Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59497

⸱

13 maja 2019

 ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Kansas University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Streszczenie

Eukariotyczne syntezy mRNA to złożony proces biochemiczny wymagający transkrypcji matrycy DNA na prekursorowy RNA przez wielopodjednostkowy enzym polimerazę II oraz kotranskrypcyjne capping i splicing prekursorowego RNA w celu utworzenia dojrzałego mRNA. Podczas syntezy mRNA kompleks elongacyjny polimerazy II RNA jest celem regulacji przez duży zbiór czynników transkrypcyjnych, które kontrolują jego aktywność katalityczną, a także enzymy cappingu, splicingu i przetwarzania 3', które tworzą dojrzałe mRNA. Ze względu na nieodłączną złożoność syntezy mRNA, prostsze systemy eksperymentalne umożliwiające izolację i badanie różnych etapów kotranskrypcji mają dużą użyteczność.

W tym artykule opisujemy jeden z takich prostych eksperymentalnych systemów odpowiednich do badania kotranskrypcyjnego cappingu RNA. System ten opiera się na zdefiniowanych kompleksach elongacyjnych polimerazy II RNA złożonych z oczyszczonej polimerazy i sztucznych pęcherzyków transkrypcyjnych. Po unieruchomieniu za pomocą biotynylowanego DNA, te kompleksy wydłużające polimerazę II RNA stanowią łatwe w manipulacji narzędzie do analizowania kotranskrypcyjnego cappingu RNA i mechanizmów, za pomocą których kompleks elongacyjny rekrutuje i reguluje enzym cappingujący podczas kotranskrypcyjnego cappingu RNA. Przewidujemy, że system ten może zostać zaadaptowany do badania rekrutacji i/lub składania białek lub kompleksów białkowych odgrywających rolę w innych etapach dojrzewania mRNA sprzężonego z kompleksem wydłużającym polimerazę II RNA.

Wprowadzenie

Synteza eukariotycznego informacyjnego RNA (mRNA) to skomplikowany proces biochemiczny, który obejmuje syntezę nieprzetworzonego prekursorowego RNA przez polimerazę RNA II i przetwarzanie prekursorowego RNA w celu uzyskania dojrzałego mRNA. Etapy przetwarzania RNA polegające na cappingu, splicingu i poliadenylacji odbywają się w dużej mierze kotranskrypcyjnie. Kompleks elongacyjny Pol II służy jako rusztowanie, które rekrutuje i koordynuje działania wielu enzymów przetwarzających RNA. W związku z tym nasze ostateczne zrozumienie, w jaki sposób generowane są dojrzałe eukariotyczne mRNA, będzie w dużej mierze zależało od opracowania systemów eksperymentalnych, które umożliwią analizę mechanizmów biochemicznych leżących u podstaw rekrutacji do kompleksu elongacyjnego i regulacji enzymów odpowiedzialnych za kotranskrypcyjne capping, splicing i poliadenylację.

Nic dziwnego, że rozwój takich eksperymentalnych systemów był trudny. Główną przeszkodą była niezwykła złożoność samej transkrypcji Pol II, gdzie proste odtworzenie podstawowej transkrypcji przez Pol II in vitro wymaga minimalnego zestawu pięciu ogólnych czynników inicjujących transkrypcję: TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF i TFIIH1. Co więcej, odtworzenie jakiegokolwiek rodzaju regulowanej transkrypcji Pol II in vitro wymaga jeszcze większego zestawu czynników transkrypcyjnych i koregulatorów. W związku z tym głównym celem było opracowanie prostszych systemów eksperymentalnych pozwalających na odtworzenie aktywnych kompleksów elongacyjnych Pol II odpowiednich do badań nad funkcjonalnym sprzężeniem transkrypcji Pol II i przetwarzania RNA.

Jedna z takich prostszych metod odtwarzania aktywnych kompleksów elongacyjnych Pol II okazała się przydatna do badań strukturalnych i biochemicznych wydłużania Pol II, a ostatnio do badania kotranskrypcyjnego przetwarzania RNA2,3,4,5. W tym artykule pokazujemy, w jaki sposób kompleksy elongacyjne Pol II przygotowane z oczyszczonych pęcherzyków Pol II i syntetycznych pęcherzyków transkrypcyjnych mogą być skutecznie wykorzystane do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego cappingu powstających transkryptów Pol II.

