Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli

Podsumowanie

Od dawna wiadomo, że wiązania dwusiarczkowe stabilizują strukturę wielu białek. Prostą metodą analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych przez te wiązania jest nieredukcyjna analiza SDS-PAGE. Tutaj metoda ta jest zilustrowana poprzez analizę izoformy jądrowej dUTPazy z ludzkiej linii komórkowej kostniakomięsaka U-2 OS.

Streszczenie

Struktury wielu białek są stabilizowane przez kowalencyjne wiązania dwusiarczkowe. W ostatnich pracach wiązanie to zostało również sklasyfikowane jako modyfikacja potranslacyjna. Dlatego ważne jest, aby móc badać tę modyfikację w żywych komórkach. Prostą metodą analizy tych stabilizowanych cysteiną kompleksów multimerycznych jest dwuetapowa metoda nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i sieciowania formaldehydu. Ta dwuetapowa metoda jest korzystna jako pierwszy krok do odkrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi ze względu na łatwość techniczną i niski koszt eksploatacji. W tym przypadku ludzka linia komórkowa kostniakomięsaka U-2 OS jest używana do zilustrowania tej metody poprzez specyficzną analizę izoformy jądrowej dUTPazy.

Wprowadzenie

Od dawna wiadomo, że wiązania dwusiarczkowe stabilizują strukturę wielu białek. W ostatnich pracach wiązanie to zostało również sklasyfikowane jako odwracalna modyfikacja potranslacyjna, działająca jako oparty na cysteinie "przełącznik redoks", który pozwala na modulację funkcji, lokalizacji i interakcji białka^1,2,3,4. Dlatego ważne jest, aby móc przestudiować tę modyfikację. Prostą metodą analizy tych stabilizowanych cysteiną kompleksów multimerycznych jest nieredukcyjna analiza SDS-PAGE⁵. Analiza SDS-PAGE jest techniką stosowaną w wielu laboratoriach, gdzie wyniki można uzyskać i zinterpretować szybko, łatwo i przy minimalnych kosztach, i jest korzystna w porównaniu z innymi technikami stosowanymi do identyfikacji wiązań dwusiarczkowych, takimi jak spektrometria mas^6,7 i dichroizm kołowy⁸.

Jednym ważnym krokiem w ustaleniu, czy ta metoda jest odpowiednią techniką do pomocy w badaniu, jest dokładne zbadanie pierwotnej sekwencji interesującego białka, aby upewnić się, że są tam obecne reszty cysteiny. Kolejnym pomocnym krokiem jest zbadanie wszelkich wcześniej opublikowanych struktur krystalicznych lub użycie aplikacji bioinformatycznej do zbadania trójwymiarowej struktury białka będącego przedmiotem zainteresowania, aby zwizualizować, gdzie mogą znajdować się reszty cysteiny. Jeśli pozostałości są obecne na powierzchni zewnętrznej, mogą być lepszym kandydatem do utworzenia wiązania dwusiarczkowego, a nie reszty cysteiny zakopanej wewnątrz struktury. Należy jednak zauważyć, że białka mogą ulegać zmianom strukturalnym w wyniku interakcji substratów lub interakcji białko-białko, dzięki czemu te reszty mogą być następnie wystawione na działanie środowiska.

Zidentyfikowane kompleksy multimeryczne mogą być następnie zweryfikowane za pomocą chemicznego sieciowania przy użyciu formaldehydu. Formaldehyd jest idealnym środkiem sieciującym dla tej techniki weryfikacji ze względu na wysoką przepuszczalność komórek i krótki zakres sieciowania wynoszący ~2-3 A, zapewniając wykrywanie specyficznych interakcji białko-białko^9,10. Tutaj metoda ta jest zilustrowana analizą izoformy jądrowej dUTPazy z ludzkiej linii komórkowej kostniakomięsaka kości U-2 OS¹¹. Jednak protokół ten można dostosować do innych linii komórkowych, tkanek i organizmów.

Protokół

1. Blokowanie wolnych reszt cysteiny za pomocą jodoacetamidu

1. Hoduj komórki U-2 OS w naczyniu o średnicy 6^cm2 do 50%-60% zbiegu w minimalnej niezbędnej pożywce o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% pirogronianu sodu w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
2. Przygotuj świeży zapas 10 mM jodoacetamidu tuż przed użyciem, a następnie wyrzuć niewykorzystany odczynnik.
3. Dodać 0,1 mM jodoacetamidu o stężeniu końcowym bezpośrednio do pożywki do hodowli komórkowych. Delikatnie kołysz naczyniem w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.

