Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do badania i modyfikowania ochrony komórek nabłonka przed salmonellą i innymi patogenami

Summary

Organoidy jelitowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) oferują ekscytujące możliwości modelowania chorób jelitowych in vitro. Wykazano różnicowanie hiPSC w organoidy jelitowe (iHO), stymulację tych iHO cytokinami oraz mikroiniekcję Salmonella Typhimurium do światła iHO, umożliwiając badanie inwazji nabłonka przez ten patogen.

Abstract

System 'organoidowy' jelitowy (iHO), w którym struktury 3-D reprezentatywne dla nabłonkowej wyściółki ludzkiego jelita mogą być wytwarzane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) i utrzymywane w hodowli, stanowi ekscytującą okazję do ułatwienia modelowania odpowiedzi nabłonkowej na infekcje jelitowe. In vivo komórki nabłonka jelitowego (IEC) odgrywają kluczową rolę w regulacji homeostazy jelitowej i mogą bezpośrednio hamować patogeny, chociaż mechanizmy, za pomocą których to zachodzi, nie są w pełni wyjaśnione. Wykazano, że cytokina interleukina-22 (IL-22) odgrywa rolę w utrzymaniu i obronie bariery nabłonka jelitowego, w tym indukowaniu uwalniania peptydów przeciwdrobnoustrojowych i chemokin w odpowiedzi na infekcję.

Opisujemy różnicowanie zdrowych kontrolnych hiPSC na iHO poprzez dodanie specyficznych kombinacji cytokin do ich pożywki hodowlanej przed osadzeniem ich w systemie hodowli opartej na macierzy błony podstawnej. Po osadzeniu iHo są hodowane w pożywkach uzupełnionych Nogginem, R-spondyną-1, naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF), CHIR99021, prostaglandyną E2 i monohydratem dichlorowodorku Y-27632. Cotygodniowe przejścia przez ręczne zakłócanie ultrastruktury iHO prowadzą do powstawania pączkujących iHO, przy czym niektóre wykazują strukturę krypty/kosmków. Wszystkie iHO wykazują zróżnicowany nabłonek składający się z komórek kubkowych, komórek enteroendokrynnych, komórek Panetha i spolaryzowanych enterocytów, co można potwierdzić za pomocą barwienia immunologicznego dla określonych markerów każdego podzbioru komórek, transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i ilościowego PCR (qPCR). Aby modelować zakażenie, serowar Salmonella enterica Typhimurium SL1344 jest mikrowstrzykiwany do światła iHo i inkubowany przez 90 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przeprowadza się zmodyfikowany test ochrony gentamycyny w celu określenia poziomów wewnątrzkomórkowej inwazji bakterii. Niektóre iHo są również wstępnie leczone rekombinowaną ludzką IL-22 (rhIL-22) przed zakażeniem, aby ustalić, czy ta cytokina chroni przed zakażeniem Salmonellą.

Introduction

W ostatnich latach badania interakcji gospodarz-patogen zostały wzbogacone o rozwój modeli 'organoidowych', w których trójwymiarowe reprezentacje nabłonka jelitowego mogą być wytwarzane z różnych progenitorów. 'Pierwotne' organoidy mogą być generowane bezpośrednio z jelitowych komórek macierzystych pobranych z biopsji jelitowych. Ponadto organoidy jelitowe mogą być generowane z hiPSC. To samo można powiedzieć o wielu tkankach, z gastric¹, liver², pancreatic^3,4, brain^5,6, lung⁷ i prostata⁸ organoidów używanych przez wielu badaczy do modelowania chorób. Istnieje wiele ekscytujących zastosowań systemu organoidowego, w tym modelowanie raka⁹ i badania przesiewowe leków¹⁰, ale tutaj skupiamy się na wykorzystaniu iHO jako modelu infekcji, przy użyciu S. enterica serowar Typhimurium (S. Typhimurium) jako przykładowy patogen i wstępne leczenie IL-22 jako terapia.

W tym badaniu, hiPSC używane do generowania iHO to iPSC 'Kolf2', generowane od zdrowej osoby i dostępne w Human Induced Pluripotent Stem Cells Initiative Consortium (HipSci; www.hipsci.org), ogólnodostępnym panelu referencyjnym charakteryzujących linie hiPSC¹¹. Jedną z zalet stosowania hiPSC jako komórek progenitorowych organoidów jest to, że obecnie dostępne są obszerne banki zdrowych linii iPSC dawców, co oznacza, że wyniki można walidować w wielu liniach komórkowych o różnym pochodzeniu genetycznym. Ponadto, jeśli naukowcy chcą przyjrzeć się specyficznym polimorfizmom pojedynczego nukleotydu (SNP) związanym z chorobą, możliwe jest użycie CRISPR/Cas9 do inżynierii mutacji w zdrowej linii komórkowej, wytwarzając w ten sposób zarówno zmutowaną linię, jak i zachowując izogeniczną linię kontrolną dla porównania¹². Z naszego doświadczenia wynika, że organoidy jelitowe pochodzące z hiPSC są większe niż ich pierwotne odpowiedniki i bardziej spójne w hodowli, co sprawia, że mikroiniekcja jest mniej trudna technicznie i potencjalnie pozwala na badanie bardziej zróżnicowanego zakresu patogenów. iHO mogą być konserwowane kriogenicznie, a my rozmnażamy kultury iHO przez okres do roku, aby wyprodukować materiał do eksperymentów.