Capping odnosi się do kowalencyjnego dodania "czapki" 5'-guanozyny do końca 5'-trifosforanu powstających transkryptów Pol II. Czapka jest ważna dla kolejnych etapów dojrzewania, transportu, translacji i innych procesów mRNA6,7. Kap jest dodawany kotranskrypcyjnie do transkryptów Pol II przez enzym określany jako enzym cappingowy. W komórkach ssaków miejsca aktywne odpowiedzialne za aktywność 5'-trifosfatazy RNA i transferazy guanylylowej enzymu zamykającego są zawarte w pojedynczym polipeptydzie8. Enzym zamykający jest rekrutowany do kompleksu elongacyjnego Pol II poprzez interakcje z jeszcze niezdefiniowanymi powierzchniami na ciele Pol II i domeną karboksylowo-końcową Rpb1 (CTD) fosforylowaną na Ser5 jego powtórzeń heptapeptydu5. W kompleksie elongacyjnym enzym zamykający katalizuje dodanie czapu 5'-guanozyny, gdy powstający transkrypt osiągnie długość co najmniej 18 nukleotydów i wyłoni się z kanału wyjściowego RNA polimerazy. W pierwszym etapie reakcji cappingu trifosfataza hydrolizuje 5'-trifosforan RNA, aby uzyskać 5'-difosforan. W drugim etapie GTP jest hydrolizowany do GMP przez transferazę guanylylu, tworząc półprodukt enzymu ograniczającego GMP. Wreszcie, transferaza guanylilowa przenosi GMP do końca 5'-difosforanu powstającego transkryptu w celu wytworzenia czapeczki.

Niezwykłą cechą reakcji cappingu jest to, że capping kotranskrypcyjny (tj. capping transkryptów związanych z funkcjonalnymi kompleksami elongacyjnymi Pol II) jest znacznie bardziej efektywny niż capping wolnego RNA5,9. W związku z tym głównym pytaniem w tej dziedzinie było to, w jaki sposób ta dramatyczna aktywacja cappingu jest osiągana poprzez interakcje enzymu cappingu z kompleksem elongacyjnym Pol II. W tym protokole opisujemy składanie aktywnych kompleksów elongacyjnych polimerazy II RNA przy użyciu wyłącznie oczyszczonej polimerazy RNA II i sztucznych pęcherzyków transkrypcyjnych. Metody te pozwalają na tworzenie kompleksów elongacyjnych polimerazy II RNA z transkryptami o określonej długości i sekwencji. W niedawnym badaniu użyliśmy tych zdefiniowanych kompleksów elongacyjnych polimerazy II RNA jako modelu do badania aspektów mechanizmów cappingu RNA5. W szczególności wykazaliśmy, że (i) capping RNA związany z tymi kompleksami elongacyjnymi był ponad 100-krotnie bardziej efektywny niż capping wolnego RNA i (ii) był stymulowany przez zależną od TFIIH fosforylację Pol II CTD. Opisane tutaj podejście można w zasadzie zaadaptować do generowania substratów do badania innych reakcji przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

W sekcji 1 tego protokołu, sztuczne kompleksy elongacyjne są tworzone przez wyżarzanie syntetycznego oligonukleotydu matrycowego nici DNA do oligonukleotydu RNA, który jest komplementarny na końcu 3' do około 9 nukleotydów matrycowej nici DNA. Pol II jest następnie ładowany do dupleksu DNA:RNA. Kompleks elongacyjny jest następnie uzupełniany przez dodanie częściowo komplementarnego, nieszablonowego oligonukleotydu DNA, który jest znakowany biotyną na końcu 3' (Rysunek 1 i Figura 2A). Oligonukleotyd RNA jest wydłużany przez Pol II w tych kompleksach elongacyjnych w celu wytworzenia znakowanych radioaktywnie transkryptów o określonej długości i sekwencji po dodaniu odpowiednich kombinacji znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Ponadto, stosując kombinację płukanek w celu usunięcia nieinkorporowanych nukleotydów i dalszego dodawania różnych kombinacji nukleotydów, można "przeprowadzić" Pol II do różnych pozycji wzdłuż matrycy DNA i zsyntetyzować RNA o określonych długościach. RNA jest następnie oczyszczane i poddawane elektroforezie w denaturujących żelach mocznikowych-PAGE. W sekcji 2 protokołu sztuczne kompleksy elongacyjne są używane do analizy kotranskrypcyjnego cappingu RNA. Przedstawiony przykład mierzy wpływ zależnej od TFIIH fosforylacji CTD Pol II na cappingowanie kotranskrypcyjnego RNA. W tym eksperymencie mierzymy zakres cappingu kotranskrypcyjnego w funkcji stężenia enzymu cappingu (5, 15 i 45 ng na reakcję) i czasu (1, 2 i 4 min).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Montaż kompleksów sztucznego wydłużenia i chodzenie Pol II

