Method Article

Izolacja i ocena ilościowa komórek szczoteczki z tchawicy myszy

DOI:

10.3791/59496

⸱

June 12th, 2019

 ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Allergy and Immunology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki szczoteczki to rzadkie cholinergiczne komórki nabłonka chemosensorycznego znalezione w naiwnej tchawicy myszy. Ze względu na ich ograniczoną liczbę, ocena ex vivo ich funkcjonalnej roli w odporności i przebudowie dróg oddechowych jest trudna. Opisano metodę izolacji komórek szczoteczki tchawicy za pomocą cytometrii przepływowej.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki szczoteczki tchawicy to cholinergiczne komórki nabłonka chemosensorycznego, zdolne do przekazywania sygnałów ze światła dróg oddechowych do układu odpornościowego i nerwowego. Należą do rodziny chemosensorycznych komórek nabłonkowych, która obejmuje komórki kępek w błonie śluzowej jelit, komórki szczoteczki w tchawicy oraz pojedyncze komórki chemosensoryczne i mikrokosmkowe w błonie śluzowej nosa. Komórki chemosensoryczne w różnych przedziałach nabłonkowych mają wspólne kluczowe markery wewnątrzkomórkowe i podstawową sygnaturę transkrypcyjną, ale wykazują również znaczną niejednorodność transkrypcji, prawdopodobnie odzwierciedlającą lokalne środowisko tkankowe. Izolacja komórek szczoteczki tchawicy z zawiesin pojedynczych komórek jest wymagana do szczegółowego określenia funkcji tych rzadkich komórek nabłonkowych, ale ich izolacja jest trudna, potencjalnie ze względu na ścisłą interakcję między komórkami szczoteczki tchawicy a zakończeniami nerwowymi lub ze względu na specyficzny dla dróg oddechowych skład połączeń ścisłych i przylegających. W tym miejscu opisujemy procedurę izolacji komórek szczoteczki z nabłonka tchawicy myszy. Metoda opiera się na wstępnym oddzieleniu nabłonka tchawicy od błony podśluzowej, co pozwala na późniejszą krótszą inkubację arkusza nabłonka z papainą. Procedura ta oferuje szybkie i wygodne rozwiązanie do sortowania cytometrycznego przepływowego i analizy funkcjonalnej żywotnych komórek szczoteczki tchawicy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki szczotek należą do klasy komórek nabłonka chemosensorycznego, charakteryzujących się ekspresją receptorów gorzkiego smaku i maszynerią transdukcji receptorów smaku znajdującą się w komórkach kubków smakowych. W przeciwieństwie do komórek kubków smakowych, komórki nabłonka chemosensorycznego są rozproszone na powierzchniach nabłonka i są określane jako pojedyncze komórki chemosensoryczne (SCC) i komórki mikrokosmków w nabłonku nosa1,2, komórki szczoteczki w tchawicy3,4, a komórki kępkowe w jelicie5,6. Komórki nabłonkowe wyrażające receptory gorzkiego smaku i maszynerię transdukcji gorzkiego smaku znajdują się również w cewce moczowej7,8 i trąbce słuchowej9. Komórki szczoteczki dróg oddechowych pełnią unikalne funkcje w neurogennych i immunologicznych odpowiedziach dróg oddechowych. Są to komórki chemosensoryczne wytwarzające acetylocholinę, które wywołują ochronne odruchy oddechowe po aktywacji związkami gorzkimi i metabolitami bakteryjnymi, takimi jak substancje wyczuwające kworum10. Komórki szczoteczki do dróg oddechowych są również dominującym źródłem IL-25 w nabłonku dróg oddechowych, która reguluje wywołane przez alergeny wziewne zapalenie typu 2 w drogach oddechowych3.