2. Zbieranie komórek

1. Odessać pożywkę z komórek.
2. Umyj komórki trzykrotnie 5 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odessać końcowy roztwór płuczący PBS, a następnie dodać 1 ml zimnego PBS.
3. Zeskrob komórki z dna naczynia za pomocą skrobaka do komórek. Za pomocą pipety o pojemności 1 ml pobrać PBS i zawiesinę komórek, a następnie dozować cały płyn do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
4. Wirować komórki w temperaturze 7 500 x g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C. Odessać PBS, pozostawiając osad komórkowy. Osad komórkowy może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia

3. Ekstrakcja białka

1. Przygotować 100 μl 1x buforu do lizy rozcieńczonego w ddH₂O (patrz tabela materiałów). Dodać fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) bezpośrednio przed użyciem do końcowego stężenia 1 mM.
2. Dodaj 50 μl 1x buforu do lizy bezpośrednio do osadu komórkowego i zawiesić. Inkubuj to na lodzie przez 5 minut.
3. Sonikować przez 8 s w trybie stałego impulsu na poziomie 40% (patrz Tabela Materiałów dla sonikatora; dostosować w razie potrzeby dla różnych sonikatorów), utrzymując ekstrakt na lodzie.
4. Wirować ekstrakt w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 16 000 x g. Supernatantem jest rozpuszczalna frakcja białkowa. W razie potrzeby można przeprowadzić analizę Bradforda w celu określenia stężenia białka.

4. Przygotowanie próbki

1. Weź 10 μl rozpuszczalnego ekstraktu białkowego i dodaj 10 μl 1x buforu do próbek Laemmli SDS (4% SDS, 20% glicerol, 0,004% błękitu bromofenolowego i 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Nie dodawaj żadnych odczynników redukujących.
2. Próbki należy przechowywać na lodzie, jeżeli tego dnia ma być przeprowadzona analiza SDS PAGE; w przypadku długotrwałego przechowywania właściwe jest -20 °C. Bezpośrednio przed uruchomieniem żelu należy podgrzewać próbkę przez 5 minut w temperaturze 85 °C.

5. Sieciowanie in vivo formaldehydu białek endogennych w komórkach U-2 OS

1. Hoduj komórki U-2 OS w kolbie o średnicy 175^cm2 do 70%-80% zbiegu (patrz sekcja 1).
2. Przeprowadź reakcję sieciowania formaldehydu
   1. W dygestorium podamy porcję 37% roztworu formaldehydu zakupionego ze źródeł komercyjnych. Utrwalacz formaldehydu dodać bezpośrednio do podłoża do końcowego stężenia 1% i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 15 minut.
   2. Aby wygasić reakcję, dodać 1,25 M glicyny do końcowego stężenia 0,125 M i inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem na kołysku przez 5 minut.
3. Umyj komórki trzykrotnie 5 ml zimnego PBS. Zassać końcowy roztwór płuczący PBS i dodać 10 ml PBS. Zeskrobać komórki z dna kolby za pomocą skrobaka do komórek.
4. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml pobrać PBS i zawiesinę komórek, a następnie dozować cały płyn do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować komórki w temperaturze 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odessać PBS, pozostawiając osad komórkowy.

6. Frakcjonowanie jąder

1. Przygotować 10 ml buforu homogenizacyjnego: 0,25 M sacharozy, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES i 0,5% BSA przy pH 7,4. Dodać PMSF bezpośrednio przed użyciem do 1 mM końcowego stężenia i 3 ml buforu zawiesiny jąder (0,1% Triton X-100 w PBS).
2. Dodać 5 ml buforu homogenizacyjnego bezpośrednio do osadu komórkowego i całkowicie zawiesić. Odwirować zawiesinę o sile 500 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
3. Zawiesić osad w 5 ml buforu homogenizacyjnego. Użyj ciasno dopasowanego homogenizatora szklano-teflonowego, odbić homogenizuj komórki przy 10 uderzeniach / 500 obr./min.
4. Odwirować zawiesinę o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie odrzucić supernatant.
   nuta: Użyć supernatantu do izolacji mitochondriów przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 10 minut.
5. Zawiesić osad w 1 ml buforu zawiesiny jąder i inkubować na lodzie przez 10 minut.
6. Wirować przy 600 x g przez 10 min. Wyrzucić supernatant.
7. Zawiesić osad w 1 ml buforu zawiesiny jąder i ponownie odwirować. Odrzucić supernatant. Ostatnim osadem będą izolowane jądra.

7. Ekstrakcja białka

1. Powtórzyć sekcję 4, z wyjątkiem dodania 25 μl 1x buforu do lizy bezpośrednio do osadu komórkowego, a następnie zawieszenia.