  1. Unieruchomić 1 nmol nieszablonowego oligo DNA zawierającego cząsteczkę biotyny 3' na kulkach magnetycznych.
    UWAGA:     Poniższe kroki można wykonać z wyprzedzeniem, aby przygotować się do przyszłych eksperymentów. Wszystkie sekwencje oligonukleotydów użyte w niniejszym protokole przedstawiono w tabeli 1. Oligonukleotydy RNA są syntetyzowane z modyfikacjami 5'-trifosforanu.
    1. Dodaj 200 μl kulek magnetycznych (10 mg/ml) do probówki o pojemności 1,5 ml wiążącej białka, a następnie umieść na stojaku magnetycznym na 2 minuty.
    2. Gdy rurka znajduje się na stojaku magnetycznym, usuń płyn z tuby, nie naruszając kulek. Aby umyć kulki, wyjmij probówkę ze stojaka, dodaj 1 ml 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, włóż probówkę z powrotem do stojaka i usuń roztwór myjący po 2 minutach.
    3. Powtórz mycie jeszcze 2 razy, używając 200 μl tego samego buforu.
    4. Zawieś kulki magnetyczne w 400 μl 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, bufor. Następnie zmieszać z 380 μlH2Oi 20 μL 10 μM nieszablonowego biotynylowanego oligonylowirusa DNA. Umieść probówkę na nutatorze i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Przemyć unieruchomiony nieszablonowy oligo DNA 3 razy 200 μl 5 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, a następnie 3 razy 200 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerolu, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej.
    6. Pozostaw probówkę na noc w temperaturze 4 °C, aby zakończyć blokowanie kulek za pomocą BSA.
    7. Następnego dnia umieść probówkę w stojaku magnetycznym, wyjmij i wyrzuć płyn, a następnie ponownie zawieś kulki w 200 μl 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerolu, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej i przenieś do nowej probówki. Dla tej matrycy DNA końcowe stężenie wynosi około 5 μM.
      nuta: Czas inkubacji i stężenie oligonukleotydów muszą być określone empirycznie dla każdego oligonukleotydowanego DNA. Matryca ta powinna wystarczyć na 200 reakcji i wystarczyć na co najmniej 6 miesięcy, jeśli jest przechowywana w temperaturze 4 °C.
  2. Wyżarzane oligonukleotydy oligonukleotydów nici matrycowej DNA w stosunku molowym 2:1 (odpowiednio 20 i 10 pmol) w celu uzyskania dupleksu DNA:RNA.
    1. Ustawić 10 μl mieszanki do wyżarzania zgodnie z opisem w tabeli 2.
      UWAGA: 10 μL mieszanki do wyżarzania wystarcza na 10 reakcji. Mieszankę do wyżarzania można w razie potrzeby zwiększyć, jeśli ma być wykonanych więcej testów.
    2. Przeprowadzić reakcje wyżarzania w termocyklerze za pomocą następującego programu: 5 min w temperaturze 45 °C, a następnie 12 cykli po 2 min każdy, zaczynając od 43 °C i zmniejszając temperaturę o 2 °C na cykl. Na biegu jałowym w temperaturze 4 °C.
      nuta: Jest to elastyczny punkt czasowy. Wyżarzanie kończy się w ciągu ~30 minut, ale można je pozostawić w temperaturze 4 °C na dłuższy czas. W laboratorium mieszaniny do wyżarzania pozostawiono na okres do 4 godzin, nie obserwując spadku wydajności reakcji.
    3. Podczas wyżarzania RNA do matrycowej nici DNA, przygotuj do późniejszych etapów protokołu. Składniki potrzebne do przygotowania każdego buforu do pojedynczej reakcji z każdym buforem są wymienione w tabelach 2–8. Skaluj receptury w górę o współczynnik [Y(X+1) + 1] dla mycia i (X+1) dla wszystkich innych. X = liczba reakcji, które należy przygotować; Y = liczba wymaganych etapów prania (minimum 3).
      UWAGA: Przygotuj wszystkie świeże w dniu eksperymentu. Nie umieszczaj probówek na lodzie po dodaniu PVA do. Dodaj Pol II lub nukleotydy do tuż przed użyciem.
  3. Załaduj oczyszczoną polimerazę RNA II do hybrydy DNA:RNA.
    1. Zmieszać 1 pmol (1 μL) dupleksu DNA:RNA z 13 μl buforu Pol II (z tabeli 3).
    2. Dodać ~0,02 jednostki oczyszczonego RNA Pol II (1 μL) do mieszaniny z kroku 1.3.1 i mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół oraz mieszając końcówką pipety, bez wprowadzania pęcherzyków. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C.