In vivo, IEC odgrywają kluczową rolę w regulacji homeostazy jelit i mogą bezpośrednio hamować patogeny, chociaż mechanizmy, dzięki którym to się dzieje, nie są dobrze poznane. Wiadomo, że cytokina IL-22 odgrywa rolę w utrzymaniu bariery nabłonkowej jelit¹³ i bierze udział w indukcji i wydzielaniu peptydów i chemokin przeciwdrobnoustrojowych w odpowiedzi na infekcję¹⁴. Jest wytwarzany przez aktywowane limfocyty T (w szczególności komórki Th17), a także przez komórki NK (natural killer) i wiąże się z receptorem heterodimerycznym złożonym z podjednostek IL-22R1 i IL-10R2¹⁵. Receptor dla IL-22 ulega ekspresji zasadniczo na IEC, co oznacza, że w modelu iHO możliwe jest wstępne traktowanie organoidów rhIL-22 po prostu przez dodanie go do pożywki hodowlanej¹⁶. Jedną z wad układu organoidowego jest to, że brakuje mu powiązanej odpowiedzi immunologicznej zwykle dostarczanej przez inne typy komórek odpornościowych; Pojawiają się jednak modele, które próbują połączyć organoidy z limfocytami jelitowymi, aby lepiej to przedstawić17^,< klasa SUP = "xref">18.

Użycie systemu mikroiniekcji jest kluczowe dla symulacji infekcji w modelu iHO, ponieważ pozwala to na bezpośrednie dostarczanie patogenów na wierzchołkową powierzchnię nabłonka, co miałoby miejsce w przypadku infekcji in vivo. Dodanie czerwieni fenolowej do roztworu bakteryjnego wstrzykniętego do iHO oznacza te, które zostały zainfekowane, unikając w ten sposób wielokrotnych wstrzyknięć tego samego iHO. Organoidy jako naczynia do modelowania infekcji stają się coraz częściej używane, z patogenami takimi jak Helicobacter pylori,¹⁹ Norovirus,²⁰ Rotavirus,²¹ Escherichia coli²², Cryptosporidium²³ oraz wirus Zika²⁴ wykazano, że są one w stanie przetrwać i replikować się w tych systemach. Technologia ta może być stosowana do szerszego zakresu patogenów, w szczególności do organizmów trudnych do hodowli, takich jak pierwotniaki lub patogeny ograniczone do ludzi, w celu uzyskania bezpośrednich informacji na temat reakcji ludzkiego nabłonka na zakażenie.

Protocol

1. Hodowla i pasażowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj metody wykorzystują komercyjnie dostępne ludzkie linie komórkowe. Wszystkie prace związane z hodowlą tkankową opisane poniżej powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym klasy II. iPSC są rutynowo utrzymywane w pożywce do hodowli komórek macierzystych (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta, co pozwala na hodowlę iPSC bez weekendów. Komórki iPSC można stosunkowo łatwo zaadaptować z innych systemów hodowli iPSC.

1. Przejdź przez komórki, gdy kolonie pokryją około 80%–90% powierzchni płytki.
2. Przygotować płytki do przejścia 1 godzinę przed użyciem, dodając witronektynę 10 μg/ml rozcieńczoną w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS; bez wapnia [Ca] i magnezu [Mg]) do płytek poddanych działaniu kultur tkankowych. Objętości do powlekania zależą od rozmiaru płyty i można je znaleźć w instrukcjach producenta. W tym czasie należy podgrzać pożywkę do hodowli komórek macierzystych do temperatury pokojowej (RT).
3. Usunąć pożywkę z iPSC gotową do przejścia i przemyć komórki 2x DPBS (bez Ca lub Mg).
4. Dodaj roztwór EDTA (patrz tabela materiałów) do płytek, upewniając się, że cała powierzchnia jest pokryta i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5–8 minut. Kiedy w środku kolonii iPSC zaczną pojawiać się, odessać i wyrzucić roztwór EDTA.
5. Dodać pożywkę do hodowli komórek macierzystych do studzienek; usunąć iPSC, delikatnie myjąc kilkakrotnie pożywkę na powierzchni płytki. Komórki iPS są pasażowane w postaci grudek, a nie pojedynczych komórek, dlatego należy upewnić się, że roztwór EDTA nie jest pozostawiony zbyt długo. Przenieś wszystkie przemieszczone iPSC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
6. Odessać witronektynę z wstępnie pokrytych płytek i zastąpić ją pożywką do hodowli komórek macierzystych. Odwróć zawiesinę iPSC kilka razy, aby upewnić się, że iPSC nie osiadły na dnie stożkowej probówki, i dodaj odpowiednią objętość zawiesiny, aby uzyskać rozcieńczenie komórek w stosunku 1:10 na nowej płytce. Współczynniki podziału można dostosować w zależności od tempa wzrostu iPSC, które może się różnić w zależności od linii iPSC.
7. Kołysz płytką, aby rozproszyć iPSC na powierzchni i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO₂ . Nakarm iPSC następnego dnia po pasażu.

