Artykuł metodologiczny

Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59481

⸱

25 czerwca 2019

 , 
1Molecular and Cellular Neurobiotechnology, Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), The Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), Parc Científic de Barcelona, 2Department of Cell Biology, Physiology, and Immunology, Universitat de Barcelona, 3Center for Networked Biomedical Research on Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 4Institute of Neuroscience, University of Barcelona

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy metodę analizy zachowania rosnących aksonów w matrycach 3D, naśladując ich naturalny rozwój.

Streszczenie

Ten protokół wykorzystuje naturalny kolagen typu I do generowania trójwymiarowego (3-D) hydrożelu do monitorowania i analizy wzrostu aksonów. Protokół koncentruje się na hodowli małych fragmentów embrionalnych lub wczesnopourodzeniowych mózgów gryzoni w hydrożelu 3D utworzonym przez kolagen typu I o określonej porowatości pochodzący ze ścięgna ogona szczura. Fragmenty tkanek są hodowane wewnątrz hydrożelu i konfrontowane z określonymi fragmentami mózgu lub genetycznie zmodyfikowanymi agregatami komórkowymi w celu wytworzenia i wydzielania cząsteczek odpowiednich do tworzenia gradientu wewnątrz porowatej matrycy. Kroki tego protokołu są proste i powtarzalne, ale obejmują krytyczne kroki, które należy dokładnie rozważyć podczas jego opracowywania. Co więcej, zachowanie rosnących aksonów może być monitorowane i analizowane bezpośrednio za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym lub mono/wielofotonowego mikroskopu fluorescencyjnego po utrwaleniu metodami immunocytochemicznymi.

Wprowadzenie

Aksony neuronalne, zakończone stożkami wzrostu aksonów, migrują na duże odległości przez macierz zewnątrzkomórkową (ECM) zarodka określonymi drogami, aby dotrzeć do odpowiednich celów. Stożek wzrostu jest dystalną częścią aksonu i specjalizuje się w wyczuwaniu fizycznego i molekularnego środowiska komórki1,2. Z molekularnego punktu widzenia stożki wzrostu są kierowane przez co najmniej cztery różne mechanizmy molekularne: przyciąganie kontaktowe, chemoprzyciąganie, odpychanie kontaktowe i chemorepulsję wyzwalane przez różne aksonalne wskazówki naprowadzania3,4,5,6. Procesy kontaktowe mogą być częściowo monitorowane w dwuwymiarowych (2D) kulturach na podłożach z mikrowzorami (np. z paskami7,8 lub spots9 zawierających cząsteczki). Jednak aksony mogą nawigować do swojego celu w sposób niedyfuzyjny, wykrywając kilka przyciągających i odpychających cząsteczek z komórek drogowskazu w środowisku4,5,10. W tym miejscu opisujemy prostą metodę hodowli 3D, aby sprawdzić, czy wydzielana cząsteczka wywołuje efekty chemorepulsywne lub chemoatrakcyjne na rozwijające się aksony.

Najwcześniejsze badania miały na celu określenie wpływu wskazówek naprowadzania aksonów, wykorzystywały hodowle eksplantatów w trójwymiarowych (3-D) matrycach do generowania gradientów symulujących warunki in vivo11,12. Podejście to, wraz z eksperymentami in vivo, pozwoliło na zidentyfikowanie czterech głównych rodzin wskazówek naprowadzających: Netrins, Slits, Semaphorins i Ephrins4,5,6. Te sygnały molekularne i inne czynniki13 są integrowane przez rosnące aksony, wyzwalając dynamikę kompleksów adhezyjnych i przenosząc siły mechaniczne przez cytoszkielet14,15,16. Aby wygenerować gradienty molekularne w kulturach 3D do nawigacji aksonalnej, pionierscy badacze wykorzystali substraty skrzepów plazmy17, który był również używany do organotypowych preparatów plastrów18. Jednak w 1958 roku zgłoszono nowy protokół generowania hydrożeli kolagenowych 3D do badań za pomocą urządzeń Maximow19, platforma hodowlana, używana w kilku badaniach odpowiednich do obserwacji mikroskopowych20. Inne pionierskie badanie wykazało, że żel kolagenowy jest narzędziem do osadzania ludzkich fibroblastów do badania różnicowania fibroblastów w miofibroblastach w procesach gojenia się ran21. Równolegle Lumsden i Davies zastosowali kolagen z bydlęcej skóry właściwej, aby przeanalizować przypuszczalny wpływ czynnika wzrostu nerwów (NGF) na prowadzenie czuciowych włókien nerwowych22. Wraz z rozwojem nowych platform hodowlanych (np. płytek wielodołkowych) przez różne firmy i laboratoria, kultury kolagenowe zostały dostosowane do tych nowych urządzeń6,23,24,25,26. Równolegle ekstrakt materiału ECM pochodzącego z linii komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm został udostępniony na rynku w celu rozszerzenia tych badań27.

