiology. 18 (9), 423-430 (2010).
- Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. MBio. 4 (5), (2013).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Wu, H., Moser, C., Wang, H. Z., Hoiby, N., Song, Z. J. Strategies for combating bacterial biofilm infections. International Journal of Oral Science. 7 (1), 1-7 (2015).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli Fibers Are Required for Development of Biofilm Architecture in Escherichia coli K-12 and Enhance Bacterial Adherence to Human Uroepithelial Cells. Microbiology and Immunology. 49 (9), 875-884 (2005).
- Cranford, S., Buehler, M. J. Materiomics: biological protein materials, from nano to macro. Nanotechnology, Science and Applications. 3, 127-148 (2010).
- Lehner, B. A. E., Schmieden, D. T., Meyer, A. S. A Straightforward Approach for 3D Bacterial Printing. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1124-1130 (2017).
- Wang, X., Smith, D. R., Jones, J. W., Chapman, M. R. In vitro polymerization of a functional Escherichia coli amyloid protein. Journal of Biological Chemistry. 282 (6), 3713-3719 (2007).
- Hammar, M., Bian, Z., Normark, S. Nucleator-dependent intercellular assembly of adhesive curli organelles in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6562-6566 (1996).
- Huang, Y. J., Xia, A. G., Yang, G., Jin, F. Bioprinting Living Biofilms through Optogenetic Manipulation. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1195-1200 (2018).
- Jin, X. F., Riedel-Kruse, I. H. Biofilm Lithography enables high-resolution cell patterning via optogenetic adhesin expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (14), 3698-3703 (2018).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).
- Percival, S. L., Suleman, L., Vuotto, C., Donelli, G. Healthcare-associated infections, medical devices and biofilms: risk, tolerance and control. Journal of Medical Microbiology. 64, 323-334 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