2. Różnicowanie od iPSC do Hindgut

1. W dniu 0 rozdzielić iPSC na 10-centymetrowym naczyniu poddanym hodowli tkankowej, wstępnie pokrytej witronektyną, jak opisano w kroku 1.2, na 10 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych uzupełnionej aktywiną A (10 ng/ml) + podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF; 12 ng/ml). Dodaj czynniki wzrostu do pożywki bezpośrednio przed użyciem; Zrób to we wszystkich kolejnych krokach.
2. W dniu 1 należy zmienić pożywkę (10 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych z aktywiną A [10 ng/ml] + bFGF [12 ng/ml]).
3. W dniu 2 należy rozpocząć różnicowanie od zmiany pożywki na 10 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych uzupełnionej następującymi czynnikami wzrostu: aktywiną A (100 ng/mL), bFGF (100 ng/ml), białkiem morfogenetycznym kości 4 (BMP-4; 10 ng/ml), inhibitorem 3-kinazy fosfoinozytolu LY294002 (10 μM) i inhibitorem GSK3 CHIR99021 (3 μM).
4. W dniu 3 zmień pożywkę na 10 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych uzupełnionej aktywiną A (100 ng/ml), bFGF (100 ng/ml), BMP-4 (10 ng/ml) i LY294002 (10 μM). Specyfikacja endodermy wywołana przez tę pożywkę powinna skutkować widocznymi zmianami w morfologii kolonii iPSC w ciągu najbliższych 24 godzin.
5. W dniu 4 zmień pożywkę na 10 ml pożywki RPMI/B27 uzupełnionej aktywiną A (100 ng/ml) i bFGF (100 ng/ml).
   nuta: Pożywka RPMI/B27 zawiera 500 ml pożywki RPMI z suplementem L-glutaminy (patrz Tabela 1), 10 ml suplementu B27 (50x, bez surowicy) i 5 ml aminokwasów endogennych. Opcjonalnie: dodać 5 ml penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml). Filtruj - sterylizuj przed użyciem.
6. W dniu 5 zmień pożywkę na 10 ml pożywki RPMI/B-27 uzupełnionej aktywiną A (50 ng/ml).
7. W 6 dniu, aby rozpocząć modelowanie endodermy tylnej do jelita tylnego, zmień pożywkę na 10 ml pożywki RPMI/B27 uzupełnionej CHIR99021 (6 μM) + kwas retinowy (3 μM).
8. W dniach 7, 8 i 9 powtórz krok 2.7. Podczas tych kroków powinny stać się widoczne struktury 3D jelita tylnego, pokrywające powierzchnię płytki.
9. W dniu 10 osadź powstałe jelito tylne w macierzy błony podstawnej (patrz Tabela materiałów).

3. Osadzenie jelita tylnego w matrycy błony podstawnej

1. Uzupełnić podłoże wzrostowe na bazie iHO (500 ml zaawansowanej pożywki Eagle's zmodyfikowanej Dulbecco [DMEM]/F12, 10 ml suplementu B27 [50x, bez surowicy], 5 ml suplementu N2 [100x, bez surowicy], 5 ml 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 5 ml aminokwasów endogennych [100x]. Opcjonalnie: dodać 5 ml penicyliny-streptomycyny [10 000 j./ml]; Filtruj - sterylizuj przed użyciem. Patrz Tabela 1).
2. Usuń pożywkę z płytki tylnego jelita grubego i umyj płytkę 1x DPBS (bez Ca lub Mg). Dodać 5 ml roztworu kolagenazy do płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
   1. Wyprodukuj roztwór kolagenazy, dodając 500 mg proszku kolagenazy dożylnej do 400 ml zaawansowanego DMEM/F12. Następnie dodać 100 ml substytutu surowicy (patrz Tabela materiałów), 5 ml L-glutaminy (200 mM) i 3,5 μl 2-merkaptoetanolu i zawirować roztwór do wymieszania. Przefiltrować i wysterylizować roztwór, gdy proszek kolagenazy całkowicie się rozpuści.
      nuta: Można go przechowywać w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy w mniejszych porcjach.
3. Dezaktywuj kolagenazę, dodając 5 ml pożywki wzrostowej iHO do płytki i zeskrob komórki jelita tylnego za pomocą skrobaka do komórek, zbierając zawiesinę jelita tylnego w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
4. Wirować przy 240 x g przez 1 minutę i odpipetować z supernatantu.
5. Dodać 10 ml pożywki, delikatnie pipetując jelito grube na mniejsze kawałki i ponownie odwirować przy 95 x g przez 1 minutę.
6. Umyj komórki 2x w pożywce wzrostowej na bazie iHO, powtarzając krok 3.5. Ponownie zawiesić komórki w małej objętości zasadowej pożywki wzrostowej (~300–500 μl) i dodać około 100 μl tego roztworu do 1,5 ml macierzy błony podstawnej. W tym czasie matryca musi pozostać na lodzie, ponieważ zacznie szybko krzepnąć w temperaturze pokojowej.
7. Umieścić 24-dołkową płytkę na podgrzewaczu płytkowym w temperaturze 37 °C i pobrać 60 μl do jednego dołka z płytki 24-dołkowej. Pozwól mu na chwilę zastygnąć i sprawdź gęstość pod mikroskopem.
   1. W razie potrzeby stopniowo dodawać więcej roztworu jelita grubego do matrycy błony podstawnej, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia, i umieścić roztwór w pozostałych studzienkach.
8. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut, następnie dodać 800 μl pożywki wzrostowej zasady iHO zawierającej czynniki wzrostu do każdej studzienki płytki 24-dołkowej w następujących stężeniach (patrz tabela 1): 500 ng/ml R-spondyny-1, 100 ng/ml Noggin, 100 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 3 μM CHIR99021, 2,5 μM prostaglandyny E2, i 10 μM Y-27632 dichlorowodorek jednowodny (inhibitor ROCK).
9. Zmieniaj podstawową pożywkę wzrostową iHO co 2-3 dni lub natychmiast, jeśli pożywka zacznie się odbarwiać. Po wstępnym wysiewie do macierzy błony podstawnej, pozwól iHo rozwijać się przez 7 dni przed ich rozszczepieniem. W dniach 3–4 w kulturze powinny być widoczne wyraźne sfery.
   1. W przypadku samej zmiany podłoża należy pominąć Y-27632, ponieważ jest to wymagane tylko podczas dzielenia/wysiewu.