Ostatnio opracowano kilka protokołów do generowania gradientów molekularnych z domniemanymi rolami w prowadzeniu aksonów za pomocą hydrożeli 3D (np. kolagenu, fibryny itp.)28. Alternatywnie, cząsteczka kandydująca może być unieruchomiona w różnym stężeniu w porowatej matrycy (np. NGF29) lub wygenerowana przez hodowlę w małym obszarze agregatów komórek hydrożelowych 3D, wydzielających cząsteczkę w celu wygenerowania gradientu radialnego4,23,24,25,26. Ostatnia możliwość zostanie wyjaśniona w niniejszym protokole.

Przedstawiona tutaj procedura jest łatwą, szybką i wysoce powtarzalną metodą opartą na analizie wzrostu aksonów w 3-D kulturach hydrożelowych embrionalnego mózgu myszy. W porównaniu z innymi metodami, protokół jest odpowiedni dla nieprzeszkolonych badaczy i może być w pełni opracowany po krótkim szkoleniu (1-2 tygodnie). W tym protokole najpierw izolujemy kolagen z ogonów dorosłych szczurów, aby dalej generować matryce 3D, w których genetycznie zmodyfikowane agregaty komórkowe są hodowane przed embrionalną tkanką neuronalną. Te agregaty komórkowe tworzą promieniste gradienty chemiczne cząsteczki kandydującej, która wywołuje odpowiedź dla rosnących aksonów. Wreszcie, ocenę wpływu cząsteczki na rosnące aksony można łatwo przeprowadzić za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym lub, alternatywnie, metod immunocytochemicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i protokołami Komitetu Etycznego ds. Eksperymentów na Zwierzętach (CEEA) Uniwersytetu w Barcelonie, a protokół użycia gryzoni w tym badaniu został sprawdzony i zatwierdzony przez CEEA Uniwersytetu w Barcelonie (zatwierdzenie CEEA #276/16 i 141/15).