Charakterystyka pełnego transkryptomu komórek szczoteczki dolnych dróg oddechowych i ich reakcji na bodźce środowiskowe została ograniczona przez ich niską liczbę w nabłonku tchawicy i bardzo ograniczoną liczbę poza dużymi oskrzelami10. Techniki stosowane do izolacji komórek chemosensorycznych z nabłonka jelitowego nie przyniosły proporcjonalnie wysokich liczb z tchawicy, prawdopodobnie z powodu intymnych kontaktów komórek szczoteczki tchawicy z zakończeniami nerwowymi10 lub innymi specyficznymi dla tkanek czynnikami błony śluzowej dróg oddechowych, takimi jak skład adherenów i białek połączeń ścisłych. Ostatnie doniesienia o udanej izolacji komórek szczoteczki tchawicy w większej liczbie do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki wykorzystywały albo 2-godzinną inkubację z papainą, albo 18-godzinną inkubację z pronase11,12. Ponieważ dłuższa inkubacja z enzymami trawiennymi może zmniejszyć żywotność komórek i zmienić profil transkrypcyjny komórek z trawionych tkanek 13, może to zniekształcić analizę porównawczą z innymi populacjami nabłonka chemosensorycznego.

Tutaj przedstawiamy metodę izolacji komórek szczoteczki tchawicy do sekwencjonowania RNA3. Leczenie tchawicy dużą dawką dypazy oddziela nabłonek od błony podśluzowej. Późniejsze trawienie arkusza nabłonka za pomocą papainy pozwala na doskonałą regenerację tej komórki strukturalnej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed przeprowadzeniem następujących eksperymentów, upewnij się, że wszystkie procedury opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i przeprowadzone zgodnie z "Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych" National Research Council (8th Edition, 2011) oraz wytycznymi ARRIVE. Wszystkie procedury opisane poniżej zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucję Opieki nad Zwierzętami i Komitet ds. Użytkowania w Szpitalu Brigham and Women's Hospital.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Przygotować roztwór do wytrawiania w postaci dypazy, który jest roztworem PBS zawierającym 16 j./ml dypazy i 20 μg/ml DNazy I. Upewnij się, że proszek dypazy jest całkowicie rozpuszczony przed podgrzaniem roztworu w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że proszek dypazy jest całkowicie rozpuszczony przed podgrzaniem roztworu w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Upewnij się, że proszek dypazy jest całkowicie rozpuszczony.
  2. Dodaj 5% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), aby uzyskać roztwór zatrzymujący.
  3. Przygotuj bufor Tyrode I: dodaj 26 j./ml papainy (20 μl/ml 48 μl/mg roztworu papainy) i 10 μl/ml L-cysteiny do buforu HEPES-Tyrode bez wapnia.
  4. Przygotować bufor Tyrode II: dodać 2 μl/ml leupeptyny (5 mg/ml) do buforu HEPES-Tyrode z wapniem.
  5. Przygotuj bufor FACS: użyj Zbilansowanego Roztworu Soli Hanksa (HBSS) bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej, uzupełnionego 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i dodaj 2% FBS.

2. Sekcja tchawicy myszy

UWAGA: Myszy używane w tym protokole to ChAT(BAC)-eGFP (B6.Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J), w wieku 3-6 miesięcy obu płci. Zminimalizuj ekspozycję tkanki na bezpośrednie światło, aby zmniejszyć fotowybielanie eGFP.

