Tutaj prezentujemy protokół, który upraszcza pomiar odpowiedzi elektroretinogramu wywołanego światłem od larw danio pręgowanego. Nowatorska elektroda w kształcie stożka z końcówką gąbki może pomóc w łatwiejszym do osiągnięcia badaniu rozwoju wzrokowego u larw danio pręgowanego za pomocą elektroretinogramu ERG, zapewniając wiarygodne wyniki i obniżając koszty.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zapis elektroretinogramu u larw danio pręgowanego przy użyciu nowatorskiej elektrody gąbczastej w kształcie stożka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Danio rerio (Danio rerio) jest powszechnie używany jako model kręgowców w badaniach rozwojowych i jest szczególnie odpowiedni do neuronauki wizualnej. Elektroretinografia (ERG) jest idealną nieinwazyjną metodą do pomiarów funkcjonalnych sprawności wzrokowej, która ma ugruntowaną pozycję u wyższych gatunków kręgowców. Podejście to jest coraz częściej stosowane do badania funkcji wzrokowych u danio pręgowanego, w tym we wczesnych stadiach rozwojowych larwalnych. Jednak do tej pory najczęściej stosowaną elektrodą rejestrującą dla larw danio pręgowanego jest szklana elektroda do mikropipet, która wymaga specjalistycznego sprzętu do jej produkcji, co stanowi wyzwanie dla laboratoriów o ograniczonych zasobach. W tym miejscu przedstawiamy protokół ERG larw danio pręgowanego przy użyciu elektrody z gąbką w kształcie stożka. Nowatorska elektroda jest łatwiejsza w produkcji i obsłudze, bardziej ekonomiczna i mniej podatna na uszkodzenie oka larwalnego niż szklana mikropipeta. Podobnie jak wcześniej opublikowane metody ERG, obecny protokół może oceniać funkcję zewnętrznej siatkówki poprzez odpowiedzi fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych, odpowiednio załamek A i B. Protokół może wyraźnie zilustrować udoskonalenie funkcji wzrokowych we wczesnym okresie rozwoju larw danio pręgowanego, wspierając użyteczność, czułość i niezawodność nowej elektrody. Uproszczona elektroda jest szczególnie przydatna przy tworzeniu nowego systemu ERG lub modyfikowaniu istniejącego aparatu ERG dla małych zwierząt do pomiaru danio pręgowanego, pomagając naukowcom zajmującym się neuronaukami wizualnymi w korzystaniu z organizmu modelowego danio pręgowanego.
Wprowadzenie
Danio rerio danio pręgowany (Danio rerio) stał się szeroko stosowanym genetycznym modelem kręgowców, włączając w to badania neuronauk wizualnych. Rosnąca popularność tego gatunku może być przypisana zaletom, takim jak łatwość manipulacji genetycznej, wysoce zachowany układ wzrokowy kręgowców (typy neuronów, anatomiczna morfologia i organizacja oraz podstawowa genetyka), wysoka płodność i niższe koszty hodowli w porównaniu z modelami ssaków1. Nieinwazyjny elektroretinogram (ERG) jest od dawna stosowany klinicznie do oceny funkcji wzrokowych człowieka, a w warunkach laboratoryjnych do ilościowego określania widzenia u wielu dużych i mały....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury elektroretinogramu (ERG) zostały wykonane zgodnie z postanowieniami kodeksu postępowania Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych w zakresie opieki i użytkowania zwierząt i zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyki zwierząt na Uniwersytecie w Melbourne.
1. Przygotowanie bufora
- Przygotuj 10x bufor Ringera złotej rybki (1,25 M NaCl, 26 mM KCl, 25 mm CaCl2, 10 mM MgCl2, 100 mM glukozy, 100 mM HEPES) za pomocą wody z odwróconej osmozy (RO). Dostosuj bufor do pH 7,8 i wysterylizuj bufor za pomocą filtra 0,22 μm. Przechowywać bufor 10x w temperaturze 4 °C jako ro....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki pomiarów ERG wykonywanych codziennie od 4 do 7 dpf. Od 4 dpf odpowiedzi ERG wykazują wyraźne komponenty fali a i b, które pochodzą odpowiednio z fotoreceptorów i komórek dwubiegunowych. W każdym badanym wieku amplituda fali b zwiększała się wraz z intensywnością światła (Rysunek 2; Rysunek 3). Co istotne, czułość siatkówki larw zebrafish na słabsze błyski wzrastała wraz z wiekiem. Fale a i b n.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Odczyty funkcjonalne, takie jak ERG, stają się coraz ważniejsze w zestawie narzędzi wykorzystywanych do badania larw danio pręgowanego 8,9,12,14. Ze względu na niewielki rozmiar oka larwy danio pręgowanego, szklane mikropipety zostały przystosowane jako elektrody rejestrujące w większości opublikowanych protokołów 3,4,5,8,9,12,13,14.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie posiadają żadnych ujawnień związanych z tą pracą.