4. Konserwacja i przejście iHO

1. Aby umożliwić stopniowe rozmrażanie, należy umieścić wymaganą objętość matrycy błony podstawnej w zakrytym pojemniku na lód w temperaturze 4 °C na noc, 24 godziny przed rozszczepieniem.
2. Usuń pożywkę z iHO i zastąp ją 500 μl roztworu do podnoszenia komórek (patrz Tabela materiałów) na studzienkę. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 40–50 minut, po czym iHO powinny unosić się w roztworze.
   1. Opcjonalnie: użyj systemu obrazowania w masce, aby wybrać tylko iHO o pożądanej morfologii (patrz Tabela materiałów).
3. Delikatnie odpipetować zawiesinę roztworu iHO/cell do stożkowych probówek o pojemności 15 ml, starając się nie rozbijać iHO. Pozwól IHO osiąść na 3–5 minut i usuń supernatant i pojedyncze komórki.
4. Ponownie zawiesić iHO w 5 ml pożywki wzrostowej na bazie iHO i delikatnie je odpipetować do umycia. Wirować przy 95 x g przez 2 min.
5. Umieścić 24-dołkową płytkę na podgrzewaczu płytkowym w temperaturze 37 °C wewnątrz okapu.
6. Usuń supernatant i ponownie zawieś iHO w ~300–500 μl podstawowej pożywki wzrostowej, używając pipety P1000, aby rozbić iHO na mniejsze kawałki. Należy pamiętać, że siła, którą należy przyłożyć, będzie się różnić w zależności od linii iHO i stanu dojrzewania, więc zacznij delikatnie, zwiększając siłę, jeśli jest to wymagane.
7. Umieścić ~100 μl iHO (objętość zależy od gęstości roztworu) w 1,5 ml macierzy membrany podstawnej i krótko odpipetować do wymieszania.
8. Umieścić 1 x 60 μl matrycy membrany podstawnej w jednym dołku płytki 24-dołkowej, pozostawić do zestalenia się na ~30 s, a następnie sprawdzić gęstość pod mikroskopem. Jeśli gęstość jest zbyt niska, dodaj więcej iHO do macierzy.
9. Powtarzaj krok 4.8, aż uzyskasz prawidłową gęstość, a następnie umieść resztę matrycy na 24-dołkowej płytce.
10. Umieścić go w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 10 minut, a następnie nałożyć na niego 800 μl podstawowej pożywki wzrostowej z czynnikami wzrostu, jak opisano w kroku 3.7.
11. Aby przygotować iHO do eksperymentu z testem inwazji (opisanego poniżej), należy przejść iHO 4-5 dni przed eksperymentem, jak opisano w krokach 4.1-4.10, ale umieścić 120 μl roztworu iHO matrycy wygenerowanego w kroku 4.7 w 5-milimetrowych naczyniach do mikroiniekcji ze szklanym dnem.
    1. Zamiast pozostawiać zawiesinę iHO w kropelce, jak w przypadku rutynowego pasażowania, rozprowadź kroplę na dnie naczynia, aby utworzyć cienką warstwę matrycy. Przykryj go 2,5 ml podstawowego podłoża wzrostowego plus czynniki wzrostu.
       nuta: Jeśli w pożywce hodowlanej zastosowano antybiotyki, należy je usunąć i zastąpić pożywką uzupełnioną antybiotykami do eksperymentów z mikroiniekcjami.

5. Prestymulacja iHO za pomocą rhIL-22

1. Odessać pożywkę z iHo i zastąpić ją świeżą zasadową pożywką wzrostową (która nie może zawierać antybiotyków) 18 godzin przed testem inwazji.
2. Dodać rhIL-22 do pożywek hodowlanych do końcowego stężenia 100 ng/ml.

6. Mikroiniekcja iHO i testy inwazji wewnątrzkomórkowej

1. W dniu poprzedzającym eksperyment ustaw S. Hoduje się Typhimurium SL1344 w 10 ml bulionu Luria-Bertani i inkubuje w temperaturze 37 °C przez noc, wstrząsając.
2. W dniu eksperymentu, jeżeli dostępny jest mikroskop z zamkniętą komorą grzewczą, należy go włączyć i pozwolić, aby temperatura osiągnęła 37 °C przed rozpoczęciem testu.
3. Rozcieńczyć nocne kultury bakteryjne w DPBS (zawierającym Ca i Mg) do gęstości optycznej 2 przy 600 nm (OD₆₀₀), a następnie wymieszać 1:1 z czerwienią fenolową.
4. Załadować naczynie do mikroiniekcji zawierające iHo na stolik mikroskopu, zdjąć pokrywę i ustawić ostrość iHO, gotowe do rozpoczęcia wstrzykiwania.
5. Włącz inżektor i stacje sterujące ramienia. Upewnij się, że wtryskiwacz jest ustawiony na ciśnienie 600 kPa i czas wtrysku 0.5 s. Jeśli nie jest jeszcze odsunięty od stolika mikroskopu, obróć ramię iniekcyjne, aby upewnić się, że tak jest.
6. Ustawić końcówkę wiertła do mikroiniekcji 6 μm, zdejmując opakowanie i plastikowy cylinder z igły. Zdjąć głowicę uchwytu z ramienia iniekcyjnego.
7. Załaduj końcówkę wiertła 10 μl inokulum, delikatnie chwytając końcówkę wiertła za jej koniec. Umieść końcówkę wiertła w głowicy uchwytu i ponownie przymocuj ją do ramienia do mikroiniekcji.
8. Delikatnie przesunąć ramię na miejsce, tak aby igła znajdowała się 1–2 cm nad naczyniem do mikroiniekcji. Użyj elementu sterującego ramienia, aby ustawić końcówkę igły na środku naczynia i opuść ją, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią podłoża.
   1. Zaprogramuj stację sterowania ramienia tak, aby po wszystkich wstrzyknięciach ponownie ustawiła igłę w tym punkcie.
9. Ustaw ostrość mikroskop na iHO i wybierz cel do wstrzyknięcia. Umieścić igłę tuż nad i po prawej stronie iHO, który ma zostać wstrzyknięty, a następnie przesunąć igłę w dół i na boki do światła iHO.
10. Nacisnąć przycisk wstrzykiwania na mikrowstrzykiwaczu; z igły wyłoni się mieszanina bakteryjna zabarwiona fenolem. Wstrzyknąć każdy iHO 3x. Wstrzyknij co najmniej 30 iHo na warunek.
    nuta: Ze względu na niejednorodność wielkości i struktury iHO w kulturze, konieczne jest wstrzyknięcie dużej liczby iHO w celu kontrolowania zmienności.
11. Po wstrzyknięciu wszystkich wymaganych iHo należy zdjąć płytkę do mikroiniekcji ze stolika, założyć pokrywkę i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 90 minut.
12. Po 90 minutach odessać pożywkę wzrostową i zastąpić ją 3 ml roztworu do podnoszenia komórek; inkubować w temperaturze 4 °C przez 45 minut.
13. Delikatnie przenieś roztwór iHO/do podnoszenia komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml DPBS. Upewnij się, że wszystkie wstrzyknięte iHO zostały usunięte z płytki (w razie potrzeby przepłukać płytkę 1 ml DPBS). Wirować przy 370 x g przez 3 min.
14. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić iHO w pożywce wzrostowej zawierającej gentamycynę w dawce 0,1 mg/ml (dodać 1 ml pożywki; następnie użyć pipety P1000 ~50x, aby rozbić iHO, i dodać 4 ml dalszej pożywki).
15. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu zabicia bakterii zewnątrzkomórkowych.
16. Odwirować iHo przy 370 x g przez 3 minuty i odessać supernatant, pozostawiając jak najmniej. Umyj iHO 1x za pomocą DPBS i ponownie odwiruj.
    nuta: Ten krok usuwa gentamycynę, co jest ważne, ponieważ pozostała gentamycyna może zabijać bakterie wewnątrzkomórkowe po lizie komórek.
17. Zawiesić iHO w 500 μl buforu do lizy (patrz Tabela Materiałów) i ręcznie oddzielić organoidy przez pipetowanie ~50x. Pozostawić tę mieszaninę na 5 minut w temperaturze suchej masy.
18. Otrzymany roztwór należy rozcieńczyć seryjnie 10-krotnie w DPBS, aby uzyskać stężenia ^10-1, ^10-2 i ^10-3. Odpipetować 3 x 20 μl kropelki czystych i rozcieńczonych roztworów na wstępnie podgrzane płytki agarowe LB.
19. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i przeprowadzić liczenie kolonii oraz obliczenie jednostek tworzących kolonie (CFU). Liczba kolonii będzie odzwierciedlać liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych, które zostały uwolnione podczas procesu lizy komórek.