8. Przygotowanie próbki

1. Przygotować dwie próbki do SDS-PAGE, pobierając po 10 μl rozpuszczalnego ekstraktu białkowego i dodając 10 μl 2x buforu do próbek Laemmli SDS i 1 μl 2-merkaptoetanolu (BME).
2. Ogrzewać jedną próbkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a drugą próbkę przez 15 minut w temperaturze 98 °C w celu odwrócenia usieciowania formaldehydu.

9. Analiza SDS-PAGE

1. Przygotuj 1 l 1x buforu do biegania Tris-glicyna (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% (w/v) SDS).
2. Skonfiguruj urządzenie do uruchamiania SDS-PAGE.
   UWAGA: Ten protokół wykorzystuje 16% prefabrykowaną stronę SDS TGX. Warto zauważyć, że można użyć dowolnego żelu procentowego.
   1. Zgodnie z protokołem producenta otwórz opakowanie, w którym przechowywany jest żel, i wyjmij kasetę.
   2. Usuń grzebień wyściełający studzienki i taśmę z dna kasety.
   3. Umieść żel w aparacie do biegania.
   4. Napełnij komorę 1x działającym buforem, aż studzienki zostaną zanurzone w cieczy. Za pomocą plastikowej pipety przepłukać studzienki za pomocą uruchomionego buforu.
3. Załaduj próbki na żel wraz z 10 μl wstępnie wybarwionego markera standardowego.
4. Uruchom żel pod napięciem 200 V, aż przód barwnika znajdzie się około 1 cm od dna żelu.

10. Western Blot

1. Przygotować 1 l 1x buforu transferowego (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 20% metanolu) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
2. Ostrożnie wyjmij żel i otwórz kasetę. Za pomocą brzytwy ostrożnie pokrój i wyrzuć żel do układania. Nabierz żel za pomocą jednego rogu i umieść go na tacy z buforem transferowym, pozwalając mu delikatnie kołysać się przez 5 minut.
3. Podczas kołysania żelu umieścić blok lodu (przechowywany w temperaturze -20 °C) w zbiorniku transferowym i dodać bufor transferowy do 3/4 wysokości.
4. Zwilż membranę z polifluorku winylidenu (PVDF), mocząc ją w 100% metanolu przez 30 s.
5. Po upływie 5 minut przygotuj się do skonfigurowania transferu w zasobniku z buforem transferu. Bufor transferowy powinien wystarczyć do całkowitego zanurzenia kleksa. Ustaw transfer blot w następujący sposób: na dole, spód uchwytu kasety (); następnie gruba gąbka, bardzo gruba bibuła, żel poliakrylamidowy, membrana PVDF, bardzo gruba bibuła i gruba gąbka; następnie w końcu górna część uchwytu kasety (biała) u góry.
6. Zablokuj kasetę i umieść urządzenie w zbiorniku transferowym z membraną PVDF skierowaną w stronę anody dodatniej, a żelem w kierunku ujemnej. Uzupełnij urządzenie buforem transferowym, aż transfer zostanie całkowicie zanurzony.
7. Umieść urządzenie na talerzu do mieszania. Dodaj mieszadło do urządzenia i rozpocznij mieszanie z prędkością 125 obr./min.
8. Praca pod napięciem 100 V przez 60 minut.
9. Podczas przenoszenia przygotuj roztwór 5% mleka w proszku rozpuszczonego w soli fizjologicznej buforowanej Tris, o Tween-20, pH 7,5 (TBST).
10. Zdemontuj urządzenie i zdejmij membranę, zwracając uwagę na to, która strona miała kontakt z żelem; upewnij się, że ta strona pozostaje na tacy przez pozostałe kroki.
11. Moczyć membranę przez 2 minuty w soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS), a następnie zablokować błonę przez inkubację w 5 ml 5% roztworu mleka-TBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
12. Zastąp mleko świeżym 4 ml 5% roztworu mleka-TBST i dodaj przeciwciało pierwszorzędowe we właściwym rozcieńczeniu (w tym przypadku nasze rozcieńczenie wynosi 1:2,000 dla przeciwciała dUTPazy) i inkubuj przez noc z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C.
13. Następnego dnia usunąć blot z bujaczka o temperaturze 4 °C do kołyski o temperaturze pokojowej, odrzucając roztwór przeciwciała pierwszorzędowego.
14. Wykonaj trzy szybkie prania za pomocą TBST, używając wystarczającej ilości płynu, aby całkowicie zanurzyć plamę, a następnie 3 prania po 5 minut każde, powoli kołysząc.
15. Po ostatnim praniu dodaj 5 ml 5% roztworu mleka TBST i kołysz blek przez 15 minut, a następnie wyrzuć.
16. Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w 5% mleku-TBST w pożądanym stężeniu. (W tym przypadku rozcieńczenie 1:5 000 koziego środka anty-króliczego rozcieńczone w 5 ml 5% roztworu TBST mleka)
17. Inkubować w temperaturze pokojowej, kołysząc przez 1 godzinę, a następnie wyrzucić roztwór.
18. Wykonaj trzy szybkie prania z TBST, a następnie 3 prania po 5 minut każde, powoli kołysząc, a następnie wyrzuć ostatnie pranie i dodaj 5 ml TBS.
19. Przygotować mieszaninę chemiluminescencyjnych roztworów detekcyjnych ECL w stosunku 1:1 (1 ml każdego odczynnika na końcową objętość 2 ml) i dodać ją bezpośrednio do blot inkubującego przez 1 minutę.
20. Usuń membranę za pomocą pęsety i przetrzyj róg chusteczką laboratoryjną, usuwając nadmiar roztworu. Umieść membranę w folii termokurczliwej i umieść białko stroną do góry w kasecie rentgenowskiej.
21. Wystaw membranę na działanie kliszy rentgenowskiej. Czas ekspozycji będzie się różnił.