      nuta: Odtąd podawane objętości dotyczą pojedynczej reakcji; Skaluj w górę zgodnie z potrzebami dla liczby reakcji w eksperymencie. W tym przykładzie użyto RNA Pol II oczyszczonego z wątroby szczura zgodnie z opisem10; jednak można również użyć RNA Pol II oczyszczonego z innych źródeł, w tym hodowanych komórek ssaków lub drożdży3,4,5,11,12,13.
  4. Uzupełnij kompleks elongacyjny przez dodanie biotynylowanego DNA bez matrycy.
    1. Dodać 5 pmol (1 μl) unieruchomionego oligo DNA bez matrycy do 14 μl buforu DNA bez matrycy (z tabeli 4), dodać do probówki z kroku 1.3.2 i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Umieścić próbkę w stojaku magnetycznym na 2 minuty. Przemyć 1x 30 μl buforu do przemywania (z tabeli 7) w celu usunięcia nieinkaskorowanego Pol II i oligonukleotydów.
  5. Generowanie kompleksów elongacyjnych zawierających znakowane radioaktywnie RNA 23mery.
    1. Wykonać wszystkie dalsze inkubacje w temperaturze 30 °C. Dodać 1 μL 15 μM ATP i 10 μCi (1 μL) [α-32P] UTP (3 000 Ci/mmol) do 23 μL buforu impulsowego i użyć go do ponownego zawieszenia umytych kulek magnetycznych.
      ostrożność: Materiały radioaktywne są niebezpieczne. Upewnij się, że nosisz odpowiedni sprzęt ochronny i przestrzegasz wszystkich wytycznych laboratoryjnych dotyczących bezpiecznego użytkowania i usuwania materiałów radioaktywnych.
      nuta: Zastąp znakowany radioaktywnie UTP 15 μM UTP, gdy znakowane radioaktywnie RNA nie jest potrzebne, na przykład w eksperymentach z western blot.
    2. Inkubować reakcję przez 10 minut, aby umożliwić syntezę znakowanych radioizotopowo 23merów.
    3. Dodać 1,5 μl roztworu zawierającego 100 μM ATP i 100 μM mieszanki UTP do 3,5 μl buforu pościgowego, dodać do probówki zawierającej wstępnie złożone kompleksy elongacyjne i inkubować przez 5 minut, aby przegonić wszystkie powstające transkrypty do 23merów.
    4. Umieścić próbkę w stojaku magnetycznym na 2 minuty, usunąć supernatant, przemyć raz 30 μl buforu do przemywania w celu usunięcia niewbudowanych nukleotydów i ponownie zawiesić w 30 μl buforu do przemywania .
    5. Dodać 94 μl mieszanki stop z proteinazą K i glikogenem (Tabela 9) w celu zakończenia reakcji lub przejść do sekcji 1.6 w celu wytworzenia kompleksów elongacyjnych z dłuższymi transkryptami lub sekcji 2 w celu przeprowadzenia testów cappingu.
  6. (Opcjonalnie) Spacer Pol II, aby utworzyć 23, 25 i 29 transkryptów nukleotydowych
    1. Postępuj zgodnie z procedurą opisaną w krokach od 1.2.1 do 1.5.4, aby przygotować kompleksy elongacyjne zawierające znakowane radioizotopowo 23mery. Zwiększ 4-krotnie, aby wygenerować 120 μl przemytych kompleksów wydłużających, co wystarcza na 4 reakcje.
    2. Oznacz 3 nowe tuby "23mer", "25mer" i "29mer". Przenieść 30 μl przemytych kompleksów wydłużających do probówki "23mer" i dodać 94 μl mieszanki zatrzymanej z proteinazą K i glikogenem.
    3. Umieścić probówkę zawierającą pozostałe 90 μl przemytych kompleksów wydłużających w stojaku magnetycznym na 2 minuty, usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 90 μl BTB uzupełnionych po 1,2 μl 1,5 mM ATP i 1,5 mM CTP. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C.
    4. Po jednokrotnym przemyciu 90 μl buforu do przemywania i ponownym wymieszaniu w 90 μl buforu do przemywania zgodnie z opisem w kroku 1.5.4, przenieść 30 μl kompleksów wydłużających do probówki "25mer" i dodać 94 μl mieszanki zatrzymanej z proteinazą K i glikogenem.
    5. Umieść probówkę zawierającą pozostałe 60 μl kompleksów wydłużających w stojaku magnetycznym na 2 minuty, usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 60 μl BTB uzupełnionym po 0,8 μl 1,5 mM ATP i 1,5 mM CTP.
    6. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 30 °C, przemyć raz 60 μl buforu do przemywania zgodnie z ppkt 1.5.5 i ponownie zawiesić w 60 μl buforu do przemywania wodą.
    7. Przenieść 30 μl z 2x próbki do probówki "29mer" i dodać 94 μl mieszanki stop z proteinazą K i glikogenem lub przejść do sekcji 2 w celu przeprowadzenia testów zamykania.
    8. Przejdź do oczyszczania i analizy RNA (sekcja 3).