7. Zamrażanie i odzyskiwanie komórek

UWAGA: Jak wspomniano wcześniej, możliwe jest kriogeniczne przechowywanie iHO i rekonstytuowanie ich w razie potrzeby. Procesy zamrażania i rozmrażania opisano poniżej.

1. Wybierz studzienki iHO, które chcesz zamrozić. Dodać roztwór do podnoszenia komórek do studzienek i inkubować przez 40–50 minut w temperaturze 4 °C. IHO powinny unosić się w roztworze.
2. Delikatnie odpipetuj iHO do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i pozwól im się uspokoić. Usuń pożywkę i umyj iHO 1x bazową pożywką wzrostową (bez czynników wzrostu).
3. Wirować przy 95 x g przez 2 minuty, usunąć supernatant i zastąpić go odpowiednią objętością pożywki do zamrażania komórek (patrz Tabela Materiałów; użyć pożywki zgodnie z instrukcjami producenta), dekantując iHO do fiolek kriogenicznych.
   1. Przechowywać fiolki w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez noc, aby umożliwić bardziej stopniowe zamrażanie; następnie przenieść je do magazynu ciekłego azotu.
4. W celu rozpuszczenia iHO należy szybko rozmrozić fiolkę kriogeniczną w temperaturze 37 °C przy użyciu kąpieli wodno-perełkowej, a następnie delikatnie odpipetować jej zawartość do 10 ml bazowej pożywki wzrostowej (bez czynników wzrostu). Poczekaj, aż iHO osiądą i zastąp pożywkę ~300 μl świeżej pożywki wzrostowej na bazie.
   1. NIE należy ręcznie rozdzielać operacji iHO. Dodaj iHO do matrycy błony podstawnej i umieść je w płytkach zgodnie z opisem w sekcji 3.

Results

Po rozpoczęciu procesu różnicowania, komórki powinny przejść przez etap definitywnego tworzenia endodermy, po którym następuje formowanie się jelita tylnego, zanim zostaną osadzone w macierzy błony podstawnej. Sferoidy będą się formować, a kultury z dużymi ilościami materiału zanieczyszczającego będą usuwać się w ciągu kilku tygodni w miarę dojrzewania iHO. Przykładowe obrazy procesu różnicowania, osadzania i pasażowania są pokazane na Rysunek 1.

Konfiguracja systemu mikroiniekcji jest taka, jak pokazano na Rysunek 2. Jednostki iHo są mikrowstrzykiwane z roztworem czerwieni fenolowej/bakteryjnej i zachowują swój czerwony kolor, co pozwala na identyfikację zainfekowanych iHO, aby zapobiec zduplikowanym wstrzyknięciom. Liczenie posianych bakterii wewnątrzkomórkowych przeprowadza się po zmodyfikowanym teście ochrony gentamycyny; prestymulacja rhIL-22 ogranicza zakażenie S. Typhimurium, przy czym po leczeniu rhIL-22 obserwuje się mniej bakterii wewnątrzkomórkowych (Ryc. 3). Rutynowo przetwarzamy również zakażone iHO do barwienia immunologicznego lub TEM, aby ułatwić wizualizację interakcji IEC-bakteria gospodarza (Rysunek 4).