1. Oczyszczanie kolagenu z ogona szczura

  1. Zbierz dorosłe ogony szczurów Sprague-Dawley (w wieku 8-9 tygodni) po złożeniu zwierzęcia w ofierze zgodnie z wytycznymi etycznymi i spłucz 95% etanolem. Umieść 2-4 ogony na lodzie (4 °C) i utrzymuj je przykryte lodem podczas tego procesu.  
  2. Aby uzyskać ścięgna ogonowe, przymocuj ogon do najbardziej ogonowych kręgów ogona za pomocą hemostatu i ściśnij ogon drugim hemostatem umieszczonym około 5-7 mm od pierwszego. Złam ogon, skręcając go ostro obiema hemostatami. Aby to zrobić, złóż/rozłóż kręgi kilka razy, aż pękną.
  3. Powoli pociągnij kręgi hemostatem, aby odłączyć ścięgna od ich pochewki, gdy wychodzi. W tym momencie przetnij ścięgna małymi nożyczkami. Trzymaj te kawałki ścięgien na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm na lodzie.
  4. Powtórz zaciskanie i przesuwanie reszty ogona, aż ścięgna zostaną całkowicie usunięte.
  5. Powtórz kroki 1.2-1.4 dla wszystkich uzyskanych ogonów.
  6. Obserwuj ścięgna pod mikroskopem. Odrzuć naczynia krwionośne, przecinając je małymi nożyczkami i przytrzymując prostymi cienkimi kleszczami, aby poprawić czystość ścięgna i spłucz ścięgna 3 razy ultraczystą wodą.
  7. Zbierz 3-4 g mokrych ścięgien. Rozpuścić ścięgna w 150 ml 3% lodowatego kwasu octowego w temperaturze 4 °C w szklanej kolbie stożkowej o pojemności 200-250 ml przez 24-36 godzin, delikatnie mieszając.
  8. Wirować przy 20 000 x g przez 1 godzinę. Równolegle należy przygotować membranę rurki dializowej, wycinając kawałek o długości około 10-15 cm i gotować go w ultraczystej wodzie zawierającej 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) przez 15 minut. Następnie delikatnie przepłukać membranę dializacyjną ultraczystą wodą.
  9. Po odwirowaniu zebrać supernatant w membranie rurki dializacyjnej przez dekantację. Osad zawiera kwaśny materiał nierozpuszczalny (białka niekolagenowe), a supernatant zawiera rozpuszczalne białka kolagenowe.
  10. Zdializować supernatant w 2 litrach sterylnego 0,1x Minimum Essential Medium Eagle (MEM), pH 4,0 w szklanej zlewce o pojemności 2-5 l. Dializuj przez 3 dni. Zmieniaj 0,1 x roztwór MEM co najmniej dwa razy dziennie, sprawdzając pH przy każdej zmianie przed użyciem. Jeśli pH zmieniło się na podstawowe, zmodyfikuj je kilkoma kroplami 0,1 M kwasu octowego, aż pH osiągnie 4,0.
  11. Po dializie dodać antybiotyki (1,5 ml penicyliny/streptomycyny (Pen-Strep)) do dializowanego roztworu kolagenu. Przygotować 5 ml porcji roztworu podstawowego kolagenu i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    nuta: Od tego momentu wszystkie procedury manipulacyjne muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym.
  12. Kontynuuj test żelowania przygotowanego roztworu podstawowego kolagenu, postępując zgodnie z kolejnymi krokami.
    1. Ponieważ kolagen podstawowy jest zwykle zbyt skoncentrowany, przygotuj 3 robocze rozcieńczenia (75%, 50% i 25% roztwór kolagenu), rozcieńczając bulion w 0,1x MEM, pH 4,0. Ostateczna objętość zalecana dla każdego rozcieńczenia roboczego wynosi 5 ml. W każdym stanie sprawdź stężenie białka za pomocą testu kolorymetrycznego białek.
    2. Umieść na lodzie kilka pustych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml (po jednej na każde robocze rozcieńczenie), 10 probówek MEM, 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i różne robocze rozcieńczenia kolagenu. Poczekaj, aż ostygną.
    3. Dodać 40-50 μl 10x MEM do zimnej (4 °C) probówki wirówkowej. Następnie delikatnie wymieszaj go z 7-8 μl roztworu wodorowęglanu sodu.
    4. Dodaj 310-330 μl jednego z różnych rozcieńczeń kolagenu do tej probówki i delikatnie wymieszaj pipetą, unikając tworzenia się pęcherzyków. Mieszaninę kolagenu, MEM i wodorowęglanu sodu należy przechowywać na lodzie (4 °C) przez co najmniej 5 minut.
    5. Odpipetować 10-25 μl mieszaniny na szalkę Petriego o średnicy 35 mm.
    6. Umieścić szalkę Petriego w inkubatorze CO2 ustawionym w temperaturze 37 °C do momentu zaobserwowania żelowania hydrożelu (± 15–20 min).
    7. Powtórzyć kroki 1.12.3-1.12.6 dla pozostałych rozcieńczeń kolagenu na różnych szalkach Petriego.
    8. Wybierz rozcieńczenie robocze kolagenu, które daje najlepsze rezultaty.
      nuta: Najlepszy hydrożel w żelu powinien mieć jednolitą półprzezroczystą konsystencję, szary kolor i nie powinien być grudkowaty ani żylasty. Z naszego doświadczenia wynika, że rozcieńczenie 3:1 (Kolagen: 0,1x MEM) daje najlepsze wyniki eksperymentalne.

2. Przygotowanie agregacji komórkowych (COS1) modyfikowanych genetycznie w celu wydzielania cząsteczki kandydującej w hydrożelach kolagenowych 3D