  1. Poddaj mysz eutanazji roztworem pentobarbitalu w dawce 100 mg/kg wstrzykiwanym dootrzewnowo lub przy użyciu standardowych protokołów zatwierdzonych przez IACUC.
  2. Zamocuj mysz na tablicy operacyjnej w pozycji leżącej na plecach za pomocą igieł 21 G z przedłużonymi kończynami górnymi i dolnymi. Spryskaj futro 70% EtOH, aby zdezynfekować obszar.
  3. Za pomocą prostych kleszczy podnieś skórę i sierść brzucha i wykonaj nacięcie pośrodku nożyczkami preparacyjnymi (nożyczki proste, 3 cm). Za pomocą nożyczek oddziel skórę od tkanki podskórnej od brzucha do żuchwy. Trzymając tkankę podskórną za pomocą kleszczy, wykonaj małe nacięcie nożyczkami na środku ściany brzucha.
  4. Otwórz otrzewną z nacięciem w kształcie litery V. Za pomocą kleszczy delikatnie przesuń jelito cienkie na bok, zlokalizuj aortę brzuszną i żyłę główną i wykonaj nacięcie nożyczkami preparacyjnymi, aby umożliwić szybkie wykrwawienie.
  5. Zlokalizuj membranę. Za pomocą igły 18 G wykonaj otwór w przeponie tuż pod mostkiem, aby opróżnić płuca. Ostrożnie oddziel przeponę od klatki piersiowej za pomocą ostrych prostych nożyczek preparacyjnych, aby przeciąć wzdłuż podstawy żeber.
  6. Za pomocą kleszczy podnieś odsłonięty koniec mostka i przetnij mostek wzdłużnie od podstawy klatki piersiowej do szyi. Wykonaj centralne nacięcie szyjki macicy krótkimi prostymi nożyczkami (2 cm) i oddziel dwa płaty gruczołu podżuchwowego.
  7. Ostrożnie usuń otaczającą tkankę łączną i grasicę pokrywającą carinę za pomocą pary precyzyjnych kleszczy o wysokiej precyzji.
  8. Wypreparuj tchawicę wolnie, najpierw oddzielając bliższy koniec na poziomie nagłośni, a następnie rozcinając dystalny koniec na poziomie rozwidlenia tchawicy.
  9. Zlokalizuj nagłośnię i przetnij tchawicę wzdłuż od nagłośni do cariny.

3. Trawienie nabłonkowe tchawicy

  1. Umieścić tchawicę w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 750 μl wstępnie podgrzanego (do 37 °C) roztworu do wytrawiania w dypazie. Inkubować na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Przykryj rurkę folią aluminiową, aby zmniejszyć ekspozycję na bezpośrednie światło.
  2. Dodaj 750 μL zimnego DMEM z 5% FBS, aby zatrzymać reakcję. Ułóż na lodzie.
  3. Przenieść tchawicę na szalkę Petriego (100 mm x 15 mm) i umieścić pod mikroskopem preparacyjnym. Zorientuj tchawicę stroną nabłonkową skierowaną do góry. Podłużnie rozcięta tchawica ma półcylindryczny kształt utrzymywany przez pierścienie chrzęstne. Nabłonek znajduje się na wklęsłej powierzchni.
  4. Przywiąż obszar nagłośni tchawicy prostymi kleszczami do szalki Petriego i za pomocą jednorazowego skalpela w rozmiarze 22 zeskrob nabłonek z tchawicy. Warstwa nabłonkowa oddziela się jako półprzezroczysty arkusz.
  5. Zmiel nabłonek skalpelem. Przenieś warstwę nabłonka do probówki o pojemności 2 ml.
  6. Przepłukać szalkę Petriego 750 μl buforu Tyrode I i przenieść do probówki o pojemności 2 ml zawierającej warstwę nabłonkową.
  7. Inkubować warstwę nabłonka tchawicy w buforze Tyrode I przez 30 minut w temperaturze 37 °C na wytrząsarce z prędkością 200 obr./min. Przykryj rurkę folią aluminiową, aby zmniejszyć ekspozycję na bezpośrednie światło.
  8. Dodać 750 μl zimnego buforu Tyrode II. Energicznie wiruj strawioną tkankę przez 20-30 s. Rozcierać homogenat za pomocą strzykawki dołączonej do igły 18 G. Zmienić na igłę o rozmiarze 21 G i rozcierać jeszcze 10-20 razy.
  9. Przefiltruj komórki przez sitko o wielkości 100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 30:1 obj./obj. zimnego bufora FACS.
  10. Wirować w temperaturze 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w zimnym buforze FACS i przenieść zawiesinę do probówki z polistyrenu o wymiarach 12 mm x 75 mm (5 ml). Wirować ponownie w temperaturze 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i wyrzucić supernatant.
  11. Ponownie zawiesić osad w 100 μl bufora FACS.
  12. Dodać 1 μl przeciwciała blokującego CD16/32 przeciwko myszy, aby zablokować niespecyficzne wiązanie i inkubować przez 15 minut na lodzie. Nie prać.
  13. Dodać następujące przeciwciała i odpowiednie kontrole izotypu: przeciwciała monoklonalne przeciwko mysim CD45 lub szczurzym IgG2a, k (0,25 μg/106 komórek w objętości 100 μl) i allofikocyjaninę (APC) przeciwko mysim EpCAM lub szczurzej IgG2b, k (0,5 μg/106 komórek w objętości 100 μl). Inkubować przez 45 minut na lodzie chronionym przed bezpośrednim światłem. Dodać 4,5 ml zimnego buforu FACS, mieszać i wirować w temperaturze 350 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić bufor FACS i ponownie zawiesić osad w 300 μl zimnego buforu FACS.
  14. Dodać jodek propidyny (PI) (5 μg/ml) bezpośrednio przed sortowaniem metodą cytometrii przepływowej.
    nuta: Komórki szczotek mają nieregularny kształt z kilkoma procesami, które mogą potencjalnie zwiększyć ich przyleganie do filtrów (Rysunek 3C). Porównaliśmy filtry 30 μm z 70 μm i 100 μm i stwierdziliśmy, że większe filtry porowe zapewniają lepszą wydajność. Ponadto dokładne roztarcie zawiesiny komórkowej po trawieniu papainą znacznie poprawia wydajność komórek szczoteczki. Zalecamy użycie igły 18G do wstępnego roztarcia, a następnie mniejszego otworu (igła 21 lub 23 G) w celu dokładniejszej dysocjacji komórek.