Rysunek 1: Ukierunkowane różnicowanie iPSC do iHO. Reprezentatywna sekwencja różnicowania od iPSC do iHO, pokazująca zaobserwowane zmiany morfologiczne i czynniki wzrostu wymagane do napędzania tych zmian. Ostateczna endoderma powstaje w 4 dniu różnicowania, po ekspozycji na określone stężenia kombinacji aktywiny A, FGF, BMP-4, LY294002 i CHIR99021. Po 8 dniach ułożenie się tej ostatecznej endodermy z określonymi stężeniami CHIR99021 i kwasu retinowego powoduje tworzenie się jelita tylnego. Po osadzeniu obserwuje się tworzenie się sferoid. Po długotrwałym pasażowaniu za pomocą nośnej macierzy błony podstawnej pokrytej pożywką uzupełnioną czynnikami proproliferacji jelit R-spondyną 1, Nogginem, EGF, CHIR99021 i prostaglandyną E2, sferoidy przechodzą w pączkujące iHO. (Zdjęcia zostały wykonane w powiększeniu 4x–10x). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Mikroiniekcja iHO z S. Typhimurium. A) system mikroiniekcji (patrz tabela materiałów) zamknięty w komorze środowiskowej; pozwala to na wstrzykiwanie iHo w kontrolowanym środowisku (37 °C/5% CO₂ ). (B) inokulum bakteryjne jest dostarczane bezpośrednio do światła iHO za pomocą mikrokapilary podłączonej do systemu mikroiniekcji. (C) Mieszając inokulum bakteryjne z czerwienią fenolową, staje się jasne, które iHo zostały zainfekowane, unikając w ten sposób podwójnych wstrzyknięć tego samego iHO. Zdjęcia zostały wykonane w 10-krotnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wstępne traktowanie iHO pochodzących z linii komórkowej Kolf2 rhIL-22 ogranicza inwazję S. Typhimurium SL1344 do komórek nabłonka jelitowego. W przypadku testów ochrony przed gentamycyną, iHo traktowano 100 ng / ml rhIL-22 18 godzin przed zakażeniem lub pozostawiono bez leczenia i inkubowano przez 90 minut po zakażeniu. Dane są średnimi trzech kontrprób technicznych dla trzech kontrprób biologicznych ± SEM. Do badania istotności wykorzystano testy U Manna-Whitneya; p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Interakcja IEC z S. Typhimurium SL1344. Panele te pokazują iHO wstrzyknięte z S. Typhimurium SL1344 i inkubowane przez 3 godziny, przed utrwaleniem i przetworzeniem w celu (A) immunofluorescencji lub (B) transmisyjnej mikroskopii elektronowej. W panelu A bakterie są widoczne w świetle iHO i wchodzą w interakcję z nabłonkiem. Jądra są barwione dilmleczanem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (niebieski), błony komórkowe falloidyną (czerwony), a bakterie CSA-1 (zielony). Zdjęcia są wykonywane w 20-krotnym powiększeniu. Panel B przedstawia trzy różne wewnątrzkomórkowe szlaki przetwarzania Salmonelli po inwazji; bakterie są widoczne (a) w wakuoli zawierającej Salmonellę, (b) wolne w cytoplazmie i (c) poddawane autofagii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

RPMI/B27 średni
składnik:	kwota:
Pożywka RPMI 1640 z suplementem glutaminy	500 ml
B27 suplement bez surowicy 50x	10 ml
Podłoże bazowe iHO
składnik:	kwota:
Zaawansowany DMEM/F12	500 ml
B27 suplement bez surowicy 50x	10 ml
Suplement bez serum N2 100x	5 ml
SZYBY SZPALKOWE 1 M	5 ml
L-glutamina 200 mM	5 ml
Czynniki wzrostu dla podłoża wzrostu bazy iHO
składnik:	kwota:
Rekombinowana ludzka R-spondyna1	500 ng/ml
Rekombinowany ludzki Noggin	100 ng/ml
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)	100 ng/ml
Prostaglandyna E2	2,5 μM
CHIR99021	3 μM
Y-27632 dichlorowodorek jednowodny	10 μM

Tabela 1: Przepisy medialne.

Discussion

Protokół ten przedstawia różnicowanie hiPSC na iHO i ich użyteczność jako modelu, w którym symuluje się infekcje jelitowe. Poniżej przedstawiamy krytyczne kroki w protokole oraz wszelkie modyfikacje lub ulepszenia, które wprowadziliśmy.

Protokół ten usprawnia proces różnicowania hiPSC w porównaniu z wcześniej opublikowanymi pracami²⁵. Poprzednio stosowane metody wymagały przeniesienia hiPSC z innych systemów hodowli hiPSC (np. hodowli hiPSC zależnej od zasilania) do chemicznie zdefiniowanego medium – alkoholu poliwinylowego (CDM-PVA). To przeniesienie do CDM-PVA trwa zwykle 2-3 tygodnie i wymaga codziennego podawania hiPSC. Protokół ten również nie był konsekwentnie skuteczny, a niektóre zróżnicowania zawiodły; w związku z tym przeprowadziliśmy próbę różnicowania przy użyciu tych samych czynników wzrostu, ale zaczynając od hiPSC hodowanych w pożywce do hodowli komórek macierzystych (a nie CDM-PVA) i zastąpieniu CDM-PVA pożywką do hodowli komórek macierzystych w dniach różnicowania 0-3. Udało się to w przypadku pięciu niezależnych linii hiPSC, które zostały dotychczas przetestowane, dzięki czemu proces różnicowania jest znacznie szybszy i wydajniejszy. Pozwala to również na hodowlę hiPSC bez weekendów przed różnicowaniem, co pozwala na większą elastyczność w hodowli hiPSC. Linie iHO wytworzone tą metodą zostały fenotypowane pod kątem markerów nabłonka jelitowego, jak opisaliśmy wcześniej dla linii hiPSC Kolf2, Yemz1 i Lise1¹⁶ i wydają się fenotypowo nie do odróżnienia od iHO wytworzonych przy użyciu poprzedniego protokołu.