2. Wykorzystanie sztucznych kompleksów elongacyjnych do oznaczania kotranskrypcyjnego cappingu

  1. Wygeneruj przemyte kompleksy elongacyjne zawierające 23mers, zwiększając procedurę opisaną w krokach od 1.2.1 do 1.5.5 13-krotnie. To wystarczy na 12 reakcji + 1 dodatkowy.
  2. Fosforylacja CTD Pol II
    1. Umieść probówkę zawierającą przemyte kompleksy wydłużające w stojaku magnetycznym na 2 minuty, usuń supernatant i ponownie zawieś kulki w 377 μl BTB uzupełnionym 13 μl 1,5 mM ATP.
    2. Przygotuj dwie nowe probówki, oznaczone odpowiednio +H i -H. Do probówki oznaczonej +H dodać 3 μL ~300 ng/μL TFIIH, a do probówki oznaczonej -H dodać 9 μL 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerolu, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej.
      nuta: Zazwyczaj używamy TFIIH oczyszczonego z wątroby szczura, ale uzyskaliśmy podobne wyniki przy użyciu ~0,6 μg/reakcję komercyjnie dostępnego rekombinowanego Cdk7/Cykliny H/MAT1 (CAK, który jest modułem kinazy z TFIIH). Więcej informacji można znaleźć w Tabeli materiałów.
    3. Dodać 87 μl przemytych kompleksów wydłużających z kroku 2.2.1 do probówki oznaczonej +H i 270 μl przemytych kompleksów wydłużających do probówki oznaczonej -H. Inkubować 10 minut w temperaturze 30 °C.
    4. Umieść próbkę w stojaku magnetycznym na 2 minuty. Aby usunąć nadmiar nukleotydów i niezwiązanego białka, należy przemyć kompleksy elongacyjne w reakcjach +H i -H odpowiednio 90 μl lub 270 μl buforu do przemywania wodą.
  3. Zamykanie RNA
    1. Zawiesić kompleksy wydłużające w probówce oznaczonej +H w 87 μl mieszanki zamykającej (BTB uzupełnionej 50 μM GTP (Tabela 10). Zawiesić kompleksy wydłużające w probówce oznaczonej -H w 261 μl mieszanki zamykającej.
    2. Przygotuj 4 nowe probówki oznaczone 5 ng CE+H, 5 ng CE, 15 ng CE, 45 ng CE. Rozcieńczyć enzym zamykający (CE) w 20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 20% glicerolu, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej w celu przygotowania roztworów zawierających 5 ng CE/μL, 15 ng CE/μL lub 45 ng CE/μL i dozować 3 μL odpowiedniego roztworu do każdej z 4 probówek.
    3. Przygotować 12 nowych probówek z 94 μl buforu zatrzymującego (2.1.1) dodanymi do każdej.
    4. Każdą reakcję zamykania należy rozpocząć od dodania 87 μl kompleksu wydłużającego potraktowanego TFIIH lub nie, do znakowanych probówek zawierających enzym zamykający. Inkubować w temperaturze 30 °C w bloku grzewczym.
    5. Po 1, 2 lub 4 minutach zatrzymaj reakcje, przenosząc 30 μl każdej mieszaniny reakcyjnej do probówek zawierających 94 μl buforu zatrzymującego. Oczyszczać i analizować produkty reakcji zgodnie z opisem w punkcie 3.