  1. Umieść 2 x 106 komórek COS1 na szalkach Petriego o średnicy 35 mm i inkubuj z kompletną pożywką hodowlaną składającą się ze 100 ml D-MEM zawierającej 10% (obj./obj.) inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 0,5% (wag./obj.) glutaminy i 1% (wag./obj.) Pen/Strep w inkubatorze do hodowli komórkowych, w celu osiągnięcia 70-80% konfluencji przez noc. Przygotować jedną szalkę Petriego do każdej procedury transfekcji.
  2. Następnego dnia transfekować komórki COS1 z DNA kodującym cząsteczkę kandydującą (Netrin-1 lub Sema3E) przy użyciu metody transfekcji opartej na liposomach zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Aby to zrobić, wymieszaj 250 μl pożywki bez surowicy i DNA (1-2 μg na warunek) z probówką wirówkową o pojemności 1,5 ml (probówka DNA) i wymieszaj. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut. Przygotować drugą probówkę (probówkę liposomalną), dodając 240 μl pożywki wolnej od surowicy i 10 μl odczynnika do transfekcji liposomalnej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    2. Po inkubacji dodaj zawartość probówki DNA do probówki liposomalnej i delikatnie wymieszaj. Teraz inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Zastąp pożywkę na hodowanych komórkach 1,5 ml pożywki bez surowicy i powoli dodawaj mieszaninę DNA-liposomów do szalki Petriego. Inkubować przez 3 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowychCO2
      3. .
  3. Po 3 godzinach inkubacji transfekcji należy zastąpić pożywkę kompletną pożywką hodowlaną i inkubować przez noc w inkubatorze.
  4. Następnego dnia przepłukać komórki 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (D-PBS), potraktować kultury Trypsin-EDTA (800 μl na każdą szalkę przez 5-15 minut w inkubatorzeCO2) i zebrać oderwane komórki 15 ml kompletnej pożywki hodowlanej.
  5. Odwirować komórki w temperaturze 4 °C przy 130 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu usunąć pożywkę i zakonserwować osad zawierający komórki COS1 na lodzie.
  6. Powtórz kroki 1.12.3-1.12.6, aby przygotować mieszaninę roboczą kolagenu.
  7. Dodać 100-150 μl mieszaniny kolagenu do osadu transfekowanych komórek i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół, a następnie rozprowadzić 45-50 μl tej mieszaniny na szalce Petriego (średnica 35 mm), aby utworzyć jednolity pas komórek kolagenowych o długości około 1-1,5 cm. Umieścić naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C (5% CO2 ) do momentu zaobserwowania żelowania (± 15-20 min).
  8. Przygotować drugi pasek zawierający komórki kontrolne (pozorowana transfekcja) w drugim naczyniu hodowlanym i umieścić go na talerzu w inkubatorze (± 15-20 min), a po zakończeniu żelowania dodać 3-4 ml ogrzanej (37 °C) kompletnej pożywki hodowlanej COS1 do każdej pożywki zawierającej zżelowane paski komórek kolagenowych i przechowywać je w inkubatorze do hodowli komórek CO2 . Następnie pokrój paski komórek kolagenowych, aby uzyskać małe kwadratowe kawałki (o długości od 400 do 500 μm) za pomocą cienkiego skalpela lub rozdrabniacza do tkanek.
  9. Przenieść wszystkie skrawki z tego samego stanu transfekcji na szalkę Petriego zawierającą 3-3,5 ml pożywki do hodowli neuronów (NCM) i sprawdzić pod mikroskopem preparacyjnym jakość kawałków. Ponownie trzymaj je w inkubatorze hodowli komórkowych CO2 .
    nuta: Pożywka do hodowli neuronów składa się z pożywki neurobazalnej zawierającej 1-5% (vol/vol) inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 2 mM glutaminy, 0,5% (wt/vol) glukozy, 1% (wt/vol) roztworu Pen-Strep i 0,044% (wt/vol) NaHCO3. Upewnij się, że pH mieści się w przedziale 7,2-7,3.

3. Wytwarzanie eksplantatu embrionalnego do hodowli

  1. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne (nożyczki, rękojeść ostrza skalpela, kleszcze proste i zakrzywione) przez autoklawowanie zgodnie z rutynowymi wytycznymi dotyczącymi sterylizacji. Równolegle przygotuj 500 ml zbilansowanego roztworu soli i buforu glukozowego Hanka i 4-5 szalek Petriego (o średnicy 100 mm) zawierających 10 ml HBSS-G. Umieść te talerze na lodzie (4 °C).
  2. Ciężarną samicę szczura (16,5 dzień zarodkowy) należy umieścić w uśmierceniu poza sterylnym obszarem, postępując zgodnie z zatwierdzonymi procedurami etycznymi. Wytnij rogi zarodka nożyczkami z jamy brzusznej i umieść je na dużej szalce Petriego zawierającej zimny HBSS-G.
  3. Umieść naczynie w okapie z przepływem laminarnym i usuń zarodki prostymi kleszczami. Umieść je w nowym naczyniu zawierającym zimny HBSS-G. Następnie usuń skórę zarodka za pomocą małych kleszczy i ostrożnie wypreparuj mózg za pomocą zakrzywionych i prostych kleszczy. Umieść je w naczyniu zawierającym zimny HBSS-G.
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć mózg na pół wzdłuż linii środkowej, aby oddzielić obie półkule skalpelem lub cienkimi nożyczkami i usunąć międzymózgowie, opony mózgowe i naczynia krwionośne z kawałków mózgu za pomocą cienkich kleszczy.
  5. Powtórz kroki 3.3-3.4 z resztą zarodków. Nie należy zwlekać z sekcją na dłużej niż 2 godziny, aby zachować jakość tkanki.
  6. Wyczyść wszystkie części rozdrabniacza tkanek 100% etanolem (zwłaszcza płytkę tnącą z politetrafluoroetylenu (PTFE) i żyletkę). Trzymaj rozdrabniacz do tkanek w okapie ze strumieniem laminarnym w świetle UV przez 15 minut.
  7. Przenieś każdy fragment tkanki (np. korę z hipokampem) na płytkę tnącą rozdrabniacza tkanek. W przypadku hipokampa umieść go prostopadle do żyletki i uzyskaj skrawki tkanki o grubości 450-500 μm.
  8. Przygotuj kilka szalek Petriego o średnicy 35 mm z 3-4 ml kompletnego NCM i przenieś kawałki tkanek z płytki rozdrabniacza tkanek na szalki Petriego. Podczas analizowania interesujących obszarów może być potrzebnych wiele potraw.
  9. Zakończ sekcję tkanek w pełnym NCM za pomocą cienkich igieł wolframowych. Sprawdź jakość uzyskanych plastrów pod mikroskopem preparacyjnym. Upewnij się, że warstwy są wyraźnie rozpoznawalne w optyce ciemnego pola i przeanalizuj obszar zainteresowania (np. region CA hipokampa) za pomocą igieł wolframowych. Wyrzuć uszkodzone plasterki. Eksplantaty hipokampa należy przechowywać w kompletnym podłożu NCM w inkubatorze CO2 .