4. Strategia bramkowania cytometrii przepływowej

  1. Zidentyfikuj komórki od gruzu według kąta rozproszenia do przodu i bocznego. Wyklucz dublety, używając wysokości i szerokości rozproszenia do przodu oraz wysokości i szerokości rozproszenia bocznego. Dublety to komórki, które mają wysokie wartości szerokości.
  2. W pojedynczych komórkach zidentyfikuj żywe komórki jako populację, która jest PI ujemna.
  3. W żywych pojedynczych komórkach zidentyfikuj komórki CD45 o niskim lub ujemnym poziomie na podstawie kontroli izotypu.
  4. W komórkach CD45 o niskim/ujemnym poziomie zidentyfikuj komórki EpCAM dodatnie, które są również eGFP dodatnie (w kanale FITC). Jest to populacja komórek szczoteczki (Rysunek 2A).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta procedura została pomyślnie wdrożona w celu wyizolowania komórek szczoteczki tchawicy do sekwencjonowania RNA3. Po wyizolowaniu tchawicy i strawieniu tkanki za pomocą 2-etapowego protokołu (Ryc. 1), komórki pobrano i wybarwiono fluorescencyjnie znakowanymi CD45 i EpCAM po wykluczeniu martwych komórek z PI. Po wyprowadzeniu dubletów w oparciu o charakterystykę rozproszenia do przodu i na boki, zdefiniowaliśmy komórki szczotkowe jako niskie/ujemne dla CD45, dodatnie dla EpCAM ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkryliśmy, że połączenie leczenia dużą dawką dypazy przez 40 minut, a następnie krótkiego leczenia papainą (30 minut) zapewnia optymalny protokół trawienia tchawicy i izolacji komórek szczoteczki. Ta kombinacja zarówno pozwala uniknąć intensywnego trawienia, jak i zapewnia najwyższą wydajność komórek szczoteczki w porównaniu z alternatywnymi protokołami.