3. Oczyszczanie i analiza RNA

  1. Oczyszczanie RNA
    1. Produkty reakcji inkubować w buforze zatrzymującym przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
      nuta: Punkt zatrzymania. Próbki w tym buforze były utrzymywane przez okres do 4 godzin bez utraty lub degradacji RNA.
    2. Ekstrahować raz 124 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) i raz chloroformem:alkoholem izoamylowym (24:1).
      ostrożność: Fenol jest niezwykle toksyczny i szybko wchłaniany przez skórę. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny.
      nuta: Aby zmaksymalizować odzysk RNA podczas ekstrakcji, należy używać dostępnych na rynku probówek zawierających żel o dużej gęstości, który tworzy stabilną barierę między fazą wodną a organiczną. Zobacz dyskusję i tabelę materiałów.
    3. Przenieść fazę wodną (górna warstwa) do nowych probówek zawierających 12,4 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2.
  2. Wytrącanie etanolu
    1. Dodać 350 μl 100% etanolu i dokładnie wymieszać przez odwrócenie.
    2. Inkubować przez co najmniej 10 minut na suchym lodzie.
      nuta: Punkt zatrzymania. Dla wygody można się tu zatrzymać i dokończyć procedurę następnego dnia; Możliwe jest jednak przejście bezpośrednio do kroku 3.3 i uruchomienie żelu tego samego dnia. RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka dni przed dalszym przetwarzaniem, ale nie należy pozostawiać go na dłużej.
  3. Przygotowanie próbek RNA do elektroforezy żelowej
    1. Pozostawić próbki do rozmrożenia, wymieszać przez odwrócenie 2-3 razy i odwirować przez 15 minut w temperaturze 21 000 x g, 4 °C, w wirówce stołowej. W międzyczasie należy przygotować denaturującą mieszankę żelową (sekcja 3.4.1).
    2. Ostrożnie usuń etanol z próbek, nie naruszając osadu.
    3. Dodać 500 μl 70% etanolu, kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu umycia granulatu, a następnie ponownie odwirować przy 21 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
    4. Usuń jak najwięcej etanolu i szybko odwiruj (5-10 s) probówki w wirówce stołowej. Następnie za pomocą końcówki ładującej żel usuń ostatnią pozostałą objętość etanolu.
    5. Suszyć na powietrzu przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    6. Rozpuść RNA, dodając 4 μlH2Odo górnej części każdej osadki. Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Dodaj 4 μl 2x barwnika RNA (patrz tabela materiałów) do mieszanki, a następnie wiruj każdą probówkę przez kilka sekund, aby całkowicie zawiesić RNA.
      nuta: Zalecany jest barwnik RNA zawierający formamid zamiast mocznika, ponieważ ten ostatni wytrąca się w niskich temperaturach.
    8. Szybko odwirować probówki, a następnie inkubować je w temperaturze 70 °C przez 10 minut w bloku grzewczym.
    9. Przechowuj probówki na suchym lodzie, aż będą gotowe do załadowania na gel.
      UWAGA:       Utrzymywanie RNA na suchym lodzie pozwala na elastyczność pracy nad innymi eksperymentami, podczas gdy żel polimeryzuje. Próbki po rozmrożeniu nie muszą być ponownie podgrzewane. Jednak RNA może być bezpośrednio załadowane po podgrzaniu, jeśli żel jest gotowy do pracy.
  4. Przygotowanie żelu Urea-PAGE
    1. Aby uzyskać 40 ml mieszanki żelowej, połącz w stożkowej probówce o pojemności 50 ml: 16,7 g mocznika, 15 ml 40% roztworu bis:akrylamidu (stosunek 19:1), 4 ml 10x TBE (1 M Tris-HCl, 1 M boran sodu, 20 mM EDTA) i 8 ml H2O. Objętość ta wystarcza na jeden żel o standardowym rozmiarze (18 cm wysokości x 16 cm szerokości) z przekładkami 1,0 mm.
      ostrożność: Akrylamid jest niezwykle toksyczny. Chociaż nie ma ryzyka wdychania, gdy znajduje się w roztworze, zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne podczas obsługi.
      nuta: Ta mieszanina służy do odlewania denaturującego 15% żelu poliakrylamidowego, który łatwo rozpuszcza RNA w zakresie 15-50 nt. W razie potrzeby zmień stężenie bis/akrylamidu, aby rozdzielić różne transkrypty RNA o różnej długości.
    2. Umieścić zamkniętą probówkę zawierającą mieszaninę żelu na nutatorze, aż mocznik całkowicie się rozpuści.
    3. Ustaw stację odlewania żelu ze szklanymi płytkami, przekładkami 1 mm i 15-dołkowym grzebieniem.