4. Przygotowanie kokultur 3D w hydrożelach kolagenowych

  1. Umieścić kilka sterylnych 4-dołkowych płytek hodowlanych w okapie z przepływem laminarnym i przygotować roboczą mieszaninę kolagenu, jak wskazano wcześniej w krokach 1.12.2-1.12.6.
  2. Umieść 15-20 μl mieszaniny hydrożelu na dnie studzienki, aby uzyskać okrągłą bazę kolagenową. Powtórz ten krok dla pozostałych studzienek. Nie należy przygotowywać więcej niż pięciu płytek jednocześnie, aby uniknąć nadmiernego parowania płynu z bazy hydrożelowej.
  3. Trzymaj szalki w inkubatorze do momentu zaobserwowania całkowitego żelowania (± 15-20 min) i wyjmij płytki z inkubatora dopiero po zakończeniu żelowania. Sprawdź jakość żelowanego kolagenu.
  4. Przenieś mały kawałek agregatu komórkowego COS1 za pomocą pipety. Umieść go na hydrożelowej podstawie i umieść kawałek tkanki na tej samej podstawie za pomocą pipety blisko kawałka komórek skupionego w jednym rozmiarze eksplantu.
  5. Przygotuj nową działającą mieszaninę kolagenu na lodzie, jak w krokach 1.12.2-1.12.6.
  6. Delikatnie odpipetować 15-20 μl tej nowej mieszanki i przykryć eksplant i agregat komórkowy. Obserwowana będzie kultura hydrożelu przypominająca kanapkę. W tym momencie ponownie zorientowaj eksplant za pomocą cienkiej igły wolframowej (nie dotykaj agregatu komórkowego COS1!), tak aby był skierowany w stronę agregatu komórkowego na ± 500-600 μm.
  7. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, aż do zaobserwowania żelowania (± 10-15 min), a następnie 0,5 ml kompletnego NCM uzupełnionego 2% suplementem witaminy B27 i przechowywać kultury przez 36 do 48 godzin w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 min).