Podczas gdy trawienie płuc w celu ekstrakcji komórek krwiotwórczych klasycznie opiera się na łagodnych enzymach trawiennych, takich jak kola...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Adamowi Chicoine z Brigham and Women's Human Immunology Center Flow Core za pomoc w sortowaniu metodą cytometrii przepływowej. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01 HL120952 (N.A.B.), R01 AI134989 (N.A.B.), U19 AI095219 (N.A.B., L.G.B) i K08 AI132723 (LGB) oraz przez American Academy of Allergy, Asthma and Immunology (AAAAI)/ American Lung Allergic Respiratory Disease Award (N.A.B.), przez AAAAI Foundation Faculty Development Award (LGB), przez Steven and Judy Kaye Young Innovators Award (N.A.B.), przez Joycelyn C. Austen Fund for Career Development of Women Physician Scientists (L.G.B.) oraz przez hojną darowiznę rodziny Vinik (L.G.B.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciała
Anti-GFP (poliklonalny kozioł Ig)Abcamcat# ab5450
APC anty-mysie CD326 (EpCAM)  (G8.8)Kot Biolegend#118214
APC Szczur IgG2a, kontrola izotypu kBiolegend#400511
DAPIBiolegendkot#422801
Przeciwciało anty-kozie IgG (H+L) Przeciwciało wtórne o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 488Life Technologies/Sondy molekularnecat#A-11055
Normalna koza IgGR& D Systemscat#AB-108-C
Pacific Blue anty-myszy CD45 (30F-11)Biolegendcat#103126
Pacific Blue Rat IgG2b, k kontrola izotypuBiolegendcat#400627
TruStain FcX (anty-mysz CD16/32) PrzeciwciałoBiolegendcat#101320
Chemikalia, peptydy i białka
DispaseGibcocat# 17105041 
DNase ISigma cat# 10104159001
HEPES-Tyrode' s Bufor bez wapnia (10 mM HEPES, 135 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 1 mM MgCl2, 12 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 0,25% BSA, 5,5 mM glukozy. Przygotowany w wodzie o stężeniu 18,2 megaoma i przefiltrowany przez 0,22 &mikro; m filtrBoston BioProductscat# PY-912
Tyrode' s Roztwór (buforowany przez HEPES) 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 25 mM HEPES, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 i 10 mM glukozy. Przygotowany w wodzie o stężeniu 18,2 megaoma i przefiltrowany przez 0,22 &mikro; m filtr. )Boston BioProductscat# BSS-355
L-CysteineSigmacat # C7352
Sól trifluorooctanu leupeptynySigmacat# L2023
Papaina z lateksu papaiSigmacat # P3125
Jodek propidyny Sigmacat# P4170
Modele eksperymentalne: Organizmy/Szczepy
ChATBAC-eGFP (B6. Cg-Tg(RP23-268L19-EGFP)2Mik/J)Laboratorium Jacksona7902
Sprzęt
LSM 800 z systemem konfokalnym Airyscan  na  Mikroskop odwrócony Zeiss Axio Observer Z1Zeiss
LSRFortessaBD647465
sprzęt jednorazowy
1,5 ml sterylne probówkiThomas Scientific1157C86
5 ml Poysterene Probówka okrągłodenna, 12 mm x 75 mm stylFalcon14-959-1A
50 ml Polipropylenowa probówka stożkowa, 30 mm x 115 mm stylFalcon352098
Feather Jednorazowy skalpel nr 12Fisher ScientificNC9999403
szalka Petriego, 100 mm x 15 mm StyleFalcon351029
Sterylne sitko do komórek, 100 μ mFisherbrandcat#22363549
Kot rekombinowane