Po wysianiu iHO wymagają co najmniej 1 miesiąca rutynowego pasażowania, z rozłupywaniem co 4–7 dni, aby ułatwić dojrzewanie. Należy zauważyć, że wystąpią pewne różnice w rozwoju iHO w zależności od użytej linii iPSC i gęstości początkowej hodowli. Podczas pierwszych kilku pasaży pojawią się widocznie zanieczyszczające komórki, które nie są iHO. W końcu umrą, pozostawiając czystą kulturę sferycznych i, po około 4 tygodniach, pączkujących iHO. Ponadto system obrazowania w masce może być używany do wybierania i przechodzenia tylko iHO o pożądanej morfologii. W miarę dojrzewania iHo będą wymagały dzielenia co 6–7 dni, w zależności od tempa wzrostu i gęstości. Jeśli wystąpi którakolwiek z poniższych sytuacji, iHo należy podzielić przed tym punktem: wnęki świetlne iHO zaczynają wypełniać się martwymi komórkami, macierz błony podstawnej zaczyna się rozpadać, iHO zaczynają wyrastać z macierzy błony podstawnej lub kultura jest zbyt gęsta i pożywka zaczyna bardzo szybko żółknąć.

Po ustaleniu hodowli iHO, jeśli w dowolnym momencie wygląd iHO zmieni się lub będzie inny niż oczekiwano (na przykład kultury pozostają kuliste, a nie pączkują), fenotypowanie za pomocą immunohistochemii i qPCR dla markerów komórkowych należy powtórzyć, aby zapewnić różnicowanie typów komórek w obrębie iHO (np. komórki kubkowe, Komórki Panetha) pozostaje nienaruszona. Jeśli iHO już się nie różnicują, należy je wyrzucić i ponownie zróżnicować lub wcześniejsze przejście iHO powinno zostać rozmrożone i ponownie odtworzone. Jeśli iHo przestają się różnicować, potencjalnymi przyczynami są wiek kultury (jeśli ma ponad 6 miesięcy), aktywność czynników wzrostu (upewnij się, że są one odtwarzane zgodnie z instrukcjami producenta i przechowywane w stanie zamrożonym w małych porcjach, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania), zbyt częste lub gwałtowne pasaże (ogólnie, Pasażowanie powinno odbywać się tylko raz w tygodniu, a jeśli iHO będą ręcznie rozdzielane zbyt energicznie w regularnych odstępach czasu, przestaną się w pełni różnicować).

Ustaliliśmy za pomocą sekwencjonowania RNA, że stymulacja IL-22 na 18 godzin przed infekcją zwiększa poziom genów przeciwdrobnoustrojowych i tych zaangażowanych w fenotyp obrony barierowej. Przed zastosowaniem nowego iHsO do testów obejmujących prestymulację rhIL-22 (lub alternatywną cytokiną, jeśli system jest do tego wykorzystywany), wskazane jest sprawdzenie aktywności genów, o których wiadomo, że są regulowane w górę przez cytokinę (w przypadku IL-22 zastosowaliśmy DUOX2 i LCN2) za pomocą qPCR po stymulacji iHOs, w celu zapewnienia ekspresji receptora i nienaruszonej sygnalizacji. Przed pierwszym zastosowaniem IL-22 przeprowadziliśmy również immunohistochemię w celu zlokalizowania receptora IL-22 na iHO, aby ustalić, że ekspresja receptora IL-22 była podstawowa, co oznacza, że prestymulację można osiągnąć po prostu przez dodanie rhIL-22 do pożywki hodowlanej iHO. Jeśli jednak receptor jest wyrażany wierzchołkowo, może być konieczne dostosowanie tego protokołu do wierzchołkowego dostarczania ligandów.

Pułapki związane z systemem mikroiniekcji są na ogół związane z delikatnością igieł wymaganych do wstrzyknięcia. W tym przypadku stosujemy dostępne na rynku końcówki wiertarskie o naświcie 6 μm. Możliwe jest wyciąganie igieł iniekcyjnych ze szklanych naczyń włosowatych²⁶ , chociaż może to być mniej jednolite, co prowadzi do wycieków z końcówki igły lub wstrzykiwania niespójnych objętości do iHO. Ważne jest, aby mieć pewność, że wstrzyknięcie zostało wykonane do światła iHO, co jest jednym z powodów stosowania czerwieni fenolowej jako barwnika; iHo będą widocznie rozszerzać się i utrzymywać czerwone inokulum, co pozwoli mieć pewność, które iHO zostały wstrzyknięte. Czasami igły zatykają się zanieczyszczeniami ze ściany iHO; w takim przypadku należy wyjąć końcówkę igły z wnętrza iHO i nacisnąć przycisk CLEAN na systemie mikroiniekcji. Spowoduje to krótki okres wyższego ciśnienia powietrza, który powinien usunąć blokadę. Spowoduje to również pewien wyciek inokulum bakteryjnego na płytkę; Dlatego, jeśli tak się stanie, czyste działanie należy powtórzyć na wszystkich płytkach, aby zapewnić równość inokulum bakteryjnego na płytce. Jedną z dużych zalet iHO pochodzących z hiPSC jest ich rozmiar. Organoidy jelitowe myszy i pierwotne organoidy ludzkie są znacznie mniejsze (mierzą odpowiednio do ~100 μm i 100–300 μm,²⁷, w porównaniu z 250–1500 μm dla iHo pochodzących z hiPSC), co oznacza, że wstrzykiwanie dużych ilości organoidów będzie wolniejsze. Pozwala to na testowanie eksperymentów iniekcyjnych na większą skalę w iHO pochodzących z hiPSC. Możliwe jest również badanie zawartości światła w iHo poprzez zbieranie ich po infekcji i ręczne dysocjowanie iHO do DPBS, uwalniając ich zawartość luminalną. Do mikroiniekcji zalecamy stosowanie wysokiego stężenia bakterii. Stwierdziliśmy, że niższe stężenia nie były wystarczające do wygenerowania odpowiedzi ze strony IEC składających się z iHO. Ponadto trudno było później zlokalizować zinternalizowane bakterie za pomocą mikroskopii. Inokulum może wymagać optymalizacji dla różnych szczepów bakterii.