5. Utrwalanie kokultur agregatów komórek eksplantatywnych i procedura immunocytochemiczna

  1. Po 36-48 godzinach inkubacji usunąć pożywkę i przepłukać 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,3. Następnie utrwalić kultury przez 1 godzinę 4% paraformaldehydem w 0,1 M buforze fosforanowym (PB), pH 7,3, w temperaturze 4 °C.
  2. Usunąć utrwalacz i delikatnie wypłukać kultury 3-4 razy (po 10-15 minut) w 0,1 M PB o pH 7,3.
  3. Odłącz kanapkę hydrożelową od dna studzienki za pomocą szpatułki lub kleszczy. Przenieś blok kolagenowy za pomocą cienkiego pędzla na 6-dołkową płytkę hodowlaną zawierającą 0,1 M PBS z 0,5% niejonowym detergentem.
  4. Swobodnie pływające hydrożele inkubować w roztworze blokującym (10% surowicy, 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego i 0,2% żelatyny w 0,1 M PBS) przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  5. Spłukać 3 razy (po 10-15 min) 0,1 M PBS zawierającym 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego.
  6. Inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w PBS zawierającym 5% surowicy, 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego, 0,2% żelatyny i 0,02% azydku sodu. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 36-48 godzin w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.
    nuta: Zwykle przeciwciało przeciwko β-tubulinie klasy III (α-TUJ-1) (rozcieńczone 1:2,000) jest używane do określenia wzrostu aksonów w kulturach hydrożelowych 3D.
  7. Po inkubacji spłukać jak w kroku 5.5.
  8. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej (lub 6-7 godzin w temperaturze 4 °C) na wytrząsarce rozcieńczonej w 5% surowicy, 0,5% niejonowym środku powierzchniowo czynnym i 0,2% żelatyny. W tym eksperymencie stosuje się biotynylowane przeciwciało przeciwko myszom (rozcieńczone w stosunku 1:200).
  9. Wypłukać kultury jak w 5.5.
  10. Inkubować kultury przez 2 dni w temperaturze 4 °C z roztworem kompleksu awidyny-biotyny (ABC) w stosunku 1:100 rozcieńczonym w PBS zawierającym 5% surowicy, 0,5% niejonowego środka powierzchniowo czynnego i 0,2% żelatyny. Alternatywnie należy użyć streptawidyny znakowanej peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczoną w stosunku 1:300-400) w tym samym buforze.
  11. Wypłukać kultury bakterii zgodnie z opisem w ppkt 5.5.
  12. Przepłukać kultury kilkakrotnie 0,1 M buforem Tris-HCl o pH 7,6 przez 1 godzinę.
  13. Inkubować kultury z 0,03% roztworem tetrachlorowodorku 3,3′-diaminobenzydyny (DAB) w 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.
  14. Dodać 5-8 μL 1% H2O2 i odczekać 10-15 min. Monitoruj rozwój DAB pod mikroskopem za pomocą obiektywu 4-10x.
  15. Zatrzymać reakcję, usuwając roztwór DAB z 0,1 M buforem Tris-HCl o pH 7,6.
  16. Płucz kultury w PBS przez 30 minut (kilka zmian).
  17. Zamontuj hydrożele na szkiełkach podstawowych za pomocą wodnych mediów montażowych.
  18. Analizuj długość i rozmieszczenie aksonów wewnątrz hydrożelu za pomocą wtyczki analitycznej Sholl lub wtyczki NeuriteJ dla oprogramowania ImageJ30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tutaj prezentujemy szeroko dostępną metodologię badania wzrostu aksonów w 3-D hydrożelowych kulturach kolagenowych embrionalnego układu nerwowego myszy. W tym celu wyizolowaliśmy kolagen z ogonów dorosłych szczurów, aby wygenerować matryce 3D, w których hodowaliśmy genetycznie zmodyfikowane agregaty komórkowe wyrażające Netrin-1 lub Sema3E skonfrontowane z embrionalną tkanką neuronalną (np. Region CA hipokampa). Te agregaty komórkowe utworzyły promieniście rozłożony gradient cząsteczki kandydującej wewnątrz macierzy kola...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wzrost rozwijających się aksonów jest głównie inwazyjny i obejmuje degradację i przebudowę ECM. Korzystając z przedstawionej tutaj procedury, naukowcy mogą uzyskać jednorodną matrycę 3D utworzoną przez naturalny kolagen typu I, w której aksony (lub komórki) mogą reagować na gradient chemiczny wydzielany przez genetycznie zmodyfikowane komórki, tak jak robią to in vivo. Różne reakcje aksonalne na gradienty sygnałów przyciągających lub hamujących (białka, lipidy itp.) można łatwo porównać ze specyficzną kontrolą (pozorowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Tomowi Yohannanowi za porady redakcyjne i M. Segura-Feliu za pomoc techniczną. Praca ta została sfinansowana przez program CERCA oraz przez Komisję ds. Uniwersytetów i Badań Departamentu Innowacji, Uniwersytetów i Przedsiębiorstw Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Prace te zostały sfinansowane przez hiszpańskie Ministerstwo Badań, Innowacji i Szkolnictwa Wyższego (MEICO) za pośrednictwem BFU2015-67777-R i RTI2018-099773-B-100, Hiszpańskiej Sieci Prionów (Prionet Hiszpania AGL2017-90665-REDT) oraz Instytutu Carlos III, CIBERNED (PRY-2018-2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