Wyniki

Jądrowa dUTPaza tworzy międzycząsteczkowe wiązanie dwusiarczkowe, tworząc stabilną konfigurację dimeru poprzez oddziaływanie dwóch reszt cysteiny znajdujących się na trzeciej pozycji aminokwasowej każdego białka monomerowego¹¹. Zostało to przedstawione na Rysunku 1A,B. Aby upewnić się, że wiązanie dwusiarczkowe nie było niespecyficznym oddziaływaniem wynikającym z nieprawidłowości migracji w środowisku nieredukującym, ...

Dyskusja

Opisana tutaj metoda daje prosty protokół analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi. Protokół ten można łatwo dostosować do innych linii hodowli komórkowych, tkanek i organizmów, co pozwala na szeroki zakres zastosowań.

Ważnym krokiem w tej procedurze jest upewnienie się, że wiązania dwusiarczkowe nie są konsekwencją procedury ekstrakcji. Wszelkie wolne reszty cysteiny można zablokować za pomocą jodoacetamidu¹³. Ten środek alkilujący ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16% prefabrykowane żele TGX	ThermoFisher	Xp00160
175 cm2 Kolba	Cell star	658175
18CO	ATCC	CRL-1459
6 cm2	talerz VWR	10861-588
A549	ATCC	CCL-185
Amersham ECL zestaw detekcyjny	GE
Aparat do przenoszenia plam	Biorad	153BR76789
BME	Sigma Aldrich	M3148
Odczynnik białkowy Bradford	Biorad	5000006
Bromofenol Blue
BSA Sygnalizacja	komórkowa	99985
Bufor do lizy komórek	Sygnalizacja komórkowa	9803
Wirówka	Eppendor	5415D
DMEM	Gibco	11330-032
Wiertarka
EDTA	Sigma Aldrich	M101
Aparat do elektroforezy	Invitrogen	A25977
Bardzo gruba bibuła zachodnia	ThermoFisher	88610
Płod Surowica bydlęca	Gibco	1932693
Formaldehyd	ThermoFisher	28908
Homogenizator
Glicerol	Sigma Aldrich	65516
Glicyna	RPI	636050
Blok grzewczy	Denville	10285-D
Hepes	Sigma Aldrich	H0527
Kwas solny	VWR	2018010431
Jodoacetamid	ThermoFisher	90034
Kimwipe	Kimtech	34155
Metanol	Pharmco	339000000
Beztłuszczowe mleko w proszku	Sygnalizacja komórkowa	99995
PBS	Sigma Aldrich	P3813
PMSF	Sigma Aldrich	329-98-6
Rurka Posi-click	Denville	C2170
Zasilacz	Biorad	200120
Marker wstępnie barwiony	ThermoFisher	26619
Membrana PVDF	Biorad	162-0177
Rocker	Reliable Scientific	55
Saos2	ATCC	HTB-85
SDS	Biorad	161-0302
Przeciwciało wtórne	Sygnalizacja komórkowa	70748
Skrobak do małych komórek	Tygon	S-50HL klasa VI
Chlorek sodu	RPI	S23020
Pirogronian sodu	Gibco
Sonicator	Branson	450
Gąbka do bibuły	Invitrogen	E19051
Płytka mieszająca	Corning	PC353
Sacharoza	Sigma Aldrich	S-1888
Tris Base	RPI	T60040
Tris Buforowana sól fizjologiczna, z Tween 20, pH 7,5	Sigma Aldrich	SRE0031
Tris-Glycine bufor do biegania	VWR	J61006
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
U-2 OS	ATCC	HTB-96
Folia rentgenowska	ThermoFisher	34090

16817200szklano-teflonowy