Podsumowując, iHO pochodzące z hiPSC stanowią obiecujący model do bezpośredniego analizowania odpowiedzi nabłonka na infekcje jelitowe, czy to poprzez badanie liczby inwazji wewnątrzkomórkowych, obrazowanie, pomiar poziomu cytokin w supernatantach iHO, czy też zbieranie RNA w celu zbadania zmian transkrypcji po ekspozycji na patogeny. Ich przydatność będzie jeszcze bardziej widoczna w przyszłości w tworzeniu modeli infekcji dla patogenów ograniczonych do stosowania u ludzi oraz w wykorzystywaniu możliwości wykorzystania tej technologii do personalizacji badań poprzez badanie określonych mutacji genetycznych związanych z chorobą i odpowiedzi na leki.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
5 mm szklane naczynia iniekcyjne z dnem	MatTek corporation	P50G-0-14-F
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Alexa fluor 647 falloidyna	Life Technologies	A22287	Stosować w stężeniu 1:1,000
B27 suplement bez surowicy	Life Technologies	17504044	Stężenie wyjściowe 50x, stężenie końcowe 1x
BMP-4 rekombinowane białko ludzkie	R& D	PHC9534	Stężenie zapasów 10 μ g/mL, stężenie końcowe 10 ng/mL
Roztwór do odzyskiwania komórek (roztwór do liftingu komórek)	BD	354253
CHIR99021	Abcam	ab120890-5mg	Stężenie zapasowe 3 mM, stężenie końcowe 3 i mikro; M
Kolagenaza, proszek typu IV	Life Technologies	17104019	Rekonstytucja w 0,1%
Fiolki kriogeniczne Corning	430487
Costar TC traktowane 24-dołkowe płytki hodowlane	Corning	CLS3527
DAPI dilactate	Sigma-Aldrich	D9564-10MG	Stosować przy stężeniu 10 nM
Dulbecco' s PBS (No MgCl2 lub CaCl2)	Life Technologies	14190-144
Dulbecco' s PBS (z MgCl2 i CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662-100ML
Naskórkowy czynnik wzrostu	R& D	236-EG-200	Stężenie zapasów 100 μ g/ml, stężenie końcowe 100 ng/ml
Eppendorf TransferMan NK2 (system mikroiniekcji)	Eppendorf	920000011
Eppendorf Femtojet express  (system mikroiniekcji)	Eppendorf	5248 000.017
Zestaw pożywki Essential 8 Flex (pożywka do hodowli komórek macierzystych)	System
EVOS XL (system obrazowania w kapturze)
Gentamycyna	Sigma-Aldrich	G1272-10ML	Stężenie podstawowe 10 mg / ml, stężenie końcowe 0,1 mg / ml
Kozia anty-Salmonella, CSA-1	Insight Biotechnology	02-91-99	Stosować w stężeniu 1:20
HEPES 1 M	Life Technologies	15630056
KnockOut Serum Replacement (zamiennik setrum)	Suplement Gibco	10828010
GlutaMAX (suplement glutaminy	ThermoFisher
L-glutamina	Life Technologies	A2916801	Stężenie magazynowe 200 mM, stężenie końcowe 2 mM
LY294002	Promega UK	V1201	Stężenie magazynowe 50 mM, stężenie końcowe 10μ M
Matrigel, GFR, bez fenolu (matryca błony podstawnej)	Corning	356231
MEM aminokwasy endogenne  roztwór (100x)	Gibco	11140035
Suplement bez surowicy N2	Life Technologies	17502048	Stężenie wyjściowe 100x, stężenie końcowe 1x
Penicylina-streptomycyna	Life Technologies	15140163	Stężenie magazynowe 10 000 U/ml, stężenie końcowe 100 U/ml
Czerwień fenolowa	Sigma-Aldrich	P0290-100ML
Mysz z końcówką piezoelektryczną ICSI, kąt końcówki 25&stopni, 6 i mikro; m średnica wewnętrzna	Eppendorf	5195000087
Prostaglandyna E2	Sigma	P0409-1MG	Stężenie podstawowe 2,5 mM, stężenie końcowe 2,5 mM
Rekombinowany ludzki FGF zasadowy	R& D	233-FB-025	Stężenie zapasów 100 μ g/mL, stężenie końcowe 100 ng/mL
Rekombinowana ludzka IL-22	R& D	6057-NG-100	Stężenie zapasów 100 μ g/mL, stężenie końcowe 100 ng/mL
Rekombinowany ludzki Noggin	R& D	6057-NG-100	Stężenie zapasów 100 μ g/ml, stężenie końcowe 100 ng/ml
Rekombinowana ludzka R-spondyna1	R& D	4645-RS-025	Stężenie podstawowe 25 mg / ml, stężenie końcowe 500 ng / ml
Rekombinowana aktywina A u człowieka / myszy / szczura	& D	338-AC-050	Stężenie zapasów 100 μ g/mL, stężenie końcowe 100 ng/mL
Odzysk pożywki do zamrażania kultur komórkowych (pożywka do zamrażania komórek)	Gibco	12648010
Kwas retinowy	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Stężenie zapasów 3 i mu; M, stężenie końcowe 3 mM
Pożywka RPMI 1640 z suplementem Glutamax (Pożywka RPMI z suplementem L-glutaminy)	Life Technologies	61870010
Triton X-100 (bufor do lizy komórek)	Sigma-Aldrich	RES9690T-A101X	Stosować w stężeniu 1%
Versene (roztwór EDTA)	Life Technologies	15040066
Vitronectin XF	Stemcell Technologies	7180
Y-27632 dichlorowodorek jednowodny	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG	Stężenie podstawowe 3 mM, stężenie końcowe 10 mM