3,3′-Tetrachlorowodorek diaminoferydyny 10 mg tabletki (DAB)SigmaD5905
Dorosłe szczury Sprague-Dawley (w wieku od 8 do 9 tygodni) Criffa-Credo, Lyon, Francja
Kompleks awidyna-biotyna-peroksydaza (ABC)Vector LabsPK-4000
B27 suplement bez surowicy 50x Invitrogen17504-044
Zestaw do oznaczania białek kwasu bicunchoninowego (BCA)Pierce23225
wektory plazmidowe cDNA linie
komórkowe COS1ATTCCRL-1570
D-(+)-GlukozaSigma16325
D-(+)-glukoza (45% roztwór w wodzie) dla kompletnego podłoża neurobazalnegoSigmaG8769
D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) do pożywki hodowlanej COS1Invitrogen41966-029
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x (bez Ca2+ i Mg2++) (D-PBS) do hodowliInvitrogen14200
Etanol merck108543
Sól disodowa (EDTA) dwuwodnego kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA)SigmaE5134
Fluorescencyjne podłoże montażowe (np. Fluoromount-G lub podobne)Mikroskopia elektronowa (EMS)17984-25
Żelatyna w proszku SigmaG1890
Lodowaty kwas octowy (Panreac, nr kat. 211008)Panreac211008
Hank' s Zrównoważony roztwór soli Invitrogen24020083
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca Invitrogen10108-165
Inaktywowana termicznie surowica końska Invitrogen26050-088
Nadtlenek wodoru (H2O2, 32 do 33% w wodzie)Sigma316989
L-glutamina roztwór 200 mM (100x) do kompletnego podłoża Neurobasel i COS1Invitrogen25030-024
Lipofectamine 2000 OdczynnikInvitrogen11668-019
Samica myszy w ciąży (dzień embrionalny od 12,5 do 16,5; E12.5-16.5) Criffa-Credo, Lyon, Francja
Zmodyfikowane minimum niezbędne podłoże Eagle (MEM)Invitrogen11012-044
Przeciwciało monoklonalne przeciwko klasie III β-tubuliny (klon TUJ-1)Biolegend801201
suplement N-2 100x Invitrogen17502-048
Podłoże neuropodstawne Invitrogen21103049
ParaformaldehydMerck1 040 051 000
Roztwór penicyliny/streptomycyny 100x Invitrogen15140-22
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 10x (PBS) do immunocytochemiiInvitrogenAM9624
Przeciwciało drugorzędowe: biotynylowany anty-mysz dla koni Vector LabsBA-2000
Pożywka bez serum (Opti-MEM)Invitrogen11058-021
Azydek sodu Panreac162712
Roztwór wodorowęglanu sodu 7,5% Invitrogen25080-094
Sterylna klasa hodowli H2O SigmaW3500
TritonTM X-100 Podstawa SigmaX100
Trizma SigmaT1503
Trypsin-EDTA (Trypsyna (0,05% (wag./obj.) z EDTA (1x)Invitrogen25300-054
Sprzęt
duże i 1 mały zakrzywiony nożyczki do preparacji Narzędzia precyzyjne Instrumenty lub podobne
stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml Eppendorf lub podobne
15 ml Corning lub podobne
2 hemostaty   Narzędzia drobne Narzędzia lub podobne
2 małe proste nożyczki preparacyjneNarzędzia drobne Narzędzia lub podobne
probówki wirówkowe o pojemności 200 ml do wirowaniaNalgene lub podobne
Kolby
Zlewka
Płytki hodowlane 4- i 6-dołkowe Nunc176740 i 140675
Automatyczne pompki do pipet oraz jednorazowe sterylne pipety plastikowe o pojemności 10 ml i 25 ml z filtrem zawierającym filtr.Gilson, Brand, Eppendorf lub podobne 
Pipety automatyczne, sterylne końcówki filtrujące i obecnie sterylne końcówki Gilson, Eppendorf lub podobny
Mikrowirówka stołowa z wirnikiem kątowym Eppendorf, Beckman Coulter lub podobny
Wirówka stołowa z chłodzeniem z wirnikiem uchylnym (z adapterami probówek 1,5, 15 i 50 ml)Eppendorf, Beckman Coulter lub podobny
inkubator do hodowli komórkowych przy 37 stopniach; C, 5% CO2 i 95% powietrza
Membrana celulozowa rurki do dializySigmaD9402
Zamknięcia węży do dializy SigmaZ37101-7
Jednorazowe pipety szklane Mikroskop
preparacyjny z optyką ciemnego pola Olympus SZ51 lub podobny 
Szybkoobrotowa wirówka Beckman Coulter z chłodzeniem lub podobna z wirnikiem kątowym o stałym natężeniu
Okap
Duże 100 mm, 60 mm i małe 35 mm Ø Naczynia do hodowli komórkowych Nut  150679, 150288 i 150318, odpowiednio
Mieszadło magnetyczne i magnetyczne pręty spinoweIKA lub podobne
Rozdrabniacz tkanek McIlwainMickle Inżynieria
laboratoryjna Jedna para cienkich kleszczy prostych i jedna para kleszczy zakrzywionych Drobne narzędzia Instrumenty lub podobne
Żyletki do rozdrabniacza
Skalpele (numer 15 i 11)
Dwie pary cienkich szpatułek do przenoszenia kolagenu i kawałków tkanekDrobne narzędzia Instrumenty lub podobne
1 Stożkowe probówki wirówkowe stożkowe ze szkła sterylnego o pojemności 200 mlszklana o pojemności 2 lz przepływem laminarnym:tkanek