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tizzano, M., et al. Nasal chemosensory cells use bitter taste signaling to detect irritants and bacterial signals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 3210-3215 (2010).
  2. Genovese, F., Tizzano, M. Microvillous cells in the olfactory epithelium express elements of the solitary chemosensory cell transduction signaling cascade. PLoS One. 13 (9), 0202754(2018).
  3. Bankova, L. G., et al. The cysteinyl leukotriene 3 receptor regulates expansion of IL-25-producing airway brush cells leading to type 2 inflammation. Science Immunology. 3 (28), (2018).
  4. Krasteva, G., Canning, B. J., Papadakis, T., Kummer, W. Cholinergic brush cells in the trachea mediate respiratory responses to quorum sensing molecules. Life Sciences. 91 (21-22), 992-996 (2012).
  5. Nadjsombati, M. S., et al. Detection of Succinate by Intestinal Tuft Cells Triggers a Type 2 Innate Immune Circuit. Immunity. 49 (1), 33-41 (2018).
  6. von Moltke, J., Ji, M., Liang, H. E., Locksley, R. M. Tuft-cell-derived IL-25 regulates an intestinal ILC2-epithelial response circuit. Nature. 529 (7585), 221-225 (2016).
  7. Deckmann, K., et al. Bitter triggers acetylcholine release from polymodal urethral chemosensory cells and bladder reflexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8287-8292 (2014).
  8. Liu, S., et al. Members of Bitter Taste Receptor Cluster Tas2r143/Tas2r135/Tas2r126 Are Expressed in the Epithelium of Murine Airways and Other Non-gustatory Tissues. Frontiers in Physiology. 8, 849(2017).
  9. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the auditory tube. Histochemistry and Cell Biology. 137 (4), 483-497 (2012).
  10. Krasteva, G., et al. Cholinergic chemosensory cells in the trachea regulate breathing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9478-9483 (2011).
  11. Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
  12. Plasschaert, L. W., et al. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte. Nature. 560 (7718), 377-381 (2018).
  13. Dwyer, D. F., Barrett, N. A., Austen, K. F. Immunological Genome Project, C. Expression profiling of constitutive mast cells reveals a unique identity within the immune system. Nature Immunology. 17 (7), 878-887 (2016).
  14. Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
  15. Bankova, L. G., Dwyer, D. F., Liu, A. Y., Austen, K. F., Gurish, M. F. Maturation of mast cell progenitors to mucosal mast cells during allergic pulmonary inflammation in mice. Mucosal Immunology. 8 (3), 596-606 (2015).
  16. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  17. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 1475-1483 (2011).
  18. Gerbe, F., et al. Intestinal epithelial tuft cells initiate type 2 mucosal immunity to helminth parasites. Nature. 529 (7585), 226-230 (2016).
  19. Rock, J. R., et al. Transmembrane protein 16A (TMEM16A) is a Ca2+-regulated Cl- secretory channel in mouse airways. Journal of Biological Chemistry. 284 (22), 14875-14880 (2009).
  20. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular and Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
  21. Verma, S., Dixit, R., Pandey, K. C. Cysteine Proteases: Modes of Activation and Future Prospects as Pharmacological Targets. Frontiers in Pharmacology. 7, 107(2016).
  22. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  23. Kaiser, O., et al. Dissociated neurons and glial cells derived from rat inferior colliculi after digestion with papain. PLoS One. 8 (12), 80490(2013).
  24. Aoyagi, T., Takeuchi, T., Matsuzaki, A., Kawamura, K., Kondo, S. Leupeptins, new protease inhibitors from Actinomycetes. Journal of Antibiotics (Tokyo). 22 (6), 283-286 (1969).
  25. Kohanski, M. A., et al. Solitary chemosensory cells are a primary epithelial source of IL-25 in patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (2), 460-469 (2018).
  26. Patel, N. N., et al. Solitary chemosensory cells producing interleukin-25 and group-2 innate lymphoid cells are enriched in chronic rhinosinusitis with nasal polyps. International Forum of Allergy & Rhinology. , (2018).
  27. Kouzaki, H., O'Grady, S. M., Lawrence, C. B., Kita, H. Proteases induce production of thymic stromal lymphopoietin by airway epithelial cells through protease-activated receptor-2. The Journal of Immunology. 183 (2), 1427-1434 (2009).
  28. Cambier, J. C., Vitetta, E. S., Kettman, J. R., Wetzel, G. M., Uhr, J. W. B-cell tolerance. III. Effect of papain-mediated cleavage of cell surface IgD on tolerance susceptibility of murine B cells. The Journal of Experimental Medicine. 146 (1), 107-117 (1977).
  29. Nishikado, H., et al. Cysteine protease antigens cleave CD123, the alpha subunit of murine IL-3 receptor, on basophils and suppress IL-3-mediated basophil expansion. Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (2), 261-266 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tracheal Brush CellsEpithelial IsolationPapain DigestionFlow Cytometric SortingDispase TreatmentCell ViabilityChAT eGFP ReporterFACS BufferPropidium IodideEpCAM Positive

Related Articles