    4. Pracując szybko, dodaj 40 μl TEMED i 400 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu do roztworu żelu i dobrze wymieszaj. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml wlej roztwór żelu między płytki, włóż grzebień i pozwól żelowi polimeryzować przez co najmniej 2 godziny < br /> nuta: Jeśli żel zostanie wylany więcej niż 2 godziny przed użyciem, po spolimeryzowaniu przykryj go wilgotnym ręcznikiem papierowym (pozostawiając grzebień na miejscu) i owiń folią, aby zapobiec wysychaniu.
  5. Elektroforeza RNA w żelu denaturującym
    1. Po polimeryzacji przenieś żel do działającego zbiornika i uruchom go wstępnie pod ciśnieniem 20 mA w 1x TBE przez 15-30 min.
    2. W międzyczasie rozmrozić próbki (jeśli zostały zamrożone), wirować i wirować przez 4 minuty w temperaturze 2 000 x g, 4 °C.
    3. Gdy będziesz gotowy, wyłącz zasilanie i ostrożnie przepłucz każdą studzienkę 1x TBE za pomocą strzykawki.
    4. Użyj końcówek do ładowania żelu, aby załadować próbki do żelu.
    5. Uruchom żel ze stałą wartością 20-30 mA przez około 2 godziny lub do momentu, gdy dolny barwnik (ksylen-cyjanol FF) dotrze do dna żelu.
  6. Usuń żel, umieść go na kawałku chłonnego papieru i owiń folią.
  7. Żel znakowany radioizotopem należy poddać badaniu przesiewowemu luminoforowemu.
  8. Zeskanuj ekran fosforowy za pomocą luminowizora i przeanalizuj obraz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunki 2 i 3 przedstawiają reprezentatywne wyniki reakcji wykorzystanych do generowania sztucznych kompleksów elongacyjnych zawierających transkrypty o różnych długościach poprzez przedłużanie polimerazy Pol II pochodzącej z różnych źródeł. Rysunek 4 obrazuje, w jaki sposób kompleksy elongacyjne te mogą być wykorzystane do analizy współtranskrypcyjnego nakładania czapeczek RNA zależnego od fosforylacji CTD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania, które mają na celu przeanalizowanie zdarzeń związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II, takich jak przetwarzanie RNA i regulacja samego wydłużania transkryptu, mogą być znacznie ułatwione dzięki zastosowaniu wysoce oczyszczonego systemu enzymatycznego. Konfiguracja takich systemów enzymatycznych może być wyzwaniem. Transkrypcja zależna od promotora przez Pol II wymaga co najmniej pięciu ogólnych czynników transkrypcyjnych. Przygotowanie i gromadzenie tych czynników może zająć miesiące; W związku z tym krokiem o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy S. Shumanowi za dostarczenie ssaczego enzymu cDNA. Prace te były częściowo wspierane przez grant dla Stowers Institute for Medical Research z Helen Nelson Medical Research Fund w Greater Kansas City Community Foundation. Oryginalne dane leżące u podstaw tego manuskryptu można uzyskać w Stowers Original Data Repository pod adresem http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1434.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[α-32P] UTP (3000 Ci/mmol), 1 mCiPerkin ElmerNEG007H001MCDo znakowania radioaktywnego RNA
2x barwnik ładujący RNANew England BiolabsB0363SWysoce zalecane. Do przygotowania RNA podczas ładowania żelem
40% Bis: Roztwór akrylamiduBiorad1610144
Albumina surowicy bydlęcej (20 mg / ml)New England BiolabsB9000S
Cdk7 / Cyklina H / MAT1 (kompleks CAK) Białko, aktywne, 10 i mikro; gMillipore Sigma14-476Służy do fosforylacji
oligonukleotydów PolIDTPatrz tabela 8, aby zapoznać się ze specyfikacjami czystości
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies Invitrogen65001Bez problemu użyliśmy również streptawidyny Dynabeads M-280, ale preferujemy kulki MyOne Streptavidin, ponieważ wolniej się osadzają
GlycoBlue Coprecipitant (15  mg / mL)Life Technologies InvitrogenAM9516Gorąco polecam. Barwniki w postaci granulek kwasów nukleinowych na niebiesko, dzięki czemu reakcje są znacznie łatwiejsze w obsłudze
Standardowy pionowy system elektroforezy Hoefer SE600 z podwójnym chłodzeniem z przekładkami 1 mm i 15-dołkowym grzebieniemHoeferSE600-15-1,5
MaXtract (1,5 ml)Qiagen129046Wysoce zalecane. Zawiera żel o dużej gęstości, który tworzy stabilną barierę między fazą wodną a organiczną; poprawia wydajność RNA podczas ekstrakcji
Roztwór proteinazy K (20  mg / ml)Life Technologies Invitrogen25530049
Oligonukleotydy RNATrilinkWięcej informacji można znaleźć w tabeli 8
Drożdżowa pirofosfataza nieorganiczna (100 jednostek/ml)New England BiolabsNEBM2403SWymagane tylko podczas reakcji cappingu
II CTD DNA Probówki o wysokiej gęstości