Bibliografia

  1. Ramón y Cajal, S. Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés. , (1894).
  2. Ramón y Cajal, S. Nuevo concepto de la histología de los centros nerviosos. , (1893).
  3. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2 (2), 001834(2010).
  4. Tessier-Lavigne, M., Goodman, C. S. The molecular biology of axon guidance. Science. 274 (5290), 1123-1133 (1996).
  5. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  6. Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (6), 001727(2011).
  7. Rosentreter, S. M., et al. Response of retinal ganglion cell axons to striped linear gradients of repellent guidance molecules. Journal of Neurobiology. 37 (4), 541-562 (1998).
  8. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nature Protocols. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  9. von Philipsborn, A. C., et al. Growth cone navigation in substrate-bound ephrin gradients. Development. 133 (13), 2487-2495 (2006).
  10. Chen, H., He, Z., Tessier-Lavigne, M. Axon guidance mechanisms: semaphorins as simultaneous repellents and anti-repellents. Nature Neuroscience. 1 (6), 436-439 (1998).
  11. Jessell, T. M., Sanes, J. R. Development. The decade of the developing brain. Current Opinion in Neurobiology. 10 (5), 599-611 (2000).
  12. Serafini, T., et al. The netrins define a family of axon outgrowth-promoting proteins homologous to C. elegans UNC-6. Cell. 78 (3), 409-424 (1994).
  13. Charron, F., Tessier-Lavigne, M. Novel brain wiring functions for classical morphogens: a role as graded positional cues in axon guidance. Development. 132 (10), 2251-2262 (2005).
  14. Fournier, M. F., Sauser, R., Ambrosi, D., Meister, J. J., Verkhovsky, A. B. Force transmission in migrating cells. Journal of Cell Biology. 188 (2), 287-297 (2010).
  15. Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40 (2), 209-227 (2003).
  16. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (5), 332-343 (2009).
  17. Castellani, V. B. Protocols for Neuronal Cell Culture. , Humana Press Inc. (2001).
  18. Gahwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
  19. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  20. Billings-Gagliardi, S., Wolf, M. K. A simple method for examining organotypic CNS cultures with Nomarski optics. In Vitro. 13 (6), 371-377 (1977).
  21. Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proceedings of the National Academy of Science. 76 (3), 1274-1278 (1979).
  22. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Earliest sensory nerve fibres are guided to peripheral targets by attractants other than nerve growth factor. Nature. 306 (5945), 786-788 (1983).
  23. Chedotal, A., et al. Semaphorins III and IV repel hippocampal axons via two distinct receptors. Development. 125 (21), 4313-4323 (1998).
  24. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  25. Klein, R. Eph/ephrin signaling in morphogenesis, neural development and plasticity. Current Opinion in Cell Biology. 16 (5), 580-589 (2004).
  26. Wang, K. H., et al. Biochemical purification of a mammalian slit protein as a positive regulator of sensory axon elongation and branching. Cell. 96 (6), 771-784 (1999).
  27. Emonard, H., Grimaud, J. A., Nusgens, B., Lapiere, C. M., Foidart, J. M. Reconstituted basement-membrane matrix modulates fibroblast activities in vitro. Journal of Cell Physiology. 133 (1), 95-102 (1987).
  28. Knapp, D. M., Helou, E. F., Tranquillo, R. T. A fibrin or collagen gel assay for tissue cell chemotaxis: assessment of fibroblast chemotaxis to GRGDSP. Experimental Cell Research. 247 (2), 543-553 (1999).
  29. Kapur, T. A., Shoichet, M. S. Immobilized concentration gradients of nerve growth factor guide neurite outgrowth. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 68 (2), 235-243 (2004).
  30. Torres-Espin, A., Santos, D., Gonzalez-Perez, F., del Valle, J., Navarro, X. Neurite-J: an image-J plug-in for axonal growth analysis in organotypic cultures. Journal of Neuroscience Methods. 236, 26-39 (2014).
  31. Balestrini, J. L., et al. Comparative biology of decellularized lung matrix: Implications of species mismatch in regenerative medicine. Biomaterials. 102, 220-230 (2016).
  32. Qian, J., et al. Kinetic Analysis of the Digestion of Bovine Type I Collagen Telopeptides with Porcine Pepsin. Journal of Food Science. 81 (1), 27-34 (2016).
  33. Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen. Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).
  34. Garnotel, R., et al. Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95). Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).
  35. Montolio, M., et al. A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration. Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).
  36. Garcia-Gareta, E. Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration. Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

hydro el kolagenowymigracja neuronalnaprowadzenie aksonalnetr jwymiarowa hodowla kom reksiekanie tkankianaliza immunocytochemicznamikroskopia w kontra cie fazowymmikroskopia fluorescencyjna

Powiązane artykuły