Podziękowania
Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez grant z Melbourne Neuroscience Institute (dla PTG, PRJ & BVB).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,22 &mikro; m filtr | Millex GP | SLGP033RS | Filtruje 10&razy; bufor dzwonka złotej rybki do sterylizacji |
| Strzykawka 1 ml | Terumo | DVR-5175 | Z 30G × ½ " do dodawania kropli soli fizjologicznej do końcówki gąbki elektrody, aby zapobiec wysuszeniu i zwiększonemu szumowi w sygnałach ERG. |
| 30 G & razy; ½ " igła | Terumo | NN*3013R | Do dodawania soli fizjologicznej do elektrody z końcówką soli fizjologicznej. |
| Instrumenty biowzmacniacza | ML135 | Do wzmacniania sygnałów ERG. | |
| Roztwór wybielacza | King White | 9333441000973 | Alternatywna metoda chlorowania elektrod srebrnych. Substancja czynna: 42 g/l podchlorynu sodu. |
| Kąpiel wodna | cyrkulacyjna Lauda-Ko?nigshoffen | MGW Lauda | Służy do wykonania podgrzewanej wodą platformy. |
| Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum do łączenia elektrod z drutem srebrnym do wzmacniacza. | |
| Faradaya | Cage'a | Do utrzymania adaptacji do ciemności i zamknięcia konfiguracji Ganzfeld w celu poprawy stosunku sygnału do szumu. | |
| Ganzfeld Bowl | International | Specjalnie zaprojektowany stymulator światła: średnica 36 mm, rozmiar apertury 13 cm. | |
| Luksusowe diody LED | Phillips Light Co. | Do stymulacji światłem dwadzieścia diod LED o mocy 5 W i jedna o mocy 1 W. | |
| Mikromanipulator | Aparat Harvard | BS4 50-2625 | Trzyma elektrodę rejestrującą podczas eksperymentów. |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | wersja 2010 | Arkusz kalkulacyjny do analizy danych. |
| Nawilżający żel pod oczy | GenTeal Gel | 9319099315560 | Służy do pokrywania larw danio pręgowanego podczas nagrań, aby uniknąć odwodnienia. Składnik aktywny: 0,3 % hypromeloza i 0,22 % karbomer 980. |
| Pipeta Pasteura | Copan | 200C | Służy do ostrożnego przenoszenia larw danio pręgowanego. |
| System akwizycji danych Powerlab | ADInstruments | ML785 | Steruje diodami LED w celu generowania bodźców. |
| Gąbka PVA | MeiCheLe | R-1675 | Do umieszczania larw danio pręgowanego i wytwarzania elektrody w kształcie stożka ti |
| Roztwór soli | fizjologicznej Aaxis Pacific | 13317002 | Do galwanizacji elektrody srebrnej. |
| Scope Software | ADInstruments | wersja 3.7.6 | Jednocześnie wyzwala bodziec przez system Powerlab i zbiera dane |
| Srebro (cienki drut okrągły) | A& E metal | 0,3 mm | Służy do wykonywania elektrod rejestrujących i referencyjnych ERG. |
| Mikroskop stereoskopowy | Leica | M80 | Służy do kształtowania i mierzenia wierzchołka gąbki w kształcie stożka (z paskiem skali na okularze). Umieszczony w klatce Faradaya w celu umieszczenia elektrody. |
| Trikaina | Sigma-aldrich | E10521-50G | Do znieczulania larw danio pręgowanego. |
| Podgrzewana wodą platforma | wykonana na | Do utrzymywania temperatury platformy gąbki i ciała larwalnego podczas zapisów ERG |
Bibliografia
- Roper, C., Tanguay, R. L. Handbook of Developmental Neurotoxicology (Second Edition). Slikker, W., Paule, M. G., Wang, C. , Academic Press. 143-151 (2018).
- Nguyen, C. T., et al. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