Bibliografia

  1. Liu, X., Bushnell, D. A., Kornberg, R. D. RNA polymerase II transcription: structure and mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1829 (1), 2-8 (2013).
  2. Daube, S. S., von Hippel, P. H. Functional transcription elongation complexes from synthetic RNA-DNA bubble duplexes. Science. 258, 1320-1324 (1992).
  3. Kireeva, M. L., Komissarova, N., Waugh, D. S., Kashlev, M. The 8-nucleotide-long RNA:DNA hybrid is a primary stability determinant of the RNA polymerase II elongation complex. Journal of Biological Chemistry. 275 (9), 6530-6536 (2000).
  4. Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (8), 831-833 (2012).
  5. Noe Gonzalez, M., Sato, S., Tomomori-Sato, C., Conaway, J. W., Conaway, R. C. CTD-dependent and -independent mechanisms govern co-transcriptional capping of Pol II transcripts. Nature Communications. 9 (1), 3392(2018).
  6. Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 2 (2), 277-298 (2011).
  7. Ramanathan, A., Robb, G. B., Chan, S. H. mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7511-7526 (2016).
  8. Ghosh, A., Lima, C. D. Enzymology of RNA cap synthesis. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 1 (1), 152-172 (2010).
  9. Moteki, S., Price, D. Functional coupling of capping and transcription of mRNA. Molecular Cell. 10, 599-609 (2002).
  10. Conaway, J. W., Conaway, R. C. An RNA polymerase II transcription factor shares functional properties with Escherichia coli sigma 70. Science. 248, 1550-1553 (1990).
  11. Wang, D., et al. Structural basis of transcription: backtracked RNA polymerase II at 3.4 angstrom resolution. Science. 324 (5931), 1203-1206 (2009).
  12. Wang, L., et al. Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex. Nature. 523 (7562), 621-625 (2015).
  13. Martinez-Rucobo, F. W., et al. Molecular Basis of Transcription-Coupled Pre-mRNA Capping. Molecular Cell. 58 (6), 1079-1089 (2015).
  14. Mandal, S. S., et al. Functional interactions of RNA-capping enzyme with factors that positively and negatively regulate promoter escape by RNA polymerase II. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101, 7572-7577 (2004).
  15. Chiu, Y. L., et al. Tat stimulates cotranscriptional capping of HIV mRNA. Molecular Cell. 10 (3), 585-597 (2002).
  16. Vos, S. M., Farnung, L., Urlaub, H., Cramer, P. Structure of paused transcription complex Pol II-DSIF-NELF. Nature. 560 (7720), 601-606 (2018).
  17. Vos, S. M., et al. Structure of activated transcription complex Pol II-DSIF-PAF-SPT6. Nature. 560 (7720), 607-612 (2018).
  18. Kujirai, T., et al. Structural basis of the nucleosome transition during RNA polymerase II passage. Science. 362 (6414), 595-598 (2018).
  19. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kompleks elongacyjnycapping kotranskrypcyjnysztuczne b ble transkrypcyjneunieruchamianie na koralikach magnetycznychdupleks DNA RNAfosforylacja TFIIHtest enzymu cappingowegodenaturuj cy el poliakrylamidowyanaliza transkrypt w znakowanych izotopowo
Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.